Summary
Denne protokollen beskriver fremstillingen av rotte hele isjias nervevev for ex vivo elektrofysiologisk stimulering og registrering i et miljøregulert, to-roms, perfundert saltvannsbad.
Abstract
Ex vivo preparater muliggjør studiet av mange nevrofysiologiske prosesser isolert fra resten av kroppen mens du bevarer lokal vevsstruktur. Dette arbeidet beskriver utarbeidelsen av rotteisjiasnervene for ex vivo nevrofysiologi, inkludert bufferforberedelse, dyreprosedyrer, utstyrsoppsett og nevrofysiologisk opptak. Dette arbeidet gir en oversikt over de ulike typer eksperimenter som er mulig med denne metoden. Den skisserte metoden tar sikte på å gi 6 timers stimulering og registrering på ekstrahert perifert nervevev i tett kontrollerte forhold for optimal konsistens i resultatene. Resultater oppnådd ved hjelp av denne metoden er A-fiber sammensatte virkningspotensialer (CAP) med topp-til-topp amplituder i millivoltområdet over hele eksperimentets varighet. CAP-amplituder og former er konsistente og pålitelige, noe som gjør dem nyttige for å teste og sammenligne nye elektroder med eksisterende modeller, eller effekten av intervensjoner på vevet, for eksempel bruk av kjemikalier, kirurgiske endringer eller nevromodulatoriske stimuleringsteknikker. Både konvensjonelle kommersielt tilgjengelige mansjettelektroder med platina-iridiumkontakter og skreddersydde ledende elastomerelektroder ble testet og ga lignende resultater når det gjelder nerve stimulus styrke-varighetsrespons.
Introduction
Den nåværende forståelsen av grunnleggende nervefunksjon som modellert i silico mangler i flere aspekter, spesielt med hensyn til effekten av nervevevsdeling utenfor soma, axon og dendritter. Axon-myelin interaksjoner er fortsatt dårlig forstått som det fremgår av det faktum at selv detaljerte beregningsmessige nervemodeller som MRG1 (for pattedyrnerver) som tilstrekkelig fanger konvensjonell elektrisk stimuleringsrespons, ikke fanger opp andre eksperimentelt observerte atferd som høyfrekvent blokkoverførsel2 eller sekundær utbruddsrespons3.
Denne protokollen gir en metode for effektivt å undersøke nevrofysiologiske prosesser på nervenivå i en akutt liten laboratoriedyrmodell, ved hjelp av en standardisert forberedelsesprotokoll for å isolere nerven, kontrollere miljøet og fjerne den fra en in vivo-kontekst til en ex vivo-kontekst. Dette vil forhindre andre kroppsprosesser eller bedøvelse som brukes av in vivo nervestimulering protokoller for å endre nerveadferd og forvirre målte resultater eller deres tolkning 4,5. Dette muliggjør utvikling av mer realistiske modeller som utelukkende fokuserer på effekter som er spesifikke for nervevev som er dårlig forstått. Denne protokollen er også nyttig som test for ny nervestimulering og registrering av elektrodematerialer og geometrier, samt nye stimuleringsparadigmer som høyfrekvent blokk 2,3. Variasjoner av denne teknikken har tidligere blitt brukt til å studere nervefysiologi under tett kontrollerte forhold6, for eksempel for å måle ionkanaldynamikk og egenskaper eller effekten av lokalbedøvelse7.
Denne teknikken gir flere fordeler sammenlignet med alternativer som akutt in vivo liten dyreforsøk8. Teknikken hindrer behovet for å opprettholde anestesidybden ettersom vevet har blitt ekstrahert fra kroppen, og reduserer mengden nødvendig utstyr som en bedøvelsesdiffusor, oksygenkonsentrator og varmepute. Dette forenkler den eksperimentelle protokollen, noe som reduserer risikoen for feil. Siden bedøvelse kan potensielt endre nervefunksjonen4, sikrer denne teknikken at tiltak ikke blir forvirret av bivirkninger fra disse bedøvelsesforbindelsene. Til slutt er denne teknikken mer hensiktsmessig enn akutte in vivo-eksperimenter når du studerer effekten av nevrotoksiske forbindelser som tetrodotoxin, som ville drepe et bedøvet dyr ved lammelse.
