Summary
Poliep bail-out is een proces dat wordt veroorzaakt door acute stress, waarbij koraalpoliepen het weefsel verteren dat hen verbindt met hun kolonie en zich ervan losmaken om als individuen te leven. Het huidige protocol beschrijft hoe koraalmicropropagatie kan worden geïnduceerd door bail-out met behulp van hypersaline of calciumvrije zeewaterbehandelingen.
Abstract
Koralen zijn koloniale dieren gevormd door modulaire eenheden die poliepen worden genoemd. Koraalpoliepen zijn fysiologisch verbonden en verbonden door weefsel. Het fenomeen van poliep bail-out is een proces dat wordt veroorzaakt door acute stress, waarbij koraalpoliepen het weefsel verteren dat hen verbindt met de rest van de kolonie en uiteindelijk loskomen van het skelet om als afzonderlijke individuen te blijven leven. Koraalbiologen erkennen al jaren het proces van poliep bail-out, maar pas onlangs zijn de micropropagates die door dit proces worden gegenereerd erkend als een modelsysteem voor koraalbiologische studies. Het gebruik van poliep bail-out kan een groot aantal klonale eenheden creëren uit een enkel koraalfragment. Een ander voordeel is dat enkele poliepen of poliepenpleisters gemakkelijk onder een microscoop kunnen worden gevisualiseerd en onderhouden in sterk gestandaardiseerde goedkope omgevingen zoals petrischalen, kolven en microfluïdische chips. Het huidige protocol demonstreert reproduceerbare methoden die in staat zijn om koraalmicropropagatie te induceren en verschillende benaderingen voor het in leven houden van de enkele poliepen op de lange termijn. Deze methodologie was in staat om met succes poliepen van de koraalsoort Pocillopora verrucosa te cultiveren tot 8 weken na de bail-out, waarbij de bruikbaarheid van het gebruik van individuele koraalpoliepen voor koraalonderzoek werd aangetoond.
Introduction
Scleractinische of rifbouwende koralen zijn cnidarians die in staat zijn om carbonaatskeletten te vormen, riffen te creëren en structureel complexe ecosystemen die te vinden zijn van diepe tot ondiepe wateromgevingen1. Tropische koraalriffen herbergen een hoge biodiversiteit en bieden essentiële ecosysteemdiensten, zoals kustbescherming en visserijonderhoud2. De meeste ondiepwaterrifbouwende koralen vertrouwen op een mutualistische relatie met algen van de familie Symbiodiniaceae, die de energie leveren die koralen nodig hebben om hun skeletten te bouwen. De symbiose tussen het koraal en de algen kan worden verbroken door omgevingsstress, waardoor koraal 3,4,5,6 wordt gebleekt. Recente temperatuuranomalieën hebben grote koraalverblekingsgebeurtenissen over de hele wereld veroorzaakt, wat leidt tot massale koraalsterfte en permanente rifdegradatie 7,8,9,10,11. Omdat dit fenomeen is gebaseerd op de uitdrijving van symbionten door post-hittestress-geassocieerde cellulaire mechanismen, zoals apoptose, autofagie en exocytose, kan koraalverbleking worden beschreven als een cellulair proces dat gevolgen op ecosysteemschaal heeft 5,6,12, wat betekent dat het hebben van in vitro culturen van koraalcellen of weefsels van toepassing zou zijn om dit fenomeen van dichtbij te bestuderen.
Vanwege het belang van koraalriffen en de grote bedreigingen waarmee ze zijn geconfronteerd, met name in de afgelopen twee decennia2, zijn koralen wereldwijd de focus geworden van onderzoek voor beschermings- en restauratiedoeleinden13. De ontwikkeling van benaderingen en experimentele systemen die betrouwbaar en reproduceerbaar zijn en een minimale impact op het milieu bieden om koralen te bestuderen, is echter een grote strijd op dit gebied.
Micropropagatie wordt gedefinieerd als de in vitro proliferatie van het genotype van een organisme door het kweken van zijn biologisch materiaal in gecontroleerde vaten14,15. Het kweken van cellen, weefsels en organen is de afgelopen decennia cruciaal geweest voor de biologie van planten en dieren. Het maakt de massale reproductie van organismen in laboratoria, de snelle beoordeling van verschillende behandelingen (zoals geneesmiddelen en geneesmiddelen) en de directe studie van celfunctie 14,15,16,17 mogelijk. Over het algemeen zijn in vitro modellen nuttig geweest voor het aanvullen en verdiepen van de studies van verschillende organismen onder beter gecontroleerde fysische en chemische omstandigheden. Vanwege de voordelen van in vitro kweektechnieken zijn verschillende dierlijke cel- en weefselkweektechnologieën ontwikkeld, geoptimaliseerd en gebruikt als belangrijke hulpmiddelen in veel onderzoeksgebieden, waar meerdere cellijnen zijn bestudeerd en gecommercialiseerd voor tal van toepassingen 16,17,18.
