Summary
Polyp bail-out er en prosess indusert av akutt stress, der korallpolypper fordøyer vevet som forbinder dem til kolonien og løsner fra det for å leve som individer. Den nåværende protokollen beskriver hvordan man induserer korallmikropropagasjon ved kausjon ved hjelp av hypersalin- eller kalsiumfrie sjøvannsbehandlinger.
Abstract
Koraller er koloniale dyr dannet av modulære enheter kalt polypper. Korallpolypper er fysiologisk forbundet og forbundet med vev. Fenomenet polyp bail-out er en prosess indusert av akutt stress, der korallpolypper fordøyer vevet som forbinder dem til resten av kolonien og til slutt løsner fra skjelettet for å fortsette å leve som separate individer. Korallbiologer har anerkjent prosessen med polyp bail-out i årevis, men først nylig har mikropropagatene generert av denne prosessen blitt anerkjent som et modellsystem for korallbiologistudier. Bruken av polyp bail-out kan skape et høyt antall kloniske enheter fra et enkelt korallfragment. En annen fordel er at enkle polypper eller flekker av polypper lett kan visualiseres under et mikroskop og vedlikeholdes i svært standardiserte lavprismiljøer som Petri-retter, kolber og mikrofluidiske sjetonger. Den nåværende protokollen demonstrerer reproduserbare metoder som er i stand til å indusere korallmikropropagasjon og forskjellige tilnærminger for å opprettholde de enkle polyppene levende på lang sikt. Denne metoden var i stand til å dyrke polypper av korallartene Pocillopora verrucosa i opptil 8 uker etter kausjon, og viste praktisk bruk av individuelle korallpolypper for korallforskning.
Introduction
Scleractinian eller revbyggende koraller er cnidarians som er i stand til å danne karbonat skjeletter, skape rev og strukturelt komplekse økosystemer som kan bli funnet fra dype til grunne vannmiljøer1. Tropiske korallrev er vertskap for høyt biologisk mangfold og tilbyr viktige økosystemtjenester, for eksempel kystvern og fiskerivedlikehold2. De fleste grunne vannrevbyggende koraller er avhengige av et gjensidig forhold til alger av familien Symbiodiniaceae, som gir den energien som koraller krever for å bygge skjelettene sine. Symbiosen mellom korallene og alger kan brytes av miljøstress, noe som forårsaker korallbleking 3,4,5,6. Nylige temperaturavvik har forårsaket store korallbleking hendelser rundt om i verden, noe som fører til masse korall dødelighet og permanent rev nedbrytning 7,8,9,10,11. Siden dette fenomenet er basert på utvisning av symbionter ved postvarmestressrelaterte cellulære mekanismer, som apoptose, autofagi og eksocytose, kan korallbleking beskrives som en cellulær prosess som har økosystemskala konsekvenser 5,6,12, noe som betyr at det å ha in vitrokulturer av korallceller eller vev vil være aktuelt for å studere dette fenomenet nøye.
På grunn av betydningen av korallrev og de store truslene de har stått overfor, spesielt de siste to tiårene2, har koraller blitt fokus for forskning for beskyttelses- og restaureringsformål over hele verden13. Utviklingen av tilnærminger og eksperimentelle systemer som er pålitelige, reproduserbare og gir minimal miljøpåvirkning for å studere koraller, er imidlertid en stor kamp på dette feltet.
Mikropropagasjon er definert som in vitroproliferasjon av en organismens genotype ved å dyrke sitt biologiske materiale i kontrollerte fartøy14,15. Dyrking av celler, vev og organer har vært avgjørende for plante- og dyrebiologi de siste tiårene. Det tillater massereproduksjon av organismer i laboratorier, rask vurdering av forskjellige behandlinger (som legemidler og legemidler), og direkte studie av cellefunksjon 14,15,16,17. Generelt har in vitro-modeller vært nyttige for å utfylle og utdype studiene av forskjellige organismer under bedre kontrollerte fysiske og kjemiske forhold. På grunn av fordelene med in vitro culturing teknikker, har ulike dyrecelle- og vevskulturteknologier blitt utviklet, optimalisert og brukt som viktige verktøy på mange forskningsfelt, hvor flere cellelinjer har blitt studert og kommersialisert for mange applikasjoner 16,17,18.
Mange fremskritt i kunnskapen om celle- og vevskultur har blitt gjort siden den første dyrevevskulturen i 188217, for eksempel bruk av naturlige og syntetiske medier, oppfinnelsen av etablerte cellelinjer og utviklingen av 3D-medier for å dyrke en rekke celletyper på en bedre måte16,17, 18,19. Imidlertid har feltet cellebiologi for det meste fokusert på en utvalgt gruppe modellorganismer, mens mange taxa fortsatt ikke har veletablerte in vitrokulturer av celler, vev eller organer20. For eksempel, i korallforskning, har ingen udødelige cellelinjer blitt mye brukt til forskning, noe som begrenser korallcelleforskning til bruk av primærcellekulturer. Disse kulturene har levedyktighet begrenset til noen uker21, uten studier som registrerer overlevelsen til individuelle celler fra alle korallvev i mer enn 13 dager til begynnelsen av 202122. Den første rapporten om bærekraftige korallcellelinjer som ble publisert var med Acropora tenuis celler som levde opptil 6 måneder, og nytten av disse cellene for fremtidig forskning gjenstår å utforske23.