Perifere nerveseksjoner er et unikt ex vivo-system siden det er stor sjanse for at fibrene som er ansvarlige for registrerte nevrale signaler ikke inneholder noen soma. Som disse normalt ville være plassert, for motoriske nevroner, i ryggraden, og for sensoriske nevroner i dorsalrot ganglia ved siden av ryggraden, kan forberedelsen av en del av pattedyrnerven grovt modelleres som en samling av rørformede membraner med ionkanaler, åpen i begge ender9. Metabolisme opprettholdes av mitokondriene som ligger i axonen på tidspunktet for vevs disseksjon10. Suturering av de åpne endene av axolemma oppfordres etter ekstraksjon for å lukke dem og dermed bidra til å opprettholde eksisterende ioniske gradienter over membranen, noe som er avgjørende for normal nervefunksjon.
For å opprettholde vev homeostase utenfor kroppen, må flere miljøvariabler kontrolleres tett. Disse er temperatur11, oksygenering12, osmolaritet, pH13,14, og tilgang til glukose for å opprettholde metabolisme. For denne protokollen er tilnærmingen å bruke en modifisert Krebs-Henseleit buffer15,16 (mKHB) kontinuerlig forverret med en blanding av oksygen og karbondioksid. mKHB er i familien av kardiolegiske buffere 6,17 brukes til å bevare dissekert vev utenfor kroppen, for eksempel i ex vivo eksperimenter. Disse bufferne inneholder ikke hemoglobin, antibiotika eller antifungals og er derfor bare egnet for preparater som involverer små mengder vev i en begrenset periode. pH-kontroll ble oppnådd med karbonat- og karbondioksidredoksparet, som krever konstant lufting av bufferen med karbondioksid for å opprettholde pH-likevekt. Dette er for å unngå å bruke andre vanlige buffermidler som HEPES, som kan endre nervecellefunksjonen18. For å oksygenere bufferen og gi pH-kontroll ble det brukt en blanding av 5 % karbondioksid i oksygen kalt karbogen (95 % O2, 5 % CO2). En varmerører ble brukt til temperaturkontroll av en bufferbeholder, og bufferen ble perfundert gjennom et nervebad, og deretter resirkulert til startbeholderen. Et typisk eksperiment ville vare 6-8 timer før nerven mister sin levedyktighet og ikke lenger reagerer tilstrekkelig på stimulering for tiltak for å være representativ for sunt vev.
For å optimalisere signal-til-støy-forholdet ble sølvkloridelektroder brukt til opptak, som ble utarbeidet i henhold til tidligere beskrevne metoder19. For stimulering kan en kombinasjon av kommersielle off-the-shelf platina mansjettelektroder og skreddersydde ledende polymermansjettelektroder brukes. Ledende polymermansjettelektroder har spesielt høyere ladekapasitet, noe som er nyttig når du stimulerer nerven ved hjelp av høy amplitudebølgeformer20.
Stimulatoren som brukes i denne protokollen, er tidligere beskrevet20. Dokumentasjon, utformingsfiler og programvareskript som skal brukes, er offentlig tilgjengelig21. Andre stimulatorer kan brukes til å utføre denne protokollen. Imidlertid er den tilpassede stimulatoren også i stand til høyfrekvent alternativ strøm (HFAC) blokk 2,20, noe som muliggjør et bredere spekter av nevrofysiologiske eksperimenter. For å bruke HFAC-blokk anbefales ledende elastomermansjetter for å unngå skade på nerven. Ledende elastomernervemansjetter er myke og fullt polymere elektrodekjeder produsert av ledende elastomerer som ledende komponent og polydimetylsiloksan som isolasjon22. Enheter ble produsert i en bipolar konfigurasjon ved hjelp av konvensjonelle lasermikrofabrikasjonsteknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All dyrepleie og prosedyrer ble utført under passende lisenser utstedt av uk Home office under Animals (Scientific Procedures) Act (1986) og ble godkjent av Animal Welfare and Ethical Review Board of Imperial College London.
1. Utarbeidelse av buffere
MERK: Denne delen av protokollen kan utføres i god tid før resten av protokollen, bortsett fra de siste trinnene som involverer utarbeidelse av modifisert Krebs-Henseleit Buffer (mKHB) ved 1x konsentrasjon.
- Forbered 1 M CaCl2 lagerløsning
- Tilsett 14.701 g CaCl2 dihydrat til et rent 100 ml beger. Tilsett ~75 ml deionisert vann og rør til fullstendig oppløsning av saltet.
