Summary
El rescate de pólipos es un proceso inducido por el estrés agudo, en el que los pólipos de coral digieren el tejido que los conecta con su colonia y se separan de ella para vivir como individuos. El presente protocolo describe cómo inducir la micropropagación de coral mediante el rescate mediante tratamientos de agua de mar hipersalina o libre de calcio.
Abstract
Los corales son animales coloniales formados por unidades modulares llamadas pólipos. Los pólipos de coral están fisiológicamente unidos y conectados por el tejido. El fenómeno del rescate de pólipos es un proceso inducido por el estrés agudo, en el que los pólipos de coral digieren el tejido que los conecta con el resto de la colonia y, en última instancia, se separan del esqueleto para continuar viviendo como individuos separados. Los biólogos de corales han reconocido el proceso de rescate de pólipos durante años, pero solo recientemente los micropropagados generados por este proceso han sido reconocidos como un sistema modelo para los estudios de biología de corales. El uso del rescate de pólipos puede crear un alto número de unidades clonales a partir de un solo fragmento de coral. Otro beneficio es que los pólipos individuales o parches de pólipos se pueden visualizar fácilmente bajo un microscopio y mantenerse en entornos de bajo costo altamente estandarizados, como placas de Petri, matraces y chips microfluídicos. El presente protocolo demuestra métodos reproducibles capaces de inducir la micropropagación de corales y diferentes enfoques para mantener vivos los pólipos individuales a largo plazo. Esta metodología fue capaz de cultivar con éxito pólipos de la especie de coral Pocillopora verrucosa hasta 8 semanas después del rescate, exhibiendo la practicidad de usar pólipos de coral individuales para la investigación de corales.
Introduction
Los corales escleractinos o constructores de arrecifes son cnidarios capaces de formar esqueletos de carbonato, crear arrecifes y ecosistemas estructuralmente complejos que se pueden encontrar desde ambientes de aguas profundas a poco profundas1. Los arrecifes de coral tropicales albergan una gran biodiversidad y proporcionan servicios ecosistémicos esenciales, como la protección costera y el mantenimiento de la pesca2. La mayoría de los corales constructores de arrecifes de aguas poco profundas dependen de una relación mutualista con las algas de la familia Symbiodiniaceae, que proporcionan la energía que los corales requieren para construir sus esqueletos. La simbiosis entre el coral y las algas puede romperse por el estrés ambiental, causando el blanqueamiento del coral 3,4,5,6. Las anomalías recientes de temperatura han causado importantes eventos de blanqueamiento de corales en todo el mundo, lo que ha llevado a la mortalidad masiva de corales y a la degradación permanente de los arrecifes 7,8,9,10,11. Como este fenómeno se basa en la expulsión de simbiontes por mecanismos celulares asociados al estrés post calor, como la apoptosis, la autofagia y la exocitosis, el blanqueamiento de corales puede describirse como un proceso celular que tiene consecuencias a escala ecosistémica 5,6,12, lo que significa que tener cultivos in vitro de células o tejidos de coral sería aplicable para estudiar de cerca este fenómeno.
Debido a la importancia de los arrecifes de coral y las principales amenazas a las que se han enfrentado, particularmente en las últimas dos décadas2, los corales se han convertido en el foco de la investigación con fines de protección y restauración en todo el mundo13. Sin embargo, el desarrollo de enfoques y sistemas experimentales que sean confiables, reproducibles y ofrezcan un impacto ambiental mínimo para estudiar los corales es una lucha importante en este campo.
La micropropagación se define como la proliferación in vitro del genotipo de un organismo mediante el cultivo de su material biológico en vasos controlados14,15. El cultivo de células, tejidos y órganos ha sido crucial para la biología vegetal y animal en las últimas décadas. Permite la reproducción masiva de organismos en laboratorios, la evaluación rápida de diferentes tratamientos (como fármacos y fármacos), y el estudio directo de la función celular 14,15,16,17. En general, los modelos in vitro han sido útiles para complementar y profundizar los estudios de diferentes organismos en condiciones físicas y químicas mejor controladas. Debido a las ventajas de las técnicas de cultivo in vitro, se han desarrollado, optimizado y utilizado diferentes tecnologías de cultivo de células animales y tejidos como herramientas importantes en muchos campos de investigación, donde se han estudiado y comercializado múltiples líneas celulares para numerosas aplicaciones 16,17,18.
