Summary
Polip kurtarma, mercan poliplerinin onları kolonilerine bağlayan dokuyu sindirdiği ve birey olarak yaşamak için ondan ayrıldığı akut stresin neden olduğu bir süreçtir. Mevcut protokol, hipersalin veya kalsiyum içermeyen deniz suyu arıtımları kullanılarak kurtarma yoluyla mercan mikroyayılımının nasıl indükleneceğini açıklamaktadır.
Abstract
Mercanlar, polip adı verilen modüler birimlerden oluşan sömürge hayvanlarıdır. Mercan polipleri fizyolojik olarak bağlanır ve doku ile bağlanır. Polip kurtarma fenomeni, mercan poliplerinin onları koloninin geri kalanına bağlayan dokuyu sindirdiği ve nihayetinde ayrı bireyler olarak yaşamaya devam etmek için iskeletten ayrıldığı akut stresin neden olduğu bir süreçtir. Mercan biyologları yıllardır polip kurtarma sürecini kabul etmişlerdir, ancak son zamanlarda bu süreç tarafından üretilen mikropropagatlar mercan biyolojisi çalışmaları için bir model sistem olarak kabul edilmiştir. Polip kurtarma işleminin kullanılması, tek bir mercan parçasından çok sayıda klonal birim oluşturabilir. Diğer bir yararı, tek poliplerin veya polip yamalarının mikroskop altında kolayca görselleştirilebilmesi ve Petri kapları, şişeler ve mikroakışkan çipler gibi son derece standartlaştırılmış düşük maliyetli ortamlarda muhafaza edilebilmesidir. Mevcut protokol, mercan mikroyayılımını indükleyebilen tekrarlanabilir yöntemleri ve tek poliplerin uzun vadede canlı tutulması için farklı yaklaşımları göstermektedir. Bu metodoloji, kurtarma işleminden sonra 8 haftaya kadar mercan türü Pocillopora verrucosa'nın poliplerini başarıyla yetiştirebildi ve mercan araştırması için bireysel mercan poliplerinin kullanılmasının pratikliğini sergiledi.
Introduction
Skleraktin veya resif oluşturan mercanlar, karbonat iskeletleri oluşturabilen, resifler oluşturabilen ve derinlerden sığ su ortamlarına kadar bulunabilen yapısal olarak karmaşık ekosistemler oluşturabilen cnidarianlardır1. Tropikal mercan resifleri yüksek biyolojik çeşitliliğe ev sahipliği yapar ve kıyı koruma ve balıkçılık bakımı gibi temel ekosistem hizmetleri sunar2. Sığ su resifi oluşturan mercanların çoğu, mercanların iskeletlerini oluşturmak için ihtiyaç duydukları enerjiyi sağlayan Symbiodiniaceae familyasının algleriyle karşılıklı bir ilişkiye dayanır. Mercan ve algler arasındaki simbiyoz, çevresel stresle kırılabilir ve mercan ağartmasına neden olabilir 3,4,5,6. Son zamanlardaki sıcaklık anomalileri, dünya çapında büyük mercan ağartma olaylarına neden olmuş, kitlesel mercan ölümlerine ve kalıcı resif bozulmasına yol açmıştır 7,8,9,10,11. Bu fenomen, simbiyontların apoptoz, otofaji ve ekzositoz gibi ısı stresi ile ilişkili hücresel mekanizmalar tarafından atılmasına dayandığından, mercan ağartma, ekosistem ölçeğinde sonuçları olan hücresel bir süreç olarak tanımlanabilir 5,6,12, yani mercan hücrelerinin veya dokularının in vitro kültürlerine sahip olmak, bu fenomeni yakından incelemek için uygulanabilir.