- Overfør løsningen til en 100 ml gradert kolbe og tilsett deionisert vann til 100 ml volum er nådd. Overfør løsningen til en flaske og oppbevar den i kjøleskap ved 4 °C.
- Forbered 10x konsentrert mKHB lager
- Tilsett 66,03 g natriumklorid (NaCl), 3,57 g kaliumklorid (KCl), 1,63 g kaliumdihydrogenfosfat (KH2PO4) og 1,44 g magnesiumsulfat til et 2 L beger.
- Tilsett ~750 ml deionisert vann til begeret og rør til saltene er oppløst (det kan være små saltkrystaller igjen nederst). Tilsett 25 ml 1 M CaCl2 lagerløsning (trinn 1.1) og rør; sørg for at dette er det siste saltet som tilsetts.
- Overfør løsningen til en 1 L gradert kolbe og tilsett deionisert vann for å nå et totalt volum på 1 L. Overfør løsningen til en 1 L flaske. Oppbevar konsentrert 10x mKHB ved 4 °C i kjøleskap.
MERK: Konsentrert mKHB-lager kan oppbevares i ca. 1 måned før utskifting.
- Forbered disseksjon Petri parabolen (belegg)
- Forbered en ren petriskål av glass (120 mm diameter) for belegg ved å vaske og tørke parabolen forsiktig.
- Etter produsentens instruksjoner for bruk og herding av det konforme alkoksybelegget, belegge bunnen av Petri Dish med ~ 3-5 mm belegg ved å forsiktig helle den konforme beleggblandingen i parabolen til ønsket tykkelse er nådd.
- Herd belegget i en ovn ved 60 °C til det er fast til berøring. Disseksjonen Petri-retten er nå klar.
MERK: Skånsom rengjøring av retten etter hver bruk vil sikre at belegget varer i årevis før utskifting er nødvendig. Når du bytter ut belegget, må du sørge for å fjerne alt beleggmaterialet før du påfører et nytt belegg. Vær oppmerksom på at det konforme alkoksybelegget (Materialbord) som brukes i denne protokollen, har en holdbarhet som er kortere enn et år.
2. Pre-disseksjon preparater
MERK: Dette trinnet starter eksperimentet. Trinnene nedenfor må utføres på samme dag, i denne rekkefølgen.
- Forbered 1x mKHB
- Klargjør et rent 2 l beger for bufferen. Overfør 200 ml 10x mKHB lager til 2 L beger. Tilsett 2,1 g natriumkarbonat (NaHCO3) og 0,99 g vannfri dekstrose (D-glukose) til 2 L begeret.
- Tilsett ca. 1 L deionisert vann til begeret. Rør til salter er helt oppløst. Overfør løsningen til en 2 L gradert kolbe og tilsett deionisert vann for å nå et totalt volum på 2 L.
- Overfør løsningen til en 2 L glassflaske plassert på en varmerører med temperaturen satt til 37 °C.
MERK: Mindre varmerører vil ofte ikke kunne nå målet 37 °C temperatur på grunn av termisk treghet i store beholdere fulle av vann. Juster temperaturen oppover slik at innholdet i flasken når 37 °C ved omrøring. Overvåk temperaturen under eksperimentet og senk den innstilte temperaturen i tilfelle overshoot. - Plasser et termometer i 2 L-flasken for å overvåke temperaturen, ved hjelp av gripere for å forhindre at termometeret blir påvirket av røreloppen. Aerer bufferen med karbogen i minst 30 minutter for å oksygenere løsningen. Dette bør sette pH til 7.4. Mål pH med en pH-måler for å sikre at den er innenfor 0,1 pH-enheter på 7,4 (ved 37 °C).
MERK: For å justere pH til 7,4, bruk saltsyre eller natriumhydroksid ved behov. - Fyll to 15 ml sentrifugerør og en 100 ml flaske med mKHB og legg dem på is for å avkjøle.
MERK: Sentrifugerørene og flasken kan rengjøres og brukes på nytt etter hvert eksperiment uten autoklavering. - For senere deler av eksperimentet, fortsett å vanne bufferen i 2 L-flasken med karbogen ved 37 °C med kontinuerlig omrøring.