Se han realizado muchos avances en el conocimiento del cultivo de células y tejidos desde el primer cultivo de tejidos animales en 188217, como el uso de medios naturales y sintéticos, la invención de líneas celulares establecidas y el desarrollo de medios 3D para cultivar una multitud de tipos de células de una mejor manera16,17, 18,19. Sin embargo, el campo de la biología celular se ha centrado principalmente en un grupo selecto de organismos modelo, mientras que muchos taxones aún no tienen cultivos in vitro bien establecidos de células, tejidos u órganos20. Por ejemplo, en la investigación de corales, no se han utilizado ampliamente líneas celulares inmortalizadas para la investigación, lo que limita la investigación de células de coral al uso de cultivos celulares primarios. Estos cultivos tienen una viabilidad limitada a unas pocas semanas21, sin que los estudios registren la supervivencia de células individuales de todos los tejidos de coral durante más de 13 días hasta principios de 202122. El primer informe de líneas celulares de coral sostenibles que se publicó fue con células de Acropora tenuis que vivieron hasta 6 meses, y la utilidad de estas células para futuras investigaciones aún no se ha explorado23.
Para superar las limitaciones en el cultivo de cultivos de células de coral y mantener un cultivo de laboratorio que preserve la organización tisular general de los corales, recientemente se ha propuesto el uso de pólipos aislados como modelo para la investigación de la biología del coral24,25. Los pólipos son las unidades anatómicas de los corales, y cada uno de ellos tiene una boca ubicada en el centro de su disco oral y está conectado a otros pólipos por el coenosarc en su región aboral26. La separación de pólipos vivos ocurre naturalmente por el proceso de rescate de pólipos, en el que el estrés agudo causa la digestión del coenosarc entre los pólipos, que luego puede desprenderse del esqueleto de la colonia 25,27,28. Se ha informado que este fenómeno ocurre en una variedad de taxones, incluidos los octocorales29,30,31, los corales negros32 y los corales escleractinos 25,27,28,32,33, y se ha relacionado con múltiples factores estresantes ambientales, como la falta de calcio en el agua24,34, el aumento de la acidez35, condiciones hiperosmóticas 25,27,32,36, altas temperaturas 36,37, inanición 33, exposición al aire25,30 y contaminación por insecticida28,38. El rescate de pólipos se ha reportado, por ejemplo, en corales pocilloporrid19, que están ampliamente distribuidos en todo el mundo y se usan comúnmente como modelos en la investigación de corales. Especies pertenecientes a este grupo, como Pocillopora damicornis y Styllophora pistillata, han generado aproximadamente 30-40 micropropagagas a partir de un fragmento de 5 mm25. Este número enfatiza la ventaja de usar el rescate de pólipos como método para la micropropagación de corales, ya que crea la posibilidad de generar muchos individuos genéticamente idénticos a partir de un pequeño trozo de coral. El uso de pólipos aislados para la investigación también tiene las mismas ventajas que los cultivos celulares en cuanto a la posibilidad de ser cultivados en entornos de laboratorio controlados, como matraces y placas de Petri. Además, las plataformas microfluídicas para mantener pólipos vivos han demostrado que estos micropropagados se pueden mantener en entornos relativamente baratos y fáciles de reproducir, con flujo de agua controlado, superficie y temperatura24,25. Estas plataformas de microfluídica también se pueden utilizar para visualizar estructuras de coral vivas bajo un microscopio directamente24,25.
En el presente artículo, resumimos y demostramos las técnicas que se han desarrollado para aislar pólipos de coral individuales de sus colonias, mostrando cómo mantenerlos en condiciones de laboratorio para el cultivo a largo plazo. Los métodos discutidos incluyen el rescate de pólipos a través de condiciones hiperosmóticas por evaporación y bombeo de agua de mar de alta salinidad e incubación en agua de mar libre de calcio.