For å overvinne begrensningene i å dyrke korallcellekulturer og opprettholde en laboratoriekultur som bevarer den generelle vevsorganisasjonen av koraller, har bruken av isolerte polypper nylig blitt foreslått som modell for korallbiologiforskning 24,25. Polypper er de anatomiske enhetene av koraller, og hver av dem har en munn som ligger i midten av deres orale disk og er koblet til andre polypper av coenosarc i sin aboral region26. Separasjonen av levende polypper skjer naturlig ved prosessen med polyp bail-out, der akutt stress forårsaker fordøyelsen av coenosarc mellom polyppene, som deretter kan løsne fra koloniens skjelett 25,27,28. Dette fenomenet har blitt rapportert å forekomme i en rekke taxa, inkludert oktokraler29,30,31, svarte koraller32, og scleractinian koraller 25,27,28,32,33, og har vært knyttet til flere miljøstressorer, for eksempel mangel på kalsium i vann 24,34, økt surhet 35, hyperosmotiske forhold 25,27,32,36, høye temperaturer36,37, sult33, lufteksponering25,30 og insektmiddelforurensning28,38. Polyp bail-out har for eksempel blitt rapportert i pocilloporid koraller19, som er utbredt over hele verden og ofte brukes som modeller i korallforskning. Arter som tilhører denne gruppen, som Pocillopora damicornis og Styllophora pistillata, har generert omtrent 30-40 mikropropagater fra et 5 mm fragment25. Dette tallet understreker fordelen med å bruke polyp bail-out som en metode for korallmikropropagasjon, da det skaper muligheten for å generere mange genetisk identiske individer fra et lite stykke koraller. Bruken av isolerte polypper til forskning har også de samme fordelene som cellekulturer når det gjelder muligheten for å bli dyrket i kontrollerte laboratoriemiljøer, som kolber og Petri-retter. I tillegg har mikrofluidiske plattformer for å opprettholde levende polypper vist at disse mikropropagatene kan holdes i relativt billige og enkle å reprodusere miljøer, med kontrollert vannstrøm, overflate og temperatur24,25. Disse mikrofluidiske plattformene kan også brukes til å visualisere levende korallstrukturer under et mikroskop direkte 24,25.
I den nåværende artikkelen oppsummerer og demonstrerer vi teknikkene som er utviklet for å isolere individuelle korallpolypper fra koloniene sine, og viser hvordan du opprettholder dem i laboratorieforhold for langsiktig kultur. Metodene som diskuteres inkluderer polyp bail-out gjennom hyperosmotiske forhold ved fordampning og pumping av sjøvann med høy saltholdighet og inkubasjon i kalsiumfritt sjøvann.
Protocol
For den nåværende studien ble en koloni tilhørende Pocillopora verrucosa korallarter samlet inn fra Al Fahal-revet (22.305118 N; 38.964568 E) av SCUBA ved dykking ved hjelp av en hammer og meisel. Koloniens slekt ble identifisert morfologisk, og arten ble klassifisert som P. verrucosa basert på tidligere publisert arbeid, inkludert Pocillopora fra Rødehavet, noe som indikerer at arten som er tilstede i dette området er P. verrucosa39,40 fra et genetisk synspunkt. Al Fahal rev er ikke en del av et beskyttet miljøområde, og det var ikke behov for spesielle tillatelser for korallinnsamling. Kolonien ble holdt i et 300 L akvarium i en måned før den ble fragmentert og fikk polyppene "bailed-out". Akvariet ble holdt ved 26 °C med to akvarievarmere, tre pumper og to lyskilder (se Materialbord), og opprettholder en 12 timers lyssyklus. Temperaturen på akvariet ble opprettholdt ved å koble hver av de to varmeovnene til en temperaturregulator. Lysutslippet ble programmert til å starte klokken 06.00 og avsluttes kl. 18.00, og produserte en bestrålingskurve som toppet seg kl. 12.00 med 230 μmol fotoner m−2s−1.
1. Polyp bail-out av høy saltholdighet etter vannfordampning
MERK: Denne metoden ble tilpasset fra Shapiro et al.25. Hvis du bruker andre arter enn Pocillopora verrucosa, bør størrelsen på polyppene tas i betraktning før du bestemmer størrelsen på fragmentet som skal kuttes.
- Klipp små fragmenter (mindre enn 1 cm i lengde) fra en korallkoloni ved hjelp av diagonale skjæretangen (se Materialtabell).
MERK: Tilpass skjæreverktøyene i henhold til korallartene som brukes. Diagonal tang er nyttige for å kutte koraller med slanke grener. I den nåværende studien ble ett fragment kuttet for hver behandling, men antall og størrelse på fragmenter kan variere avhengig av antall polypper ønsket. Størrelsen på kuttfragmentene må ikke overstige dybden på vannet etter fordampning, slik at korallene forblir helt inne i vannet etter at prosessen er ferdig. - Legg de kuttede fragmentene i små Petri-retter fylt med 12 ml sjøvann som korallkolonien er akklimatiserte til. Dette kan være kunstig sjøvann (se Materialfortegnelse) eller filtrert sjøvann i samme saltholdighet som korallkolonien ble satt inn i før fragmentering.
