Summary
Polyp bail-out er en proces induceret af akut stress, hvor koralpolypper fordøjer vævet, der forbinder dem med deres koloni og løsner sig fra det for at leve som individer. Den nuværende protokol beskriver, hvordan man inducerer koralmikroformering ved hjælp af hypersalin- eller calciumfrie havvandsbehandlinger.
Abstract
Koraller er koloniale dyr dannet af modulære enheder kaldet polypper. Koralpolypper er fysiologisk forbundet og forbundet med væv. Fænomenet polyp bail-out er en proces induceret af akut stress, hvor koralpolypper fordøjer vævet, der forbinder dem med resten af kolonien og i sidste ende løsner sig fra skelettet for at fortsætte med at leve som separate individer. Koralbiologer har anerkendt processen med polyp-bail-out i årevis, men først for nylig er de mikropropagater, der genereres af denne proces, blevet anerkendt som et modelsystem til koralbiologiske undersøgelser. Brugen af polyp bail-out kan skabe et stort antal klonale enheder fra et enkelt koralfragment. En anden fordel er, at enkeltpolypper eller pletter af polypper let kan visualiseres under et mikroskop og vedligeholdes i meget standardiserede lavprismiljøer såsom petriskåle, kolber og mikrofluidiske chips. Denne protokol demonstrerer reproducerbare metoder, der er i stand til at fremkalde koralmikroformering og forskellige tilgange til at holde de enkelte polypper i live på lang sigt. Denne metode var i stand til med succes at dyrke polypper af koralarten Pocillopora verrucosa i op til 8 uger efter bail-out og udstille det praktiske ved at bruge individuelle koralpolypper til koralforskning.
Introduction
Scleractinian eller reef-building koraller er cnidarians, der er i stand til at danne karbonatskeletter, skabe rev og strukturelt komplekse økosystemer, der kan findes fra dybe til lavvandede miljøer1. Tropiske koralrev er vært for høj biodiversitet og leverer vigtige økosystemtjenester såsom kystbeskyttelse og fiskerivedligeholdelse2. De fleste lavvandede revbyggende koraller er afhængige af et mutualistisk forhold til alger af familien Symbiodiniaceae, som giver den energi, som koraller har brug for til at bygge deres skeletter. Symbiosen mellem korallerne og algerne kan brydes af miljøbelastning, hvilket forårsager koralblegning 3,4,5,6. Nylige temperaturanomalier har forårsaget store koralblegningshændelser rundt om i verden, hvilket har ført til massekoraldødelighed og permanent nedbrydning af rev 7,8,9,10,11. Da dette fænomen er baseret på udvisning af symbionter ved postvarmestressassocierede cellulære mekanismer, såsom apoptose, autofagi og exocytose, kan koralblegning beskrives som en cellulær proces, der har konsekvenser på økosystemskala 5,6,12, hvilket betyder at have in vitro-kulturer af koralceller eller væv ville være anvendelig til at studere dette fænomen nøje.
På grund af betydningen af koralrev og de store trusler, de har stået over for, især i de sidste to årtier2, er koraller blevet fokus for forskning til beskyttelse og restaureringsformål over hele verden13. Udviklingen af tilgange og eksperimentelle systemer, der er pålidelige, reproducerbare og tilbyder minimal miljøpåvirkning for at studere koraller, er imidlertid en stor kamp på dette område.
Mikroformering defineres som in vitro-proliferation af en organismes genotype ved dyrkning af dens biologiske materiale i kontrollerede beholdere14,15. Dyrkning af celler, væv og organer har været afgørende for plante- og dyrebiologi i de seneste årtier. Det tillader massegengivelse af organismer i laboratorier, hurtig vurdering af forskellige behandlinger (såsom lægemidler og lægemidler) og direkte undersøgelse af cellefunktion 14,15,16,17. Generelt har in vitro-modeller været nyttige til at supplere og uddybe undersøgelserne af forskellige organismer under bedre kontrollerede fysiske og kemiske forhold. På grund af fordelene ved in vitro-dyrkningsteknikker er forskellige dyrecelle- og vævskulturteknologier blevet udviklet, optimeret og brugt som vigtige værktøjer inden for mange forskningsområder, hvor flere cellelinjer er blevet undersøgt og kommercialiseret til adskillige anvendelser 16,17,18.
Mange fremskridt i viden om celle- og vævskultur er blevet gjort siden den første dyrevævskultur i 188217, såsom brugen af naturlige og syntetiske medier, opfindelsen af etablerede cellelinjer og udviklingen af 3D-medier til at dyrke en lang række celletyper på en bedre måde16,17, 18,19. Cellebiologiområdet har dog mest fokuseret på en udvalgt gruppe af modelorganismer, mens mange taxa stadig ikke har veletablerede in vitro-kulturer af celler, væv eller organer20. For eksempel er der i koralforskning ikke blevet brugt udødeliggjorte cellelinjer i vid udstrækning til forskning, hvilket begrænser koralcelleforskning til brugen af primære cellekulturer. Disse kulturer har levedygtighed begrænset til et par uger21, uden undersøgelser, der registrerer overlevelsen af individuelle celler fra alle koralvæv i mere end 13 dage indtil begyndelsen af 202122. Den første rapport om bæredygtige koralcellelinjer, der blev offentliggjort, var med Acropora tenuis-celler, der levede op til 6 måneder, og nytten af disse celler til fremtidig forskning skal stadig undersøges23.