Mercan resiflerinin önemi ve özellikle son yirmi yılda karşı karşıya kaldıkları büyük tehditlernedeniyle2, mercanlar dünya çapında koruma ve restorasyon amaçlı araştırmaların odağı haline gelmiştir13. Bununla birlikte, güvenilir, tekrarlanabilir ve mercanları incelemek için minimum çevresel etki sunan yaklaşımların ve deneysel sistemlerin geliştirilmesi bu alanda büyük bir mücadeledir.
Mikropropagasyon, bir organizmanın genotipinin, biyolojik materyalinin kontrollü kaplarda kültürlenerek in vitro çoğalması olarak tanımlanır14,15. Hücrelerin, dokuların ve organların kültürlenmesi, son yıllarda bitki ve hayvan biyolojisi için çok önemli olmuştur. Organizmaların laboratuvarlarda kitlesel üremesine, farklı tedavilerin (ilaçlar ve farmasötikler gibi) hızlı bir şekilde değerlendirilmesine ve hücre fonksiyonunun doğrudan incelenmesine izin verir14,15,16,17. Genel olarak, in vitro modeller, daha iyi kontrol edilen fiziksel ve kimyasal koşullar altında farklı organizmaların çalışmalarını tamamlamak ve derinleştirmek için yararlı olmuştur. İn vitro kültürleme tekniklerinin avantajları nedeniyle, farklı hayvan hücresi ve doku kültürü teknolojileri geliştirilmiş, optimize edilmiş ve çok sayıda uygulama için çoklu hücre hatlarının çalışıldığı ve ticarileştirildiği birçok araştırma alanında önemli araçlar olarak kullanılmıştır16,17,18.
1882'deki ilk hayvan doku kültüründen bu yana, hücre ve doku kültürü bilgisindeki birçok ilerleme kaydedilmiştir 17, doğal ve sentetik ortamın kullanılması, yerleşik hücre hatlarının icadı ve çok sayıda hücre tipini daha iyi bir şekilde yetiştirmek için 3D ortamın geliştirilmesi gibi16,17, 18,19. Bununla birlikte, hücre biyolojisi alanı çoğunlukla seçilmiş bir model organizma grubuna odaklanırken, birçok takson hala hücre, doku veya organların in vitro kültürlerine sahip değildir20. Örneğin, mercan araştırmalarında, mercan hücresi araştırmalarını birincil hücre kültürlerinin kullanımıyla sınırlayan araştırma için ölümsüzleştirilmiş hücre hatları yaygın olarak kullanılmamıştır. Bu kültürlerin yaşayabilirliği birkaç hafta 21 ile sınırlıdır,2021'in başına kadar 13 günden fazla bir süre boyunca tüm mercan dokularından bireysel hücrelerin hayatta kalmasını kaydeden hiçbir çalışma yoktur22. Yayınlanacak sürdürülebilir mercan hücresi hatlarının ilk raporu, 6 aya kadar yaşayan Acropora tenuis hücreleri ile yapıldı ve bu hücrelerin gelecekteki araştırmalar için faydası araştırılmaya devam ediyor23.
