Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Forberedelse og morfologisk analyse av kyllingkraniale nevrale kamcellekulturer

Published: June 27, 2022 doi: 10.3791/63799
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 2,3
1Department of Biology and Neuroscience Program, Hamline University, 2Department of Genetics, Cell Biology and Development, University of Minnesota, 3Developmental Biology Center, University of Minnesota

Summary

Denne allsidige protokollen beskriver isoleringen av premigratoriske nevrale kamceller (NCC) gjennom eksisjon av kraniale nevrale folder fra kyllingembryoer. Ved plating og inkubasjon kommer migrerende NCCer fra nevrale foldeksplanter, noe som muliggjør vurdering av cellemorfologi og migrasjon i et forenklet 2D-miljø.

Abstract

Under vertebratutvikling migrerer nevrale kamceller (NCC) mye og differensierer til forskjellige celletyper som bidrar til strukturer som kraniofacialskjelettet og det perifere nervesystemet. Selv om det er avgjørende å forstå NCC-migrasjon i sammenheng med et 3D-embryo, letter isolering av migrerende celler i 2D-kultur visualisering og funksjonell karakterisering, som utfyller embryonale studier. Denne protokollen demonstrerer en metode for å isolere kyllingkraniale nevrale folder for å generere primære NCC-kulturer. Migrerende NCC kommer fra nevrale foldeplanter belagt på et fibronektinbelagt substrat. Dette resulterer i spredte, tilhørende NCC-populasjoner som kan vurderes ved farging og kvantitative morfologiske analyser. Denne forenklede kulturtilnærmingen er svært tilpasningsdyktig og kan kombineres med andre teknikker. For eksempel kan NCC-emigrasjon og migrasjonsadferd evalueres ved time-lapse-avbildning eller funksjonelt spørres ved å inkludere inhibitorer eller eksperimentelle manipulasjoner av genuttrykk (f.eks. DNA, morfolino eller CRISPR-elektroporering). På grunn av sin allsidighet gir denne metoden et kraftig system for å undersøke kranial NCC-utvikling.

Introduction

Nevrale kamceller (NCC) er en forbigående cellepopulasjon i virveldyrembryoer. NCC er spesifisert ved grensen til nevrale platen og gjennomgår en epithelial-til-mesenkymal overgang (EMT) for å migrere fra dorsal nevralerøret 1. Etter EMT sprer NCC seg mye gjennom hele embryoet, og differensierer og bidrar til ulike strukturer, inkludert kraniofacialskjelettet, utstrømningskanalen i hjertet og flertallet av det perifere nervesystemet2. Endringer i cellepolaritet, cytoskjelettet og adhesjonsegenskaper ligger under dette skiftet fra en premigratorisk til en migrerende cellepopulasjon3. Studier av NCC EMT og migrasjon gir innsikt i grunnleggende mekanismer for cellemotilitet og informerer innsats for å forebygge og behandle fødselsskader og kreftmetastase.

Mens in vivo-analyse er avgjørende for å forstå NCCs utviklingsprosesser i en embryonal kontekst, tilbyr in vitro-metoder visuell og fysisk tilgjengelighet som letter ytterligere eksperimentelle veier. I et forenklet 2D-miljø kan NCC-morfologi, cytoskeletale strukturer og avstand migreres evalueres. Videre kan effekten av genetisk eller løselig faktorforstyrrelse på migrerende oppførsel av motile NCC analyseres 4,5,6,7,8,9,10. I tillegg kan isolerte premigratoriske eller migrerende NCC-er samles inn, samles sammen og brukes til metoder med høy gjennomstrømning for å studere utviklingsreguleringen av NCC gjennom proteomisk, transkriptomisk og epigenomisk profilering 7,11. Mens metoder er tilgjengelige for å forberede kraniale NCCer fra ulike utviklingsmodellorganismer12,13,14, demonstrerer denne artikkelen mekanikken i tilnærmingen for de som først lærer å dyrke kranial NCC fra kyllingembryoer.

Den nåværende protokollen beskriver en allsidig teknikk for fremstilling av NCC-kulturer hos kyllinger (figur 1). Fordi NCC migrerer lett fra eksplanterte nevrale folder på et kultursubstrat, segregerer kylling-NCC-er naturlig fra embryonalt vev, og primære kulturer genereres lett. Ettersom midthjerne-NCC-er migrerer en masse fra kraniale nevrale folder (i motsetning til den langvarige, celle-for-celle-delamineringen i stammen15), består disse kulturene hovedsakelig av migrerende kraniale nevrale kamceller, med innledende nevralfoldeksisjon som gir en innsamlingsmetode for premigratoriske NCC-er. En grunnleggende metode for dissekering og dyrking av kyllingkraniale nevrale folder er detaljert, og forslag til forskjellige applikasjoner og variasjoner på denne metoden tilbys.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over kyllingkranial nevral foldekulturprotokoll. (A,B) Kraniale nevrale folder (skissert i blått) blir skåret ut fra et kyllingembryo med fem somitter (vist i dorsalvisning i A). Grå bånd, hjerte halvmåne. (C) Når de er belagt på fibronektin, kommer migrerende nevrale kamceller ut av nevrale folder og sprer seg på substratet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethvert utvalg av Gallus gallus raser kan brukes, inkludert White Leghorn, Golden Sex Link eller Rhode Island Red. Kyllingeggene som ble brukt i denne studien var av forskjellige raser og hentet fra flere kilder, inkludert lokale gårder og klekkerier.