For at overvinde begrænsningerne i dyrkning af koralcellekulturer og for at opretholde en laboratoriekultur, der bevarer korallernes overordnede vævsorganisation, er brugen af isolerede polypper for nylig blevet foreslået som en model for koralbiologisk forskning24,25. Polypper er de anatomiske enheder af koraller, og hver af dem har en mund placeret i midten af deres orale disk og er forbundet med andre polypper af coenosarc i sin aborale region26. Adskillelsen af levende polypper sker naturligt ved processen med polyp bail-out, hvor akut stress forårsager fordøjelsen af coenosarc mellem polypperne, som derefter kan løsne sig fra koloniens skelet 25,27,28. Dette fænomen er rapporteret at forekomme i en række taxa, herunder octocorals 29,30,31, sorte koraller32 og scleractinske koraller25,27,28,32,33, og har været forbundet med flere miljømæssige stressfaktorer, såsom mangel på calcium i vand 24,34, øget surhedsgrad 35, hyperosmotiske tilstande 25,27,32,36, høje temperaturer36,37, sult33, lufteksponering25,30 og insekticidforurening28,38. Polyp bail-out er for eksempel blevet rapporteret i pocilloporid koraller19, som er bredt fordelt over hele verden og er almindeligt anvendt som modeller i koralforskning. Arter, der tilhører denne gruppe, såsom Pocillopora damicornis og Styllophora pistillata, har genereret ca. 30-40 mikropropagater fra et 5 mm fragment25. Dette tal understreger fordelen ved at bruge polyp bail-out som en metode til koralmikroformering, da det skaber mulighed for at generere mange genetisk identiske individer fra et lille stykke koral. Brugen af isolerede polypper til forskning har også de samme fordele som cellekulturer med hensyn til muligheden for at blive dyrket i kontrollerede laboratoriemiljøer, såsom kolber og petriskåle. Derudover har mikrofluidiske platforme til vedligeholdelse af levende polypper vist, at disse mikropropagater kan opbevares i relativt billige og let reproducerende miljøer med kontrolleret vandstrøm, overflade og temperatur24,25. Disse mikrofluidiske platforme kan også bruges til at visualisere levende koralstrukturer under et mikroskop direkte24,25.
I denne artikel opsummerer og demonstrerer vi de teknikker, der er udviklet til at isolere individuelle koralpolypper fra deres kolonier, og viser, hvordan man opretholder dem under laboratorieforhold for langsigtet kultur. De diskuterede metoder omfatter polyp bail-out gennem hyperosmotiske forhold ved fordampning og pumpning af havvand med høj saltholdighed og inkubation i calciumfrit havvand.
Protocol
Til denne undersøgelse blev en koloni tilhørende Pocillopora verrucosa koralarten indsamlet fra Al Fahal-revet (22.305118 N; 38.964568 E) ved DYKNING ved hjælp af en hammer og mejsel. Koloniens slægt blev identificeret morfologisk, og dens art blev klassificeret som P. verrucosa baseret på tidligere offentliggjort arbejde, herunder Pocillopora fra Rødehavet, hvilket indikerer, at arten i dette område fra et genetisk synspunkt er P. verrucosa39,40. Al Fahal-revet er ikke en del af et beskyttet miljøområde, og der var ikke behov for særlige tilladelser til koralindsamling. Kolonien blev holdt i et 300 L akvarium i en måned, før den blev fragmenteret og fik sine polypper "reddet ud". Akvariet blev holdt ved 26 ° C med to akvarievarmere, tre pumper og to lyskilder (se materialetabel) og opretholdt en 12 timers lyscyklus. Akvariet blev opretholdt ved at forbinde hver af de to varmeapparater til en temperaturregulator. Lysemission blev programmeret til at starte kl. 6 og slutte kl. 18, hvilket gav en bestrålingskurve, der toppede kl. 12 med 230 μmol fotoner m−2s−1.
1. Polyp bail-out ved høj saltholdighed efter vandfordampning
BEMÆRK: Denne metode blev tilpasset fra Shapiro et al.25. Hvis der anvendes andre arter end Pocillopora verrucosa, skal polyppernes størrelse tages i betragtning, inden størrelsen af det fragment, der skal skæres, bestemmes.
- Skær små fragmenter (mindre end 1 cm i længden) fra en koralkoloni ved hjælp af diagonal skæretang (se Materialetabel).
BEMÆRK: Tilpas skæreværktøjerne efter de anvendte koralarter. Diagonal tang er nyttige til at skære koraller med slanke grene. I den aktuelle undersøgelse blev der skåret et fragment for hver behandling, men antallet og størrelsen af fragmenter kan variere afhængigt af antallet af ønskede polypper. Størrelsen af de afskårne fragmenter må ikke overstige vandets dybde efter fordampning, så korallerne forbliver helt inde i vandet, efter at processen er færdig. - Læg de afskårne fragmenter i små petriskåle fyldt med 12 ml havvand, som koralkolonien er blevet akklimatiseret til. Dette kan være kunstigt havvand (se materialetabel) eller filtreret havvand med samme saltholdighed, som koralkolonien blev indsat i før fragmentering.