Veel vooruitgang in de kennis van cel- en weefselkweek is geboekt sinds de eerste dierlijke weefselkweek in 188217, zoals het gebruik van natuurlijke en synthetische media, de uitvinding van gevestigde cellijnen en de ontwikkeling van 3D-media om een veelheid aan celtypen op een betere manier te cultiveren 16,17, 18,19. Het gebied van celbiologie heeft zich echter vooral gericht op een selecte groep modelorganismen, terwijl veel taxa nog steeds geen gevestigde in vitro culturen van cellen, weefsels of organen hebben20. In koraalonderzoek zijn bijvoorbeeld geen onsterfelijke cellijnen op grote schaal gebruikt voor onderzoek, waardoor koraalcelonderzoek wordt beperkt tot het gebruik van primaire celculturen. Deze culturen hebben een levensvatbaarheid die beperkt is tot een paar weken21, zonder studies die de overleving van individuele cellen uit alle koraalweefsels gedurende meer dan 13 dagen tot begin 2021 registreren22. Het eerste rapport van duurzame koraalcellijnen dat werd gepubliceerd, was met Acropora tenuis-cellen die tot 6 maanden leefden, en het nut van deze cellen voor toekomstig onderzoek moet nog worden onderzocht23.
Om de beperkingen in het kweken van koraalcelculturen te overwinnen en een laboratoriumcultuur te behouden die de algehele weefselorganisatie van koralen behoudt, is het gebruik van geïsoleerde poliepen onlangs voorgesteld als een model voor koraalbiologisch onderzoek24,25. Poliepen zijn de anatomische eenheden van koralen, en elk van hen heeft een mond in het midden van hun orale schijf en is verbonden met andere poliepen door de coenosarc in zijn aboriale gebied26. De scheiding van levende poliepen vindt van nature plaats door het proces van poliep bail-out, waarbij acute stress de vertering van de coenosarc tussen de poliepen veroorzaakt, die vervolgens kan loskomen van het skelet van de kolonie 25,27,28. Dit fenomeen is gemeld om voor te komen in een verscheidenheid van taxa, waaronder octocoralen 29,30,31, zwarte koralen 32, en scleractinian koralen 25,27,28,32,33, en is in verband gebracht met meerdere omgevingsstressoren, zoals gebrek aan calcium in water24,34, verhoogde zuurgraad35, hyperosmotische omstandigheden 25,27,32,36, hoge temperaturen36,37, honger33, blootstelling aan lucht25,30 en insecticide besmetting28,38. Poliep bail-out is bijvoorbeeld gemeld in pocilloporide koralen19, die wijd verspreid zijn over de hele wereld en vaak worden gebruikt als modellen in koraalonderzoek. Soorten die tot deze groep behoren, zoals Pocillopora damicornis en Styllophora pistillata, hebben ongeveer 30-40 micropropagates gegenereerd uit een fragment van 5 mm25. Dit aantal benadrukt het voordeel van het gebruik van poliep bail-out als een methode voor koraalmicropropagatie, omdat het de mogelijkheid creëert om veel genetisch identieke individuen te genereren uit een klein stukje koraal. Het gebruik van geïsoleerde poliepen voor onderzoek heeft ook dezelfde voordelen als celculturen met betrekking tot de mogelijkheid om te worden gekweekt in gecontroleerde laboratoriumomgevingen, zoals kolven en petrischalen. Bovendien hebben microfluïdische platforms om levende poliepen te onderhouden aangetoond dat deze micropropagates kunnen worden bewaard in relatief goedkope en gemakkelijk te reproduceren omgevingen, met gecontroleerde waterstroom, oppervlak en temperatuur24,25. Deze microfluïdica platforms kunnen ook worden gebruikt om levende koraalstructuren onder een microscoop direct24,25 te visualiseren.
In dit artikel vatten we de technieken samen die zijn ontwikkeld om individuele koraalpoliepen uit hun kolonies te isoleren en laten we zien hoe ze in laboratoriumomstandigheden kunnen worden onderhouden voor langdurige cultuur. De besproken methoden omvatten poliep bail-out door hyperosmotische omstandigheden door verdamping en het pompen van zeewater met een hoog zoutgehalte en incubatie in calciumvrij zeewater.
Protocol
Voor deze studie werd een kolonie die behoort tot de Pocillopora verrucosa-koraalsoort verzameld uit het Al Fahal-rif (22.305118 N; 38.964568 E) door SCUBA door te duiken met een hamer en beitel. Het geslacht van de kolonie werd morfologisch geïdentificeerd en de soort werd geclassificeerd als P. verrucosa op basis van eerder gepubliceerd werk, waaronder Pocillopora uit de Rode Zee, wat aangeeft dat, vanuit genetisch oogpunt, de soort die in dit gebied aanwezig is P. verrucosa39,40 is. Het Al Fahal-rif maakt geen deel uit van een beschermd natuurgebied en er waren geen speciale vergunningen nodig voor het verzamelen van koraal. De kolonie werd een maand lang in een aquarium van 300 L gehouden voordat het werd gefragmenteerd en zijn poliepen "gered" werden. Het aquarium werd op 26 °C gehouden met twee aquariumverwarmers, drie pompen en twee lichtbronnen (zie Materiaaltabel), met behoud van een lichtcyclus van 12 uur. De temperatuur van het aquarium werd gehandhaafd door elk van de twee kachels aan te sluiten op een temperatuurregelaar. De lichtemissie werd geprogrammeerd om te beginnen om 6 uur 's ochtends en te eindigen om 18.00 uur, waardoor een bestralingscurve ontstond die piekte om 12.00 uur met 230 μmol fotonen m−2s−1.
1. Poliep bail-out door hoog zoutgehalte na waterverdamping
OPMERKING: Deze methode is aangepast van Shapiro et al.25. Bij gebruik van andere soorten dan Pocillopora verrucosa moet rekening worden gehouden met de grootte van de poliepen voordat de grootte van het te snijden fragment wordt bepaald.