1. Fremstilling av løsninger og materialer

  1. Forbered Ringers løsning ved å blande 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl 2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na 2 HPO 4 og 0,147mM KH2 PO4 (se materialfortegnelse). Juster pH til 7,4 og filtrer steriliser i 100 ml flasker. Oppbevares på et rent, tørt sted. Ikke vask flasker med såpe (behandle som vevskulturglass).
  2. Klargjør 1 mg/ml stamløsning fibronectin (FN) (se materialfortegnelse) ved å oppløse FN i steril Ringers løsning og oppbevares i 100 μL aliquots ved -80 °C (stabil i minst 4 år).
  3. Forbered komplette kulturmedier ved å supplere L15-medier med 0,8% L-glutamin, 0,08% penicillin / streptomycin, 10% FBS og 10% kyllingembryoekstrakt12. Lag 3 ml aliquots og lagre ved -20 °C eller -80 °C.
    MERK: Hvis kulturer inkuberes i en CO2 inkubator, må DMEM / F12 erstattes av L15, som er bufret for luft.
  4. Forbered 4% paraformaldehydoppløsning i 1x PBS. Juster pH til 7,4. Lag 10 ml aliquots og lagre dem ved -20 °C.
    FORSIKTIG: Paraformaldehyd må håndteres i en avtrekkshette.
  5. Forbered filterpapirstøtterammer (ca. 1 cm x 1,5 cm rektangler papir med to eller tre hullhull som overlapper på den lange aksen).
    1. Punch hull langs kanten av et stort stykke filterpapir ved hjelp av en standard tre-hulls punch, klipp / trim den stansede kanten i en stripe, og kutt deretter stripen mellom hullene i rektangler ~ 1,5 cm i lengde. Autoklav filtrerer papir før bruk (valgfritt).
  6. Samle disseksjonsverktøy, inkludert fine tang (# 5), stump tang, disseksjonssaks, fjærsaks og skjerpede wolframnåler16.

2. Embryo inkubasjon

  1. Få befruktede egg fra noen av kildene nevnt ovenfor.
  2. Plasser de befruktede eggene i oppreist stilling (eggets lange akse vertikalt med den spisse enden ned / stump side opp) inne i en fuktet inkubator ved 38 ° C (100 ° F).
  3. Inkuber til fire til syv somitter har dannet seg (trinn 8 + -9) 17, som tar omtrent 35 timer.
    MERK: Inkubasjonstiden kan variere betydelig avhengig av belastning, hønenes alder, sesong, etc., og må være eksperimentelt bestemt. Programmerbare utløpstimere er nyttige for å starte inkubasjon om natten for å oppnå ønsket timing.
  4. Etter fjerning fra inkubatoren, spray eggene grundig med 70% etanol og la dem tørke for å desinfisere skallene.
    MERK: Embryoer kan samles umiddelbart, men å la egg avkjøles til romtemperatur reduserer skjørheten til eggeplommene og embryotapet under innsamling.

3. Tilberedning av kulturretter

  1. Velg nevrale brettkulturretter (se Materialtabell) som passer for nedstrømsapplikasjonen.
    1. For kulturer som skal fikses og farges, bruk glassdeksler plassert i flerbrønnskulturskåler.
      MERK: Coverslips som samsvarer med brønnstørrelsen vil bevege seg mindre med væskeblanding, noe som gjør det mindre sannsynlig at eksplanter skifter og mer sannsynlig å feste seg til dekselet i stedet for oppvaskbunnen.
    2. Velg glassbunn enkeltkammer eller delte kammerretter (se Materialtabell) for levende avbildning med et omvendt mikroskop.
    3. For levende avbildning på et oppreist eller stereomikroskop, bruk 6-, 12- eller 24-brønns optisk passende vevskulturplater.
    4. Velg plastvevskulturskåler for masseinnsamling av migrerende nevrale kamceller for analyser med høy gjennomstrømning.
  2. Tilsett 10 U/ml penicillin og 10 μg/ml streptomycin til en 100 ml flaske steril Ringer-oppløsning (for eksempel 100 μL 10 000 U/ml penicillin og 10 000 μg/ml streptomycin, for å lage Ringers P/S). Bruk Ringer's P/S innen 1 uke.
  3. Tine en aliquot på 1 mg / ml FN på is. Fortynn med Ringers P/S til en konsentrasjon på 10-100 μg/ml FN.
  4. Pipet nok FN-løsning til å dekke bunnen av brønnen eller parabolen. For eksempel 100 μL per brønn i en 24-brønns plate, 500 μL for en 35 mm tallerken.
  5. Bytt lokket og inkuber tallerkener eller tallerkener med FN-løsning i en fuktet inkubator (eller et dekket brett med destillert vann-gjennomvåt papirhåndklær) ved 38 ° C (100 ° F) i minst 1 time mens du dissekerer nevrale folder.