BEMÆRK: Det er vigtigt at dække fragmentet helt med vand. Hvis 12 ml i en petriskål ikke er nok til at dække det afskårne fragment, skal du optimere beholderen og volumenet i overensstemmelse hermed. I denne undersøgelse blev det udnyttede vand opsamlet fra Rødehavet, og dets saltholdighed var 40 PSU målt ved en multiparametermeter (se materialetabel). - Lad pladen stå åben i ~24 timer ved omgivelsestemperatur, så vandet kan fordampe, og saltholdigheden gradvist kan øges. Når vævsfordøjelsen kan observeres mellem polypper, fortsættes til trin 1.4.
BEMÆRK: Når inkubationstiden er gået, skal vandets saltholdighed være ca. 40% højere end i begyndelsen, og polypperne skal være klar til at blive løsnet fra skelettet. - Brug en 1 ml overførselspipette til at skabe en blid strøm tæt på koralvævet. Strømmen vil langsomt hjælpe den komplette løsrivelse af polypperne, der allerede har fordøjet vævet omkring dem fra skeletet.
BEMÆRK: Når vandstrømmen skabes med pipetten, skal separate polypper eller grupper af polypper komme ud af skelettet som flager. Hvis et overskyet stof kommer ud i stedet, indikerer det vævsdød eller opløsning, hvilket betyder, at korallerne blev inkuberet for længe eller i en for stressende tilstand (i dette tilfælde høj saltholdighed). Det er meget vigtigt at lave en blid strøm af vand for at løsne polypperne, da en stærkere strøm kan forårsage fysisk skade på dem. - Udskift langsomt vandet i petriskålen med isosmotisk vand (brug det samme vand som i trin 1.2.) ved hjælp af en pipette. En 50% vandudveksling over 10 minutter er nok til at akklimatisere polypperne tilbage til en ikke-stressende saltholdighedstilstand.
BEMÆRK: Da koralkolonier af pocilloporid-arten Pocillopora verrucosa fra Rødehavet blev brugt, blev der udført test for at bestemme under hvilke specifikke forhold korallerne fra dette unikke miljø ville redde. Det er vigtigt at fremhæve den høje saltholdighed i Rødehavet sammenlignet med de fleste andre revmiljøer.
2. Polyp redning ved høj saltholdig havvandsforsyning
BEMÆRK: Denne metode blev tilpasset fra Chuang et al.27.
- Forbered 3 liter havvand med høj saltholdighed ved at tilsætte NaCl til havvand, indtil saltholdigheden stiger med 85 %, målt ved hjælp af en saltholdighedssonde.
BEMÆRK: I den aktuelle undersøgelse blev der fremstillet et 74 PSU højsaltholdigt havvand fra 40 PSU havvand fra Det Røde Hav. - Skær små koralfragmenter som beskrevet i trin 1.1.
- Anbring de afskårne fragmenter i en 10 L beholder fyldt med 3 L isosmotisk havvand (i dette tilfælde havvand med ikke-stressende saltholdighed for korallerne, det samme som anvendt i trin 1.2) forbundet med en peristaltisk pumpe (se Materialetabel).
BEMÆRK: For bedre vedligeholdelse af korallernes sundhed kan temperaturregulatorer, luftpumper og lys tilføjes for at simulere de samme akvarieforhold, som kolonien tidligere var udsat for. Under inkubationen i det nuværende arbejde blev koralfragmenterne opbevaret i beholdere ved 26 °C under en 12 timers daglig lyscyklus. Vandbevægelsen og homogeniseringen af temperaturen blev opretholdt af luftpumper. - Beholderen indeholdende koralfragmenter fyldes med det højsaltholdige havvand, der er fremstillet i trin 2.1 ved hjælp af den peristaltiske pumpe i 24 timer med en hastighed på 126 ml/t. Tilsæt i alt 3 liter vand med en stigende saltholdighed på ca. 40%.
BEMÆRK: Vand med høj saltholdighed kan produceres ved blot at tilsætte NaCl til havvand, indtil det når den tilsigtede saltholdighed. - Der skabes en skånsom vandstrøm med en pipette for at frigøre polypperne fra skelettet (trin 1.4).
- Udskift langsomt det vand, hvori polypperne er indeholdt, med isosmotisk vand (trin 1.5.). Fortsæt derefter til trin 4 eller trin 5.
3. Polyp bail-out ved calciumfri havvand inkubation
BEMÆRK: Denne metode blev tilpasset fra Pang et al.24.
- Calciumfrit, kunstigt havvand (CaFSW) fremstilles ved tilsætning af 26,29 g NaCl, 0,872 g KCl, 2,16 gMgSO4, 11,94 g MgCl2, 3,42 g Na2SO4 og 0,286 g NaHCO3 (se materialetabel) til 1 liter deioniseret vand.