MERK: Det er viktig å dekke fragmentet helt med vann. Hvis 12 ml i en Petri-tallerken ikke er nok til å dekke kuttfragmentet, optimalisere beholderen og volumet tilsvarende. I den nåværende studien ble vannet som ble brukt samlet inn fra Rødehavet, og saltholdigheten var 40 PSU, målt ved en multiparametermåler (se Materialfortegnelse). - La platen stå åpen i ca. 24 timer ved omgivelsestemperatur, slik at vannet kan fordampe og saltholdigheten gradvis kan øke. Når vevsfordøyelse er observerbar mellom polypper, fortsett til trinn 1.4.
MERK: Etter at inkubasjonstiden har gått, må saltholdigheten i vannet være ca. 40% høyere enn i begynnelsen, og polyppene må være klare til å løsnes fra skjelettet. - Bruk en 1 ml overføringspipette, skape en mild strøm nær korallvevet. Strømmen vil sakte hjelpe fullstendig løsrivelse av polypper som allerede har fordøyd vevet rundt dem fra skjelettet.
MERK: Når vannstrømmen er opprettet med pipetten, må separate polypper eller grupper av polypper komme av skjelettet som flak. Hvis et overskyet stoff kommer av i stedet, indikerer det vevsdød eller oppløsning, noe som betyr at korallene ble inkubert for lenge eller i en for stressende tilstand (i dette tilfellet høy saltholdighet). Det er svært viktig å lage en mild strøm av vann for å løsne polyppene, da en sterkere strømning kan forårsake fysisk skade på dem. - Bytt vannet langsomt i Petri-fatet med isosmotisk vann (bruk samme vann som i trinn 1.2.) ved hjelp av en pipette. En 50% vannutveksling over 10 min er nok til å akklimatisere polyppene tilbake til en ikke-stressende saltholdighetstilstand.
MERK: Ettersom korallkolonier av pocilloporid-arten Pocillopora verrucosa fra Rødehavet ble brukt, ble det utført tester for å bestemme under hvilke spesifikke forhold korallene fra dette unike miljøet ville kausjonere ut. Det er viktig å synliggjøre rødehavets høye saltholdighet sammenlignet med de fleste andre revmiljøer.
2. Polyp bail-out av høy saltholdighet sjøvann forsyning
MERK: Denne metoden ble tilpasset fra Chuang et al.27.
- Forbered 3 L sjøvann med høy saltholdighet ved å legge NaCl til sjøvann til saltholdigheten øker med 85%, målt ved en saltholdighetssonde.
MERK: I den nåværende studien ble det utarbeidet et 74 PSU sjøvann med høy saltholdighet fra 40 PSU sjøvann fra Rødehavet. - Klipp små fragmenter av koraller som beskrevet i trinn 1.1.
- Plasser de kuttede fragmentene i en 10 L beholder fylt med 3 L isosmotisk sjøvann (i dette tilfellet sjøvann med ikke-stressende saltholdighet for korallene, det samme som brukes i trinn 1.2) koblet til en peristaltisk pumpe (se Materialtabell).
MERK: For bedre vedlikehold av korallhelsen kan temperaturregulatorer, luftpumper og lys legges til for å simulere de samme akvarieforholdene som kolonien tidligere var utsatt for. Under inkubasjonen i det nåværende arbeidet ble korallfragmentene holdt i beholdere ved 26 °C, under en 12 timers daglig lyssyklus. Vannbevegelsen og homogeniseringen av temperaturen ble opprettholdt av luftpumper. - Fyll beholderen som inneholder korallfragmenter med sjøvannet med høy saltholdighet tilberedt i trinn 2.1 ved hjelp av den peristaltiske pumpen i 24 timer med en hastighet på 126 ml/t. Tilsett totalt 3 L vann med en økende saltholdighet på ca. 40%.
MERK: Vann med høy saltholdighet kan produseres ganske enkelt ved å tilsette NaCl i sjøvann til det når den tiltenkte saltholdigheten. - Lag en mild vannstrøm med en pipette for å frigjøre polyppene fra skjelettet (trinn 1.4.).
- Bytt sakte ut vannet der polyppene er inneholdt for isosmotisk vann (trinn 1.5.). Deretter går du videre til trinn 4 eller trinn 5.
3. Polyp bail-out ved kalsiumfri sjøvann inkubasjon
MERK: Denne metoden ble tilpasset fra Pang et al.24.
- Forbered kalsiumfri kunstig sjøvannsløsning (CaFSW) ved å tilsette 26,29 g NaCl, 0,872 g KCl, 2,16 g MgSO4, 11,94 g MgCl2, 3,42 g Na2SO4 og 0,286 g NaHCO3 (se materialtabell) til 1 liter deionisert vann.
MERK: Denne løsningen ble justert fra tidligere protokoller for å være bedre egnet for koraller tilpasset en saltholdighet på 40 PSU. For koraller tilpasset andre saltholdighetsforhold, bruk samme andel salter, men juster den totale massen av solutes for å oppnå saltholdigheten som er bedre egnet til korallene som er i bruk. - Klipp små fragmenter av koraller som beskrevet i trinn 1.1.