4. Isolering av kyllingembryoer

  1. Pass på å opprettholde eggets orientering (embryoet flyter til toppen av eggeplommen under inkubasjon). Bruk saks eller stump tang til å stikke et lite hull i skallet, omtrent 1/4-1/3 av veien ned langs egget.
    1. Sett forsiktig spissen av saks eller stump tang inn i det lille hullet, sørg for ikke å forstyrre eggeplommen, og kutt gjennom eggeskallet rundt egget, fjern toppen av eggeskallet (figur 2A).
  2. Plasser embryoet for isolasjon.
    MERK: Hvis embryoet ikke er ideelt plassert i skallkoppen, bruk stumpe tang for å snu eggeplommen forsiktig, slik at embryoet er på toppen. Alternativt kan du helle eggeplommen i en hansket, cupped hånd, vær forsiktig så du ikke bryter eggeplommen og lar albuminet renne bort (figur 2B). Deretter kan embryoet plasseres ved å flytte eggeplommen fra hånd til hånd.
  3. Forbered embryoet forsiktig ved å bruke den flate kanten av lukkede, stumpe tang for å tørke bort overflødig albumin som er igjen på eggeplommens overflate som dekker embryoet (figur 2C). Overflødig albumin kan også fjernes ved hjelp av forsiktig trykk med en delikat oppgavevisker.
    MERK: Når albumin er ryddet bort, skal eggeplommens overflate vises strukturert i stedet for glatt. Hvis du ikke tørker bort tilstrekkelig albumin, hemmes adhesjonen av filterpapirstøtten i avsnitt 4, trinn 4.
  4. Bruk tang til å plassere en filterpapirstøtteramme over embryoet, med embryoet i rammens vindu. Trykk forsiktig ned på filterpapiret for å feste det på eggeplommen.
  5. Klipp rundt utsiden av filterpapirrammen med disseksjonssaks (figur 2D). Bruk tang eller saksespisser for å ta tak i kanten av rammen og løft embryoet forsiktig bort fra eggeplommen (figur 2E). Å løfte bort i vinkel vil bidra til å fjerne embryoet rent fra eggeplommen.
  6. Plasser embryoet med papirrammens side ned (embryoventral side opp) i en 60 mm eller 100 mm petriskål fylt med Ringers P/S (figur 2F). Hold parabolen av embryoer på is hvis du samler for en RNA- eller proteinfølsom nedstrøms applikasjon.
    MERK: Hvis du ikke plasserer embryoer med ventral side opp, risikerer du å løsne dem fra papirrammene. Flere embryoer kan samles og lagres i Ringers P/S i opptil 1 time før de går over til trinnene for disseksjon av nevralfold.

5. Dissekere nevrale folder

  1. Overfør et embryo til en ren skål som inneholder Ringers P/S-løsning og skyll embryoet ved å holde filterpapirrammen med tang og forsiktig sveipe frem og tilbake for å fjerne enhver eggeplomme som skjuler embryoets syn. Bytt Ringer's P/S eller overfør til en fersk rett hvis det blir overskyet.
  2. Plasser embryoets dorsale / rammeside opp under et dissekeringsmikroskop. La embryoet ligge på papirrammen for å holde det strukket stramt og holdt på plass, fjern vitellinemembranen ved hjelp av tang for å eksponere nevrale folder.
    MERK: Hvis embryoet faller av papirrammen, kan det legges flatt i fatet eller festes til en sylgardbelagt tallerken18 for disseksjon.
  3. Bruk vårsaks eller en skjerpet wolframnål, og fjern forsiktig midthjernens nevrale folder. Inkluder vev caudal til de ekspanderende optiske vesiklene og rostral til bakhjernen, hvor rhombomere-innsnevringer bare begynner å vises (hjertehalvmånen er også en nyttig indikator, figur 3B, C). Pass på å fjerne det dorsale aspektet av nevralfolden med minimal forurensende nevrale rør og ikke-nevrale ektoderm (figur 3C).
  4. Overfør nevrale folder til en ren tallerken som inneholder Ringers P/S ved hjelp av en P20-pipettor eller en steril Pasteur-pipette i glass skyllet med yolky Ringer's P/S (dette blokkerer plasten eller glasset for å forhindre at vevet setter seg fast). Oppbevar oppsamlede folder på is mens du dissekerer ytterligere bretter.