BEMÆRK: Denne opløsning blev justeret fra tidligere protokoller for at være bedre egnet til koraller tilpasset en saltholdighed på 40 PSU. For koraller, der er tilpasset andre saltholdighedsforhold, skal du bruge den samme andel salte, men justere den samlede masse af opløste stoffer for at opnå den saltholdighed, der er bedre egnet til de koraller, der er i brug. - Skær små fragmenter af koraller som beskrevet i trin 1.1.
- Nedsænk koralfragmenterne i petriskåle fyldt med CaFSW, der er fremstillet tidligere (trin 3.1.) og inkuber dem i orbitalinkubatorer ved en rotationshastighed på 80 o / min i 3 timer.
BEMÆRK: Igen er det vigtigt at dække fragmentet helt med vand. Hvis en petriskål ikke er nok til at dække fragmentet, skal du optimere beholderen og volumenet i henhold til det eksperimentelle behov. - Fragmenterne overføres til petriskåle eller 6-brønds tallerkener fyldt med 20% Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) og 100 mg/ml ampicillinopløsning (se materialetabel) tilberedt med 40 PSU kunstigt havvand. Fragmenterne inkuberes ved 26 °C og 80 o/min, og medier udskiftes hver dag, indtil vævsfordøjelsen kan observeres mellem polypperne, og de enkelte polypper begynder at løsne sig fra skelettet.
BEMÆRK: I de fleste tilfælde er vævsfordøjelsen fuldstændig inden for 20 timer efter inkubation i dette medie, og der er ikke behov for udvekslinger. - Overfør polypperne til steriliseret havvand til første genopretning ved hjælp af en pipette. Efter 1 times inkubation fortsættes til trin 4 eller trin 5.
4. Vedligeholdelse af polypper i petriskåle
- Når polypperne er returneret til filtreret havvand med ikke-stressende saltholdighed, skal du vælge levedygtige polypper ved at observere vævsintegritet og bevægelse forårsaget af ciliary flow under et stereomikroskop.
- Læg de udvalgte polypper i en petriskål af glas eller plast, og dæk petriskålen med et planktonnet (200 μm maskestørrelse, se Materialetabel), så polypperne ikke flyder væk fra fadet.
BEMÆRK: Størrelsen på maskenettet kan variere afhængigt af polyppernes størrelse. Det er vigtigt at bemærke, at nettene skal have porer, der er mindre end polypperne og tillader vandudveksling og lysindtrængning. - Placer petriskålen inde i et akvarium med de passende betingelser for de anvendte koralarter.
BEMÆRK: I denne undersøgelse var betingelserne 40 PSU-filtreret havvand ved 26 °C og en 12 timers lyscyklus. - Åbn petriskålene mindst en gang om ugen for at forny vandet og rengøre opvasken. Dette trin er vigtigt for at eliminere algeovervækst, der kan konkurrere med eller beskadige koralpolypperne ved lokalt at frigive giftige forbindelser.
5. Vedligeholdelse af polypper i inkubatorer
- Vælg levedygtige polypper som beskrevet i trin 4.1.
- Polypperne anbringes i 75 cm2 overfladecellekolber fyldt med 50 ml isosmotisk havvand ved hjælp af transferpipetter.
BEMÆRK: I det nuværende arbejde blev filtreret havvand opsamlet fra Rødehavet brugt til vedligeholdelse af polypper. Vand med de samme egenskaber som det, der blev brugt i trin 1.2, kan bruges. - Luk kolberne og flyt dem til inkubatorer. Sæt inkubatorerne til 12 timers lyscyklusser ved 26 °C og 40 o / min. Udskift 50% af vandmængden hver 4. dag, og overfør indholdet til rene kolber, når/hvis de bliver fulde af alger eller biofilm på væggene.
BEMÆRK: Billederne blev taget med et fuldt apokromatisk zoomsystem udstyret med et HD-kamera (se Materialetabel) for de repræsentative resultater.
Representative Results
Polyp bail-out blev induceret i koralfragmenter tilhørende en enkelt koloni af arten P. verrucosa efter tre forskellige metoder (figur 1). Bail-out induceret af høj saltholdighed efter vandfordampning var afsluttet efter 24 timers inkubation af koralfragmenter i petriskåle ved omgivelsestemperatur fyldt med vand oprindeligt ved 40 PSU, som derefter nåede en endelig saltholdighed på 59 PSU, når processen var overstået (figur 2A-C, I). Redning ved saltvandsforsyning blev også nået efter 24 timers inkubation i vand oprindeligt ved 40 PSU, der nåede en saltholdighed på 52 PSU efter 12 timer og 59 PSU ved afslutningen af processen efter 24 timer (figur 2D-F, I). I begge forsøg var en stigning i saltholdigheden ansvarlig for induktion af vævsfordøjelse af polypperne. Efter 12 timer forårsagede tilstanden med høj saltholdighed sammentrækningen af polypperne i forbindelse med den gradvise udtynding af coenosarc, hvilket i sidste ende forårsagede den endelige løsrivelse af polypperne efter 24 timer. Bail-out induktionen gennem inkubation i calciumfrit havvand var afsluttet efter en 3 timers inkubation i CaFSW efterfulgt af en 20 timers inkubation i 20% DMEM-mediet (figur 2G-H). Vævet blev løsnet fra skelettet i alle tre metoder efter at have skubbet det væk med en pipette, indtil individualiserede koralpolypper (figur 3A-C) og "vævskugler" blev genereret.