Mercan hücre kültürlerinin kültürlenmesindeki sınırlamaların üstesinden gelmek ve mercanların genel doku organizasyonunu koruyan bir laboratuvar kültürünü sürdürmek için, izole poliplerin kullanımı son zamanlarda mercan biyolojisi araştırmaları için bir model olarak önerilmiştir24,25. Polipler, mercanların anatomik birimleridir ve her birinin oral disklerinin merkezinde bulunan bir ağzı vardır ve aboral bölgesindeki koenosark tarafından diğer poliplere bağlanır26. Canlı poliplerin ayrılması, doğal olarak, akut stresin polipler arasındaki koenosarkın sindirimine neden olduğu ve daha sonra koloninin iskeletinden ayrılabildiği polip kurtarma işlemi ile gerçekleşir25,27,28. Bu fenomenin, oktomercanlar29,30,31, siyah mercanlar 32 ve skleraktin mercanları 25,27,28,32,33 dahil olmak üzere çeşitli taksonlara dahil olduğu bildirilmiştir ve sudaki kalsiyum eksikliği 24,34, artan asitlik 35 gibi çoklu çevresel stresörlerle ilişkilendirilmiştir. hiperozmotik koşullar 25,27,32,36, yüksek sıcaklıklar 36,37, açlık 33, havaya maruz kalma25,30 ve insektisit kontaminasyonu 28,38. Polip kurtarma paketi, örneğin, dünya çapında yaygın olarak dağıtılan ve mercan araştırmalarında model olarak yaygın olarak kullanılan pocilloporid mercanlar19'da bildirilmiştir. Pocillopora damicornis ve Styllophora pistillata gibi bu gruba ait türler, 5 mm'lik bir parçadan yaklaşık 30-40 mikropropagat üretmiştir25. Bu sayı, küçük bir mercan parçasından genetik olarak özdeş birçok birey üretme imkanı yarattığından, mercan mikropropagasyonu için bir yöntem olarak polip kurtarma işleminin kullanılmasının avantajını vurgulamaktadır. Araştırma için izole poliplerin kullanılması, şişeler ve Petri yemekleri gibi kontrollü laboratuar ortamlarında kültürlenme olasılığı ile ilgili hücre kültürleriyle aynı avantajlara sahiptir. Ek olarak, canlı polipleri korumak için mikroakışkan platformlar, bu mikropropajların kontrollü su akışı, yüzey ve sıcaklık24,25 ile nispeten ucuz ve çoğaltılması kolay ortamlarda tutulabileceğini göstermiştir. Bu mikroakışkan platformlar, canlı mercan yapılarını mikroskop altında doğrudan24,25 görselleştirmek için de kullanılabilir.
Bu makalede, bireysel mercan poliplerini kolonilerinden izole etmek için geliştirilen teknikleri özetlemekte ve göstererek, uzun süreli kültür için laboratuvar koşullarında nasıl korunacaklarını göstermekteyiz. Tartışılan yöntemler arasında buharlaşma ve yüksek tuzlulukta deniz suyunun pompalanması yoluyla hiperozmotik koşullar yoluyla polip kurtarma ve kalsiyum içermeyen deniz suyunda inkübasyon bulunmaktadır.
Protocol
Bu çalışma için Al Fahal resifinden (22.305118 N; 38.964568 E) Pocillopora verrucosa mercan türlerine ait bir koloni SCUBA tarafından çekiç ve keski kullanılarak dalış yapılarak toplanmıştır. Koloninin cinsi morfolojik olarak tanımlandı ve türleri, Kızıldeniz'den Pocillopora da dahil olmak üzere daha önce yayınlanmış çalışmalara dayanarak P. verrucosa olarak sınıflandırıldı, bu da genetik açıdan bu alanda bulunan türlerin P. verrucosa39,40 olduğunu gösteriyor. Al Fahal resifi, korunan bir çevre alanının parçası değildir ve mercan toplama için özel bir izne gerek yoktur. Koloni, parçalanmadan ve poliplerinin "kurtarılmasından" önce bir ay boyunca 300 L'lik bir akvaryumda tutuldu. Akvaryum, iki akvaryum ısıtıcısı, üç pompa ve iki ışık kaynağı ile 26 ° C'de tutuldu (bkz. Akvaryumun sıcaklığı, iki ısıtıcının her birini bir sıcaklık kontrol cihazına bağlayarak korunmuştur. Işık emisyonu sabah 6'da başlayıp akşam 6'da bitecek şekilde programlandı ve 230 μmol foton m-2 s-1 ile 12:00'de zirveye ulaşan bir ışıma eğrisi üretti.
1. Su buharlaşmasından sonra yüksek tuzluluk ile polip kurtarma
NOT: Bu yöntem Shapiro ve ark.25'ten uyarlanmıştır. Pocillopora verrucosa'dan farklı türler kullanılıyorsa, kesilecek parçanın boyutunu belirlemeden önce poliplerin boyutu dikkate alınmalıdır.