- Knip kleine fragmenten (minder dan 1 cm lang) uit een koraalkolonie met behulp van een diagonale snijtang (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Pas de snijgereedschappen aan op basis van de koraalsoorten die worden gebruikt. Diagonale tangen zijn handig voor het snijden van koralen met slanke takken. In de huidige studie werd voor elke behandeling één fragment gesneden, maar het aantal en de grootte van fragmenten kan variëren afhankelijk van het gewenste aantal poliepen. De grootte van de gesneden fragmenten mag de diepte van het water na verdamping niet overschrijden, zodat de koralen volledig in het water blijven nadat het proces is voltooid. - Plaats de gesneden fragmenten in kleine petrischaaltjes gevuld met 12 ml zeewater waaraan de koraalkolonie is gewend. Dit kan kunstmatig zeewater zijn (zie Tabel van Materialen) of gefilterd zeewater met hetzelfde zoutgehalte als waar de koraalkolonie vóór de fragmentatie in werd ingebracht.
OPMERKING: Het is belangrijk om het fragment volledig met water te bedekken. Als 12 ml in een petrischaal niet voldoende is om het gesneden fragment te bedekken, optimaliseer dan de container en het volume dienovereenkomstig. In de huidige studie werd het gebruikte water verzameld uit de Rode Zee en het zoutgehalte was 40 PSU, gemeten door een multiparametermeter (zie Tabel van materialen). - Laat de plaat bij omgevingstemperatuur ~24 uur open staan zodat het water kan verdampen en het zoutgehalte geleidelijk kan toenemen. Wanneer weefselvertering waarneembaar is tussen poliepen, gaat u verder met stap 1.4.
OPMERKING: Nadat de incubatietijd is verstreken, moet het zoutgehalte van het water ongeveer 40% hoger zijn dan in het begin en moeten de poliepen klaar zijn om van het skelet te worden losgemaakt. - Gebruik een transferpipet van 1 ml om een zachte stroom dicht bij het koraalweefsel te creëren. De stroming zal langzaam helpen bij het volledig losmaken van de poliepen die het weefsel om hen heen al uit het skelet hebben verteerd.
OPMERKING: Wanneer de waterstroom met de pipet wordt gecreëerd, moeten afzonderlijke poliepen of groepen poliepen als vlokken van het skelet afkomen. Als er in plaats daarvan een troebele substantie afkomt, duidt dit op weefseldood of desintegratie, wat betekent dat de koralen te lang of in een te stressvolle toestand (in dit geval een hoog zoutgehalte) zijn geïncubeerd. Het is erg belangrijk om een zachte waterstroom te maken om de poliepen los te maken, omdat een sterkere stroming fysieke schade aan hen kan veroorzaken. - Wissel het water in de petrischaal langzaam met isosmotisch water (gebruik hetzelfde water als in stap 1.2.) met behulp van een pipet. Een wateruitwisseling van 50% gedurende 10 minuten is voldoende om de poliepen terug te laten acclimatiseren aan een niet-stressvolle zoutgehalteconditie.
OPMERKING: Omdat koraalkolonies van de pocilloporide soort Pocillopora verrucosa uit de Rode Zee werden gebruikt, werden tests uitgevoerd om te bepalen onder welke specifieke omstandigheden de koralen uit deze unieke omgeving zouden redden. Het is belangrijk om het hoge zoutgehalte van de Rode Zee te benadrukken in vergelijking met de meeste andere rifomgevingen.
2. Poliep bail-out door hoge zoutgehalte zeewatertoevoer
OPMERKING: Deze methode is aangepast van Chuang et al.27.
- Bereid 3 L zeewater met een hoog zoutgehalte door NaCl aan zeewater toe te voegen totdat het zoutgehalte met 85% toeneemt, gemeten door een zoutgehaltesonde.
OPMERKING: In de huidige studie werd een zeewater met een hoog zoutgehalte van 74 PSU bereid uit 40 PSU zeewater uit de Rode Zee. - Knip kleine fragmenten koraal zoals beschreven in stap 1.1.
- Plaats de gesneden fragmenten in een container van 10 L gevuld met 3 L isosmotisch zeewater (in dit geval zeewater met niet-stressvol zoutgehalte voor de koralen, hetzelfde als gebruikt in stap 1.2) aangesloten op een peristaltische pomp (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Voor een beter onderhoud van de gezondheid van het koraal kunnen temperatuurregelaars, luchtpompen en lichten worden toegevoegd om dezelfde aquariumomstandigheden te simuleren waaraan de kolonie eerder werd blootgesteld. Tijdens de incubatie in het huidige werk werden de koraalfragmenten bewaard in containers bij 26 °C, onder een dagelijkse lichtcyclus van 12 uur. De waterbeweging en homogenisatie van de temperatuur werden gehandhaafd door luchtpompen. - Vul de container met koraalfragmenten met het zeewater met een hoog zoutgehalte dat in stap 2.1 is bereid met behulp van de peristaltische pomp gedurende 24 uur met een snelheid van 126 ml / h. Voeg in totaal 3 L water toe bij een toenemend zoutgehalte van ongeveer 40%.
OPMERKING: Water met een hoog zoutgehalte kan eenvoudig worden geproduceerd door NaCl aan zeewater toe te voegen totdat het beoogde zoutgehalte is bereikt. - Creëer een zachte waterstroom met een pipet om de poliepen uit het skelet los te maken (stap 1.4.).
- Wissel het water waarin de poliepen zich bevinden langzaam om voor isosmotisch water (stap 1.5.). Ga vervolgens verder met stap 4 of stap 5.
3. Poliep bail-out door calciumvrije zeewater incubatie
OPMERKING: Deze methode is aangepast van Pang et al.24.