Efter løsrivelsen blev polypperne fra alle tre metoder opsamlet og fik lov til at komme sig i havvand, inden de blev tildelt petriskåle dækket med net eller cellekolber. Polypperne opnået ved fordampning og vandforsyningsmetoder blev opretholdt i petriskåle inde i akvarier og overlevede i henholdsvis 6 uger og 8 uger (figur 3D og figur 3F). Disse mikropropagater bevarede den sædvanlige anatomi af polypper og præsenterede tentakler, basale diske og mund1. Polypperne opnået gennem inkubation i calciumfrit havvand havde en kort levetid og overlevede op til 1 dag, hvorefter deres væv dissocierede. Polypper opnået ved havvandsfordampningsmetoden opbevaret i cellekulturkolber inde i inkubatorer overlevede i op til 3 uger uden dissociation af væv (figur 3F). I alle tilfælde, selvom polypperne ikke kunne fastgøres til substratet, var de visuelt sunde og bevarede deres farve, hvor zooxanthellae-celler stadig var synlige inde i deres væv1.
Figur 1: Skematisk repræsentation af de tre forskellige testede metoder til polyp bail-out induktion (venstre) efterfulgt af illustrationen af to metoder til at opretholde de erhvervede polypper under laboratorieforhold (højre). (A) Repræsentation af metoden til polyp bail-out ved vandfordampning. (B) Repræsentation af metoden til redning af polypper ved høj saltholdig havvandsforsyning. (C) Repræsentation af metoden til redning af polyp ved calciumfri havvandsinkubation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Billeder af polyp bail-out processen induceret af tre forskellige metoder ved hjælp af fragmenter af koralarten P. verrucosa. (A-C) Et koralfragment ved henholdsvis 0 timer, 12 timer og 24 timer efter inkubation i en petriskål ved hjælp af vandfordampningsmetoden. (D-F) Et koralfragment ved henholdsvis 0 timer, 12 timer og 24 timer efter inkubation ved hjælp af havvandsforsyningsmetoden med høj saltholdighed. (G,H) Koralfragmenter udsat for den calciumfrie havvandsinkubationsmetode henholdsvis før og efter. Inkubationerne i calciumfrit kunstigt havvand var i 3 timer og i 20% DMEM i 21 timer. (I) Grafisk repræsentation af saltholdighedsværdierne i PSU af havvandet over tid under vandfordampning og høj saltholdighed havvandsforsyning redningsinduktionsmetoder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Billeder af P. verrucosa polypper opnået fra de tre demonstrerede bail-out induktionsprocedurer. (A-C) Billederne af polypper opnået ved henholdsvis fordampning, saltvandsforsyning og calciumfri havvandsmetoder blev fanget umiddelbart efter, at de blev løsnet fra skelettet. (D) Billedet af en koralpolyp opnået ved fordampningsmetoden efter at have overlevet 6 uger i en petriskål. (E) Billedet af en koralpolyp opnået ved saltvandsforsyningsmetoden efter at have overlevet 8 uger i en petriskål. (F) Billedet af en koralpolyp opnået ved fordampningsmetoden efter at have overlevet 3 uger i en cellekulturkolbe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Polyppers overlevelsesrate efter at være blevet underkastet redningsprocesser og den tid, der er nødvendig for processen, der skal afsluttes, varierer blandt tidligere rapporterede undersøgelser 25,33,41, hvilket muligvis forklares af de forskellige eksperimentelle tilgange, der anvendes i hver undersøgelse. For eksempel præsenterer forskellige koralarter eller endda koraller fra samme art, men akklimatiseret til forskellige miljøforhold (f.eks. Koraller fra Rødehavet), forskellige tærskler for saltholdighedsniveauer. Den valgte redningsmetode og laboratorie-/akvarieforholdene spiller også en vigtig rolle i resultaterne. I nogle tilfælde har vedligeholdelsen af koralmikropropagater under laboratorieforhold overgået overlevelsestiden for koralcellekulturer ved at nå måneders overlevelse i azooxanthellat3 3,41 og zooxanthellat25 koraller. Tidspunktet for, hvornår polyp-bail-out-processen er afsluttet, har også varieret i forskellige undersøgelser, der spænder fra et par timer2 5,2 7,30 til uge35 inkubation udsat for den stressor, der er ansvarlig for at forårsage bail-out. En anden variabel, der skal tages i betragtning ved undersøgelse af polyp-bail-out, er genopretningen af polypperne efter eksponering for den akutte stress, der udløste deres frigivelse. Det kan stadig diskuteres, om polypper efter bail-out er i god nok stand til at blive brugt som modeller til at studere koralbiologi. Genopretningen af deres væv efter nedbrydningen af coenosarc er et spørgsmål om bekymring, når disse mikropropagater anvendes. Imidlertid har polypper i mange undersøgelser, herunder nutiden, været i stand til at præsentere zooxanthellae celler inde i deres væv og eksterne morfologier med intakt oral-aboral polarisering og tentakler uger efter bail-out 25,27,32,36. Tidligere undersøgelser har også vist, at frigivne koralpolypper udsat for stærkt saltvand eller opvarmet havvand efter at være blevet lettet fra akut stress har været i stand til at genvinde ekspressionen af gener relateret til processer som apoptose, proteolyse og celledeling til niveauer svarende til dem, der blev fundet før bail-out32,36 og endda for at øge ekspressionen af gener relateret til vævsheling36.