6. Plating nevrale folder

  1. Tine et aliquot av komplette kulturmedier (seksjon 1, trinn 3). Tilsett 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin og filtersteriliser. Oppbevar klargjorte medier ved 37–38 °C mens du utfører andre trinn.
  2. Fjern kulturretter fra inkubatoren (avsnitt 3, trinn 5). Bruk en pipettor eller Pasteur-pipette, fjern FN-løsningen fra deksler, servise eller brønner. Etter å ha skyllet det FN-belagte substratet med Ringer's P/S, tilsett et passende volum av komplette kulturmedier til oppvasken eller brønnene (500 μL for brønner i en 24-brønnsplate, 2 ml for en 35 mm tallerken eller en seksbrønnsplate).
    MERK: Mindre volumer kan bevare dyre reagenser (f.eks. så lavt som 200 μL for en 24-brønns tallerken), men sørg for at parabolen er tilstrekkelig fuktet for å unngå fordampning.
  3. Bruk en pipettespiss med en pipetor på p20 eller p200 og skyll først pipettespissen med yolky Ringer's P/S for å blokkere plasten og forhindre at vevet setter seg fast. Deretter overfører du de isolerte nevrale foldene til de FN-belagte dekslene, og passer på å overføre så lite Ringer's P/S som mulig. Plasser folden(e) mot midten av den FN-belagte dekselleveren.
    MERK: En eller noen få nevrale folder kan belegges på en 12 mm deksel i en 19 mm brønn, opptil 50 på en 35 mm plate.
  4. Etter å ha latt plantene slå seg ned i 10-15 minutter, plasser dem i et fuktet kammer ved 38 ° C (100 ° F) ved sakte og forsiktig å bære kulturskålene med belagte nevrale folder. Dette vil minimere forskyvningen av nevrale folder i brønnene, slik at de forblir spredt og fester seg til eventuelle deksler.
    MERK: Når du bruker L15 (ikke DMEM), kan eksplantkulturretter også inkuberes i en egginkubator ved hjelp av et dekket brett med fuktede papirhåndklær.
  5. Inkubere nevrale foldkulturer i den fuktede inkubatoren i løpet av aktiv migrasjon (ca. 16-20 timer totalt, figur 4).

7. Fiksering og farging av kultiverte migrerende NCC-er for morfologisk analyse

  1. Fjern kulturmediet med en Pasteur-pipette og skyll brønnene med filtersterilisert 1x PBS.
  2. Tilsett 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur.
    MERK: Fikseringstiden må kanskje bestemmes eksperimentelt. Det er også mulig å legge paraformaldehyd direkte til media i 10 min (50:50), fjerne og erstatte med ufortynnet 4% paraformaldehyd i 10 minutter for å beholde mer delikate cellulære strukturer.
  3. Fjern paraformaldehyd og skyll tre ganger med 1x PBS.
  4. Stain fast NCC med et passende fargestoff for morfologisk vurdering. Som et eksempel er farging med Oregon Green konjugert phalloidin detaljert her.
    MERK: Visualisering av aktincytoskjelettet med phalloidin19 avslører den strukturelle kompleksiteten til migrerende NCC med relativt jevn fargeintensitet; Phalloidin kan imidlertid ikke markere alle celleområder. Fargestoffer som merker plasmamembranen (f.eks. hvetekimagglutinin eller DiI) eller cytoplasma kan også brukes, men kompliserer avbildningen av fine fremspring i forhold til den sterkt fargestoffkroppen. I tillegg kan immunfluorescens utføres samtidig for å merke nevrale kamceller med HNK-1 eller for å bestemme subcellulær lokalisering av et protein av interesse 7,20.
    1. Fjern den endelige PBS-skyllingen og tilsett PBS + 0,5% Triton X-100 (PBST) + 5% serum (FBS eller fra et annet dyr som er egnet for costaining med et antistoff) for å dekke dekslene og inkubere i 10 minutter på en plattformrister ved romtemperatur.
    2. Pipet 200 nM Oregon Green konjugert falloidin (fortynnet i PBST + 5% serum) på en glatt overflate (for eksempel fleksibel parafinforseglingsfilm) for hver deksel. For en 12 mm coverslip, pipette et volum på 30 μL.
    3. Bruk et par tang, fjern dekselet fra PBST + 5% serum, og sørg for å opprettholde orienteringen til cellene som vender oppover. Berør kanten av dekselet kort til en delikat oppgavevisker for å transportere av overflødig væske.
    4. Plasser forsiktig hver coverslip celleside ned på dråpen av fortynnet phalloidin. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Hold dekslene i mørket under farging (dekk med en aluminiumsfoliedekket tallerken eller legg i en skuff).
    5. Under inkubasjonen legger du PBST til brønnene i kulturskålen (750 μL PBST for hver brønn i en 24-brønnsplate).
    6. Etter inkubasjonsperioden løfter du deksler av fargeløsningen og legger dem tilbake i kulturskålen, snur dekselet slik at cellesiden er oppe. Forsikre deg om at dekselet er dekket med PBST og legg på en plattformrister i 10 minutter, slik at dekslene er dekket og i mørket. Fjern PBST og gjenta dette trinnet to ganger, i totalt tre vasker på 10 minutter.
    7. Plasser en dråpe (per deksel) monteringsmedier (se Materialfortegnelse) på et mikroskoplysbilde. 25 μL volum fungerer bra for en 12 mm coverslip.
    8. Etter den siste vasken med PBST, berør kanten av dekselet til en delikat oppgavevisker for å fjerne overflødig væske, og hold styr på cellesiden av dekselet.
    9. Monter dekselcellesiden ned ved å senke dekselet sakte i vinkel på monteringsmediet for å unngå å lage bobler. La mediet stille inn før avbildning.