- Senk korallfragmentene i Petri-retter fylt med CaFSW tilberedt tidligere (trinn 3.1.) og inkuber dem i orbitale inkubatorer med en rotasjonshastighet på 80 rpm i 3 timer.
MERK: Igjen er det viktig å dekke fragmentet helt med vann. Hvis en Petri-tallerken ikke er nok til å dekke fragmentet, optimaliserer du beholderen og volumet i henhold til det eksperimentelle behovet. - Overfør fragmentene til Petri-retter eller 6-brønnsplater fylt med 20% Dulbeccos Modified Eagle Media (DMEM) og 100 mg/ml ampicillin-oppløsning (se Materialbord) tilberedt med 40 PSU kunstig sjøvann. Inkuber fragmentene ved 26 °C og 80 o/min, og utveksle media hver dag til vevsfordøyelsen er observerbar mellom polyppene og individuelle polypper begynner å løsne fra skjelettet.
MERK: I de fleste tilfeller er vevs fordøyelsen fullført innen 20 timer etter inkubasjon i dette mediet, og ingen utveksling er nødvendig. - Overfør polyppene til sterilisert sjøvann for første gjenvinning ved hjelp av en pipette. Etter 1 t inkubasjon, fortsett til trinn 4 eller trinn 5.
4. Polyp vedlikehold i Petri retter
- Når polyppene er returnert til filtrert sjøvann med ikke-stressende saltholdighet, velg levedyktige polypper ved å observere vevsintegritet og bevegelse forårsaket av ciliary strømning under et stereomikroskop.
- Legg de valgte polyppene i en petriskål av glass eller plast og dekk Petri-parabolen med et planktonnett (200 μm maskestørrelse, se Materialbord) slik at polyppene ikke flyter bort fra parabolen.
MERK: Størrelsen på nettnettet kan variere avhengig av størrelsen på polyppene. Det er viktig å merke seg at garnene må ha porer som er mindre enn polyppene og tillate vannutveksling og lett penetrasjon. - Plasser Petri-parabolen inne i et akvarium med de riktige forholdene for korallartene som brukes.
MERK: I denne studien var forholdene 40 PSU filtrert sjøvann ved 26 °C og en lyssyklus på 12 timer. - Åpne Petri-rettene minst en gang i uken for å fornye vannet og rengjøre oppvasken. Dette trinnet er viktig for å eliminere algerovervekst som kan konkurrere med eller skade korallpolyppene ved å frigjøre giftige forbindelser lokalt.
5. Polyp vedlikehold i inkubatorer
- Velg levedyktige polypper som beskrevet i trinn 4.1.
- Legg polyppene i 75 cm2 overflatecelleflasker fylt med 50 ml isosmotisk sjøvann ved hjelp av overføringspipetter.
MERK: I dagens arbeid ble filtrert sjøvann samlet inn fra Rødehavet brukt til polypvedlikehold. Vann med samme egenskaper som den som brukes i trinn 1.2 kan brukes. - Lukk kolbeene og flytt dem til inkubatorer. Sett inkubatorene til 12 timers lyssykluser ved 26 °C og 40 o/min. Bytt ut 50% av vannvolumet hver fjerde dag og overfør innholdet til rene kolber når / hvis de blir fulle av alger eller biofilm på veggene.
MERK: Bildene ble tatt med et fullt apochromatisk zoomsystem utstyrt med et HD-kamera (se Materialfortegnelser) for de representative resultatene.
Representative Results
Polyp bail-out ble indusert i korallfragmenter som tilhører en enkelt koloni av arten P. verrucosa etter tre forskjellige metoder (figur 1). Bail-out indusert av høy saltholdighet etter vannfordampning var fullført etter 24 timers inkubasjon av korallfragmenter i Petri-retter ved omgivelsestemperatur fylt med vann i utgangspunktet ved 40 PSU, som deretter nådde en endelig saltholdighet på 59 PSU når prosessen var over (Figur 2A-C, I). Bail-out av saltvannsforsyning ble også nådd etter 24 timers inkubasjon i vann i utgangspunktet ved 40 PSU som nådde en saltholdighet på 52 PSU etter 12 timer og 59 STRØMFORSYNING ved slutten av prosessen, etter 24 timer (Figur 2D-F,I). I begge forsøkene var en økning i saltholdighet ansvarlig for induksjon av vevsfordøyelse av polyppene. Etter 12 timer forårsaket den høye saltholdighetstilstanden sammentrekningen av polyppene i forbindelse med gradvis tynning av coenosarc, noe som til slutt forårsaket den endelige løsningen av polyppene etter 24 timer. Bail-out induksjonen gjennom inkubasjon i kalsiumfritt sjøvann var fullført etter en 3h inkubasjon i CaFSW etterfulgt av en 20h inkubasjon i 20% DMEM media (Figur 2G-H). Vevet ble løsnet fra skjelettet i alle tre metodene etter å ha presset det bort med en pipette til individualiserte korallpolypper (figur 3A-C) og "vevskuler" ble generert.