Med hensyn til forskellen i overlevelse mellem metoder er det vigtigt at fremhæve, at denne tid kan variere mellem forskellige eksperimenter, selvom de samme teknikker anvendes, og det kan relateres til sundheden for de anvendte fragmenter og korrekt vedligeholdelse af polypperne efter bail-out-processen. I tilfælde af bail-out gennem calciumfri havvand inkubation var polyp overlevelse begrænset til 1 dag. Det kan således konkluderes, at metoden ikke er velegnet til den undersøgte arts langsigtede overlevelse, eller der skal foretages en bedre tilpasning af teknikken til P. verrucosa koraller fra Rødehavet. De rapporterede resultater viste, at der blev opnået en længere overlevelsestid med metoderne baseret på den gradvise stigning i saltholdigheden, når polypperne blev udsat for dryp af vand med høj saltholdighed. Denne metode kan levere en mere kontrolleret stigning i saltholdigheden end fordampningsmetoden, samtidig med at den ikke er ansvarlig for en stigning i koncentrationen af andre stoffer, der findes i havvandet, herunder koralens metaboliske affald, som er potentielt giftigt for organismen. Af alle disse grunde er denne metode blevet foreslået som et sikrere alternativ til opretholdelse af sunde polypper27. Selvom denne metode er blevet antaget at være sikrere for polyp sundhed og i stand til at producere polypper, der lever længere, en kendsgerning, der blev bekræftet i denne nuværende publikation, er der behov for yderligere undersøgelser for at bekræfte det. Begge højsaltholdighedsinducerede redningsforsøg viste en fuldstændig løsrivelse af polypper, efter at saltholdigheden nåede 59 PSU i 24 timer. Hvis saltholdigheden øges ud over det niveau, hvor redningspakken er afsluttet, vil polypperne blive yderligere stresset, hvilket reducerer deres chance for at overleve og komme sig efter den akutte stressbehandling. Derfor anbefales det ikke at opretholde polypperne længere i sådanne saltholdighedsniveauer. Ved udførelse af bail-out induktionsmetoden ved eksponering for calciumfrit havvand blev der opnået en komplet løsrivelse fra en 3 timers inkubation i calciumfrit kunstigt havvand, hvilket betyder, at yderligere eksponering for dette medium heller ikke anbefales.
For at adressere de metoder, der var mere passende til undersøgelse af koralpolypper i laboratorie- / in vitro-undersøgelser , fokuserede denne undersøgelse kun på tre procedurer, der tog tæt på 24 timer for redningsprocessen at være afsluttet og blev brugt i undersøgelser, der involverede langsigtet vedligeholdelse af koralpolypper fra scleractinske koraller. Andre metoder, der rapporterede at tage betydeligt længere tid end denne gang, blev ikke anvendt. Aflejring af polypper til et substrat blev ikke forsøgt i denne undersøgelse, som fokuserede på at producere polypper, der kunne overføres til forskellige miljøer eller let indsamles til analyser ved hjælp af engangspipetter. Resultaterne viser, at polypper fra koralarten P. verrucosa blev holdt i live med tilhørende zooxanthellae-celler, sund visuel status og en bevaret grov ydre anatomisk struktur i op til 8 uger, selv uden fastgørelse til et substrat. Disse resultater indikerer, at flere biologiske replikater kan genereres fra enkelte koralfragmenter ved hjælp af nogle af de teknikker, der er demonstreret i denne undersøgelse. Sådanne biologiske replikater kan opbevares i kontrollerede miljøer (såsom petriskåle og cellekolber) og opbevares under laboratorieforhold til månedlange forsøg og anvendes til flere formål.