- Çapraz kesme penseleri kullanarak bir mercan kolonisinden küçük parçaları (uzunluğu 1 cm'den az) kesin (bkz.
NOT: Kesici aletleri kullanılan mercan türlerine göre uyarlayın. Diyagonal pense, mercanları ince dallarla kesmek için kullanışlıdır. Mevcut çalışmada, her tedavi için bir parça kesilmiştir, ancak parçaların sayısı ve boyutu, istenen polip sayısına bağlı olarak değişebilir. Kesilen parçaların boyutu, buharlaşmadan sonra suyun derinliğini geçmemelidir, bu nedenle mercanlar işlem yapıldıktan sonra tamamen suyun içinde kalır. - Kesilen parçaları, mercan kolonisinin alıştığı 12 mL deniz suyuyla doldurulmuş küçük Petri kaplarına yerleştirin. Bu, yapay deniz suyu ( Malzeme Tablosuna bakınız) veya mercan kolonisinin parçalanmadan önce yerleştirildiği tuzlulukla aynı tuzlulukta filtrelenmiş deniz suyu olabilir.
NOT: Parçanın tamamen su ile kaplanması önemlidir. Bir Petri kabındaki 12 mL, kesilen parçayı örtmek için yeterli değilse, kabı ve hacmi buna göre optimize edin. Bu çalışmada, kullanılan su Kızıldeniz'den toplandı ve tuzluluğu, çok parametreli bir sayaçla ölçülen 40 PSU idi (bkz. - Plakayı ortam sıcaklığında ~ 24 saat açık bırakın, böylece su buharlaşabilir ve tuzluluğu yavaş yavaş artabilir. Polipler arasında doku sindirimi gözlenebildiğinde, Adım 1.4'e geçin.
NOT: Kuluçka süresi geçtikten sonra, suyun tuzluluğu başlangıçtan yaklaşık% 40 daha yüksek olmalı ve poliplerin iskeletten ayrılmaya hazır olması gerekir. - 1 mL'lik bir transfer pipeti kullanarak, mercan dokusuna yakın nazik bir akış oluşturun. Akış, etraflarındaki dokuyu iskeletten zaten sindirmiş olan poliplerin tamamen ayrılmasına yavaşça yardımcı olacaktır.
NOT: Pipetle birlikte su akışı oluşturulduğunda, ayrı polipler veya polip grupları iskeletten pul şeklinde çıkmalıdır. Bunun yerine bulutlu bir madde çıkarsa, doku ölümünü veya parçalanmasını gösterir, bu da mercanların çok uzun süre veya çok stresli bir durumda (bu durumda, yüksek tuzluluk) inkübe edildiği anlamına gelir. Polipleri ayırmak için yumuşak bir su akışı yapmak çok önemlidir, çünkü daha güçlü bir akış onlara fiziksel zarar verebilir. - Petri kabındaki suyu bir pipet kullanarak yavaşça izosmotik suyla değiştirin (Adım 1.2'deki ile aynı suyu kullanın). 10 dakikadan fazla% 50'lik bir su değişimi, polipleri stresli olmayan bir tuzluluk durumuna geri alıştırmak için yeterlidir.
NOT: Kızıldeniz'den Pocillopora verrucosa pocilloporid türünün mercan kolonileri kullanıldığından, bu eşsiz ortamdaki mercanların hangi özel koşullar altında kurtarılacağını belirlemek için testler yapılmıştır. Diğer resif ortamlarının çoğuna kıyasla Kızıldeniz'in yüksek tuzluluğunu vurgulamak önemlidir.
2. Yüksek tuzlulukta deniz suyu temini ile polip kurtarma
NOT: Bu yöntem Chuang ve ark.27'den uyarlanmıştır.