8. Morfologisk vurdering av kultiverte migrerende NCCer

  1. Bilde fargede celler og eksporter som .tiff filer.
    MERK: Et 40x-mål fungerer bra for bildekulturer, men mål fra 10x (for å fange et helt felt av migrerende NCCer) til 100x (enkelt NCC) kan brukes til å samle bilder for morfologisk vurdering. Bilder i denne studien ble tatt med en invertert multimodal bildeplattform (se tabell over materialer).
  2. Last opp bildene til et bildeanalyseprogram (ImageJ21, se Materialfortegnelse). Klikk på Image > Duplicate for å lage en ny kopi av hvert bilde som skal brukes til analyse, og dermed la originalen være uredigert, da det meste av bildebehandlingen ikke kan reverseres.
  3. Klikk på Bilde > Juster > Lysstyrke / kontrast og bruk skyvestenger for å justere lysstyrken eller kontrasten til bildene.
  4. Konverter bildene til gråtoner ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Hvis bilder eksporteres i RGB, lastes de opp i RGB som en sammenslått kanal. For å skille bildene, klikk på Image > Color > Split Channels for å hente enkeltkanals gråtonebilder.
    2. Hvis bildene allerede er atskilt, går du til Bilde > Skriv inn > 8-biters for å konvertere filen til gråtoner.
  5. Klikk på Bilde > Juster > terskel for å konvertere til et binært bilde der piksler identifiseres som celler (forgrunn, svart) eller bakgrunn (hvit). Bruk skyvestangen og / eller klikk på Auto for å velge terskelinnstillingen som tydelig definerer celler fra bakgrunnen.
    1. Hvis cellene overlapper hverandre eller fargingen ikke er kontinuerlig, kan det være nødvendig å behandle videre ved hjelp av funksjonene Vannskille eller Fyllhull22. Dette vil skille celler fra hverandre eller fylle ut hull i celler som skal analyseres. Klikk på Process > Binary > Make Binary for først å konvertere bildet til et 8-biters binært format. Klikk deretter på Prosess > binær > vannskille eller fyllhull.
      MERK: Programvaren vil gjøre sitt beste egnet for hvor signaler må skilles eller fylles ut, som kan justeres ytterligere ved hjelp av plug-ins om nødvendig.
  6. Velg målingene som skal registreres. Klikk på Analyser > angi målinger og merk av for Formbeskrivelser-boksene for analyse av sirkularitet (Circ.), Aspect Ratio (AR), Roundness (Round) og Solidity.
    MERK: Andre målinger kan også inkluderes, som Areal og Perimeter, avhengig av hvilken type analyse som trengs.
  7. Klikk på Analyser > Analyser partikler, og angi parametrene fra menyen " Analyser partikler".
    1. Under "Størrelse" anslår du grovt hvor store cellene eller partiklene av interesse er i piksler, da bakgrunnssignal eller mindre celleavfall også vil bli inkludert hvis størrelsesparameteren forblir satt til 0-uendelig (for eksempel satt som 500-uendelig i figur 5).
      MERK: Justering av størrelsen til et strammere område kan utelukke mindre eller større partikler enn de som trengs for analyse.
    2. Under "Sirkularitet", la på 0-1,0 for å måle alle celleformer i bildet.
    3. Under "Vis" velger du Bare Outlines fra rullegardinmenyen for å inspisere cellekonturene som er valgt med "Analyser partikler" -funksjonen. Skann omrissene for å sikre at overlappende celler skilles, men celler deles ikke unødvendig. Merk også av i menyboksene for "Vis resultater", "Oppsummer" og "Legg til i leder".
  8. Når alle parametrene er angitt, klikker du på OK.
    MERK: Fire separate vinduer vil dukke opp, som viser (1) de nakne konturene av cellene som er identifisert i bildet, (2) cellene som telles i bildet, (3) resultatene av hver celles målinger, og (4) et sammendrag av totalt antall celler som telles og deres gjennomsnittlige målinger.
    1. Hvis rusk ble talt, ble overlappende celler talt som en, enkeltceller ble talt som multipler, eller mange celler ble utelatt fra tellingen, gå tilbake til det opprinnelige, uredigerte bildet, lag et nytt duplikat og juster "Terskel" eller andre parametere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En oversikt over denne protokollen er vist i figur 1. De rugede eggene ble åpnet, og eggeplommen, med embryoet på overflaten, ble isolert ved forsiktig å helle i håndflaten på en hansket hånd (figur 2A, B). Etter å ha ryddet bort albuminet (figur 2C), ble filterpapirrammer påført eggeplommemembranen som omgir embryoet for å lette kutting og løfting av embryoet fra eggeplommen, som begynner å søle bort når eggeplommemembranene er kuttet (figur 2D, E).