Siden de første tilfældige beskrivelser af polyp bail-out 42,43 er der etableret nye protokoller for at finde mere standardiserede metoder til at fremkalde polypfrigivelse og opretholde sådanne polypper i live, som kan bruges til fremtidige forskningsapplikationer. Disse omfatter undersøgelse af forskellige aspekter forbundet med koral holobiont fysiologi44 og vært-mikrobiom interaktioner45, de molekylære mekanismer involveret i koralblegning 5,25, og sundhed, modstandsdygtighed og beskyttelse af koral holobiont 12,13,46,47 . Desuden kan frigivne koralpolypper bruges til applikationer uden for forskningens område og er blevet foreslået at være nyttige til at skabe propaguler, der kan fastgøres til et substrat og vokse, hvilket potentielt skaber flere koralindivider, der kan bruges til restaureringsformål, når standardiserede protokoller til redning bliver udbredt28 . Samlet set, selvom mere dybtgående eksperimenter ved hjælp af bailed-out polypper bør udføres for at standardisere metoden, har det vist sig, at polyp bail-out er en reproducerbar tilgang, der kan anvendes som et værktøj i koralforskning til flere formål.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Adam Barno og Francisca Garcia for deres støtte i eksperimenterne og overvågningen af koralpolypperne. Vi takker også KAUST Coastal &Marine Resources Core Lab for deres hjælp vedrørende akvarievedligeholdelse og infrastruktur. Undersøgelsen blev finansieret af KAUST-tilskudsnummer BAS/1/1095-01-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5560 Conductivity/Temperature Probe | YSI | 5560 | Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter |
| Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers | Ace Hardware | 2004083 | Used to cut coral fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | Used in DMEM medium. |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41965-039 | Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method |
| Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene | Thermo Fisher Scientific | FB0875713A | Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium. |
| Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt | Schego | 548 | Heaters used in aquarium |
| Leica Application Suite Version 4.2 | Leica Microsystems | NA | Software used for image capture in demonstrative results |
| Leica IC80 HD | Leica Microsystems | 12730216 | Camera used to take demonstrative results pictures |
| Leica MDG33 | Leica Microsystems | 10 450 123 | Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures |
| Leica Z6 APO | Leica Microsystems | NA | Macroscope used to take demonstrative results pictures |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific | 7487-88-9 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | HV-77602-10 | Peristaltic pump head. |
| Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller | Masterflex | EW-07557-00 | Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol. |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft | Masterflex | HV-96410-16 | Tubing for peristaltic pump. |
| Millex 33 mm PVDF 0.22 µm Sterile RUO | Sigma-Aldrich | SLGVR33RS | Used to filter artificial sea water. |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 156499 | Flask usually used for cell culture used for polyp culture. |
| Orbital shaker, Advanced 5000, VWR | VWR | 444-2916 | Shaker used inside incubator. |
| Percival Incubator - I-22VL | Percival | NA | Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks. |
| Plankton net 200 µm mesh size | KC Denmark | NA | Used for covering petri dishes containing coral polyps. |
| Potassium Chloride | VWR Chemicals | 7447-40-7 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| ProQuatro Multiparameter Meter | YSI | 606950 | Used for measuring salinity thoughout the protocol |
| RADION XR15 G5 PRO | Ecotech | NA | Lights used in aquarium |
| Red Sea Salt Premium grade, moderate Alkalinity |
Red Sea | NA | Used to prepare 40 PSU artifical sea water. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Sodium Sulfate Anhydrous | VWR Chemicals | 7757-82-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| TRD 112 thermostat | Schego | NA | Thermostat used in aquarium |
| Turbelle Nanostream 6025 | Tunze | 6025 000 | Pumps used in aquarium |
References
- Goffredo, S., Dubinsky, Z. The Cnidaria, Past, Present and Future: The World of Medusa and her Sisters. , Springer. (2016).
- Knowlton, N., et al. Rebuilding coral reefs: a decadal grand challenge. International Coral Reef Society and Future Earth Coasts. , 56 (2021).
- Brown, B. Coral bleaching: causes and consequences. Coral Reefs. 16 (1), 129-138 (1997).
- Douglas, A.
- Nielsen, D. A., Petrou, K., Gates, R. D. Coral bleaching from a single cell perspective. The ISME Journal. 12 (6), 1558-1567 (2018).
- Oakley, C. A., Davy, S. K. Coral Bleaching: Patterns, Processes, Causes and Consequences. Coral Bleaching Book. , Springer. 189-211 (2018).
- Donner, S. D., Heron, S. F., Skirving, W. J. Future scenarios: a review of modelling efforts to predict the future of coral reefs in an era of climate change. Coral Bleaching. , 159-173 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O. Climate change, coral bleaching and the future of the world's coral reefs. Marine and Freshwater Research. 50 (8), 839-866 (1999).
- Hughes, T. P., et al. Global warming impairs stock-recruitment dynamics of corals. Nature. 568 (7752), 387-390 (2019).
- Moore, J. A., et al. Unprecedented mass bleaching and loss of coral across 12 of latitude in Western Australia in 2010-11. PLoS One. 7 (12), 51807 (2012).
- Duarte, G. A., et al. Heat waves are a major threat to turbid coral reefs in Brazil. Frontiers in Marine Science. 7, 179 (2020).
- Santoro, E. P., et al. Coral microbiome manipulation elicits metabolic and genetic restructuring to mitigate heat stress and evade mortality. Science Advances. 7 (33), (2021).
- Voolstra, C. R., et al. Extending the natural adaptive capacity of coral holobionts. Nature Reviews Earth & Environment. 2 (11), 747-762 (2021).
- Debergh, P. C., Read, P. E. Micropropagation. 1, Kluwer Academic Publishers. 1-13 (1991).
- Nitish, K., Reddy, M. P. In vitro plant propagation: a review. Journal of Forest and Environmental Science. 27 (2), 61-72 (2011).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 354 (4), 1095-1100 (2007).
- Yao, T., Asayama, Y. Animal-cell culture media: history, characteristics, and current issues. Reproductive Medicine and Biology. 16 (2), 99-117 (2017).
- Merten, O. W. Introduction to animal cell culture technology-past, present and future. Cytotechnology. 50 (1-3), 1 (2006).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. P. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Goldstein, B., King, N. The future of cell biology: emerging model organisms. Trends in Cell Biology. 26 (11), 818-824 (2016).