Protocol
Para el presente estudio, una colonia perteneciente a la especie de coral Pocillopora verrucosa fue recolectada del arrecife Al Fahal (22.305118 N; 38.964568 E) por SCUBA mediante buceo con martillo y cincel. El género de la colonia fue identificado morfológicamente, y su especie fue clasificada como P. verrucosa en base a trabajos publicados previamente, incluyendo Pocillopora del Mar Rojo, indicando que, desde un punto de vista genético, la especie presente en esta área es P. verrucosa39,40. El arrecife Al Fahal no es parte de un área ambiental protegida, y no se necesitaron permisos especiales para la recolección de corales. La colonia se mantuvo en un acuario de 300 L durante un mes antes de ser fragmentada y tener sus pólipos "rescatados". El acuario se mantuvo a 26 ° C con dos calentadores de acuario, tres bombas y dos fuentes de luz (ver Tabla de materiales), manteniendo un ciclo de luz de 12 h. La temperatura del acuario se mantuvo conectando cada uno de los dos calentadores a un controlador de temperatura. La emisión de luz se programó para comenzar a las 6 AM y terminar a las 6 PM, produciendo una curva de irradiancia que alcanzó su punto máximo a las 12 PM con 230 fotones μmol m−2s−1.
1. Rescate de pólipos por alta salinidad después de la evaporación del agua
NOTA: Este método fue adaptado de Shapiro et al.25. Si se utilizan especies diferentes a Pocillopora verrucosa, se debe tener en cuenta el tamaño de los pólipos antes de determinar el tamaño del fragmento a cortar.
- Cortar fragmentos pequeños (de menos de 1 cm de longitud) de una colonia de coral utilizando alicates de corte diagonales (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Adaptar las herramientas de corte según la especie de coral que se utilice. Los alicates diagonales son útiles para cortar corales con ramas delgadas. En el estudio actual, se cortó un fragmento para cada tratamiento, pero el número y el tamaño de los fragmentos pueden variar según el número de pólipos deseados. El tamaño de los fragmentos cortados no debe exceder la profundidad del agua después de la evaporación, por lo que los corales permanecen completamente dentro del agua después de que se realiza el proceso. - Coloque los fragmentos cortados en pequeñas placas de Petri llenas de 12 ml de agua de mar a las que se ha aclimatado la colonia de coral. Esto puede ser agua de mar artificial (ver Tabla de Materiales) o agua de mar filtrada a la misma salinidad en la que se insertó la colonia de coral antes de la fragmentación.
NOTA: Es importante cubrir el fragmento completamente con agua. Si 12 ml en una placa de Petri no es suficiente para cubrir el fragmento cortado, optimice el recipiente y el volumen en consecuencia. En el presente estudio, el agua utilizada se recolectó del Mar Rojo, y su salinidad fue de 40 PSU, medida por un medidor multiparamétrico (ver Tabla de Materiales). - Deje la placa abierta durante ~ 24 h a temperatura ambiente para que el agua pueda evaporarse y su salinidad pueda aumentar gradualmente. Cuando la digestión de los tejidos sea observable entre pólipos, continúe con el Paso 1.4.
NOTA: Después de que haya pasado el tiempo de incubación, la salinidad del agua debe ser aproximadamente un 40% más alta que al principio, y los pólipos deben estar listos para separarse del esqueleto. - Usando una pipeta de transferencia de 1 ml, cree un flujo suave cerca del tejido de coral. El flujo ayudará lentamente al desprendimiento completo de los pólipos que ya han digerido el tejido que los rodea del esqueleto.
NOTA: Cuando el flujo de agua se crea con la pipeta, los pólipos separados o grupos de pólipos deben salir del esqueleto como escamas. Si una sustancia turbia se desprende en su lugar, indica la muerte o desintegración del tejido, lo que significa que los corales se incubaron durante demasiado tiempo o en una condición demasiado estresante (en este caso, alta salinidad). Es muy importante hacer un flujo suave de agua para separar los pólipos, ya que un flujo más fuerte puede causarles daños físicos. - Intercambie lentamente el agua de la placa de Petri con agua isosmótica (use la misma agua que en el Paso 1.2.) usando una pipeta. Un intercambio de agua del 50% durante 10 minutos es suficiente para aclimatar los pólipos a una condición de salinidad no estresante.