- Bir tuzluluk probu ile ölçülen tuzluluk% 85 oranında artana kadar deniz suyuna NaCl ekleyerek 3 L yüksek tuzluluk deniz suyu hazırlayın.
NOT: Mevcut çalışmada, Kızıldeniz'den gelen 40 PSU deniz suyundan 74 PSU yüksek tuzlulukta deniz suyu hazırlanmıştır. - Adım 1.1'de açıklandığı gibi küçük mercan parçalarını kesin.
- Kesilen parçaları, peristaltik bir pompaya bağlı 3 L izosmotik deniz suyu (bu durumda, mercanlar için stresli olmayan tuzluluğa sahip deniz suyu, Adım 1.2'de kullanılanla aynı) ile doldurulmuş 10 L'lik bir kaba yerleştirin (bkz.
NOT: Mercan sağlığının daha iyi korunması için, koloninin daha önce maruz kaldığı aynı akvaryum koşullarını simüle etmek için sıcaklık kontrolörleri, hava pompaları ve ışıklar eklenebilir. Mevcut çalışmadaki inkübasyon sırasında, mercan parçaları günlük 12 saatlik bir ışık döngüsü altında, 26 ° C'de kaplarda tutuldu. Su hareketi ve sıcaklığın homojenizasyonu hava pompaları tarafından sağlandı. - Mercan parçaları içeren kabı, 126 mL / s hızında peristaltik pompayı kullanarak 24 saat boyunca Adım 2.1'de hazırlanan yüksek tuzluluktaki deniz suyuyla doldurun. Yaklaşık %40'lık artan bir tuzlulukta toplam 3 L su ekleyin.
NOT: Yüksek tuzluluklu su, amaçlanan tuzluluğa ulaşana kadar deniz suyuna NaCl eklenerek üretilebilir. - Polipleri iskeletten serbest bırakmak için pipetle nazik bir su akışı oluşturun (Adım 1.4.).
- Poliplerin bulunduğu suyu izosmotik su ile yavaşça değiştirin (Adım 1.5.). Ardından, Adım 4 veya Adım 5'e geçin.
3. Kalsiyumsuz deniz suyu inkübasyonu ile polip kurtarma
NOT: Bu yöntem Pang ve ark.24'ten uyarlanmıştır.
- 1 L deiyonize suya 26.29 g NaCl, 0.872 g KCl, 2.16 g MgSO 4, 11.94 g MgCl 2, 3.42 g Na2SO 4 ve 0.286 g NaHCO3 (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek kalsiyum içermeyen yapay deniz suyu (CaFSW) çözeltisi hazırlayın.
NOT: Bu çözüm, 40 PSU'luk bir tuzluluğa uyarlanmış mercanlar için daha uygun olacak şekilde önceki protokollerden ayarlanmıştır. Diğer tuzluluk koşullarına uyarlanmış mercanlar için, aynı oranda tuz kullanın, ancak kullanımdaki mercanlara daha uygun tuzluluğu elde etmek için toplam çözünen kütlesini ayarlayın. - Adım 1.1'de açıklandığı gibi küçük mercan parçalarını kesin.
- Mercan parçalarını daha önce hazırlanan CaFSW ile doldurulmuş Petri kaplarına batırın (Adım 3.1.) ve yörüngesel inkübatörlerde 3 saat boyunca 80 rpm dönme hızında inkübe edin.
NOT: Yine, parçayı tamamen suyla örtmek önemlidir. Bir Petri kabı parçayı örtmek için yeterli değilse, kabı ve hacmi deneysel ihtiyaca göre optimize edin. - Parçaları, Petri kaplarına veya 40 PSU yapay deniz suyu ile hazırlanan %20 Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ve 100 mg/mL ampisilin çözeltisi ( bakınız Malzeme Tablosu) ile doldurulmuş 6 delikli plakalara aktarın. Parçaları 26 ° C ve 80 rpm'de inkübe edin, polipler arasında doku sindirimi gözlenene ve bireysel polipler iskeletten ayrılmaya başlayana kadar her gün medyayı değiştirin.