Etter løsningen ble polyppene fra alle tre metodene samlet og tillatt å gjenopprette i sjøvann før de ble tildelt Petri-retter dekket med garn eller celleflasker. Polyppene hentet fra fordampning og vannforsyningsmetodene ble opprettholdt i Petri-retter inne i akvarier og overlevde i henholdsvis 6 uker og 8 uker (figur 3D og figur 3F). Disse mikropropagatene beholdt den vanlige anatomien til polypper, og presenterte tentakler, basale disker og munn1. Polyppene oppnådd gjennom inkubasjonen i kalsiumfritt sjøvann hadde kort levetid, og overlevde opptil 1 dag, hvoretter vevet deres dissosierte. Polypper hentet fra sjøvannsfordampningsmetoden holdt i cellekulturflasker inne i inkubatorer overlevde i opptil 3 uker uten dissosiasjon av vev (figur 3F). I alle tilfeller, selv om polyppene ikke kunne feste seg til substratet, var de visuelt sunne og opprettholdt fargen, med zooxanthellae-celler som fortsatt var synlige inne i vevet1.
Figur 1: Skjematisk representasjon av de tre forskjellige testede metodene for polyp bail-out induksjon (venstre) etterfulgt av illustrasjonen av to metoder for å opprettholde de oppkjøpte polyppene under laboratorieforhold (høyre). (høyre). (A) Representasjon av metodikken for polyp bail-out ved vannfordampning. (B) Representasjon av metodikken for polyp bail-out av høy saltholdighet sjøvann forsyning. (C) Representasjon av metodikken for polyp bail-out ved kalsiumfri sjøvann inkubasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bilder av polyp bail-out prosessen indusert av tre forskjellige metoder ved hjelp av fragmenter av korallarter P. verrucosa. (A-C) Et korallfragment ved henholdsvis 0 timer, 12 timer og 24 timer etter inkubasjon i en Petri-tallerken ved hjelp av vannfordampningsmetoden. (D-F) Et korallfragment ved henholdsvis 0 t, 12 timer og 24 timer etter inkubasjon, ved hjelp av den høye saltholdige sjøvannsforsyningsmetoden. (G,H) Korallfragmenter utsatt for den kalsiumfrie sjøvannsinkuberingsmetoden før og etter henholdsvis. Inkubasjonene i kalsiumfritt kunstig sjøvann var i 3 timer og i 20% DMEM i 21 timer (I) Grafisk representasjon av saltholdighetsverdiene i sjøvannsenheten over tid under vannfordampning og høy saltholdighet sjøvann leverer bail-out induksjonsmetoder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bilder av P. verrucosa-polypper hentet fra de tre demonstrerte bail-out induksjonsprosedyrene. (A-C) Bildene av polyppene hentet fra henholdsvis fordampning, saltvannsforsyning og kalsiumfrie sjøvannsmetoder ble fanget umiddelbart etter at de ble løsnet fra skjelettet. (D) Bildet av en korallpolypp hentet fra fordampningsmetoden etter å ha overlevd 6 uker i en Petri-tallerken. (E) Bildet av en korallpolypp hentet fra saltvannsforsyningsmetoden etter å ha overlevd 8 uker i en Petri-tallerken. (F) Bildet av en korallpolypp hentet fra fordampningsmetoden etter å ha overlevd 3 uker i en cellekulturflaske. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Polyppenes overlevelsesrate etter å ha blitt sendt til kausjonsprosesser og tiden som trengs for at prosessen skal fullføres varierer mellom tidligere rapportert forskning 25,33,41, noe som muligens forklares av de forskjellige eksperimentelle tilnærmingene som brukes i hver studie. For eksempel presenterer forskjellige korallarter, eller til og med koraller fra samme art, men akklimatiserte til forskjellige miljøforhold (f.eks. koraller fra Rødehavet), forskjellige terskler til saltholdighetsnivåer. Metoden for bail-out valgt og laboratorie - / akvarieforholdene spiller også viktige roller i resultatene. I noen tilfeller har vedlikehold av korallmikropropagater under laboratorieforhold overgått overlevelsestiden til korallcellekulturer ved å nå måneder med overlevelse i azooxanthellate3 3,41 og zooxanthellate25 koraller. Tiden for at kausjonsprosessen for polyp skal være fullført har også variert i forskjellige studier, alt fra noen timer2 5,2 7,30 til uke35 av inkubasjon utsatt for stressoren som er ansvarlig for å forårsake kausjon. En annen variabel som må tas i betraktning når du studerer polyp bail-out er utvinning av polypper etter eksponering for akutt stress som utløste utgivelsen. Det er fortsatt diskutabelt hvis polypper etter kausjon er i god nok stand til å brukes som modeller for å studere korallbiologi. Gjenoppretting av vevet etter nedbrytningen av coenosarc er et spørsmål om bekymring når du bruker disse mikropropagatene. Imidlertid har polypper i mange studier, inkludert nåtiden, vært i stand til å presentere zooxanthellae celler inne i vevet og eksterne morfologier med intakt oral-aboral polarisering og tentakler uker etter kausjonut 25,27,32,36. Tidligere studier har også funnet ut at etter å ha blitt lettet fra akutt stress, har frigjort korallpolypper utsatt for svært saltvann eller oppvarmet sjøvann vært i stand til å gjenopprette uttrykket av gener relatert til prosesser som apoptose, proteolyse og celledeling til nivåer som ligner de som ble funnet før kausjon32,36 og til og med for å øke uttrykket av gener relatert til vevsheling36.
Når det gjelder forskjellen i overlevelse mellom metoder, er det viktig å markere at denne gangen kan variere mellom forskjellige eksperimenter selv om de samme teknikkene brukes, og det kan være relatert til helsen til fragmentene som brukes og riktig vedlikehold av polyppene etter kausjonsprosessen. I tilfelle av bail-out gjennom kalsiumfri sjøvann inkubasjon, polyp overlevelse var begrenset til 1 dag. Dermed kan det konkluderes med at metoden ikke er godt egnet for artens langsiktige overlevelse, eller en bedre tilpasning av teknikken for P. verrucosa koraller fra Rødehavet må gjøres. De rapporterte resultatene viste at en lengre overlevelsestid ble oppnådd med metodene basert på den gradvise økningen i saltholdighet, da polyppene ble utsatt for drypping av vann med høy saltholdighet. Denne metoden kan gi en mer kontrollert økning i saltholdighet enn fordampningsmetoden, samtidig som den ikke er ansvarlig for en økning i konsentrasjonen av andre stoffer som finnes i sjøvannet, inkludert korallens metabolske avfall, som potensielt er giftig for organismen. Av alle disse grunnene har denne metoden blitt foreslått som et tryggere alternativ for å opprettholde sunne polypper27. Selv om denne metoden har blitt hypoteset om å være tryggere for polypphelse og i stand til å produsere polypper som lever lenger, et faktum som ble bekreftet i denne nåværende publikasjonen, er det nødvendig med ytterligere undersøkelser for å bekrefte det. Begge de høy saltholdighetsinduserte kausjonsforsøkene viste en fullstendig løsrivelse av polypper etter at saltholdigheten nådde 59 strømforsyningsenhet i 24 timer. Hvis saltholdighet økes forbi nivået der bail-out er fullført, vil ytterligere stress bli forårsaket av polyppene, noe som reduserer sjansen for å overleve og gjenopprette fra akutt stressbehandling. Derfor anbefales det ikke å opprettholde polyppene lenger i slike saltholdighetsnivåer. Når du utfører bail-out induksjonsmetoden ved eksponering for kalsiumfritt sjøvann, ble det oppnådd en fullstendig løsrivelse fra en 3 h inkubasjon i kalsiumfritt kunstig sjøvann, noe som betyr at ytterligere eksponering for dette mediet heller ikke anbefales.
For å adressere metodene som var mer tilstrekkelige for studiet av korallpolypper i laboratorie- / in vitro-undersøkelser , fokuserte denne studien bare på tre prosedyrer som tok nær 24 timer for at kausjonsprosessen skulle være fullført og ble brukt i studier som involverte langsiktig vedlikehold av korallpolypper fra scleractinian koraller. Andre metoder rapportert å ta betydelig lengre tid enn denne gangen var ikke engasjert. Oppgjør av polypper til et substrat ble ikke forsøkt i denne studien, som fokuserte på å produsere polypper som kunne overføres til forskjellige miljøer eller lett samles inn for analyser ved hjelp av engangspipetter. Resultatene viser at polypper fra korallartene P. verrucosa ble holdt i live, med tilhørende zooxanthellae-celler, sunn visuell status og en bevart brutto ekstern anatomisk struktur, i opptil 8 uker, selv uten vedlegg til et substrat. Disse resultatene indikerer at mer biologiske replikeringer kan genereres fra enkeltkorallfragmenter ved hjelp av noen av teknikkene som er demonstrert i denne studien. Slike biologiske replikeringer kan holdes i kontrollerte miljøer (som Petri-retter og celleflasker) og vedlikeholdes i laboratorieforhold for månedslange eksperimenter og brukes til flere formål.