Figure 2
Figur 2: Isolering av fire til syv somittiske kyllingembryoer. Befruktede egg ble inkubert i 35 timer. Et egg ble åpnet med stump tang (A), og eggeplommen ble helt i en hansket hånd (B). Overflødig albumin ble fjernet (C) slik at en filterpapirstøtte (D, innfelt) ville feste seg til eggeplommen. Embryoet ble kuttet fra eggeplommen (D), løftet av (E) og plassert i Ringers P/S (F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Etter å ha skyllet embryoet og gått over til å rense Ringers P/S, var nevrale folder synlige i de isolerte embryoene (figur 3A). Disse foldene inneholder premigrerende kraniale nevrale kamceller. Når de er skåret ut fra et embryo (figur 3B, C) og samlet (figur 3D), kan isolerte nevrale folder belegges for å skape migrerende NCC-kulturer.

Figure 3
Figur 3: Disseksjon av kylling dorsale nevrale folder. I Ringers P/S ble vårsaks brukt til å fjerne nevrale folder. (A) Embryo dorsal visning, fremre mot toppen av figuren. Nevrale folder virker mer ugjennomsiktige enn det omkringliggende vevet. Midbrain nevrale folder ligger bakre til de optiske lobene (rosa) og fremre til hjertets halvmåne (gul). (B) Dorsal visning av embryoet etter at nevrale folder ble fjernet, og viser eksisjonsgrenser. (C) Lateral visning av embryoet med nevrale folder fjernet. Disseksjonsteknikken fjerner det dorsale nevrale røret, og unngår ventrale og ikke-nevrale rørstrukturer. (D) Isolerte nevrale folder i Ringers P/S. Skalalinje = 300 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Når nevrale folder ble belagt på FN, begynte NCC å dukke opp fra adherent nevrale foldeksplanter innen 3-4 timer etter inkubasjon (figur 4A), og migrasjon ble fullført etter ca. 20 timer (figur 4B). HNK-1-farging, som merker migrerende NCC20, var tydelig i de fleste celler i kulturen (figur 4D). Et negativt resultat oppstod når nevrale folder ikke klarte å feste seg til dekselet, eller ingen NCC emigrerte fra eksplanten (data ikke vist). NCC ble analysert ved å fikse kulturene, fargelegge filamentøst aktin og utføre ulike målinger i ImageJ for å evaluere NCCs morfologi og migrasjon (figur 5). Gjennomsnittlig areal av de 69 analyserte cellene var 802,11 ± 69,65 μm 2, med et område fra 60,27-2664,53 μm2, fordelt som vist i søylediagrammet og fiolinplottet (figur 5C). Sirkularitet (formel: sirkularitet = 4π(areal/omkrets²)), et mål som gjenspeiler fremspringet til en celle, varierte fra 0,101-0,875, med et gjennomsnitt på 0,38 ± 0,15. Lavere verdier indikerer en langstrakt form, mens en verdi på 1 indikerer en perfekt sirkel. Som det fremgår av fiolinplottet, viser de fleste celler en langstrakt form (figur 5D). Et annet mål på celleform er sideforholdet (AR), som er hovedaksen til cellen delt på den mindre aksen. En AR-verdi på 1 indikerer en symmetrisk form23. Migrerende NCC i dette feltet hadde en gjennomsnittlig AR på 2,13 ± 0,11, med verdier fra 1,14-5,59 (figur 5E). Ved å bruke disse kvantitative målene på NCC-morfologi, kan det gjøres strenge sammenligninger mellom eksperimentelle forhold og forskjellige publiserte studier.