NOT: Çoğu durumda, doku sindirimi bu ortamda inkübasyondan sonraki 20 saat içinde tamamlanır ve değişim gerekmez. - Bir pipet kullanarak ilk geri kazanım için polipleri sterilize edilmiş deniz suyuna aktarın. 1 saatlik inkübasyondan sonra, Adım 4 veya Adım 5'e geçin.
4. Petri kaplarında polip bakımı
- Polipler stressiz tuzluluk ile filtrelenmiş deniz suyuna geri döndükten sonra, stereomikroskop altında siliyer akışın neden olduğu doku bütünlüğünü ve hareketini gözlemleyerek canlı polipleri seçin.
- Seçilen polipleri bir cam veya plastik Petri kabına yerleştirin ve Petri kabını bir plankton ağı (200 μm ağ boyutu, bkz.
NOT: Ağ ağının boyutu, poliplerin boyutuna göre değişebilir. Ağların poliplerden daha küçük gözeneklere sahip olması ve su değişimine ve ışık penetrasyonuna izin vermesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir. - Petri kabını, kullanılan mercan türleri için uygun koşullara sahip bir akvaryumun içine yerleştirin.
NOT: Bu çalışmada, koşullar 26 ° C'de 40 PSU filtrelenmiş deniz suyu ve 12 saatlik bir ışık döngüsü idi. - Suyu yenilemek ve bulaşıkları temizlemek için Petri bulaşıklarını haftada en az bir kez açın. Bu adım, yerel olarak toksik bileşikleri serbest bırakarak mercan polipleriyle rekabet edebilecek veya zarar verebilecek alg aşırı büyümesini ortadan kaldırmak için önemlidir.
5. İnkübatörlerde polip bakımı
- Adım 4.1'de açıklandığı gibi uygulanabilir polipleri seçin.
- Polipleri, transfer pipetleri kullanarak 50 mL izosmotik deniz suyu ile doldurulmuş 75cm2 yüzey hücre şişelerine yerleştirin.
NOT: Mevcut çalışmada, polip bakımı için Kızıldeniz'den toplanan filtrelenmiş deniz suyu kullanılmıştır. Adım 1.2'de kullanılanla aynı özelliklere sahip su kullanılabilir. - Şişeleri kapatın ve inkübatörlere taşıyın. İnkübatörleri 26 °C ve 40 rpm'de 12 saatlik ışık döngüsüne ayarlayın. Su hacminin% 50'sini her 4 günde bir değiştirin ve duvarlarda yosun veya biyofilmle dolduklarında / dolduklarında içeriği temiz şişelere aktarın.
NOT: Görüntüler, temsili sonuçlar için HD kamera ile donatılmış tamamen apokromatik bir yakınlaştırma sistemi ile yakalanmıştır (bkz.
Representative Results
Polip kurtarma, P. verrucosa türünün tek bir kolonisine ait mercan parçalarında üç farklı yöntem izlenerek indüklendi (Şekil 1). Petri kaplarında mercan parçalarının başlangıçta 40 PSU'da suyla doldurulmuş ortam sıcaklığında 24 saat inkübasyonundan sonra su buharlaşmasının neden olduğu yüksek tuzluluğun neden olduğu kurtarma işlemi, daha sonra işlem bittiğinde 59 PSU'luk nihai bir tuzluluğa ulaştı (Şekil 2A-C, I). Tuzlu su temini ile kurtarmaya da, başlangıçta 40 PSU'da suda 24 saatlik inkübasyondan sonra, 12 saat sonra 52 PSU'ya ve işlemin sonunda 24 saat sonra 59 PSU'luk bir tuzluluğa ulaşan suya ulaşıldı (Şekil 2D-F, I). Her iki deneyde de, tuzluluktaki bir artış, polipler tarafından doku sindiriminin indüklenmesinden sorumluydu. 12 saat sonra, yüksek tuzluluk durumu, poliplerin coenosarc'ın kademeli olarak incelmesi ile birlikte büzülmesine neden oldu ve sonuçta 24 saat sonra poliplerin son ayrılmasına neden oldu. Kalsiyumsuz deniz suyunda inkübasyon yoluyla kurtarma indüksiyonu, CaFSW'de 3 saatlik bir inkübasyondan sonra% 20 DMEM ortamında 20 saatlik bir inkübasyondan sonra tamamlandı (Şekil 2G-H). Doku, bireyselleştirilmiş mercan polipleri (Şekil 3A-C) ve "doku topları" üretilene kadar bir pipetle itildikten sonra her üç yöntemde de iskeletten ayrıldı.