- Bereid calciumvrije kunstmatige zeewateroplossing (CaFSW) door toevoeging van 26,29 g NaCl, 0,872 g KCl, 2,16 g MgSO4, 11,94 g MgCl2, 3,42 g Na2SO4 en 0,286 g NaHCO3 (zie materiaaltabel) aan 1 l gedeïoniseerd water.
OPMERKING: Deze oplossing is aangepast ten opzichte van eerdere protocollen om beter geschikt te zijn voor koralen die zijn aangepast aan een zoutgehalte van 40 PSU. Voor koralen die zijn aangepast aan andere zoutgehalteomstandigheden, gebruik hetzelfde aandeel zouten, maar pas de totale massa van opgeloste stoffen aan om het zoutgehalte te verkrijgen dat beter geschikt is voor de koralen in gebruik. - Knip kleine fragmenten van koralen zoals beschreven in stap 1.1.
- Dompel de koraalfragmenten onder in petrischalen gevuld met de CaFSW die eerder zijn bereid (stap 3.1.) en incubeer ze in orbitale incubators met een rotatiesnelheid van 80 tpm gedurende 3 uur.
OPMERKING: Nogmaals, het is belangrijk om het fragment volledig met water te bedekken. Als een petrischaal niet voldoende is om het fragment te bedekken, optimaliseer dan de container en het volume volgens de experimentele behoefte. - Breng de fragmenten over in petrischalen of 6-wells platen gevuld met 20% Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) en 100 mg/ml ampicilline-oplossing (zie Materiaaltabel) bereid met 40 PSU kunstmatig zeewater. Incubeer de fragmenten bij 26 °C en 80 rpm en wissel de media elke dag uit totdat weefselvertering waarneembaar is tussen de poliepen en individuele poliepen zich beginnen los te maken van het skelet.
OPMERKING: In de meeste gevallen is de weefselvertering binnen 20 uur na incubatie in dit medium voltooid en zijn er geen uitwisselingen nodig. - Breng de poliepen over op gesteriliseerd zeewater voor initieel herstel met behulp van een pipet. Ga na 1 uur incubatie verder met stap 4 of stap 5.
4. Polieponderhoud in petrischalen
- Zodra de poliepen zijn teruggebracht naar gefilterd zeewater met niet-stresserend zoutgehalte, selecteert u levensvatbare poliepen door weefselintegriteit en beweging veroorzaakt door ciliaire stroming onder een stereomicroscoop te observeren.
- Plaats de geselecteerde poliepen in een glazen of plastic petrischaal en bedek de petrischaal met een planktonnet (maaswijdte 200 μm, zie Materiaaltabel) zodat de poliepen niet van de schaal wegdrijven.
OPMERKING: De grootte van het maasnet kan variëren afhankelijk van de grootte van de poliepen. Het is belangrijk op te merken dat de netten poriën moeten hebben die kleiner zijn dan de poliepen en wateruitwisseling en lichtpenetratie mogelijk maken. - Plaats de petrischaal in een aquarium met de juiste omstandigheden voor de gebruikte koraalsoorten.
OPMERKING: In deze studie waren de omstandigheden 40 PSU gefilterd zeewater bij 26 °C en een lichtcyclus van 12 uur. - Open de petrischaaltjes minstens één keer per week om het water te vernieuwen en de vaat schoon te maken. Deze stap is belangrijk om algengroei te elimineren die kan concurreren met of schade kan toebrengen aan de koraalpoliepen door lokaal giftige stoffen vrij te geven.
5. Polieponderhoud in incubators
- Selecteer levensvatbare poliepen zoals beschreven in stap 4.1.
- Plaats de poliepen in 75 cm2 oppervlaktecelkolven gevuld met 50 ml isosmotisch zeewater met behulp van transferpipetten.
OPMERKING: In het huidige werk werd gefilterd zeewater verzameld uit de Rode Zee gebruikt voor polieponderhoud. Water met dezelfde eigenschappen als het water dat in stap 1.2 is gebruikt, kan worden gebruikt. - Sluit de kolven en verplaats ze naar incubators. Stel de incubators in op 12 uur lichtcycli bij 26 °C en 40 rpm. Wissel elke 4 dagen 50% van het watervolume uit en breng de inhoud over naar schone kolven wanneer / als ze vol algen of biofilm op de muren komen.
OPMERKING: De beelden zijn vastgelegd met een volledig apochromatisch zoomsysteem uitgerust met een HD-camera (zie Materiaaltabel) voor de representatieve resultaten.
Representative Results
Poliep bail-out werd geïnduceerd in koraalfragmenten die behoren tot een enkele kolonie van de soort P. verrucosa volgens drie verschillende methoden (figuur 1). Bail-out geïnduceerd door hoog zoutgehalte nadat waterverdamping was voltooid na 24 uur incubatie van koraalfragmenten in petrischalen bij omgevingstemperatuur gevuld met water aanvankelijk bij 40 PSU, dat vervolgens een eindzoutgehalte van 59 PSU bereikte zodra het proces voorbij was (figuur 2A-C, I). Bail-out door zoutwatertoevoer werd ook bereikt na 24 uur incubatie in water aanvankelijk bij 40 PSU die een zoutgehalte van 52 PSU bereikte na 12 h en 59 PSU aan het einde van het proces, na 24 h (figuur 2D-F, I). In beide experimenten was een toename van het zoutgehalte verantwoordelijk voor de inductie van weefselvertering door de poliepen. Na 12 uur veroorzaakte de hoge zouttoestand de samentrekking van de poliepen in combinatie met de geleidelijke verdunning van de coenosarc, waardoor uiteindelijk na 24 uur de uiteindelijke loslating van de poliepen ontstond. De bail-out inductie door incubatie in calciumvrij zeewater was voltooid na een incubatie van 3 uur in CaFSW gevolgd door een incubatie van 20 uur in de 20% DMEM-media (figuur 2G-H). Het weefsel werd in alle drie de methoden losgemaakt van het skelet nadat het met een pipet was weggeduwd totdat geïndividualiseerde koraalpoliepen (figuur 3A-C) en "weefselballen" werden gegenereerd.