Figure 4
Figur 4: Migrerende NCC-er kommer fra dyrkede nevrale folder. Brightfield-bilder av belagte nevrale folder etter 3 timers inkubasjon (A) og 20 timers inkubasjon (B). Skala bar = 200 μm. (C,D) Den nevrale folden er i stor grad spredt etter 20 timers inkubasjon, men gjenværende tilstede på høyre side av disse bildene. Skala bar = 500 μm. Migrerende NCC-er er synlige med DAPI (C) og HNK-1-farging (D). HNK-1 immunostaining bekrefter at dyrkede celler er migrerende NCCs. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Morfologisk vurdering av kultiverte migrerende NCCer. (A) Phalloidinfarging av filamentøst aktin i NCC migrert fra en nevral fold etter 20 timer i kultur. Skala bar = 50 μm. (B) Terskelbilde med celler som vises svart og bakgrunnen hvit. Gule omriss omgir objekter som telles som celler, og celler nummereres. (C-E) Grafiske alternativer for å vise morfologiske vurderingsdata. Bargrafer og fiolinplott ble opprettet fra målinger av de 69 cellene vist i panel B for å skildre området (μm2, C), sirkulariteten (D) og sideforholdet (E) til de målte cellene. Stolpediagrammer viser gjennomsnittsverdier med feilfelt som representerer standardfeilen for gjennomsnittet til venstre for hvert panel. Fiolinplott ble opprettet med app.rawgraphs.io. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Teknikken beskrevet her gir en tilpasningsdyktig metode for å isolere kyllingnevrale folder og plating dem for å skape kulturer av migrerende kraniale NCCer. Disse kulturene gir forenklede 2D-forhold for enkel analyse av kylling NCC-migrasjon og morfologi som kan supplere mer teknisk utfordrende i ovo-bildebehandlingsmetoder24,25,26. Selv om denne in vitro-metoden er relativt enkel, er konsistente resultater avhengig av egg og reagenser av høy kvalitet. I tillegg, på grunn av kulturens iboende variabilitet, krever reproduserbarhet eksperimentell repetisjon og kvantifisering.

Vedheft av nevrale folder til FN er avgjørende for NCC-migrasjon i kultur. Av og til vil ikke eksplanter feste seg ordentlig, og nevralfolden vil enten flyte bort eller produsere ingen/få migrerende NCC-er. Dette kan skje når en kranial nevral fold ikke lander kuttet med siden ned; Prøv å orientere plantene i kulturbeholderen før inkubasjon og la dem bosette seg i 10-15 minutter før du flytter dem. På grunn av væskeblanding under overføring til inkubatoren vil imidlertid noen nevrale folder uunngåelig holde seg suboptimalt fra tid til annen. Når vedheft og migrasjon er problematisk for et helt eksperiment, kan dette gjenspeile gammel FN (bruk en fersk aliquot fra -80 °C for hvert eksperiment), kulturmedium med utløpte komponenter (lagre medier fremstilt i eksperimentstørrelse aliquots ved -20 °C og tilsett ferskt antibiotika på brukstidspunktet) eller bruk av deksler som ikke er egnet for cellekultur (f.eks. celler vil ikke feste seg til coverslips for histologi). En forurenset inkubator kan også føre til at hele NCC-kultureksperimenter mislykkes.