MERK: Uovervåket bruk av karbogen kan være farlig hvis det ikke er på plass automatiske systemer for å stenge av gassstrømmen i tilfelle lekkasje. En automatisert sensor og elektronisk avstengningsventil kan redusere dette; Ellers må en person overlates til å overvåke utstyret hvis disseksjonen finner sted i et annet rom. I alle tilfeller bør en oksygensensor brukes i nærheten av oppsettet for å advare operatørene når oksygenkonsentrasjonen stiger over 25%. Bruk et rom med aktiv ventilasjon hvis mulig.
- Slå på signalanskaffelsesenheten, lavstøyforsterkeren, linjestøyfilteret og oscilloskopet for registrering og stimulering, for å gi nok tid til temperaturstabilisering.
- Kontroller at alt elektrisk opptaksutstyr er riktig konfigurert
- Sett lavstøyforsterkeren til AC-koblet inngang med inngangsbåndpassfilteret satt til 6 dB roll-off per tiår, og cutoff-frekvenser satt til henholdsvis 30 Hz og 3 kHz for høypass- og lavpassfiltrene.
- Sett forsterkningen av lavstøyforsterkeren til 100.
3. Anestesi og euthanization av dyr
MERK: Hunnrotter mellom 250 og 330 g (Materialtabell) ble brukt til studiene.
- Forbered kirurgiske verktøy og forbruksvarer: 12 cm rett saks (stump); 2 mm skjærekant vinklet vårsaks; 4 cm fin saks, skarp eller halvskarp; #7 Dumont tang; 45° vinklede fine tang og 6-0 suturing silke eller tråd.
- Plasser rotten i en bedøvelsesbeholder eller et kammer. Koble oksygen og bedøvelsesdiffusoren til beholderen. Sett bedøvelseskonsentrasjonen (isofluran) til 3,5% og vent ca. 10 min eller til dyret viser tegn på anestesi som tap av høyre refleks.
- Etter at rotten viser tegn på anestesi, bekreft bevissthetstapet med en tåklemme abstinensreflekstest. Fortsett bare når det ikke er tåuttak; Ellers må du kontrollere alle tilkoblinger og bedøvelsesnivåer i ventilen og gjenta trinn 3.2.
- Ta dyret ut av beholderen og fortsett med cervical dislokasjon, etterfulgt av snitt av en lårarterie for bekreftelse av død.
4. Disseksjonsprotokoll
MERK: Plasser dyret med magen ned på disseksjonsbordet. Gjenta følgende trinn for begge beina. Vanligvis dissekeres høyre ben først.
- Hold ankelen godt mellom tommelen, pekefingeren og langfingeren, kutt calcaneal senen ved hjelp av 12 cm rett stump saks.
- Med fin skarp saks, gjør et hudinnsnitt fra calcaneal senen langs baksiden av benet helt opp til bunnen av ryggraden, pass på å ikke dissekere muskelvevet nedenfor.
- Bruk fine tang og fin saks, gjør forsiktige snitt gjennom muskellagene nær midten av baksiden av benet til isjiasnerven er utsatt. Så snart isjiasnerven er synlig, fukt hulrommet ved hjelp av iskald mKHB for å forhindre at nerven tørker ut.
- Bruk hemostater, trekk hudklaffene på hver side fra hverandre, og hold snittet åpent for finere disseksjonsarbeid. Fra plasseringen av calcaneal sene snitt, med fin saks, avbryte muskelen på medialsiden av benet for å frigjøre nerven. Fortsett å opprettholde fuktighetsnivået i området med iskald mKHB.
- Som nerven er utsatt mens du beveger deg opp i beinet, dissekere overlying muskelvev. Frigjør nerven nærmere ryggraden fra bindevev til du når ryggspalten der det er en knekk i nerven. Ikke prøv å rense nerven ennå, da hastighet er viktig på dette stadiet.
- Kutt nerven så nær ryggraden som mulig med fin saks. For å gjøre disseksjonen enklere, trekk forsiktig enden av nerven nær ankelen ved hjelp av tang. Klem aldri nerven i midten, men bare endene. Trekk aldri en nerve stramt.
VALGFRITT: På dette tidspunktet, hvis tiden tillater det, kan suturering av begge ender av nerven utføres for å opprettholde levedyktigheten. Hold håndteringen på et minimum for å forhindre skade. Hvis det ikke er nok tid (se trinn 4.5), hopper du over dette trinnet og følger trinn 5.2 senere. - Plasser den dissekerte nerven i 15 ml sentrifugerøret fylt med mKHB (trinn 2.1.5), lukk røret og legg røret tilbake på is til starten av rengjøringsprosedyren.
- Gjenta trinn 4.1-4.7 for det andre benet. Ideelt sett bør hver nerve ta 5-10 min å trekke ut, for å maksimere vevets levedyktighet.
5. Nerve rengjøring prosedyre
- Fyll den belagte Petri-retten omtrent halvveis med kjølt oksygenert mKHB. Plasser en av de dissekerte isjiasnervene i parabolen og fest begge ender av nerven til parabolen slik at nerven er rett uten knekk, torsjon eller vridninger. Fest nerven så nær endene som mulig.
- Bruk 6-0 silke suturer eller fin tråd, knytte en dobbel knute rundt hver ende av nerven for å forhindre cytosol lekkasje i bufferen. Plasser knutene like ved siden av insektpinnene på siden nærmere midten av nerven, da dette vil forhindre lekkasje fra nervevev inn i bufferen. Ikke utfør dette trinnet hvis nerven tidligere har vært ligated.
- Bruk mikroskopet for presisjon og den 2 mm vinklede vårsaksen, fjern fett, blodkar og muskelvev fra nerven. Beskjær eventuelle nervegrener som ikke vil bli brukt i stimulerings- og opptaksprotokollen.
- Hver 5 min rengjøring, erstatt bufferen med fersk kjølt oksygenert mKHB. Bruk fine tang til å trekke på bindevev, fett og blodårer for å lette disseksjonen.
- Legg nervene tilbake i transportrørene fylt med fersk oksygenert kjølt mKHB og legg rørene på is.
6. Oppsett av utstyr
MERK: Utstyrsoppsettet som brukes til å utføre eksperimenter, er illustrert i figur 1. Kort sagt består den av et nervebad med to rom, en 2 L flaske plassert på en varmerører, en kilde til karbogen for buffer lufting og rør for å tillate bufferen å strømme fra flasken til badet, og tilbake til flasken ved hjelp av en peristaltisk pumpe. Badekaret kan bearbeides av plexiglass eller 3D-trykt fra vanntette materialer. Den har en dybde på ca 2 cm, og skilleveggen som skiller de to kamrene i badekaret har et hull med en diameter på 1,5 mm for å tillate gjenging av en perifer nerve over begge kamrene. Ett kammer er stort, må være minst 4 eller 5 cm langt, og vil bli fylt med buffer. Det andre kammeret skal være minst 3 cm langt og fylles med silikon eller mineralolje. Badet må ikke gjøres for stort, da dette vil forringe kontrollen av perfusjon, temperatur og pH. Ulike badestørrelser kan være nødvendig avhengig av størrelsen på nervevevet som studeres.
- Forbered et rent nervebad med to kammer (se Tilleggsfil for designspesifikasjoner). Plasser nervebadet under nivået på 2 L-flasken som er plassert på varmerøreren, ved hjelp av standard laboratoriesjefhoder og gripere. Koble avløpet på badekaret til den peristaltiske pumpeinntaket.
- Koble utløpet til den peristaltiske pumpen til et rør som fører tilbake til bufferflasken på 2 L. Koble badekarinntaket til et rør med en justerbar strømningsventil og sett røret inne i 2 L-flasken. Bruk en treveisventil med en sprøyte koblet til midtuttaket for å hjelpe til med å grunne røret som en sifon for tyngdekraftassistert buffertilstrømning.
- Prime sifonen ved å tegne sprøyten til bufferen strømmer inn i den. Konfigurer ventilen slik at bufferhastigheten inn i badekaret er ~ 5-6 ml·min-1. Strømmen kan økes i utgangspunktet for å fylle badekaret. Når badebuffernivået har nådd avløpet, plasser nervene i badekaret.
- Bruk en insektpinne, sikre enden av nerven i hjørnet av det bufferfylte badekammeret. Bruk 45° vinklede fine tang og klem nerven bare i enden, tre forsiktig nerven som skal stimuleres gjennom hullet i skilleveggen mellom de to badekamrene.
- Sikre den andre enden av nerven i badekarets oljekammer med en insektpinne, og sørg for at nerven er rett uten å bli strukket og er fri for knekk og vendinger. Bruk silikonfett, lag en forsegling for å forhindre bufferlekkasje fra bufferkammeret inn i oljekammeret. Fyll oljekammeret med silikon eller mineralolje.
- Plasser Ag/AgCl-opptakselektrodekrokene i oljebadkammeret og fest dem med sjefshoder og gripere. Draper delen av nerven i oljebadet over krokene uten å trekke nerven stramt. Ikke klem nerven; bruk vinklede tang for å løfte nerven uten å klemme.
- Juster eller reparer silikonfetttetningen hvis det blir observert lekkasje etter at du har flyttet nerven.
- Koble referansen Ag/AgCl-elektroden til forsterkerjordet og plasser elektroden i det bufferfylte badekammeret ved å sikre den ved hjelp av en laboratoriegriper.
7. Elektrodeimplantasjon på nerven i badekaret
- Forbered en ren nervemansjettelektrode for stimulering i henhold til referanse21. Plasser elektroden i det bufferfylte badekammeret. Bruk tang eller fine pinsett med stumpe eller vinklede spisser, åpne elektroden i badekaret for å fukte innsiden av mansjetten.
- Hvis det gjenstår bobler, bruk en fin sprøyte til å trekke bufferen fra badekaret og tvinge boblene ut av mansjetten. Med en pinsett under nerven, åpne mansjetten forsiktig og skyv den under nerven. Lukk mansjetten rundt nerven, pass på å unngå knekking eller vridning av nerven.
- Koble stimuleringselektroden til stimulatoren og fest stimuleringselektrodens ledning med tape. Koble den nåværende returelektroden til stimulatoren og fest ledningen med tape. Hvis du bruker et firkantet platinaplate som strømreturelektrode, plasserer du arket vekk fra nerven i badekaret.
8. Stimulering og opptak
- Koble stimulatorens TTL-signalutgang til kanal 4 i oscilloskopet, som skal brukes til å utløse oscilloskopet. Trykk kategorien Utløserkanal på skjermbildet oscilloskop, og angi Kanal 4 som utløsende kanal. Sett avtrekkernivået til 1 V ved hjelp av nivåknappen .
- På oscilloskopet setter du tidsoppløsningen til 1 ms/divisjon og spenningsoppløsning til 10 mV/divisjon. Sentrer utløserreferansen i tide og sett utløsernivået til 1 V.
MERK: Følg trinn 8.3 til 8.6 hvis du bruker den egendefinerte stimulatoren (se Materialfortegnelse). Det antas at MATLAB-programvaren og enhetsdriverne er installert på laboratoriedatamaskinen ved hjelp av instruksjoner som er gitt fritt online for den tilpassede nevrale stimulatoren21. Ellers følger du produsentens instruksjoner for bruk av en kommersielt tilgjengelig stimulator som et alternativ. - Koble stimulatoren til laboratoriedatamaskinen. Slå på stimulatoren ved å koble batteristrømforsyningen til strøminngangen. Start MATLAB-programvaren på laboratoriedatamaskinen.
- Utfør det egendefinerte MATLAB-skriptet: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Tabell over materialer).
MERK: USB-kommunikasjonskabelen mellom datamaskinen og stimulatoren skal blinke grønt. Hvis den ikke gjør det, er det en konfigurasjonsfeil, og strømforsyningen og tilkoblingene må bekreftes. - Åpne MATLAB-skriptet: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (Materialliste). Ved å redigere MATLAB-skriptet direkte, sett parametrene som følger: stimulatorpulsamplitude = -300 μA, stimulatorpulsbredde = 300 μs, stimulator antall pulser = 10 og stimulatortid mellom pulser = 1 s.
- Start stimuleringsprotokollen ved å klikke på Kjør i MATLAB-programvaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative resultater som kan oppnås med denne protokollen er de konsistente sammensatte virkningspotensialene fra A-type nervefibre i isjiasnerven. Disse virkningspotensialene har vanligvis en topp-til-topp-amplitude på ca. 1 mV ved elektroden og derfor 100 mV når den er forsterket (figur 2). Lignende stimuleringsamplituder og pulsbredder bør gi lignende CAP-amplituder. Ledende elastomermansjettelektroder vil generelt kreve litt høyere stimuleringsamplituder for å oppnå samme CAP-amplitude sammenlignet med kommersielt tilgjengelige platinamansjettelektroder. Denne forskjellen er generelt liten sammenlignet med variasjonen i stimuleringsamplitude som kreves for å stimulere nerver som kommer fra forskjellige dyr. Dette skyldes at små forskjeller i nervestørrelse og mansjetttilpasning har stor effekt på den nødvendige stimuleringsamplituden for å oppnå en bestemt CAP-amplitude, uavhengig av mansjettmaterialet. Dette kan brukes til å teste effekten av forskjellige buffersammensetninger, for eksempel forskjellige ionkonsentrasjoner eller tilsetning av nerveeksitatoriske eller hemmende stoffer som tetrodotoxin. Hvis bufferavfallsrøret føres til en ekstra beholder, kan tilsetningen av nerveeksitabilitetsforandrende stoffer gjøres midlertidig for eksperimentet, med utvaskingshastigheter avhengig av buffertilstrømningshastigheten.
Minimum strømtetthet, beregnet som stimuleringsamplitude delt på overflaten av stimuleringselektrodene, som kreves for å aktivere A-type fibrene, og oppnå et observerbart sammensatt virkningspotensial i oscilloskopet ble plottet versus pulsbredde i figur 3. Resultatene vist i figur 3 representerer typisk nerveeksitabilitet for både kommersielt tilgjengelige standard platinanervemansjetter og skreddersydde ledende elastomernernermansjetter.
De ekstraherte nervene skal forbli levedyktige i ca. 6 timer etter ekstraksjon, og derfor må eksperimenter passe innenfor dette tidsvinduet. Tap av nerve levedyktighet fører til en progressiv nedgang i CAP amplitude og ledningshastighet. Etter handlingspotensialets amplitude avtar under 50% av den første amplituden (ved starten av opptaket), bør nerven betraktes som ikke lenger levedyktig, da resultatene vil bli betydelig skjevt. Representative resultater med hensyn til nervelevelevelse er vist i figur 4. Høyre og venstre isjiasnervene ble hentet ut fra ett dyr mellom 10:00 og 11:00 på en gitt dag. De første CAP-ene ble hentet fra høyre isjiasnerv under innledende tester før eksperimenter, og standard CAP-er ble oppnådd fra både venstre og høyre isjiasnerven, som hadde blitt holdt i live ved hjelp av denne protokollen, på slutten av forsøkene. Minimal CAP amplitude reduksjon ble observert med høyre isjias nerve, mens venstre isjias nerve CAP amplitude på ca 3 mV var lik den av høyre isjias nerve i begynnelsen av eksperimentet mer enn 6 h etter nerveutvinning.
Figur 1: Skjematisk representasjon av det eksperimentelle oppsettet som brukes i protokollen. Denne figuren er endret fra Rapeaux, A. et al. (2020)20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative CAPs oppnådde ex vivo etter stimulering ved metalliske og ledende elastomer nerve mansjett arrays. Gjengitt med modifikasjoner fra Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: A-fiberaktiveringsterskel for metalliske og ledende elastomermansjettmatriser. Feilfelt representerer standardavviket ±1 fra gjennomsnittet. Gjengitt med modifikasjoner fra Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative CAPer fikk ex vivo over en dag med eksperimenter og brukte begge isjiasnervene fra ett dyr. (A) A-type fiber CAP oppnådd nær middagstid fra høyre isjiasnerve. (B) A-type fiber CAP oppnådd midt på ettermiddagen fra venstre isjiasnerven. (C) A-type fiber CAP oppnådd på slutten av eksperimenter med samme venstre isjias nerve i (B). X-aksen tilsvarer tidspunktet på dagen da opptakene ble tatt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbeidet beskrev vi en protokoll for å forberede rotte isjiasnervene for ex vivo nevrofysiologi. Vevsekstraksjon tar omtrent 30 minutter, inkludert dyrehåndtering, anestesi, avhorning og disseksjon, mens nerverengjøring, plassering i badekaret og elektrodeimplantasjon bør kreve ytterligere 30 minutter før opptak kan startes. Bufferforberedelse kan utføres på 30 min, selv om dette kan gjøres før resten av eksperimentet. Denne typen forberedelse og eksperiment har blitt brukt og beskrevet i de siste 7,12, ved hjelp av lignende buffere og for samme vevstype. Så vidt forfatterne vet, er dette imidlertid første gang det gis en beskrivelse av bufferforberedelse, disseksjon, utstyrsoppsett og påfølgende opptak i samme dokument.