Siden de første tilfeldige beskrivelsene av polyp bail-out 42,43, nye protokoller har blitt etablert for å finne mer standardiserte metoder for å indusere polyp utgivelse og opprettholde slike polypper i live, som kan brukes til fremtidige forskningsapplikasjoner. Disse inkluderer å undersøke forskjellige aspekter knyttet til korall holobiont fysiologi44 og host-mikrobiome interaksjoner45, molekylære mekanismer involvert i korallbleking 5,25, og helse, motstandskraft og beskyttelse av korall holobiont 12,13,46,47 . Videre kan utgitte korallpolypper brukes til applikasjoner utenfor forskningsområdet og har blitt foreslått å være nyttige for å lage propaguler som kan festes til et substrat og vokse, og potensielt skape flere korallpersoner som kan brukes til restaureringsformål når standardiserte protokoller for bail-out blir utbredt28 . Totalt sett, selv om mer dyptgående eksperimenter ved hjelp av bailed-out polypper bør utføres for å standardisere metodikken, har det vist seg at polyp bail-out er en reproduserbar tilnærming som kan brukes som et verktøy i korallforskning til flere formål.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Adam Barno og Francisca Garcia for deres støtte i forsøkene og overvåkingen av korallpolyppene. Vi takker også KAUST Coastal &Marine Resources Core Lab for deres hjelp med vedlikehold og infrastruktur i akvariet. Studien ble finansiert av KAUST-tilskuddsnummer BAS/1/1095-01-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5560 Conductivity/Temperature Probe | YSI | 5560 | Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter |
| Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers | Ace Hardware | 2004083 | Used to cut coral fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | Used in DMEM medium. |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41965-039 | Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method |
| Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene | Thermo Fisher Scientific | FB0875713A | Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium. |
| Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt | Schego | 548 | Heaters used in aquarium |
| Leica Application Suite Version 4.2 | Leica Microsystems | NA | Software used for image capture in demonstrative results |
| Leica IC80 HD | Leica Microsystems | 12730216 | Camera used to take demonstrative results pictures |
| Leica MDG33 | Leica Microsystems | 10 450 123 | Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures |
| Leica Z6 APO | Leica Microsystems | NA | Macroscope used to take demonstrative results pictures |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific | 7487-88-9 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | HV-77602-10 | Peristaltic pump head. |
| Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller | Masterflex | EW-07557-00 | Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol. |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft | Masterflex | HV-96410-16 | Tubing for peristaltic pump. |
| Millex 33 mm PVDF 0.22 µm Sterile RUO | Sigma-Aldrich | SLGVR33RS | Used to filter artificial sea water. |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 156499 | Flask usually used for cell culture used for polyp culture. |
| Orbital shaker, Advanced 5000, VWR | VWR | 444-2916 | Shaker used inside incubator. |
| Percival Incubator - I-22VL | Percival | NA | Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks. |
| Plankton net 200 µm mesh size | KC Denmark | NA | Used for covering petri dishes containing coral polyps. |
| Potassium Chloride | VWR Chemicals | 7447-40-7 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| ProQuatro Multiparameter Meter | YSI | 606950 | Used for measuring salinity thoughout the protocol |
| RADION XR15 G5 PRO | Ecotech | NA | Lights used in aquarium |
| Red Sea Salt Premium grade, moderate Alkalinity |
Red Sea | NA | Used to prepare 40 PSU artifical sea water. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Sodium Sulfate Anhydrous | VWR Chemicals | 7757-82-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| TRD 112 thermostat | Schego | NA | Thermostat used in aquarium |
| Turbelle Nanostream 6025 | Tunze | 6025 000 | Pumps used in aquarium |
References
- Goffredo, S., Dubinsky, Z. The Cnidaria, Past, Present and Future: The World of Medusa and her Sisters. , Springer. (2016).
- Knowlton, N., et al. Rebuilding coral reefs: a decadal grand challenge. International Coral Reef Society and Future Earth Coasts. , 56 (2021).
- Brown, B. Coral bleaching: causes and consequences. Coral Reefs. 16 (1), 129-138 (1997).
- Douglas, A.
- Nielsen, D. A., Petrou, K., Gates, R. D. Coral bleaching from a single cell perspective. The ISME Journal. 12 (6), 1558-1567 (2018).
- Oakley, C. A., Davy, S. K. Coral Bleaching: Patterns, Processes, Causes and Consequences. Coral Bleaching Book. , Springer. 189-211 (2018).
- Donner, S. D., Heron, S. F., Skirving, W. J. Future scenarios: a review of modelling efforts to predict the future of coral reefs in an era of climate change. Coral Bleaching. , 159-173 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O. Climate change, coral bleaching and the future of the world's coral reefs. Marine and Freshwater Research. 50 (8), 839-866 (1999).
- Hughes, T. P., et al. Global warming impairs stock-recruitment dynamics of corals. Nature. 568 (7752), 387-390 (2019).
- Moore, J. A., et al. Unprecedented mass bleaching and loss of coral across 12 of latitude in Western Australia in 2010-11. PLoS One. 7 (12), 51807 (2012).
- Duarte, G. A., et al. Heat waves are a major threat to turbid coral reefs in Brazil. Frontiers in Marine Science. 7, 179 (2020).
- Santoro, E. P., et al. Coral microbiome manipulation elicits metabolic and genetic restructuring to mitigate heat stress and evade mortality. Science Advances. 7 (33), (2021).
- Voolstra, C. R., et al. Extending the natural adaptive capacity of coral holobionts. Nature Reviews Earth & Environment. 2 (11), 747-762 (2021).
- Debergh, P. C., Read, P. E. Micropropagation. 1, Kluwer Academic Publishers. 1-13 (1991).
- Nitish, K., Reddy, M. P. In vitro plant propagation: a review. Journal of Forest and Environmental Science. 27 (2), 61-72 (2011).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 354 (4), 1095-1100 (2007).
- Yao, T., Asayama, Y. Animal-cell culture media: history, characteristics, and current issues. Reproductive Medicine and Biology. 16 (2), 99-117 (2017).
- Merten, O. W. Introduction to animal cell culture technology-past, present and future. Cytotechnology. 50 (1-3), 1 (2006).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. P. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Goldstein, B., King, N. The future of cell biology: emerging model organisms. Trends in Cell Biology. 26 (11), 818-824 (2016).