Ayrılmadan sonra, her üç yöntemden polipler toplandı ve ağlarla veya hücre şişeleriyle kaplı Petri kaplarına tahsis edilmeden önce deniz suyunda iyileşmelerine izin verildi. Evaporasyon ve su temini yöntemlerinden elde edilen polipler akvaryumların içindeki Petri kaplarında muhafaza edilmiş ve sırasıyla 6 hafta ve 8 hafta boyunca hayatta kalmıştır (Şekil 3D ve Şekil 3F). Bu mikropropajatlar, dokunaçları, bazal diskleri ve ağızları sunan poliplerin olağan anatomisini korudu1. Kalsiyumsuz deniz suyunda inkübasyonla elde edilen polipler, 1 güne kadar hayatta kalan kısa bir ömre sahipti ve daha sonra dokuları ayrıştı. İnkübatörlerin içindeki hücre kültürü şişelerinde tutulan deniz suyu buharlaştırma yönteminden elde edilen polipler, dokuların ayrışması olmadan 3 haftaya kadar hayatta kalmıştır (Şekil 3F). Her durumda, polipler substrata bağlanamasa bile, görsel olarak sağlıklıydılar ve renklerini korudular, zooxanthellae hücreleri dokularının içinde hala görülebiliyordu1.
Şekil 1: Polip kurtarma indüksiyonu için test edilmiş üç farklı metodolojinin şematik gösterimi (solda) ve ardından edinilen poliplerin laboratuvar koşullarında tutulması için iki yöntemin gösterilmesi (sağda). (A) Su buharlaşması ile polip kurtarma metodolojisinin gösterimi. (B) Polip kurtarma metodolojisinin yüksek tuzlulukta deniz suyu temini ile temsil edilmesi. (C) Kalsiyumsuz deniz suyu inkübasyonu ile polip kurtarma metodolojisinin temsili. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mercan türü P. verrucosa'nın parçalarını kullanarak üç farklı metodolojinin neden olduğu polip kurtarma sürecinin görüntüleri. (A-C) Kuluçkadan sonra sırasıyla 0 saat, 12 saat ve 24 saat sonra bir mercan parçası, su buharlaştırma yöntemini kullanarak bir Petri kabında. (D-F) Yüksek tuzluluklu deniz suyu temini yöntemini kullanarak, inkübasyondan sonra sırasıyla 0 saat, 12 saat ve 24 saatte bir mercan parçası. (G,H) Kalsiyum içermeyen deniz suyu inkübasyon yöntemine maruz kalan mercan parçaları sırasıyla önce ve sonra. Kalsiyumsuz yapay deniz suyundaki inkübasyonlar 3 saat ve 21 saat için% 20 DMEM'de idi. (I) Su buharlaşması sırasında zaman içinde deniz suyunun PSU'sundaki tuzluluk değerlerinin grafiksel gösterimi ve yüksek tuzluluklu deniz suyu temini kurtarma indüksiyon yöntemleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Gösterilen üç kurtarma indüksiyon prosedüründen elde edilen P. verrucosa poliplerinin görüntüleri. (A-C) Sırasıyla buharlaşma, tuzlu su temini ve kalsiyum içermeyen deniz suyu yöntemlerinden elde edilen poliplerin görüntüleri, iskeletten ayrıldıktan hemen sonra yakalandı. (D) Bir Petri kabında 6 hafta hayatta kaldıktan sonra buharlaşma yönteminden elde edilen bir mercan polipinin görüntüsü. (E) Petri