Na het losmaken werden de poliepen van alle drie de methoden verzameld en in zeewater laten herstellen voordat ze werden toegewezen aan petrischalen bedekt met netten of celkolven. De poliepen verkregen uit de verdamping en de watervoorzieningsmethoden werden gehandhaafd in petrischalen in aquaria en overleefden respectievelijk 6 weken en 8 weken (figuur 3D en figuur 3F). Deze micropropagates behielden de gebruikelijke anatomie van poliepen en presenteerden tentakels, basale schijven en monden1. De poliepen verkregen door de incubatie in calciumvrij zeewater hadden een korte levensduur en overleefden tot 1 dag, waarna hun weefsel dissocieerde. Poliepen verkregen uit de zeewaterverdampingsmethode die in celkweekkolven in couveuses werd bewaard, overleefden tot 3 weken zonder dissociatie van weefsels (figuur 3F). In alle gevallen, hoewel de poliepen zich niet aan het substraat konden hechten, waren ze visueel gezond en behielden ze hun kleur, waarbij zooxanthellae-cellen nog steeds zichtbaar waren in hun weefsels1.
Figuur 1: Schematische weergave van de drie verschillende geteste methodologieën voor poliep bail-out inductie (links) gevolgd door de illustratie van twee methoden om de verworven poliepen in laboratoriumomstandigheden te behouden (rechts). (A) Representatie van de methodologie voor poliep bail-out door waterverdamping. (B) Weergave van de methodologie voor de redding van poliep door een hoog zoutgehalte zeewater. (C) Weergave van de methode voor de redding van poliep door calciumvrije zeewaterincubatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Afbeeldingen van het poliep bail-out proces geïnduceerd door drie verschillende methodologieën met behulp van fragmenten van de koraalsoort P. verrucosa. (A-C) Een koraalfragment op respectievelijk 0 h, 12 h en 24 h na incubatie in een petrischaaltje met behulp van de waterverdampingsmethode. (D-F) Een koraalfragment op respectievelijk 0 h, 12 h en 24 h na incubatie, met behulp van de zeewatertoevoermethode met een hoog zoutgehalte. (G,H) Koraalfragmenten blootgesteld aan de calciumvrije zeewater incubatiemethode voor en na, respectievelijk. De incubaties in calciumvrij kunstmatig zeewater waren gedurende 3 uur en in 20% DMEM gedurende 21 uur. (I) Grafische weergave van de zoutgehaltewaarden in PSU van het zeewater in de loop van de tijd tijdens de waterverdamping en de inductiemethoden voor de toevoer van zeewater met een hoog zoutgehalte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Afbeeldingen van P. verrucosa-poliepen verkregen uit de drie gedemonstreerde bail-out inductieprocedures. (A-C) De beelden van de poliepen verkregen uit respectievelijk de verdamping, zoutwatertoevoer en calciumvrije zeewatermethoden werden onmiddellijk vastgelegd nadat ze van het skelet waren losgemaakt. (D) Het beeld van een koraalpoliep verkregen uit de verdampingsmethode na 6 weken overleven in een petrischaaltje. (E) Het beeld van een koraalpoliep verkregen uit de zoutwatertoevoermethode na 8 weken overleven in een petrischaal. (F) Het beeld van een koraalpoliep verkregen uit de verdampingsmethode na 3 weken overleven in een celkweekkolf. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De overlevingskans van poliepen na te zijn onderworpen aan bail-outprocessen en de tijd die nodig is om het proces te voltooien, variëren tussen eerder gerapporteerd onderzoek 25,33,41, wat mogelijk wordt verklaard door de verschillende experimentele benaderingen die in elke studie worden toegepast. Verschillende koraalsoorten, of zelfs koralen van dezelfde soort, maar gewend aan verschillende omgevingsomstandigheden (bijv. Koralen uit de Rode Zee), presenteren verschillende drempels voor zoutgehalteniveaus. De gekozen methode van bail-out en de laboratorium/aquariumcondities spelen ook een belangrijke rol in de resultaten. In sommige gevallen heeft het onderhoud van koraalmicropropagates onder laboratoriumomstandigheden de overlevingstijd van koraalcelculturen overschreden door maanden van overleving te bereiken in azoöxanthellaat3 3,41 en zooxanthellaat25 koralen. De tijd voor het voltooien van het poliep-bail-outproces varieerde ook in verschillende onderzoeken, variërend van een paar uur2 5,2 7,30 tot week35 incubatie blootgesteld aan de stressor die verantwoordelijk is voor het veroorzaken van bail-out. Een andere variabele waarmee rekening moet worden gehouden bij het bestuderen van de bail-out van poliepen is het herstel van de poliepen na blootstelling aan de acute stress die hun vrijlating veroorzaakte. Het is nog steeds de vraag of poliepen na bail-out in een goede staat zijn om te worden gebruikt als modellen om koraalbiologie te bestuderen. Het herstel van hun weefsels na de afbraak van de coenosarc is een punt van zorg bij het gebruik van deze micropropagates. Poliepen in veel studies, waaronder de huidige, zijn echter in staat geweest om zooxanthellae-cellen in hun weefsels en externe morfologieën te presenteren met intacte oraal-abanale polarisatie en tentakels weken na bail-out 25,27,32,36. Eerdere studies hebben ook aangetoond dat, na te zijn verlost van acute stress, vrijgekomen koraalpoliepen blootgesteld aan zeer zout of verwarmd zeewater in staat zijn geweest om de expressie van genen gerelateerd aan processen zoals apoptose, proteolyse en celdeling te herstellen tot niveaus die vergelijkbaar zijn met die gevonden vóór bail-out32,36 en zelfs om de expressie van genen gerelateerd aan weefselgenezing te verhogen36.
Met betrekking tot het verschil in overleving tussen methoden, is het belangrijk om te benadrukken dat deze tijd kan variëren tussen verschillende experimenten, zelfs als dezelfde technieken worden gebruikt, en het kan verband houden met de gezondheid van de gebruikte fragmenten en het juiste onderhoud van de poliepen na het bail-outproces. In het geval van de bail-out door calciumvrije zeewater incubatie was de poliepoverleving beperkt tot 1 dag. Zo kan worden geconcludeerd dat de methode niet goed geschikt is voor het voortbestaan op lange termijn van de bestudeerde soorten, of dat een betere aanpassing van de techniek voor P. verrucosa-koralen uit de Rode Zee moet worden gemaakt. De gerapporteerde resultaten toonden aan dat een langere overlevingstijd werd verkregen met de methoden op basis van de geleidelijke toename van het zoutgehalte, wanneer de poliepen werden blootgesteld aan het druppelen van water met een hoog zoutgehalte. Deze methode kan een meer gecontroleerde toename van het zoutgehalte opleveren dan de verdampingsmethode, terwijl het tegelijkertijd niet verantwoordelijk is voor een toename van de concentratie van andere stoffen in het zeewater, waaronder het metabolische afval van het koraal, dat potentieel giftig is voor het organisme. Om al deze redenen is deze methode voorgesteld als een veiliger alternatief voor het behoud van gezonde poliepen27. Hoewel wordt verondersteld dat deze methode veiliger is voor de gezondheid van poliepen en in staat is om poliepen te produceren die langer leven, een feit dat in deze huidige publicatie werd bevestigd, zijn aanvullende onderzoeken nodig om dit te bevestigen. Beide door een hoog zoutgehalte geïnduceerde bail-out experimenten toonden een volledig loslating van poliepen aan nadat het zoutgehalte 59 PSU bereikte in 24 uur. Als het zoutgehalte wordt verhoogd tot voorbij het niveau waarop de bail-out is voltooid, zal verdere stress worden veroorzaakt voor de poliepen, waardoor hun kans om te overleven en te herstellen van de acute stressbehandeling wordt verminderd. Daarom wordt het niet aanbevolen om de poliepen langer in dergelijke zoutgehalteniveaus te houden. Bij het uitvoeren van de bail-out inductiemethode door blootstelling aan calciumvrij zeewater werd een volledige onthechting verkregen uit een incubatie van 3 uur in calciumvrij kunstmatig zeewater, wat betekent dat verdere blootstelling aan dit medium ook niet wordt aanbevolen.
Om de methoden aan te pakken die meer geschikt waren voor de studie van koraalpoliepen in laboratorium / in vitro enquêtes, richtte deze studie zich alleen op drie procedures die bijna 24 uur duurden voordat het bail-outproces was voltooid en werden gebruikt in studies die betrekking hadden op het langetermijnonderhoud van koraalpoliepen van scleractinische koralen. Andere methoden waarvan werd gemeld dat ze aanzienlijk langer duurden dan deze tijd, werden niet ingeschakeld. De zetting van poliepen naar een substraat werd niet geprobeerd in deze studie, die zich richtte op het produceren van poliepen die konden worden overgebracht naar verschillende omgevingen of gemakkelijk konden worden verzameld voor analyses met behulp van wegwerppipetten. De resultaten tonen aan dat poliepen van de koraalsoort P. verrucosa in leven werden gehouden, met geassocieerde zooxanthellae-cellen, een gezonde visuele status en een bewaarde grove externe anatomische structuur, gedurende maximaal 8 weken, zelfs zonder aanhechting aan een substraat. Deze resultaten geven aan dat meer biologische replicaties kunnen worden gegenereerd uit enkele koraalfragmenten met behulp van enkele van de technieken die in deze studie zijn aangetoond. Dergelijke biologische replicaties kunnen worden bewaard in gecontroleerde omgevingen (zoals petrischalen en celkolven) en in laboratoriumomstandigheden worden onderhouden voor experimenten van een maand en voor verschillende doeleinden worden gebruikt.
Sinds de eerste incidentele beschrijvingen van poliep bail-out42,43, zijn nieuwe protocollen opgesteld om meer gestandaardiseerde methoden te vinden voor het induceren van poliepafgifte en het in leven houden van dergelijke poliepen, die kunnen worden gebruikt voor toekomstige onderzoekstoepassingen. Deze omvatten het onderzoeken van verschillende aspecten die verband houden met de koraal holobiontfysiologie44 en gastheer-microbioom interacties45, de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij koraalverbleking 5,25, en de gezondheid, veerkracht en bescherming van de koraal holobiont 12,13,46,47 . Bovendien kunnen vrijgekomen koraalpoliepen worden gebruikt voor toepassingen buiten het domein van onderzoek en is gesuggereerd dat ze nuttig zijn voor het maken van propagules die zich aan een substraat kunnen hechten en groeien, waardoor mogelijk meerdere koraalpersonen kunnen worden gecreëerd die kunnen worden gebruikt voor restauratiedoeleinden zodra gestandaardiseerde protocollen voor bail-out wijdverspreid worden28 . Over het algemeen, hoewel meer diepgaande experimenten met geredde poliepen moeten worden uitgevoerd om de methodologie te standaardiseren, is aangetoond dat poliep bail-out een reproduceerbare benadering is die kan worden toegepast als een hulpmiddel in koraalonderzoek voor verschillende doeleinden.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Adam Barno en Francisca Garcia voor hun steun bij de experimenten en monitoring van de koraalpoliepen. We bedanken ook het KAUST Coastal &Marine Resources Core Lab voor hun hulp met betrekking tot het onderhoud en de infrastructuur van het aquarium. De studie werd gefinancierd door KAUST-subsidienummer BAS/1/1095-01-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5560 Conductivity/Temperature Probe | YSI | 5560 | Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter |
| Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers | Ace Hardware | 2004083 | Used to cut coral fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | Used in DMEM medium. |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41965-039 | Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method |
| Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene | Thermo Fisher Scientific | FB0875713A | Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium. |
| Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt | Schego | 548 | Heaters used in aquarium |
| Leica Application Suite Version 4.2 | Leica Microsystems | NA | Software used for image capture in demonstrative results |
| Leica IC80 HD | Leica Microsystems | 12730216 | Camera used to take demonstrative results pictures |
| Leica MDG33 | Leica Microsystems | 10 450 123 | Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures |
| Leica Z6 APO | Leica Microsystems | NA | Macroscope used to take demonstrative results pictures |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific | 7487-88-9 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | HV-77602-10 | Peristaltic pump head. |
| Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller | Masterflex | EW-07557-00 | Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol. |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft | Masterflex | HV-96410-16 | Tubing for peristaltic pump. |
| Millex 33 mm PVDF 0.22 µm Sterile RUO | Sigma-Aldrich | SLGVR33RS | Used to filter artificial sea water. |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 156499 | Flask usually used for cell culture used for polyp culture. |
| Orbital shaker, Advanced 5000, VWR | VWR | 444-2916 | Shaker used inside incubator. |
| Percival Incubator - I-22VL | Percival | NA | Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks. |
| Plankton net 200 µm mesh size | KC Denmark | NA | Used for covering petri dishes containing coral polyps. |
| Potassium Chloride | VWR Chemicals | 7447-40-7 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| ProQuatro Multiparameter Meter | YSI | 606950 | Used for measuring salinity thoughout the protocol |
| RADION XR15 G5 PRO | Ecotech | NA | Lights used in aquarium |
| Red Sea Salt Premium grade, moderate Alkalinity |
Red Sea | NA | Used to prepare 40 PSU artifical sea water. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Sodium Sulfate Anhydrous | VWR Chemicals | 7757-82-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| TRD 112 thermostat | Schego | NA | Thermostat used in aquarium |
| Turbelle Nanostream 6025 | Tunze | 6025 000 | Pumps used in aquarium |
References
- Goffredo, S., Dubinsky, Z. The Cnidaria, Past, Present and Future: The World of Medusa and her Sisters. , Springer. (2016).
- Knowlton, N., et al. Rebuilding coral reefs: a decadal grand challenge. International Coral Reef Society and Future Earth Coasts. , 56 (2021).
- Brown, B. Coral bleaching: causes and consequences. Coral Reefs. 16 (1), 129-138 (1997).
- Douglas, A.
- Nielsen, D. A., Petrou, K., Gates, R. D. Coral bleaching from a single cell perspective. The ISME Journal. 12 (6), 1558-1567 (2018).
- Oakley, C. A., Davy, S. K. Coral Bleaching: Patterns, Processes, Causes and Consequences. Coral Bleaching Book. , Springer. 189-211 (2018).
- Donner, S. D., Heron, S. F., Skirving, W. J. Future scenarios: a review of modelling efforts to predict the future of coral reefs in an era of climate change. Coral Bleaching. , 159-173 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O. Climate change, coral bleaching and the future of the world's coral reefs. Marine and Freshwater Research. 50 (8), 839-866 (1999).
- Hughes, T. P., et al. Global warming impairs stock-recruitment dynamics of corals. Nature. 568 (7752), 387-390 (2019).
- Moore, J. A., et al. Unprecedented mass bleaching and loss of coral across 12 of latitude in Western Australia in 2010-11. PLoS One. 7 (12), 51807 (2012).
- Duarte, G. A., et al. Heat waves are a major threat to turbid coral reefs in Brazil. Frontiers in Marine Science. 7, 179 (2020).
- Santoro, E. P., et al. Coral microbiome manipulation elicits metabolic and genetic restructuring to mitigate heat stress and evade mortality. Science Advances. 7 (33), (2021).
- Voolstra, C. R., et al. Extending the natural adaptive capacity of coral holobionts. Nature Reviews Earth & Environment. 2 (11), 747-762 (2021).
- Debergh, P. C., Read, P. E. Micropropagation. 1, Kluwer Academic Publishers. 1-13 (1991).
- Nitish, K., Reddy, M. P. In vitro plant propagation: a review. Journal of Forest and Environmental Science. 27 (2), 61-72 (2011).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 354 (4), 1095-1100 (2007).
- Yao, T., Asayama, Y. Animal-cell culture media: history, characteristics, and current issues. Reproductive Medicine and Biology. 16 (2), 99-117 (2017).