I tillegg til å produsere spredte NCC-er i kultur og muliggjøre analyse av migrerende NCC-morfologi, er denne protokollen også et utgangspunkt for mange andre eksperimenter. Planter belagt på deksler kan også behandles for immunfluorescens (etter avsnitt 7, trinn 3) for å bestemme subcellulær lokalisering av et protein av interesse7. Mens analyse av morfologi og migrasjonsavstand er mulig i faste kulturer, som beskrevet her, muliggjør time-lapse-avbildning av NCC under kulturinkubasjon (avsnitt 6, trinn 5) ytterligere datainnsamling om direksjonalitet og persistens av migrasjon og dynamikk av cellemotilitet (målinger av membranfremspring, vedheft, etc.) 14,24,27. Forbigående genetisk manipulering av embryoer kan oppnås ved elektroporering18,28 av reagenser (morpholinos29, DNA-ekspresjonskonstruksjoner eller CRISPR-vektorer30) ved Hamburger og Hamilton stadium 4+17. Disse elektroporerte embryoene kan deretter brukes i protokollen for å skape migrerende NCC-kulturer med tap av funksjon eller overuttrykk av gener av interesse. Funksjonsanalyse kan også oppnås ved å tilsette kjemiske hemmere til mediet i NCC-kulturer 7,27 (avsnitt 6, trinn 2). Profilering på befolkningsnivå av NCC-er gjennom -omics-nivåanalyser krever innsamling av NCC-er som råstoff 7,11,31. Mens markører har blitt brukt til å isolere NCC gjennom fluorescensaktivert cellesortering31, krever dette spesialisert flowcytometriutstyr og enzymatisk dissosiasjon av celler. Å følge metodene beskrevet her for å nøye excise dorsale nevrale folder (minimere samlingen av ventrale nevrale rør og ikke-nevrale ektodermceller) gir en billig metode for å samle premigrerende NCC11 (avsnitt 5, trinn 4). Innsamling av NCC etter spredning i kultur (avsnitt 6, trinn 5) tilfører en relativt ren populasjon av naturlig segregerte, migrerende NCC-er for videre analyse (HNK-1-farging, en markør for migrerende NCC-er, i flertallet av dyrkede celler i figur 4D; som i7). Til slutt kan disse variasjonene brukes i kombinasjon. For eksempel kan immunfluorescens eller time-lapse-avbildning brukes til å evaluere effekten av genuttrykksmanipulasjoner eller tilsetning av inhibitorer27. Samlet sett gir denne tilpasningsdyktige, rimelige protokollen midler til å vurdere morfologien til villtype kraniale migrerende NCCer i kultur med flere potensielle modifikasjoner for å oppnå ulike eksperimentelle mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Corinne A. Fairchild og Katie L. Vermillion, som deltok i utviklingen av vår versjon av chick cranial neural fold culture protocol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software  Zeiss Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective
CaCl2 Sigma-Aldrich C3306
Chamber dishes (glass bottom, single or divided) MatTek; Cell Vis P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis)
X000NOK1OJ (Cellvis)		 Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm
Cover glass Carolina Biological Supply Company 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter 
DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 11320033 Alternative for L15 media
Egg incubator Sportsman 1502
FBS  Life Technologies 10437-028
Fibronectin Fisher Scientific CB-40008A
Filter paper Whatman grade 3MM chromatography
Forceps (blunt) Fisher Scientific; Thomas Scientific 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)
Forceps (fine) Fine Science Tools 11252-20 Dumont #5
Image J https://fiji.sc/ Free image analysis software
KCl Sigma-Aldrich P3911
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662
L15 media Invitrogen 11415064
L-glutamine Invitrogen 25030
Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) Vector Laboratories; Thermofisher Scientific H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9638
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-148 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin
Petri Dishes VWR (or similar) 60 mm, 100 mm
Phalloidin Sigma-Aldrich P1951 multiple flurophores available
Pin holder Fine Science Tools 26016-12 For tungsten needle (alternative for spring scissors)
Scissors (dissection) Fine Science Tools 14061-10
Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)
Sylgard Krayden Sylgard 184
Syringe Filters Sigma-Aldrich SLGVM33RS Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
Tissue culture dishes Sarstedt 83-3900 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Tungsten wire Variety of sources 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
  2. Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory. Development. 147 (20), (2021).
  3. Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest. Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).
  4. McLennan, R., et al. Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia. Development. 147 (1), 185231 (2020).
  5. Carmona-Fontaine, C., et al. Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration. Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).
  6. Giovannone, D., et al. Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor. Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).
  7. Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration. Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).
  8. Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  9. Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).
  10. Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling. Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).
  11. Jacques-Fricke, B. T., et al. Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors. Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).
  12. Bronner-Fraser, M., García-Castro, M. Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways. Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).
  13. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).
  14. Malagon, S. G. G., et al. Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration. Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).
  15. Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).
  16. Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  18. Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. Embryological and genetic manipulation of chick development. Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).
  19. Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. The phalloidin binding site of F-actin. The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).
  20. Bronner-Fraser, M. Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1. Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Soille, P., Vincent, L. Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).
  23. Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
  24. Ezin, M., Fraser, S. Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
  25. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In ovo live imaging of avian embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).
  26. McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).
  27. Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration. Journal of Cell Science. , (2022).
  28. Williams, R., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
  29. Moulton, J. D. Using morpholinos to control gene expression. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).
  30. Gandhi, S., et al. A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos. Development. 148 (7), (2021).
  31. Williams, R. M., et al. Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo. Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 184
Forberedelse og morfologisk analyse av kyllingkraniale nevrale kamcellekulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jacques-Fricke, B. T.,… More

Jacques-Fricke, B. T., Roffers-Agarwal, J., Gustafson, C. M., Gammill, L. S. Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures. J. Vis. Exp. (184), e63799, doi:10.3791/63799 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter