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Biology

प्रयोगशाला प्रायोगिक उपयोग के लिए व्यक्तिगत माइक्रोप्रोपेगेट प्राप्त करने के लिए कोरल कॉलोनियों में पॉलीप बेल-आउट को प्रेरित करना

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63840
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Red Sea Research Center (RSRC), Division of Biological and Environmental Science and Engineering (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

पॉलीप बेल-आउट तीव्र तनाव से प्रेरित एक प्रक्रिया है, जिसमें कोरल पॉलीप्स ऊतक को अपनी कॉलोनी से जोड़ते हैं और व्यक्तियों के रूप में रहने के लिए इससे अलग हो जाते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल बताता है कि हाइपरसेलिन या कैल्शियम मुक्त समुद्री जल उपचार का उपयोग करके बेल-आउट द्वारा कोरल माइक्रोप्रोपेगेशन को कैसे प्रेरित किया जाए।

Abstract

कोरल औपनिवेशिक जानवर हैं जो मॉड्यूलर इकाइयों द्वारा गठित होते हैं जिन्हें पॉलीप्स कहा जाता है। कोरल पॉलीप्स शारीरिक रूप से जुड़े होते हैं और ऊतक से जुड़े होते हैं। पॉलीप बेल-आउट की घटना तीव्र तनाव से प्रेरित एक प्रक्रिया है, जिसमें कोरल पॉलीप्स ऊतक को कॉलोनी के बाकी हिस्सों से जोड़ते हैं और अंततः अलग-अलग व्यक्तियों के रूप में रहने के लिए कंकाल से अलग हो जाते हैं। कोरल जीवविज्ञानियों ने वर्षों से पॉलीप बेल-आउट की प्रक्रिया को स्वीकार किया है, लेकिन हाल ही में इस प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न माइक्रोप्रोपेगेट्स को कोरल जीव विज्ञान अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में मान्यता दी गई है। पॉलीप बेल-आउट का उपयोग एक एकल मूंगा टुकड़े से उच्च संख्या में क्लोनल इकाइयां बना सकता है। एक और लाभ यह है कि पॉलीप्स के एकल पॉलीप्स या पैच को माइक्रोस्कोप के तहत आसानी से देखा जा सकता है और पेट्री डिश, फ्लास्क और माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स जैसे अत्यधिक मानकीकृत कम लागत वाले वातावरण में बनाए रखा जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल लंबे समय तक जीवित एकल पॉलीप्स को बनाए रखने के लिए कोरल माइक्रोप्रोपेगेशन और विभिन्न दृष्टिकोणों को प्रेरित करने में सक्षम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीकों को प्रदर्शित करता है। यह पद्धति बेल-आउट के बाद 8 सप्ताह तक कोरल प्रजातियों पोसिलोपोरा वेरुकोसा के पॉलीप्स की सफलतापूर्वक खेती करने में सक्षम थी, जो कोरल अनुसंधान के लिए व्यक्तिगत कोरल पॉलीप्स का उपयोग करने की व्यावहारिकता का प्रदर्शन करती है।

Introduction

स्क्लेरैक्टिनियन या रीफ-बिल्डिंग कोरल कार्बोनेट कंकाल बनाने, चट्टानों को बनाने और संरचनात्मक रूप से जटिल पारिस्थितिक तंत्र बनाने में सक्षम हैं जो गहरे से उथले पानी के वातावरण तक पाए जा सकते हैं1. उष्णकटिबंधीय प्रवाल भित्तियां उच्च जैव विविधता की मेजबानी करती हैं और आवश्यक पारिस्थितिकी तंत्र सेवाएं प्रदान करती हैं, जैसे कि तटीय संरक्षण और मत्स्य पालन रखरखाव2. अधिकांश उथले-पानी की चट्टान-निर्माण कोरल परिवार के शैवाल के साथ पारस्परिक संबंध पर भरोसा करते हैं सिम्बायोडिनियासी, जो ऊर्जा प्रदान करते हैं जो कोरल को अपने कंकाल बनाने के लिए आवश्यक है। मूंगा और शैवाल के बीच सहजीवन पर्यावरणीय तनाव से टूट सकता है, जिससे मूंगा विरंजन 3,4,5,6 हो सकता है। हाल के तापमान विसंगतियों ने दुनिया भर में प्रमुख प्रवाल विरंजन घटनाओं का कारण बना है, जिससे बड़े पैमाने पर प्रवाल मृत्यु दर और स्थायी चट्टान गिरावट 7,8,9,10,11 हो गई है। चूंकि यह घटना पोस्ट हीट स्ट्रेस-जुड़े सेलुलर तंत्र, जैसे एपोप्टोसिस, ऑटोफैगी और एक्सोसाइटोसिस द्वारा सहजीवन के निष्कासन पर आधारित है, कोरल विरंजन को एक सेलुलर प्रक्रिया के रूप में वर्णित किया जा सकता है जिसमें पारिस्थितिकी तंत्र-पैमाने के परिणाम 5,6,12 होते हैं, जिसका अर्थ है कि कोरल कोशिकाओं या ऊतकों की इन विट्रो संस्कृतियों में होना इस घटना का बारीकी से अध्ययन करने के लिए लागू होगा।

प्रवाल भित्तियों के महत्व और प्रमुख खतरों के कारण वे सामना कर रहे हैं, विशेष रूप से पिछले दो दशकों में2, कोरल दुनिया भर में सुरक्षा और बहाली उद्देश्यों के लिए अनुसंधान का केंद्र बन गए हैं13. हालांकि, दृष्टिकोण और प्रयोगात्मक प्रणालियों का विकास जो विश्वसनीय, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं, और कोरल का अध्ययन करने के लिए न्यूनतम पर्यावरणीय प्रभाव प्रदान करते हैं, इस क्षेत्र में एक बड़ा संघर्ष है।

माइक्रोप्रोपेगेशन को नियंत्रित जहाजों14,15 में अपनी जैविक सामग्री को संवर्धन करके एक जीव के जीनोटाइप के इन विट्रो प्रसार के रूप में परिभाषित किया गया है। हाल के दशकों में पौधे और पशु जीव विज्ञान के लिए कोशिकाओं, ऊतकों और अंगों की संवर्धन महत्वपूर्ण रही है। यह प्रयोगशालाओं में जीवों के बड़े पैमाने पर प्रजनन, विभिन्न उपचारों (जैसे दवाओं और फार्मास्यूटिकल्स) के तेजी से मूल्यांकन और सेल फ़ंक्शन 14,15,16,17 के प्रत्यक्ष अध्ययन की अनुमति देता है। सामान्य तौर पर, इन विट्रो मॉडल बेहतर नियंत्रित भौतिक और रासायनिक स्थितियों के तहत विभिन्न जीवों के अध्ययन को पूरक और गहरा करने के लिए उपयोगी रहे हैं। इन विट्रो संवर्धन तकनीकों के फायदों के कारण, विभिन्न पशु कोशिका और ऊतक संस्कृति प्रौद्योगिकियों को कई अनुसंधान क्षेत्रों में महत्वपूर्ण उपकरणों के रूप में विकसित, अनुकूलित और उपयोग किया गया है, जहां कई सेल लाइनों का अध्ययन और व्यावसायीकरण कई अनुप्रयोगों के लिए किया गया है 16,17,18।

सेल और टिशू कल्चर के ज्ञान में कई प्रगति 188217 में पहली पशु ऊतक संस्कृति के बाद से की गई है, जैसे कि प्राकृतिक और सिंथेटिक मीडिया का उपयोग, स्थापित सेल लाइनों का आविष्कार, और बेहतर तरीके से सेल प्रकारों की भीड़ की खेती करने के लिए 3 डी मीडिया का विकास16,17, 18,19. हालांकि, कोशिका जीव विज्ञान के क्षेत्र ने ज्यादातर मॉडल जीवों के एक चुनिंदा समूह पर ध्यान केंद्रित किया है, जबकि कई कर अभी भी कोशिकाओं, ऊतकों या अंगों की इन विट्रो संस्कृतियों में अच्छी तरह से स्थापित नहीं हैं20. उदाहरण के लिए, कोरल अनुसंधान में, अनुसंधान के लिए बड़े पैमाने पर कोई अमर सेल लाइनों का उपयोग नहीं किया गया है, जो प्राथमिक सेल संस्कृतियों के उपयोग के लिए कोरल सेल अनुसंधान को बाधित करता है। इन संस्कृतियों की व्यवहार्यता कुछ हफ्तों 21 तक सीमित है,जिसमें 2021 22 की शुरुआत तक 13 दिनों से अधिक समय तक सभी प्रवाल ऊतकों से व्यक्तिगत कोशिकाओं के अस्तित्व को रिकॉर्ड करने वाला कोई अध्ययन नहींहै। प्रकाशित होने वाली टिकाऊ मूंगा सेल लाइनों की पहली रिपोर्ट एक्रोपोरा टेनुइस कोशिकाओं के साथ थी जो 6 महीने तक जीवित रहती थीं, और भविष्य के अनुसंधान के लिए इन कोशिकाओं की उपयोगिता का पता लगाया जाना बाकी है।

मूंगा कोशिका संस्कृतियों की संवर्धन में सीमाओं को दूर करने और एक प्रयोगशाला संस्कृति को बनाए रखने के लिए जो कोरल के समग्र ऊतक संगठन को संरक्षित करता है, पृथक पॉलीप्स का उपयोग हाल ही में कोरल जीव विज्ञान अनुसंधान24,25 के लिए एक मॉडल के रूप में प्रस्तावित किया गया है। पॉलीप्स कोरल की शारीरिक इकाइयाँ हैं, और उनमें से प्रत्येक का मुंह उनकी मौखिक डिस्क के केंद्र में स्थित है और अपने एबोरल क्षेत्र26 में कोनोसार्क द्वारा अन्य पॉलीप्स से जुड़ा हुआ है। लाइव पॉलीप्स का पृथक्करण पॉलीप बेल-आउट की प्रक्रिया से स्वाभाविक रूप से होता है, जिसमें तीव्र तनाव पॉलीप्स के बीच कोनोसार्क के पाचन का कारण बनता है, जो तब कॉलोनी के कंकाल25,27,28 से अलग हो सकता है। इस घटना को विभिन्न प्रकार के करों में होने की सूचना मिली है, जिसमें ऑक्टोकोरल29,30,31, काले कोरल32, और स्क्लेरैक्टिनियन कोरल 25,27,28,32,33 शामिल हैं, और कई पर्यावरणीय तनावों से जुड़ा हुआ है, जैसे कि पानी में कैल्शियम की कमी 24,34, अम्लतामें वृद्धि 35, हाइपरोस्मोटिक स्थितियां 25,27,32,36, उच्च तापमान36,37, भुखमरी33, वायु जोखिम25,30 और कीटनाशक संदूषण28,38। पॉलीप बेल-आउट, उदाहरण के लिए, पोसिलोपोरिड कोरल19 में रिपोर्ट किया गया है, जो दुनिया भर में व्यापक रूप से वितरित किए जाते हैं और आमतौर पर कोरल अनुसंधान में मॉडल के रूप में उपयोग किए जाते हैं। इस समूह से संबंधित प्रजातियां, जैसे कि पोसिलोपोरा डेमिकॉर्निस और स्टाइलोफोरा पिस्टिलाटा, ने 5 मिमी टुकड़े25 से लगभग 30-40 माइक्रोप्रोपेगेट उत्पन्न किए हैं। यह संख्या कोरल माइक्रोप्रोपेगेशन के लिए एक विधि के रूप में पॉलीप बेल-आउट का उपयोग करने के लाभ पर जोर देती है, क्योंकि यह मूंगा के एक छोटे से टुकड़े से कई आनुवंशिक रूप से समान व्यक्तियों को उत्पन्न करने की संभावना पैदा करती है। अनुसंधान के लिए पृथक पॉलीप्स के उपयोग में नियंत्रित प्रयोगशाला वातावरण, जैसे फ्लास्क और पेट्री व्यंजनों में सुसंस्कृत होने की संभावना के बारे में सेल संस्कृतियों के समान फायदे हैं। इसके अतिरिक्त, लाइव पॉलीप्स को बनाए रखने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों ने प्रदर्शित किया है कि इन माइक्रोप्रोपेगेट्स को नियंत्रित जल प्रवाह, सतह और तापमान24,25 के साथ अपेक्षाकृत सस्ते और आसानी से पुन: उत्पन्न वातावरण में रखा जा सकता है। इन माइक्रोफ्लुइडिक्स प्लेटफार्मों का उपयोग माइक्रोस्कोप के तहत सीधे24,25 के तहत जीवित प्रवाल संरचनाओं की कल्पना करने के लिए भी किया जा सकता है।

वर्तमान लेख में, हम उन तकनीकों को संक्षेप में प्रस्तुत और प्रदर्शित करते हैं जिन्हें उनकी कॉलोनियों से व्यक्तिगत प्रवाल पॉलीप्स को अलग करने के लिए विकसित किया गया है, यह दिखाते हुए कि उन्हें दीर्घकालिक संस्कृति के लिए प्रयोगशाला स्थितियों में कैसे बनाए रखा जाए। चर्चा की गई विधियों में वाष्पीकरण और उच्च लवणता वाले समुद्री जल को पंप करके हाइपरोस्मोटिक स्थितियों के माध्यम से पॉलीप बेल-आउट और कैल्शियम मुक्त समुद्री जल में इनक्यूबेशन शामिल हैं।

Protocol

वर्तमान अध्ययन के लिए, पोसिलोपोरा वेरुकोसा कोरल प्रजातियों से संबंधित एक कॉलोनी को हथौड़ा और छेनी का उपयोग करके डाइविंग करके स्कूबा द्वारा अल फहल रीफ (22.305118 एन; 38.964568 ई) से एकत्र किया गया था। कॉलोनी के जीनस को रूपात्मक रूप से पहचाना गया था, और इसकी प्रजातियों को पहले प्रकाशित कार्य के आधार पर पी वेरुकोसा के रूप में वर्गीकृत किया गया था, जिसमें शामिल हैं पोसिलोपोरा लाल सागर से, यह दर्शाता है कि, आनुवंशिक दृष्टिकोण से, इस क्षेत्र में मौजूद प्रजातियां पी। अल फहल रीफ एक संरक्षित पर्यावरण क्षेत्र का हिस्सा नहीं है, और प्रवाल संग्रह के लिए किसी विशेष परमिट की आवश्यकता नहीं थी। कॉलोनी को खंडित होने और इसके पॉलीप्स "बेल-आउट" होने से पहले एक महीने के लिए 300 एल मछलीघर में रखा गया था। मछलीघर को दो मछलीघर हीटर, तीन पंप और दो प्रकाश स्रोतों (सामग्री की तालिका देखें) के साथ 26 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था, जो 12 घंटे के प्रकाश चक्र को बनाए रखता है। मछलीघर का तापमान दो हीटरों में से प्रत्येक को तापमान नियंत्रक से जोड़कर बनाए रखा गया था। प्रकाश उत्सर्जन को सुबह 6 बजे शुरू करने और शाम 6 बजे समाप्त करने के लिए प्रोग्राम किया गया था, जिससे एक विकिरण वक्र का उत्पादन हुआ जो 230 μmol फोटॉनों के साथ 12 बजे चरम पर था एम−2एस−1।

1. पानी के वाष्पीकरण के बाद उच्च लवणता से पॉलीप बेल-आउट

नोट: इस विधि को शापिरो एट अल .25 से अनुकूलित किया गया था। यदि पोसिलोपोरा वेरुकोसा की तुलना में विभिन्न प्रजातियों का उपयोग करते हैं, तो काटे जाने वाले टुकड़े के आकार को निर्धारित करने से पहले पॉलीप्स के आकार को ध्यान में रखा जाना चाहिए।

  1. विकर्ण काटने वाले सरौता का उपयोग करके एक मूंगा कॉलोनी से छोटे टुकड़े (लंबाई में 1 सेमी से कम) काटें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: उपयोग की जा रही मूंगा प्रजातियों के अनुसार काटने के उपकरण को अनुकूलित करें। विकर्ण सरौता पतली शाखाओं के साथ कोरल काटने के लिए उपयोगी होते हैं। वर्तमान अध्ययन में, प्रत्येक उपचार के लिए एक टुकड़ा काट दिया गया था, लेकिन वांछित पॉलीप्स की संख्या के आधार पर टुकड़ों की संख्या और आकार भिन्न हो सकते हैं। कटे हुए टुकड़ों का आकार वाष्पीकरण के बाद पानी की गहराई से अधिक नहीं होना चाहिए, इसलिए प्रक्रिया पूरी होने के बाद कोरल पूरी तरह से पानी के अंदर रहते हैं।
  2. कटे हुए टुकड़ों को 12 मिलीलीटर समुद्री जल से भरे छोटे पेट्री व्यंजनों में रखें, जिसमें मूंगा कॉलोनी को आदी किया गया है। यह कृत्रिम समुद्री जल हो सकता है ( सामग्री की तालिका देखें) या उसी लवणता पर फ़िल्टर किया गया समुद्री जल जैसा कि कोरल कॉलोनी को विखंडन से पहले डाला गया था।
    नोट: पानी के साथ टुकड़े को पूरी तरह से कवर करना महत्वपूर्ण है। यदि पेट्री डिश में 12 एमएल कटे हुए टुकड़े को कवर करने के लिए पर्याप्त नहीं है, तो कंटेनर और तदनुसार वॉल्यूम का अनुकूलन करें। वर्तमान अध्ययन में, उपयोग किए गए पानी को लाल सागर से एकत्र किया गया था, और इसकी लवणता 40 पीएसयू थी, जिसे मल्टीपैरामीटर मीटर द्वारा मापा गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. प्लेट को परिवेश के तापमान पर ~ 24 घंटे के लिए खुला छोड़ दें ताकि पानी वाष्पित हो सके और इसकी लवणता धीरे-धीरे बढ़ सके। जब ऊतक पाचन पॉलीप्स के बीच अवलोकन योग्य होता है, तो चरण 1.4 पर आगे बढ़ें।
    नोट: इनक्यूबेशन समय बीतने के बाद, पानी की लवणता शुरुआत की तुलना में लगभग 40% अधिक होनी चाहिए, और पॉलीप्स को कंकाल से अलग होने के लिए तैयार होना चाहिए।
  4. एक 1 एमएल हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर, मूंगा ऊतक के करीब एक कोमल प्रवाह बनाने के लिए। प्रवाह धीरे-धीरे पॉलीप्स की पूरी टुकड़ी में मदद करेगा जो पहले से ही कंकाल से उनके चारों ओर के ऊतक को पचा चुके हैं।
    नोट: जब पानी का प्रवाह पिपेट के साथ बनाया जाता है, तो अलग-अलग पॉलीप्स या पॉलीप्स के समूहों को गुच्छे के रूप में कंकाल से आना चाहिए। यदि इसके बजाय एक बादल पदार्थ निकलता है, तो यह ऊतक मृत्यु या विघटन को इंगित करता है, जिसका अर्थ है कि कोरल को बहुत लंबे समय तक या बहुत तनावपूर्ण स्थिति में ऊष्मायन किया गया था (इस मामले में, उच्च लवणता)। पॉलीप्स को अलग करने के लिए पानी का एक कोमल प्रवाह बनाना बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि एक मजबूत प्रवाह उन्हें शारीरिक नुकसान पहुंचा सकता है।
  5. धीरे-धीरे आइसोस्मोटिक पानी के साथ पेट्री डिश में पानी का आदान-प्रदान करें (चरण 1.2 के समान पानी का उपयोग करें। 10 मिनट से अधिक 50% पानी का आदान-प्रदान पॉलीप्स को गैर-तनावपूर्ण लवणता की स्थिति में वापस लाने के लिए पर्याप्त है।
    नोट: जैसा कि लाल सागर से पोसिलोपोरिड प्रजातियों पोसिलोपोरा वेरुकोसा की प्रवाल कॉलोनियों का उपयोग किया गया था, यह निर्धारित करने के लिए परीक्षण किए गए थे कि इस अद्वितीय वातावरण से कोरल किन विशिष्ट परिस्थितियों में बेल-आउट करेंगे। अधिकांश अन्य चट्टान वातावरण की तुलना में लाल सागर की उच्च लवणता को उजागर करना महत्वपूर्ण है।

2. उच्च लवणता समुद्री जल आपूर्ति द्वारा पॉलीप बेल-आउट

नोट: इस विधि को चुआंग एट अल .27 से अनुकूलित किया गया था।

  1. समुद्री जल में एनएसीएल जोड़कर उच्च लवणता समुद्री जल के 3 एल तैयार करें जब तक कि लवणता 85% तक बढ़ न जाए, जिसे लवणता जांच द्वारा मापा जाता है।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, लाल सागर से 40 पीएसयू समुद्री जल से 74 पीएसयू उच्च लवणता समुद्री जल तैयार किया गया था।
  2. चरण 1.1 में वर्णित मूंगा के छोटे टुकड़ों को काटें।
  3. कटे हुए टुकड़ों को 3 एल आइसोस्मोटिक समुद्री जल (इस मामले में, कोरल के लिए गैर-तनावपूर्ण लवणता के साथ समुद्री जल, चरण 1.2 में उपयोग किए जाने वाले समान) से भरे 10 एल कंटेनर में रखें जो एक पेरिस्टाल्टिक पंप से जुड़ा हुआ है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: प्रवाल स्वास्थ्य के बेहतर रखरखाव के लिए, तापमान नियंत्रकों, वायु पंप, और रोशनी को उसी मछलीघर की स्थिति का अनुकरण करने के लिए जोड़ा जा सकता है जैसा कि कॉलोनी पहले उजागर हुआ था। वर्तमान काम में इनक्यूबेशन के दौरान, मूंगा के टुकड़ों को 12 घंटे के दैनिक प्रकाश चक्र के तहत 26 डिग्री सेल्सियस पर कंटेनरों में रखा गया था। पानी की गति और तापमान के समरूपता को वायु पंपों द्वारा बनाए रखा गया था।
  4. घंटा दर पर 24 घंटे के लिए पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके चरण 2.1 में तैयार उच्च लवणता वाले समुद्री जल के साथ मूंगा टुकड़ों वाले कंटेनर को भरें। लगभग 40% की बढ़ती लवणता पर कुल 3 एल पानी जोड़ें।
    नोट: इच्छित लवणता तक पहुंचने तक समुद्री जल में एनएसीएल जोड़कर उच्च लवणता वाले पानी का उत्पादन किया जा सकता है।
  5. कंकाल से पॉलीप्स जारी करने के लिए एक पिपेट के साथ एक कोमल पानी का प्रवाह बनाएं (चरण 1.4।)।
  6. धीरे-धीरे उस पानी का आदान-प्रदान करें जिसमें पॉलीप्स आइसोस्मोटिक पानी के लिए निहित हैं (चरण 1.5।)। इसके बाद, चरण 4 या चरण 5 पर जाएं।

3. कैल्शियम मुक्त समुद्री जल इनक्यूबेशन द्वारा पॉलीप बेल-आउट

नोट: इस विधि को पांग एट अल .24 से अनुकूलित किया गया था।

  1. 26.29 ग्राम एनएसीएल, 0.872 ग्राम केसीएल, 2.16 ग्राम एमजीएसओ 4, एमजीसीएल 2 के 11.94 ग्राम, ना2एसओ 4 के 3.42 ग्राम, और नाएचसीओ3 के 0.286 ग्राम (सामग्री की तालिका देखें) को 1 एल विआयनीकृत पानी में जोड़कर कैल्शियम मुक्त कृत्रिम समुद्री जल (सीएएफएसडब्ल्यू) समाधान तैयार करें।
    नोट: यह समाधान पिछले प्रोटोकॉल से समायोजित किया गया था ताकि 40 पीएसयू की लवणता के लिए अनुकूल कोरल के लिए बेहतर अनुकूल हो सके। अन्य लवणता स्थितियों के अनुकूल कोरल के लिए, लवण के समान अनुपात का उपयोग करें, लेकिन लवणता प्राप्त करने के लिए विलेय के कुल द्रव्यमान को समायोजित करें जो उपयोग में कोरल के लिए बेहतर अनुकूल है।
  2. चरण 1.1 में वर्णित कोरल के छोटे टुकड़े काटें।
  3. पहले तैयार किए गए सीएएफएसडब्ल्यू से भरे पेट्री व्यंजनों में मूंगा के टुकड़ों को डुबोएं (चरण 3.1.) और उन्हें 3 घंटे के लिए 80 आरपीएम रोटेशन गति पर कक्षीय इनक्यूबेटरों में सेते हैं।
    नोट: फिर से, पानी के साथ टुकड़े को पूरी तरह से कवर करना महत्वपूर्ण है। यदि एक पेट्री डिश टुकड़े को कवर करने के लिए पर्याप्त नहीं है, तो प्रयोगात्मक आवश्यकता के अनुसार कंटेनर और वॉल्यूम का अनुकूलन करें।
  4. 40 पीएसयू कृत्रिम समुद्री जल के साथ तैयार 20% दुलबेको के संशोधित ईगल मीडिया (डीएमईएम) और 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन समाधान (सामग्री की तालिका देखें) से भरे पेट्री व्यंजन या 6-अच्छी तरह से प्लेटों में टुकड़ों को स्थानांतरित करें। 26 डिग्री सेल्सियस और 80 आरपीएम पर टुकड़ों सेते हैं, हर दिन मीडिया का आदान-प्रदान करते हैं जब तक कि पॉलीप्स के बीच ऊतक पाचन अवलोकन योग्य न हो और व्यक्तिगत पॉलीप्स कंकाल से अलग होने लगते हैं।
    नोट: ज्यादातर मामलों में, ऊतक पाचन इस मीडिया में इनक्यूबेशन के 20 घंटे के भीतर पूरा हो गया है, और कोई आदान-प्रदान की आवश्यकता नहीं है।
  5. एक पिपेट का उपयोग कर प्रारंभिक वसूली के लिए निष्फल समुद्री जल के लिए पॉलीप्स स्थानांतरण। इनक्यूबेशन के 1 घंटे के बाद, चरण 4 या चरण 5 पर जाएं।

4. पेट्री व्यंजनों में पॉलीप रखरखाव

  1. एक बार जब पॉलीप्स गैर-तनावपूर्ण लवणता के साथ फ़िल्टर किए गए समुद्री जल में वापस आ जाते हैं, तो स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत सिलिअरी प्रवाह के कारण ऊतक अखंडता और आंदोलन को देखकर व्यवहार्य पॉलीप्स का चयन करें।
  2. चयनित पॉलीप्स को एक ग्लास या प्लास्टिक पेट्री डिश में रखें और पेट्री डिश को प्लवक नेट (200 μm मेष आकार, सामग्री की तालिका देखें) के साथ कवर करें ताकि पॉलीप्स डिश से दूर न तैरें।
    नोट: जाल नेट का आकार पॉलीप्स के आकार के अनुसार भिन्न हो सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जाल में छिद्र होने चाहिए जो पॉलीप्स से छोटे होते हैं और पानी के आदान-प्रदान और प्रकाश प्रवेश की अनुमति देते हैं।
  3. उपयोग की जाने वाली मूंगा प्रजातियों के लिए उपयुक्त परिस्थितियों के साथ एक मछलीघर के अंदर पेट्री डिश रखें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, शर्तें 26 डिग्री सेल्सियस और 12 घंटे प्रकाश चक्र पर 40 पीएसयू फ़िल्टर किए गए समुद्री जल थीं।
  4. पानी को नवीनीकृत करने और व्यंजनों को साफ करने के लिए सप्ताह में कम से कम एक बार पेट्री व्यंजन खोलें। शैवाल अतिवृद्धि को खत्म करने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है जो स्थानीय रूप से विषाक्त यौगिकों को जारी करके कोरल पॉलीप्स के साथ प्रतिस्पर्धा या क्षति पहुंचा सकता है।

5. इनक्यूबेटरों में पॉलीप रखरखाव

  1. चरण 4.1 में वर्णित व्यवहार्य पॉलीप्स का चयन करें।
  2. स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर आइसोस्मोटिक समुद्री जल के 50 मिलीलीटर से भरा 75 सेमी2 सतह सेल फ्लास्क में पॉलीप्स रखें।
    नोट: वर्तमान कार्य में, लाल सागर से एकत्र किए गए फ़िल्टर किए गए समुद्री जल का उपयोग पॉलीप रखरखाव के लिए किया गया था। चरण 1.2 में उपयोग किए गए समान विशेषताओं वाले पानी का उपयोग किया जा सकता है।
  3. फ्लास्क बंद करें और उन्हें इनक्यूबेटर में ले जाएं। इनक्यूबेटरों को 26 डिग्री सेल्सियस और 40 आरपीएम पर 12 घंटे प्रकाश चक्रों में सेट करें। हर 4 दिनों में पानी की मात्रा का 50% एक्सचेंज करें और सामग्री को फ्लास्क को साफ करने के लिए स्थानांतरित करें जब / यदि वे दीवारों पर शैवाल या बायोफिल्म से भरे होते हैं।
    नोट: छवियों को प्रतिनिधि परिणामों के लिए एचडी कैमरा ( सामग्री की तालिका देखें) से लैस पूरी तरह से एपोक्रोमैटिक ज़ूम सिस्टम के साथ कैप्चर किया गया था।

Representative Results

पॉलीप बेल-आउट को तीन अलग-अलग तरीकों (चित्रा 1) का पालन करते हुए प्रजातियों पी वेरुकोसा की एक कॉलोनी से संबंधित मूंगा टुकड़ों में प्रेरित किया गया था। पानी वाष्पीकरण के बाद उच्च लवणता से प्रेरित बेल-आउट परिवेश के तापमान पर पेट्री व्यंजनों में मूंगा टुकड़ों के इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद पूरा हो गया था, जो शुरू में 40 पीएसयू में पानी से भरा हुआ था, जो तब प्रक्रिया समाप्त होने के बाद 59 पीएसयू की अंतिम लवणता तक पहुंच गया था (चित्रा 2 ए-सी, आई)। खारे पानी की आपूर्ति द्वारा बेल-आउट भी 40 पीएसयू में शुरू में पानी में इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद पहुंच गया था जो 12 घंटे के बाद 52 पीएसयू और प्रक्रिया के अंत में 59 पीएसयू की लवणता तक पहुंच गया था, 24 घंटे के बाद (चित्रा 2 डी-एफ, आई)। दोनों प्रयोगों में, लवणता में वृद्धि पॉलीप्स द्वारा ऊतक पाचन के प्रेरण के लिए जिम्मेदार थी। 12 घंटे के बाद, उच्च लवणता की स्थिति ने कोनोसार्क के क्रमिक पतले होने के साथ संयोजन के रूप में पॉलीप्स के संकुचन का कारण बना, अंततः 24 घंटे के बाद पॉलीप्स की अंतिम टुकड़ी का कारण बना। कैल्शियम मुक्त समुद्री जल में इनक्यूबेशन के माध्यम से बेल-आउट प्रेरण सीएएफएसडब्ल्यू में 3 एच इनक्यूबेशन के बाद पूरा हो गया था, इसके बाद 20% डीएमईएम मीडिया (चित्रा 2 जी-एच) में 20 एच इनक्यूबेशन था। ऊतक व्यक्तिगत मूंगा जंतु (चित्रा 3 ए-सी) और "ऊतक गेंदों" उत्पन्न होने तक एक पिपेट के साथ दूर धक्का देने के बाद सभी तीन तरीकों से कंकाल से अलग हो गया था।

टुकड़ी के बाद, सभी तीन तरीकों से पॉलीप्स एकत्र किए गए थे और जाल या सेल फ्लास्क के साथ कवर पेट्री व्यंजनों को आवंटित करने से पहले समुद्री जल में ठीक होने की अनुमति दी गई थी। वाष्पीकरण और पानी की आपूर्ति विधियों से प्राप्त पॉलीप्स को एक्वैरियम के अंदर पेट्री व्यंजनों में बनाए रखा गया था और क्रमशः 6 सप्ताह और 8 सप्ताह तक जीवित रहा (चित्रा 3 डी और चित्रा 3 एफ)। इन माइक्रोप्रोपेगेट्स ने पॉलीप्स की सामान्य शारीरिक रचना को बनाए रखा, तम्बू, बेसल डिस्क और मुंह पेश किया1. कैल्शियम मुक्त समुद्री जल में इनक्यूबेशन के माध्यम से प्राप्त पॉलीप्स का जीवनकाल कम था, जो 1 दिन तक जीवित रहता था, जिसके बाद उनके ऊतक अलग हो जाते थे। इनक्यूबेटरों के अंदर सेल संस्कृति फ्लास्क में रखे समुद्री जल वाष्पीकरण विधि से प्राप्त पॉलीप्स ऊतकों के पृथक्करण (चित्रा 3 एफ) के बिना 3 सप्ताह तक जीवित रहे। सभी मामलों में, भले ही पॉलीप्स सब्सट्रेट से संलग्न नहीं हो सकते थे, वे नेत्रहीन स्वस्थ थे और अपने रंग को बनाए रखते थे, ज़ोक्सांथेला कोशिकाएं अभी भी अपने ऊतकों के अंदर दिखाई दे रही थीं1.

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगशाला स्थितियों (दाएं) में अधिग्रहित पॉलीप्स को बनाए रखने के लिए दो तरीकों के चित्रण के बाद पॉलीप बेल-आउट प्रेरण (बाएं) के लिए तीन अलग-अलग परीक्षण पद्धतियों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) पानी के वाष्पीकरण द्वारा पॉलीप बेल-आउट के लिए पद्धति का प्रतिनिधित्व। (बी) उच्च लवणता समुद्री जल आपूर्ति द्वारा पॉलीप बेल-आउट के लिए पद्धति का प्रतिनिधित्व। (सी) कैल्शियम मुक्त समुद्री जल इनक्यूबेशन द्वारा पॉलीप बेल-आउट के लिए पद्धति का प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: कोरल प्रजातियों के टुकड़ों का उपयोग करके तीन अलग-अलग तरीकों से प्रेरित पॉलीप बेल-आउट प्रक्रिया की छवियां पी। (ए-सी) पानी वाष्पीकरण विधि का उपयोग करके पेट्री डिश में क्रमशः इनक्यूबेशन के बाद 0 घंटे, 12 घंटे और 24 घंटे पर एक मूंगा टुकड़ा। (डी-एफ) उच्च लवणता समुद्री जल आपूर्ति विधि का उपयोग करके क्रमशः इनक्यूबेशन के बाद 0 घंटे, 12 घंटे और 24 घंटे पर एक मूंगा टुकड़ा। (जी, एच) कैल्शियम मुक्त समुद्री जल के संपर्क में आने वाले मूंगा के टुकड़े क्रमशः पहले और बाद में विधि इनक्यूबेशन हैं। कैल्शियम मुक्त कृत्रिम समुद्री जल में ऊष्मायन 3 घंटे के लिए और 20% डीएमईएम में 21 घंटे के लिए थे (I) पानी के वाष्पीकरण और उच्च लवणता समुद्री जल आपूर्ति बेल-आउट प्रेरण विधियों के दौरान समय के साथ समुद्री जल के पीएसयू में लवणता मूल्यों का चित्रमय प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: तीन प्रदर्शित बेल-आउट प्रेरण प्रक्रियाओं से प्राप्त पी वेरुकोसा पॉलीप्स की छवियां( ए-सी) क्रमशः वाष्पीकरण, खारे पानी की आपूर्ति और कैल्शियम मुक्त समुद्री जल विधियों से प्राप्त पॉलीप्स की छवियों को कंकाल से अलग होने के तुरंत बाद कब्जा कर लिया गया था। (डी) पेट्री डिश में 6 सप्ताह तक जीवित रहने के बाद वाष्पीकरण विधि से प्राप्त एक मूंगा पॉलीप की छवि। (ई) पेट्री डिश में 8 सप्ताह तक जीवित रहने के बाद खारे पानी की आपूर्ति विधि से प्राप्त एक मूंगा पॉलीप की छवि। (एफ) सेल संस्कृति फ्लास्क में 3 सप्ताह जीवित रहने के बाद वाष्पीकरण विधि से प्राप्त एक मूंगा पॉलीप की छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

बेल-आउट प्रक्रियाओं में प्रस्तुत किए जाने के बाद पॉलीप्स जीवित रहने की दर और प्रक्रिया को पूरा करने के लिए आवश्यक समय पहले से रिपोर्ट किए गए शोध 25,33,41 के बीच भिन्न होता है, जिसे संभवतः प्रत्येक अध्ययन में लागू विभिन्न प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों द्वारा समझाया गया है। उदाहरण के लिए, विभिन्न प्रवाल प्रजातियां, या यहां तक कि एक ही प्रजाति के कोरल, लेकिन विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों (जैसे, लाल सागर से कोरल) के आदी, लवणता के स्तर के लिए अलग-अलग थ्रेसहोल्ड प्रस्तुत करते हैं। चयनित बेल-आउट की विधि और प्रयोगशाला / मछलीघर की स्थिति भी परिणामों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। कुछ मामलों में, प्रयोगशाला स्थितियों के तहत कोरल माइक्रोप्रोपेगेट्स के रखरखाव ने एज़ोक्सैंथेलेट 3 3,41 और ज़ोक्सैंथेलेट25 कोरल में जीवित रहने के महीनों तक पहुंचकर कोरल सेल संस्कृतियों के अस्तित्व के समय को पार कर लिया है। पॉलीप बेल-आउट प्रक्रिया को पूरा करने का समय भी विभिन्न अध्ययनों में भिन्न होता है, कुछघंटों 2 5,2 7,30 से लेकर सप्ताह3 5 तक इनक्यूबेशन बेल-आउट पैदा करने के लिए जिम्मेदार तनाव के संपर्क में आते हैं। पॉलीप बेल-आउट का अध्ययन करते समय ध्यान में रखा जाने वाला एक और चर तीव्र तनाव के संपर्क में आने के बाद पॉलीप्स की वसूली है जिसने उनकी रिहाई को ट्रिगर किया। यह अभी भी बहस का विषय है कि क्या बेल-आउट के बाद पॉलीप्स कोरल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए मॉडल के रूप में उपयोग किए जाने के लिए पर्याप्त स्थिति में हैं। इन माइक्रोप्रोपेगेट्स का उपयोग करते समय कोनोसार्क के क्षरण के बाद उनके ऊतकों की वसूली चिंता का विषय है। हालांकि, वर्तमान सहित कई अध्ययनों में पॉलीप्स, अपने ऊतकों और बाहरी आकृति विज्ञान के अंदर ज़ोक्सांथेला कोशिकाओं को बरकरार मौखिक-अबोरल ध्रुवीकरण और 25,27,32,36 के बाद टेंटकल्स के साथ पेश करने में सक्षम रहे हैं। पिछले अध्ययनों में यह भी पाया गया है कि, तीव्र तनाव से राहत मिलने के बाद, अत्यधिक खारा या गर्म समुद्री जल के संपर्क में आने वाले प्रवाल पॉलीप्स एपोप्टोसिस, प्रोटियोलिसिस और कोशिका विभाजन जैसी प्रक्रियाओं से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति को पुनर्प्राप्त करने में सक्षम हैं, जो बेल-आउट32,36 से पहले पाए गए स्तरों के समान हैं और यहां तक कि ऊतक उपचार 36 से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए भी।

विधियों के बीच अस्तित्व में अंतर के संबंध में, यह उजागर करना महत्वपूर्ण है कि यह समय विभिन्न प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकता है, भले ही एक ही तकनीक का उपयोग किया जाता है, और यह उपयोग किए गए टुकड़ों के स्वास्थ्य और बेल-आउट प्रक्रिया के बाद पॉलीप्स के उचित रखरखाव से संबंधित हो सकता है। कैल्शियम मुक्त समुद्री जल इनक्यूबेशन के माध्यम से बेल-आउट के मामले में, पॉलीप अस्तित्व 1 दिन तक सीमित था। इस प्रकार, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि विधि अध्ययन की गई प्रजातियों के दीर्घकालिक अस्तित्व के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है, या लाल सागर से पी वेरुकोसा कोरल के लिए तकनीक का बेहतर अनुकूलन किया जाना चाहिए। रिपोर्ट किए गए परिणामों से पता चला कि लवणता में क्रमिक वृद्धि के आधार पर विधियों के साथ लंबे समय तक जीवित रहने का समय प्राप्त किया गया था, जब पॉलीप्स को उच्च लवणता वाले पानी के टपकने के अधीन किया गया था। यह विधि वाष्पीकरण विधि की तुलना में लवणता में अधिक नियंत्रित वृद्धि प्रदान कर सकती है, साथ ही मूंगा के चयापचय अपशिष्ट सहित समुद्री जल में पाए जाने वाले अन्य पदार्थों की एकाग्रता में वृद्धि के लिए जिम्मेदार नहीं है, जो जीव के लिए संभावित रूप से विषाक्त है। इन सभी कारणों से, इस पद्धति को स्वस्थ पॉलीप्स27 को बनाए रखने के लिए एक सुरक्षित विकल्प के रूप में सुझाया गया है। यद्यपि इस पद्धति को पॉलीप स्वास्थ्य के लिए सुरक्षित होने की परिकल्पना की गई है और लंबे समय तक रहने वाले पॉलीप्स का उत्पादन करने में सक्षम है, एक तथ्य जो इस वर्तमान प्रकाशन में पुष्टि की गई थी, इसकी पुष्टि करने के लिए अतिरिक्त सर्वेक्षणों की आवश्यकता है। दोनों उच्च लवणता-प्रेरित बेल-आउट प्रयोगों ने 24 घंटे में लवणता 59 पीएसयू तक पहुंचने के बाद पॉलीप्स की एक पूरी टुकड़ी का प्रदर्शन किया। यदि लवणता उस स्तर से आगे बढ़ जाती है जिस पर बेल-आउट पूरा हो जाता है, तो पॉलीप्स को और तनाव होगा, जिससे तीव्र तनाव उपचार से बचने और ठीक होने की संभावना कम हो जाएगी। इसलिए, इस तरह के लवणता के स्तर में पॉलीप्स को लंबे समय तक बनाए रखने की सिफारिश नहीं की जाती है। कैल्शियम मुक्त समुद्री जल के संपर्क में आकर बेल-आउट प्रेरण विधि का प्रदर्शन करते समय, कैल्शियम मुक्त कृत्रिम समुद्री जल में 3 घंटे के इनक्यूबेशन से एक पूर्ण टुकड़ी प्राप्त की गई थी, जिसका अर्थ है कि इस माध्यम के आगे के संपर्क की भी सिफारिश नहीं की जाती है।

इन विट्रो सर्वेक्षणों में कोरल पॉलीप्स के अध्ययन के लिए अधिक पर्याप्त तरीकों को संबोधित करने के लिए, इस अध्ययन ने केवल तीन प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित किया, जिन्हें बेल-आउट प्रक्रिया को पूरा होने में लगभग 24 घंटे लगे और उन अध्ययनों में उपयोग किया गया जिनमें स्क्लेरैक्टिनियन कोरल से कोरल पॉलीप्स का दीर्घकालिक रखरखाव शामिल था। इस समय की तुलना में काफी अधिक समय लेने के लिए रिपोर्ट किए गए अन्य तरीकों को व्यस्त नहीं किया गया था। इस अध्ययन में एक सब्सट्रेट के लिए पॉलीप्स के निपटान का प्रयास नहीं किया गया था, जो पॉलीप्स के उत्पादन पर केंद्रित था जिसे विभिन्न वातावरणों में स्थानांतरित किया जा सकता था या डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग करके विश्लेषण के लिए आसानी से एकत्र किया जा सकता था। परिणाम बताते हैं कि कोरल प्रजातियों से पॉलीप्स पी वेरुकोसा को जीवित रखा गया था, संबंधित ज़ोक्सांथेला कोशिकाओं, स्वस्थ दृश्य स्थिति और एक संरक्षित सकल बाहरी शारीरिक संरचना के साथ, 8 सप्ताह तक, यहां तक कि सब्सट्रेट से लगाव के बिना भी। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि इस अध्ययन में प्रदर्शित कुछ तकनीकों का उपयोग करके एकल मूंगा टुकड़ों से अधिक जैविक प्रतिकृतियां उत्पन्न की जा सकती हैं। इस तरह के जैविक प्रतिकृतियों को नियंत्रित वातावरण (जैसे पेट्री डिश और सेल फ्लास्क) में रखा जा सकता है और महीने भर के प्रयोगों के लिए प्रयोगशाला स्थितियों में बनाए रखा जा सकता है और कई उद्देश्यों के लिए उपयोग किया जा सकता है।

पॉलीप बेल-आउट42,43 के पहले आकस्मिक विवरणों के बाद से, पॉलीप रिलीज को प्रेरित करने और ऐसे पॉलीप्स को जीवित रखने के लिए अधिक मानकीकृत तरीकों को खोजने के लिए नए प्रोटोकॉल स्थापित किए गए हैं, जिनका उपयोग भविष्य के अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। इनमें कोरल होलोबियंट फिजियोलॉजी44 और होस्ट-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन45 से जुड़े विभिन्न पहलुओं की जांच करना, कोरल ब्लीचिंग5,25 में शामिल आणविक तंत्र, और कोरल होलोबियंट 12,13,46,47 के स्वास्थ्य, लचीलापन और सुरक्षा शामिल हैं। . इसके अलावा, जारी किए गए कोरल पॉलीप्स का उपयोग अनुसंधान के दायरे के बाहर अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है और प्रोपेग्यूल बनाने के लिए उपयोगी होने का सुझाव दिया गया है जो एक सब्सट्रेट से जुड़ सकते हैं और बढ़ सकते हैं, संभावित रूप से कई कोरल व्यक्तियों का निर्माण कर सकते हैं जिनका उपयोग बहाली उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है एक बार बेल-आउट के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल व्यापक हो जाते हैं28 . कुल मिलाकर, हालांकि पद्धति को मानकीकृत करने के लिए बेल-आउट पॉलीप्स का उपयोग करके अधिक गहराई से प्रयोग किए जाने चाहिए, यह दिखाया गया है कि पॉलीप बेल-आउट एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दृष्टिकोण है जिसे कई उद्देश्यों के लिए मूंगा अनुसंधान में एक उपकरण के रूप में लागू किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम प्रवाल पॉलीप्स के प्रयोगों और निगरानी में उनके समर्थन के लिए एडम बार्नो और फ्रांसिस्का गार्सिया को धन्यवाद देते हैं। हम मछलीघर रखरखाव और बुनियादी ढांचे के बारे में उनकी सहायता के लिए केएयूएसटी तटीय और समुद्री संसाधन कोर लैब को भी धन्यवाद देते हैं। अध्ययन को केएयूएसटी अनुदान संख्या बीएएस / 1/ 1095-01-01 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5560 Conductivity/Temperature Probe YSI 5560 Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter
Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers Ace Hardware 2004083 Used to cut coral fragments
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518 Used in DMEM medium.
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 41965-039 Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method
Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene Thermo Fisher Scientific FB0875713A Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium.
Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt Schego 548 Heaters used in aquarium
Leica Application Suite Version 4.2 Leica Microsystems NA Software used for image capture in demonstrative results
Leica IC80 HD Leica Microsystems 12730216 Camera used to take demonstrative results pictures
Leica MDG33 Leica Microsystems 10 450 123 Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures
Leica Z6 APO Leica Microsystems NA Macroscope used to take demonstrative results pictures
Magnesium Chloride Thermo Fisher Scientific 7487-88-9 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Magnesium Sulfate Anhydrous Sigma-Aldrich 7791-18-6 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor Masterflex HV-77602-10 Peristaltic pump head.
Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller Masterflex EW-07557-00 Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol.
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft Masterflex HV-96410-16 Tubing for peristaltic pump.
Millex 33 mm PVDF 0.22 µm Sterile RUO Sigma-Aldrich SLGVR33RS Used to filter artificial sea water.
Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface Thermo Fisher Scientific 156499 Flask usually used for cell culture used for polyp culture.
Orbital shaker, Advanced 5000, VWR VWR 444-2916 Shaker used inside incubator.
Percival Incubator - I-22VL Percival NA Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks.
Plankton net 200 µm mesh size KC Denmark NA Used for covering petri dishes containing coral polyps.
Potassium Chloride VWR Chemicals 7447-40-7 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
ProQuatro Multiparameter Meter YSI 606950 Used for measuring salinity thoughout the protocol
RADION XR15 G5 PRO Ecotech NA Lights used in aquarium
Red Sea Salt
Premium grade, moderate Alkalinity		 Red Sea NA Used to prepare 40 PSU artifical sea water.
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich 144-55-8 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
Sodium Sulfate Anhydrous VWR Chemicals 7757-82-6 Used for preparing calcium-free artificial seawater.
TRD 112 thermostat Schego NA Thermostat used in aquarium
Turbelle Nanostream 6025 Tunze 6025 000 Pumps used in aquarium

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जीव विज्ञान अंक 182 पॉलीप बेल-आउट माइक्रोप्रोपेगेशन पॉलीप अस्तित्व पोसिलोपोरा वेरुकोसा प्रवाल पॉलीप प्रवाल भित्तियों
प्रयोगशाला प्रायोगिक उपयोग के लिए व्यक्तिगत माइक्रोप्रोपेगेट प्राप्त करने के लिए कोरल कॉलोनियों में पॉलीप बेल-आउट को प्रेरित करना
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Cardoso, P. M., Alsaggaf, A. A.,… More

Cardoso, P. M., Alsaggaf, A. A., Villela, H. M., Peixoto, R. S. Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use. J. Vis. Exp. (182), e63840, doi:10.3791/63840 (2022).

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