- Merten, O. W. Introduction to animal cell culture technology-past, present and future. Cytotechnology. 50 (1-3), 1 (2006).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. P. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Goldstein, B., King, N. The future of cell biology: emerging model organisms. Trends in Cell Biology. 26 (11), 818-824 (2016).
- Lecointe, A., et al. Scleractinian coral cell proliferation is reduced in primary culture of suspended multicellular aggregates compared to polyps. Cytotechnology. 65 (5), 705-724 (2013).
- Nowotny, J. D., Connelly, M. T., Traylor-Knowles, N. Novel methods to establish whole-body primary cell cultures for the cnidarians Nematostella vectensis and Pocillopora damicornis. Scientific Reports. 11 (1), 1-9 (2021).
- Kawamura, K., Nishitsuji, K., Shoguchi, E., Fujiwara, S., Satoh, N. Establishing sustainable cell lines of a coral, Acropora tenuis. Marine Biotechnology. 23, 373-388 (2021).
- Pang, A. -P., Luo, Y., He, C., Lu, Z., Lu, X. A polyp-on-chip for coral long-term culture. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
- Shapiro, O. H., Kramarsky-Winter, E., Gavish, A. R., Stocker, R., Vardi, A. A coral-on-a-chip microfluidic platform enabling live-imaging microscopy of reef-building corals. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Tambutté, S., et al. Coral biomineralization: From the gene to the environment. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 408 (1-2), 58-78 (2011).
- Chuang, P. -S., Mitarai, S. Signaling pathways in the coral polyp bail-out response. Coral Reefs. 39 (6), 1535-1548 (2020).
- Schweinsberg, M., Gösser, F., Tollrian, R. The history, biological relevance, and potential applications for polyp bail-out in corals. Ecology and Evolution. 11 (13), 8424-8440 (2021).
- Rakka, M., et al. First description of polyp bail-out in cold-water octocorals under aquaria maintenance. Coral Reefs. 38 (1), 15-20 (2019).
- Wells, C. D., Tonra, K. J. Polyp bail-out and reattachment of the abundant Caribbean octocoral Eunicea flexuosa. Coral Reefs. 40 (1), 27-30 (2021).
- Coppari, M., et al. Unveiling asexual reproductive traits in black corals: polyp bail-out in Antipathella subpinnata. Coral Reefs. 39 (6), 1517-1523 (2020).
- Chuang, P. S., Ishikawa, K., Mitarai, S. Morphological and genetic recovery of coral polyps after bail-out. Frontiers in Marine Science. 8, 280 (2021).
- Serrano, E., Coma, R., Inostroza, K., Serrano, O. Polyp bail-out by the coral Astroides calycularis (Scleractinia, Dendrophylliidae). Marine Biodiversity. 48 (3), 1661-1665 (2018).
- Kopecky, E. J., Ostrander, G. K. Isolation and primary culture of viable multicellular endothelial isolates from hard corals. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 35 (10), 616-624 (1999).
- Kvitt, H., et al. Breakdown of coral colonial form under reduced pH conditions is initiated in polyps and mediated through apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (7), 2082-2086 (2015).
- Gösser, F., Raulf, A., Mosig, A., Tollrian, R., Schweinsberg, M. Signaling pathways of heat-and hypersalinity-induced polyp bail-out in Pocillopora acuta. Coral Reefs. 40 (6), 1713-1728 (2021).
- Fordyce, A. J., Camp, E. F., Ainsworth, T. D. Polyp bail-out in Pocillopora damicornis following thermal stress. F1000Research. 6, 687 (2017).
- Wecker, P., et al. Exposure to the environmentally-persistent insecticide chlordecone induces detoxification genes and causes polyp bail-out in the coral P. Damicornis. Chemosphere. 195, 190-200 (2018).
- Schmidt-Roach, S., Miller, K. J., Lundgren, P., Andreakis, N. With eyes wide open: a revision of species within and closely related to the Pocillopora damicornis species complex (Scleractinia; Pocilloporidae) using morphology and genetics. Zoological Journal of the Linnean Society. 170 (1), 1-33 (2014).
- Gélin, P., Postaire, B., Fauvelot, C., Magalon, H. Reevaluating species number, distribution and endemism of the coral genus Pocillopora Lamarck, 1816 using species delimitation methods and microsatellites. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 430-446 (2017).
- Capel, K. C. C., Migotto, A., Zilberberg, C., Kitahara, M. V. Another tool towards invasion? Polyp "bail-out" in Tubastraea coccinea. Coral Reefs. 33 (4), 1165 (2014).
- Kawaguti, S. Materials for the study of reef-building corals III. Science of the South Sea (Kagaku Nanyo). 5, 95-106 (1942).
- Goreau, T. F., Goreau, N. I. The physiology of skeleton formation in corals. II. Calcium deposition by hermatypic corals under various conditions in the reef. Biological Bulletin. 117, 239-250 (1959).
- Swain, T. D., et al. Physiological integration of coral colonies is correlated with bleaching resistance. Marine Ecology Progress Series. 586, 1-10 (2018).
- Sweet, M., et al. Insights into the cultured bacterial fraction of corals. mSystems. 6 (3), 01249 (2020).
- Peixoto, R. S., Rosado, P. M., Leite, D. C. dA., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial microorganisms for corals (BMC): proposed mechanisms for coral health and resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341 (2017).
- Peixoto, R. S., et al. Coral probiotics: premise, promise, prospects. Annual Review of Animal Biosciences. 9, 265-288 (2021).