- Lecointe, A., et al. Scleractinian coral cell proliferation is reduced in primary culture of suspended multicellular aggregates compared to polyps. Cytotechnology. 65 (5), 705-724 (2013).
- Nowotny, J. D., Connelly, M. T., Traylor-Knowles, N. Novel methods to establish whole-body primary cell cultures for the cnidarians Nematostella vectensis and Pocillopora damicornis. Scientific Reports. 11 (1), 1-9 (2021).
- Kawamura, K., Nishitsuji, K., Shoguchi, E., Fujiwara, S., Satoh, N. Establishing sustainable cell lines of a coral, Acropora tenuis. Marine Biotechnology. 23, 373-388 (2021).
- Pang, A. -P., Luo, Y., He, C., Lu, Z., Lu, X. A polyp-on-chip for coral long-term culture. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
- Shapiro, O. H., Kramarsky-Winter, E., Gavish, A. R., Stocker, R., Vardi, A. A coral-on-a-chip microfluidic platform enabling live-imaging microscopy of reef-building corals. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Tambutté, S., et al. Coral biomineralization: From the gene to the environment. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 408 (1-2), 58-78 (2011).
- Chuang, P. -S., Mitarai, S. Signaling pathways in the coral polyp bail-out response. Coral Reefs. 39 (6), 1535-1548 (2020).
- Schweinsberg, M., Gösser, F., Tollrian, R. The history, biological relevance, and potential applications for polyp bail-out in corals. Ecology and Evolution. 11 (13), 8424-8440 (2021).
- Rakka, M., et al. First description of polyp bail-out in cold-water octocorals under aquaria maintenance. Coral Reefs. 38 (1), 15-20 (2019).
- Wells, C. D., Tonra, K. J. Polyp bail-out and reattachment of the abundant Caribbean octocoral Eunicea flexuosa. Coral Reefs. 40 (1), 27-30 (2021).
- Coppari, M., et al. Unveiling asexual reproductive traits in black corals: polyp bail-out in Antipathella subpinnata. Coral Reefs. 39 (6), 1517-1523 (2020).
- Chuang, P. S., Ishikawa, K., Mitarai, S. Morphological and genetic recovery of coral polyps after bail-out. Frontiers in Marine Science. 8, 280 (2021).
- Serrano, E., Coma, R., Inostroza, K., Serrano, O. Polyp bail-out by the coral Astroides calycularis (Scleractinia, Dendrophylliidae). Marine Biodiversity. 48 (3), 1661-1665 (2018).
- Kopecky, E. J., Ostrander, G. K. Isolation and primary culture of viable multicellular endothelial isolates from hard corals. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 35 (10), 616-624 (1999).
- Kvitt, H., et al. Breakdown of coral colonial form under reduced pH conditions is initiated in polyps and mediated through apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (7), 2082-2086 (2015).
- Gösser, F., Raulf, A., Mosig, A., Tollrian, R., Schweinsberg, M. Signaling pathways of heat-and hypersalinity-induced polyp bail-out in Pocillopora acuta. Coral Reefs. 40 (6), 1713-1728 (2021).
- Fordyce, A. J., Camp, E. F., Ainsworth, T. D. Polyp bail-out in Pocillopora damicornis following thermal stress. F1000Research. 6, 687 (2017).
- Wecker, P., et al. Exposure to the environmentally-persistent insecticide chlordecone induces detoxification genes and causes polyp bail-out in the coral P. Damicornis. Chemosphere. 195, 190-200 (2018).
- Schmidt-Roach, S., Miller, K. J., Lundgren, P., Andreakis, N. With eyes wide open: a revision of species within and closely related to the Pocillopora damicornis species complex (Scleractinia; Pocilloporidae) using morphology and genetics. Zoological Journal of the Linnean Society. 170 (1), 1-33 (2014).
- Gélin, P., Postaire, B., Fauvelot, C., Magalon, H. Reevaluating species number, distribution and endemism of the coral genus Pocillopora Lamarck, 1816 using species delimitation methods and microsatellites. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 430-446 (2017).
- Capel, K. C. C., Migotto, A., Zilberberg, C., Kitahara, M. V. Another tool towards invasion? Polyp "bail-out" in Tubastraea coccinea. Coral Reefs. 33 (4), 1165 (2014).
- Kawaguti, S. Materials for the study of reef-building corals III. Science of the South Sea (Kagaku Nanyo). 5, 95-106 (1942).
- Goreau, T. F., Goreau, N. I. The physiology of skeleton formation in corals. II. Calcium deposition by hermatypic corals under various conditions in the reef. Biological Bulletin. 117, 239-250 (1959).
- Swain, T. D., et al. Physiological integration of coral colonies is correlated with bleaching resistance. Marine Ecology Progress Series. 586, 1-10 (2018).
- Sweet, M., et al. Insights into the cultured bacterial fraction of corals. mSystems. 6 (3), 01249 (2020).
- Peixoto, R. S., Rosado, P. M., Leite, D. C. dA., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial microorganisms for corals (BMC): proposed mechanisms for coral health and resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341 (2017).
- Peixoto, R. S., et al. Coral probiotics: premise, promise, prospects. Annual Review of Animal Biosciences. 9, 265-288 (2021).