- Lecointe, A., et al. Scleractinian coral cell proliferation is reduced in primary culture of suspended multicellular aggregates compared to polyps. Cytotechnology. 65 (5), 705-724 (2013).
- Nowotny, J. D., Connelly, M. T., Traylor-Knowles, N. Novel methods to establish whole-body primary cell cultures for the cnidarians Nematostella vectensis and Pocillopora damicornis. Scientific Reports. 11 (1), 1-9 (2021).
- Kawamura, K., Nishitsuji, K., Shoguchi, E., Fujiwara, S., Satoh, N. Establishing sustainable cell lines of a coral, Acropora tenuis. Marine Biotechnology. 23, 373-388 (2021).
- Pang, A. -P., Luo, Y., He, C., Lu, Z., Lu, X. A polyp-on-chip for coral long-term culture. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
- Shapiro, O. H., Kramarsky-Winter, E., Gavish, A. R., Stocker, R., Vardi, A. A coral-on-a-chip microfluidic platform enabling live-imaging microscopy of reef-building corals. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Tambutté, S., et al. Coral biomineralization: From the gene to the environment. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 408 (1-2), 58-78 (2011).
- Chuang, P. -S., Mitarai, S. Signaling pathways in the coral polyp bail-out response. Coral Reefs. 39 (6), 1535-1548 (2020).
- Schweinsberg, M., Gösser, F., Tollrian, R. The history, biological relevance, and potential applications for polyp bail-out in corals. Ecology and Evolution. 11 (13), 8424-8440 (2021).
- Rakka, M., et al. First description of polyp bail-out in cold-water octocorals under aquaria maintenance. Coral Reefs. 38 (1), 15-20 (2019).
- Wells, C. D., Tonra, K. J. Polyp bail-out and reattachment of the abundant Caribbean octocoral Eunicea flexuosa. Coral Reefs. 40 (1), 27-30 (2021).
- Coppari, M., et al. Unveiling asexual reproductive traits in black corals: polyp bail-out in Antipathella subpinnata. Coral Reefs. 39 (6), 1517-1523 (2020).
- Chuang, P. S., Ishikawa, K., Mitarai, S. Morphological and genetic recovery of coral polyps after bail-out. Frontiers in Marine Science. 8, 280 (2021).
- Serrano, E., Coma, R., Inostroza, K., Serrano, O. Polyp bail-out by the coral Astroides calycularis (Scleractinia, Dendrophylliidae). Marine Biodiversity. 48 (3), 1661-1665 (2018).
- Kopecky, E. J., Ostrander, G. K. Isolation and primary culture of viable multicellular endothelial isolates from hard corals. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 35 (10), 616-624 (1999).
- Kvitt, H., et al. Breakdown of coral colonial form under reduced pH conditions is initiated in polyps and mediated through apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (7), 2082-2086 (2015).
- Gösser, F., Raulf, A., Mosig, A., Tollrian, R., Schweinsberg, M. Signaling pathways of heat-and hypersalinity-induced polyp bail-out in Pocillopora acuta. Coral Reefs. 40 (6), 1713-1728 (2021).
- Fordyce, A. J., Camp, E. F., Ainsworth, T. D. Polyp bail-out in Pocillopora damicornis following thermal stress. F1000Research. 6, 687 (2017).
- Wecker, P., et al. Exposure to the environmentally-persistent insecticide chlordecone induces detoxification genes and causes polyp bail-out in the coral P. Damicornis. Chemosphere. 195, 190-200 (2018).
- Schmidt-Roach, S., Miller, K. J., Lundgren, P., Andreakis, N. With eyes wide open: a revision of species within and closely related to the Pocillopora damicornis species complex (Scleractinia; Pocilloporidae) using morphology and genetics. Zoological Journal of the Linnean Society. 170 (1), 1-33 (2014).
- Gélin, P., Postaire, B., Fauvelot, C., Magalon, H. Reevaluating species number, distribution and endemism of the coral genus Pocillopora Lamarck, 1816 using species delimitation methods and microsatellites. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 430-446 (2017).
- Capel, K. C. C., Migotto, A., Zilberberg, C., Kitahara, M. V. Another tool towards invasion? Polyp "bail-out" in Tubastraea coccinea. Coral Reefs. 33 (4), 1165 (2014).
- Kawaguti, S. Materials for the study of reef-building corals III. Science of the South Sea (Kagaku Nanyo). 5, 95-106 (1942).
- Goreau, T. F., Goreau, N. I. The physiology of skeleton formation in corals. II. Calcium deposition by hermatypic corals under various conditions in the reef. Biological Bulletin. 117, 239-250 (1959).
- Swain, T. D., et al. Physiological integration of coral colonies is correlated with bleaching resistance. Marine Ecology Progress Series. 586, 1-10 (2018).
- Sweet, M., et al. Insights into the cultured bacterial fraction of corals. mSystems. 6 (3), 01249 (2020).
- Peixoto, R. S., Rosado, P. M., Leite, D. C. dA., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial microorganisms for corals (BMC): proposed mechanisms for coral health and resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341 (2017).
- Peixoto, R. S., et al. Coral probiotics: premise, promise, prospects. Annual Review of Animal Biosciences. 9, 265-288 (2021).