NOTA: Como se utilizaron colonias de coral de la especie pocilloporid Pocillopora verrucosa del Mar Rojo, se llevaron a cabo pruebas para determinar bajo qué condiciones específicas rescatarían los corales de este entorno único. Es importante destacar la alta salinidad del Mar Rojo en comparación con la mayoría de los otros entornos de arrecifes.
2. Rescate de pólipos por suministro de agua de mar de alta salinidad
NOTA: Este método fue adaptado de Chuang et al.27.
- Prepare 3 L de agua de mar de alta salinidad agregando NaCl al agua de mar hasta que la salinidad aumente en un 85%, medida por una sonda de salinidad.
NOTA: En el estudio actual, se preparó un agua de mar de alta salinidad de 74 PSU a partir de 40 PSU de agua de mar del Mar Rojo. - Cortar pequeños fragmentos de coral como se describe en el Paso 1.1.
- Coloque los fragmentos cortados en un recipiente de 10 L lleno de 3 L de agua de mar isosmótica (en este caso, agua de mar con salinidad no estresante para los corales, la misma que se usa en el Paso 1.2) conectada a una bomba peristáltica (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Para un mejor mantenimiento de la salud del coral, se pueden agregar controladores de temperatura, bombas de aire y luces para simular las mismas condiciones del acuario a las que la colonia estuvo expuesta anteriormente. Durante la incubación en el presente trabajo, los fragmentos de coral se mantuvieron en recipientes a 26 °C, bajo un ciclo de luz diario de 12 h. El movimiento del agua y la homogeneización de la temperatura se mantuvieron mediante bombas de aire. - Llene el recipiente que contiene fragmentos de coral con el agua de mar de alta salinidad preparada en el Paso 2.1 utilizando la bomba peristáltica durante 24 h a una velocidad de 126 ml / h. Agregue un total de 3 L de agua a una salinidad creciente de aproximadamente el 40%.
NOTA: El agua de alta salinidad se puede producir simplemente agregando NaCl al agua de mar hasta alcanzar la salinidad prevista. - Cree un flujo de agua suave con una pipeta para liberar los pólipos del esqueleto (Paso 1.4.).
- Intercambie lentamente el agua en la que están contenidos los pólipos por agua isosmótica (Paso 1.5.). A continuación, continúe con el Paso 4 o el Paso 5.
3. Rescate de pólipos mediante la incubación de agua de mar libre de calcio
NOTA: Este método fue adaptado de Pang et al.24.
- Preparar una solución de agua de mar artificial libre de calcio (CaFSW) añadiendo 26,29 g de NaCl, 0,872 g de KCl, 2,16 g de MgSO4, 11,94 g de MgCl2, 3,42 g de Na2SO4 y 0,286 g de NaHCO3 (ver Tabla de Materiales) a 1 L de agua desionizada.
NOTA: Esta solución se ajustó a partir de protocolos anteriores para ser más adecuada para corales adaptados a una salinidad de 40 PSU. Para los corales adaptados a otras condiciones de salinidad, use la misma proporción de sales pero ajuste la masa total de solutos para obtener la salinidad que se adapte mejor a los corales en uso. - Cortar pequeños fragmentos de corales como se describe en el Paso 1.1.
- Sumergir los fragmentos de coral en placas de Petri rellenas con el CaFSW preparado previamente (Paso 3.1.) e incubarlos en incubadoras orbitales a una velocidad de rotación de 80 rpm durante 3 h.
NOTA: Una vez más, es importante cubrir el fragmento completamente con agua. Si una placa de Petri no es suficiente para cubrir el fragmento, optimice el recipiente y el volumen de acuerdo con la necesidad experimental. - Transfiera los fragmentos a placas de Petri o placas de 6 pocillos llenas con 20% de Medios de Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco y 100 mg / ml de solución de ampicilina (ver Tabla de Materiales) preparada con agua de mar artificial de 40 PSU. Incubar los fragmentos a 26 °C y 80 rpm, intercambiando los medios todos los días hasta que la digestión del tejido sea observable entre los pólipos y los pólipos individuales comiencen a desprenderse del esqueleto.
NOTA: En la mayoría de los casos, la digestión del tejido se completa dentro de las 20 h de la incubación en este medio, y no se necesitan intercambios. - Transfiera los pólipos al agua de mar esterilizada para la recuperación inicial utilizando una pipeta. Después de 1 h de incubación, continúe con el Paso 4 o el Paso 5.
4. Mantenimiento de pólipos en placas de Petri
- Una vez que los pólipos se devuelven al agua de mar filtrada con salinidad no estresante, seleccione pólipos viables observando la integridad del tejido y el movimiento causado por el flujo ciliar bajo un estereomicroscopio.
- Coloque los pólipos seleccionados en una placa de Petri de vidrio o plástico y cubra la placa de Petri con una red de plancton (tamaño de malla de 200 μm, consulte la Tabla de materiales) para que los pólipos no floten lejos de la placa.
NOTA: El tamaño de la red de malla puede variar según el tamaño de los pólipos. Es importante tener en cuenta que las redes deben tener poros que sean más pequeños que los pólipos y permitan el intercambio de agua y la penetración de la luz. - Coloque la placa de Petri dentro de un acuario con las condiciones adecuadas para las especies de coral utilizadas.
NOTA: En el presente estudio, las condiciones fueron 40 PSU de agua de mar filtrada a 26 °C y un ciclo de luz de 12 h. - Abra las placas de Petri al menos una vez a la semana para renovar el agua y limpiar los platos. Este paso es importante para eliminar el crecimiento excesivo de algas que pueden competir o dañar los pólipos de coral al liberar localmente compuestos tóxicos.
5. Mantenimiento de pólipos en incubadoras
- Seleccione pólipos viables como se describe en el paso 4.1.
- Coloque los pólipos en matraces de celdas de superficie de 75 cm2 llenos de 50 ml de agua de mar isosmótica utilizando pipetas de transferencia.
NOTA: En el trabajo actual, el agua de mar filtrada recolectada del Mar Rojo se utilizó para el mantenimiento de pólipos. Se puede utilizar agua con las mismas características que la utilizada en el Paso 1.2. - Cierre los matraces y muévalos a las incubadoras. Ajuste las incubadoras a ciclos de luz de 12 h a 26 °C y 40 rpm. Intercambie el 50% del volumen de agua cada 4 días y transfiera el contenido a matraces limpios cuando / si se llenan de algas o biopelículas en las paredes.
NOTA: Las imágenes fueron capturadas con un sistema de zoom totalmente apocromático equipado con una cámara HD (ver Tabla de Materiales) para los resultados representativos.
Representative Results
El rescate de pólipos fue inducido en fragmentos de coral pertenecientes a una sola colonia de la especie P. verrucosa siguiendo tres métodos diferentes (Figura 1). El rescate inducido por la alta salinidad después de la evaporación del agua se completó después de 24 h de incubación de fragmentos de coral en placas de Petri a temperatura ambiente llenas de agua inicialmente a 40 PSU, que luego alcanzó una salinidad final de 59 PSU una vez finalizado el proceso (Figura 2A-C, I). El rescate por suministro de agua salada también se alcanzó después de 24 h de incubación en agua inicialmente a 40 PSU que alcanzó una salinidad de 52 PSU después de 12 h y 59 PSU al final del proceso, después de 24 h (Figura 2D-F, I). En ambos experimentos, un aumento en la salinidad fue responsable de la inducción de la digestión de los tejidos por los pólipos. Después de 12 h, la condición de alta salinidad causó la contracción de los pólipos junto con el adelgazamiento gradual del coenosarc, causando finalmente el desprendimiento final de los pólipos después de 24 h. La inducción de rescate a través de la incubación en agua de mar libre de calcio se completó después de una incubación de 3 horas en CaFSW seguida de una incubación de 20 horas en el medio DMEM al 20% (Figura 2G-H). El tejido se separó del esqueleto en los tres métodos después de empujarlo con una pipeta hasta que se generaron pólipos de coral individualizados (Figura 3A-C) y "bolas de tejido".
Después del desprendimiento, los pólipos de los tres métodos se recolectaron y se les permitió recuperarse en agua de mar antes de asignarse a placas de Petri cubiertas con redes o matraces celulares. Los pólipos obtenidos de la evaporación y los métodos de suministro de agua se mantuvieron en placas de Petri dentro de acuarios y sobrevivieron durante 6 semanas y 8 semanas, respectivamente (Figura 3D y Figura 3F). Estos micropropagados conservaron la anatomía habitual de los pólipos, presentando tentáculos, discos basales y bocas1. Los pólipos obtenidos a través de la incubación en agua de mar libre de calcio tuvieron una vida útil corta, sobreviviendo hasta 1 día, después de lo cual su tejido se disoció. Los pólipos obtenidos del método de evaporación de agua de mar mantenidos en matraces de cultivo celular dentro de incubadoras sobrevivieron hasta 3 semanas sin disociación de tejidos (Figura 3F). En todos los casos, a pesar de que los pólipos no podían adherirse al sustrato, estaban visualmente sanos y mantenían su color, con células de zooxantelas aún visibles dentro de sus tejidos1.
Figura 1: Representación esquemática de las tres metodologías diferentes probadas para la inducción de rescate de pólipos (izquierda) seguida de la ilustración de dos métodos para mantener los pólipos adquiridos en condiciones de laboratorio (derecha). (A) Representación de la metodología para el rescate de pólipos por evaporación de agua. B) Representación de la metodología para el rescate de pólipos mediante el suministro de agua de mar de alta salinidad. (C) Representación de la metodología para el rescate de pólipos mediante la incubación de agua de mar libre de calcio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes del proceso de rescate de pólipos inducido por tres metodologías diferentes utilizando fragmentos de la especie coralina P. verrucosa. (A-C) Un fragmento de coral a las 0 h, 12 h y 24 h después de la incubación, respectivamente, en una placa de Petri utilizando el método de evaporación de agua. (D-F) Un fragmento de coral a las 0 h, 12 h y 24 h después de la incubación, respectivamente, utilizando el método de suministro de agua de mar de alta salinidad. (G,H) Fragmentos de coral expuestos al método de incubación de agua de mar libre de calcio antes y después, respectivamente. Las incubaciones en agua de mar artificial libre de calcio fueron durante 3 h y en DMEM al 20% durante 21 h. (I) Representación gráfica de los valores de salinidad en la fuente de alimentación del agua de mar a lo largo del tiempo durante la evaporación del agua y los métodos de inducción de rescate del suministro de agua de mar de alta salinidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes de pólipos de P. verrucosa obtenidas de los tres procedimientos de inducción de rescate demostrados. (A-C) Las imágenes de los pólipos obtenidos de los métodos de evaporación, suministro de agua salada y agua de mar libre de calcio, respectivamente, se capturaron inmediatamente después de que se separaron del esqueleto. (D) La imagen de un pólipo de coral obtenida del método de evaporación después de sobrevivir 6 semanas en una placa de Petri. (E) La imagen de un pólipo de coral obtenida del método de suministro de agua salada después de sobrevivir 8 semanas en una placa de Petri. (F) La imagen de un pólipo de coral obtenida del método de evaporación después de sobrevivir 3 semanas en un matraz de cultivo celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
La tasa de supervivencia de los pólipos después de ser sometidos a procesos de rescate y el tiempo necesario para que el proceso se complete varían entre las investigaciones previamenteinformadas 25,33,41, lo que posiblemente se explica por los diferentes enfoques experimentales aplicados en cada estudio. Por ejemplo, diferentes especies de coral, o incluso corales de la misma especie pero aclimatados a diferentes condiciones ambientales (por ejemplo, corales del Mar Rojo), presentan diferentes umbrales para los niveles de salinidad. El método de rescate seleccionado y las condiciones de laboratorio / acuario también juegan un papel importante en los resultados. En algunos casos, el mantenimiento de micropropagados de coral en condiciones de laboratorio ha superado el tiempo de supervivencia de los cultivos de células de coral al alcanzar meses de supervivencia en corales azooxantehellate3 3,41 y zooxantelato25. El tiempo para que se complete el proceso de rescate de pólipos también ha variado en diferentes estudios, que van desde unas pocas horas2 5,2 7,30 hasta semanas35 de incubación expuestas al factor estresante responsable de causar el rescate. Otra variable a tener en cuenta al estudiar el rescate de pólipos es la recuperación de los pólipos después de la exposición al estrés agudo que desencadenó su liberación. Todavía es discutible si los pólipos después del rescate están en condiciones lo suficientemente buenas como para ser utilizados como modelos para estudiar la biología del coral. La recuperación de sus tejidos después de la degradación del coenosarc es motivo de preocupación cuando se utilizan estos micropropagados. Sin embargo, los pólipos en muchos estudios, incluido el presente, han podido presentar células zooxantelas dentro de sus tejidos y morfologías externas con polarización oral-aboral intacta y tentáculos semanas después del rescate 25,27,32,36. Estudios previos también han encontrado que, tras ser liberados del estrés agudo, los pólipos de coral liberados expuestos a agua de mar altamente salina o calentada han sido capaces de recuperar la expresión de genes relacionados con procesos como la apoptosis, la proteólisis y la división celular a niveles similares a los encontrados antes del rescate32,36 e incluso de aumentar la expresión de genes relacionados con la cicatrización tisular36.
En cuanto a la diferencia de supervivencia entre métodos, es importante destacar que este tiempo puede variar entre diferentes experimentos incluso si se utilizan las mismas técnicas, y puede estar relacionado con la salud de los fragmentos utilizados y el mantenimiento adecuado de los pólipos después del proceso de rescate. En el caso del rescate a través de la incubación de agua de mar libre de calcio, la supervivencia de los pólipos se limitó a 1 día. Por lo tanto, se puede concluir que el método no es adecuado para la supervivencia a largo plazo de las especies estudiadas, o se debe hacer una mejor adaptación de la técnica para los corales P. verrucosa del Mar Rojo. Los resultados reportados mostraron que se obtuvo un mayor tiempo de supervivencia con los métodos basados en el aumento gradual de la salinidad, cuando los pólipos fueron sometidos al goteo de agua de alta salinidad. Este método puede ofrecer un aumento más controlado de la salinidad que el método de evaporación, al mismo tiempo que no es responsable de un aumento en la concentración de otras sustancias que se encuentran en el agua de mar, incluidos los desechos metabólicos del coral, que son potencialmente tóxicos para el organismo. Por todas estas razones, este método se ha sugerido como una alternativa más segura para mantener pólipos sanos27. Aunque se ha planteado la hipótesis de que este método es más seguro para la salud de los pólipos y capaz de producir pólipos que viven más tiempo, un hecho que fue corroborado en esta publicación actual, se necesitan encuestas adicionales para confirmarlo. Ambos experimentos de rescate inducidos por alta salinidad demostraron un desprendimiento completo de pólipos después de que la salinidad alcanzara 59 PSU en 24 h. Si la salinidad aumenta más allá del nivel en el que se completa el rescate, se causará más estrés a los pólipos, reduciendo sus posibilidades de sobrevivir y recuperarse del tratamiento del estrés agudo. Por lo tanto, no se recomienda mantener los pólipos por más tiempo en tales niveles de salinidad. Al realizar el método de inducción de rescate por exposición a agua de mar libre de calcio, se obtuvo un desprendimiento completo de una incubación de 3 h en agua de mar artificial libre de calcio, lo que significa que tampoco se recomienda una mayor exposición a este medio.
Para abordar los métodos que fueron más adecuados para el estudio de los pólipos de coral en estudios de laboratorio / in vitro , este estudio se centró solo en tres procedimientos que tardaron cerca de 24 horas en completarse el proceso de rescate y se utilizaron en estudios que involucraron el mantenimiento a largo plazo de pólipos de coral de corales escleractinos. Otros métodos reportados para tomar significativamente más tiempo que este tiempo no fueron utilizados. El asentamiento de pólipos a un sustrato no se intentó en este estudio, que se centró en producir pólipos que podrían transferirse a diferentes entornos o recogerse fácilmente para análisis utilizando pipetas desechables. Los resultados demuestran que los pólipos de la especie de coral P. verrucosa se mantuvieron vivos, con células zooxantelas asociadas, estado visual saludable y una estructura anatómica externa gruesa preservada, durante hasta 8 semanas, incluso sin unión a un sustrato. Estos resultados indican que se pueden generar más réplicas biológicas a partir de fragmentos de coral individuales utilizando algunas de las técnicas demostradas en este estudio. Tales réplicas biológicas pueden mantenerse en ambientes controlados (como placas de Petri y matraces celulares) y mantenerse en condiciones de laboratorio para experimentos de un mes de duración y usarse para varios propósitos.
Desde las primeras descripciones incidentales del rescate de pólipos42,43, se han establecido nuevos protocolos para encontrar métodos más estandarizados para inducir la liberación de pólipos y mantener vivos dichos pólipos, que pueden usarse para futuras aplicaciones de investigación. Estos incluyen la investigación de diferentes aspectos asociados con la fisiología del holobionte de coral44 y las interacciones huésped-microbioma45, los mecanismos moleculares involucrados en el blanqueamiento de corales 5,25 y la salud, resiliencia y protección del holobionte de coral 12,13,46,47 . Además, los pólipos de coral liberados se pueden usar para aplicaciones fuera del ámbito de la investigación y se ha sugerido que son útiles para crear propágulos que pueden adherirse a un sustrato y crecer, creando potencialmente múltiples individuos de coral que pueden usarse con fines de restauración una vez que los protocolos estandarizados para el rescate se generalicen28 . En general, aunque se deben realizar experimentos más profundos utilizando pólipos rescatados para estandarizar la metodología, se ha demostrado que el rescate de pólipos es un enfoque reproducible que se puede aplicar como una herramienta en la investigación de corales para varios propósitos.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Adam Barno y Francisca García por su apoyo en los experimentos y monitoreo de los pólipos de coral. También agradecemos al KAUST Coastal & Marine Resources Core Lab por su asistencia con respecto al mantenimiento y la infraestructura del acuario. El estudio fue financiado por la subvención KAUST número BAS/1/1095-01-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5560 Conductivity/Temperature Probe | YSI | 5560 | Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter |
| Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers | Ace Hardware | 2004083 | Used to cut coral fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | Used in DMEM medium. |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41965-039 | Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method |
| Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene | Thermo Fisher Scientific | FB0875713A | Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium. |
| Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt | Schego | 548 | Heaters used in aquarium |
| Leica Application Suite Version 4.2 | Leica Microsystems | NA | Software used for image capture in demonstrative results |
| Leica IC80 HD | Leica Microsystems | 12730216 | Camera used to take demonstrative results pictures |
| Leica MDG33 | Leica Microsystems | 10 450 123 | Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures |
| Leica Z6 APO | Leica Microsystems | NA | Macroscope used to take demonstrative results pictures |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific | 7487-88-9 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | HV-77602-10 | Peristaltic pump head. |
| Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller | Masterflex | EW-07557-00 | Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol. |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft | Masterflex | HV-96410-16 | Tubing for peristaltic pump. |
| Millex 33 mm PVDF 0.22 µm Sterile RUO | Sigma-Aldrich | SLGVR33RS | Used to filter artificial sea water. |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 156499 | Flask usually used for cell culture used for polyp culture. |
| Orbital shaker, Advanced 5000, VWR | VWR | 444-2916 | Shaker used inside incubator. |
| Percival Incubator - I-22VL | Percival | NA | Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks. |
| Plankton net 200 µm mesh size | KC Denmark | NA | Used for covering petri dishes containing coral polyps. |
| Potassium Chloride | VWR Chemicals | 7447-40-7 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| ProQuatro Multiparameter Meter | YSI | 606950 | Used for measuring salinity thoughout the protocol |
| RADION XR15 G5 PRO | Ecotech | NA | Lights used in aquarium |
| Red Sea Salt Premium grade, moderate Alkalinity |
Red Sea | NA | Used to prepare 40 PSU artifical sea water. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Sodium Sulfate Anhydrous | VWR Chemicals | 7757-82-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| TRD 112 thermostat | Schego | NA | Thermostat used in aquarium |
| Turbelle Nanostream 6025 | Tunze | 6025 000 | Pumps used in aquarium |
References
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