Denne protokollen kan muliggjøre et bredt spekter av eksperimenter innen nevrofysiologi som ikke ville være mulig i verken in vitro - eller in vivo-sammenhenger . For eksempel er en fordel med ex vivo-preparater at de bevarer makroen og mikrostrukturen til det ekstraherte vevet mens de isolerer dette vevet fra resten av kroppen. Dette resulterer i et enklere oppsett da anestesi ikke trenger å opprettholdes, noe som ellers er et krav i in vivo-eksperimenter . Når det gjelder muliggjørende eksperimenter, tillater ex vivo-preparater bruk av stoffer som tetrodtoksin, som er vanskelig å rettferdiggjøre i en in vivo-sammenheng 23 , da de har høy risiko for dyret. Når bruken av slike stoffer er til nytte for undersøkelse, er de lettere å bruke i ex vivo-preparater . Bruken av den tilpassede stimulatoren20 muliggjør eksperimenter ved hjelp av HFAC-blokk for nevromodulering ved hjelp av dette eksperimentelle oppsettet.
Det mest kritiske trinnet i protokollen er disseksjonstrinnet, fordi selv en liten feil ved bruk av disseksjonssaksen kan skade nerven hvis det ikke tas nok forsiktighet. Hastigheten på dette stadiet er også viktig, da vevet raskt må ekstraheres fra kroppen og plasseres i en kjølt buffer for å maksimere levedyktigheten ved starten av opptaket. Etter vevsekstraksjon, mens det bør tas hensyn til når du rengjør nerven og implanterer elektroder, er protokollen mer fleksibel med hensyn til tid, og risikoen for operatørfeil er derfor lavere. Ettersom nervediametre og plassering av fascicles i nervene vil variere fra dyr til dyr, bør det forventes noe variasjon i resultatene selv om du bruker samme elektroder og stimuleringsprotokoll. Effekten av denne variasjonen kan ses i feilfeltene for stimuleringsterskler i figur 3. Det er viktig å ikke klemme nerven på noe stadium av preparatet, da dette kan forårsake irreversibel skade på vevet. Håndter nerven bare ved endene ved hjelp av tang og med stor forsiktighet for ikke å trekke nerven stramt.
Flere aspekter av protokollen i sin nåværende form kan forbedres ved å øke mengden utstyr og oppstillingstid. For å hjelpe til med diagnosen potensielle problemer med dette eksperimentelle oppsettet, kan automatiserte målinger av pH og oppløst oksygen i badekaret være nyttige, men har ikke blitt implementert her. Begge målingene kan oppnås ved hjelp av amperometriske eller potensiometriske metoder12,19. Utstyr som vil kreve regelmessig vedlikehold er slanger og glassvarer, som akkumulerer saltavsetninger over tid. AgCl-opptakskrokene vil også kreve regelmessig re-belegg eller utskifting, sammen med AgCl-referansen. Stimuleringselektroder bør rengjøres etter hver bruk, men vil vanligvis ikke kreve utskifting for mange eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
ÅPEN TILGANG-SETNING:
I forbindelse med åpen tilgang har forfatteren brukt en Creative Common Attribution (CC BY)-lisens (der det er tillatt av UKRI, 'Open Government License' eller 'Creative Commons Attribution No-derivatives (CC BY-ND) lisens kan oppgis i stedet) til enhver forfatter akseptert manuskriptversjon som oppstår.
DELING AV DATA:
Rådataene som brukes i tallene i denne artikkelen vil bli gjort tilgjengelig av forfatterne, uten unødig reservasjon.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner Dr. Gerald Hunsberger fra GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, konge av Preussen, PA, USA og Galvani Bioelectronics (Stevenage, Storbritannia) for å dele sin opprinnelige nerveforberedelsesteknikk med oss. Forfatterne anerkjenner Robert Toth for dual-chamber nerve bad design. Forfatterne erkjenner finansiering fra Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) stipend fra Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). Forfatterne anerkjenner High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) fra Imperial College London for finansiering av Adrien Rapeaux (EP/L016796/1 ). Adrien Rapeaux er for tiden finansiert av UK Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre. Forfatterne anerkjenner takknemlig Zack Bailey fra Imperial College, ved Institutt for bioingeniør, for hjelp med eksperimenter og tilgang til dyrevev under produksjonen av JoVE-videoartikkelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S.
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, Pt 3 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces. , Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021).
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