kabında 8 hafta hayatta kaldıktan sonra tuzlu su temini yönteminden elde edilen bir mercan polipinin görüntüsü. (F) Bir hücre kültürü şişesinde 3 hafta hayatta kaldıktan sonra buharlaşma yönteminden elde edilen bir mercan polipinin görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Kurtarma süreçlerine sunulduktan sonra poliplerin hayatta kalma oranı ve sürecin tamamlanması için gereken süre, muhtemelen her çalışmada uygulanan farklı deneysel yaklaşımlarla açıklanan, daha önce bildirilen25,33,41 araştırma arasında değişmektedir. Örneğin, farklı mercan türleri, hatta aynı türden olan ancak farklı çevresel koşullara alışmış mercanlar (örneğin, Kızıldeniz'den gelen mercanlar), tuzluluk seviyelerine farklı eşikler sunar. Seçilen kurtarma yöntemi ve laboratuvar/akvaryum koşulları da sonuçlarda önemli rol oynamaktadır. Bazı durumlarda, mercan mikropropagatlarının laboratuvar koşullarında korunması, azooksantelat 3 3,41 ve zooksantelat25 mercanlarda aylarca sağkalıma ulaşarak mercan hücre kültürlerinin hayatta kalma süresini aşmıştır. Polip kurtarma sürecinin tamamlanması için gereken süre, kurtarma operasyonuna neden olan stresöre maruz kalan birkaç saat 25,2 7,30 ila 3 5 hafta arasında değişen farklı çalışmalarda da değişmiştir. Polip kurtarma işlemini incelerken dikkate alınması gereken bir diğer değişken, poliplerin salınımlarını tetikleyen akut strese maruz kaldıktan sonra geri kazanılmasıdır. Kurtarma işleminden sonra poliplerin mercan biyolojisini incelemek için model olarak kullanılacak kadar iyi durumda olup olmadığı hala tartışmalıdır. Koenosarkın bozulmasından sonra dokularının iyileşmesi, bu mikropropagatları kullanırken endişe vericidir. Bununla birlikte, günümüzde de dahil olmak üzere birçok çalışmada polipler, dokularının içindeki zooksanthellae hücrelerini ve dış morfolojilerini,25,27,32,36 kurtarma işleminden haftalar sonra bozulmamış oral-aboral polarizasyon ve dokunaçlarla sunabilmiştir. Önceki çalışmalar ayrıca, akut stresten kurtulduktan sonra, yüksek oranda tuzlu veya ısıtılmış deniz suyuna maruz kalan salınan mercan poliplerinin, apoptoz, proteoliz ve hücre bölünmesi gibi süreçlerle ilgili genlerin ekspresyonunu, kurtarma işleminden önce bulunanlara benzer seviyelere geri kazanabildiğini bulmuştur 32,36 ve hatta doku iyileşmesi ile ilgili genlerin ekspresyonunu arttırabilir36.
Yöntemler arasındaki sağkalım farkı ile ilgili olarak, aynı teknikler kullanılsa bile bu sürenin farklı deneyler arasında değişebileceğini ve kullanılan parçaların sağlığı ve kurtarma işleminden sonra poliplerin uygun şekilde bakımı ile ilgili olabileceğini vurgulamak önemlidir. Kalsiyumsuz deniz suyu inkübasyonu yoluyla kurtarma durumunda, polip sağkalımı 1 gün ile sınırlıydı. Bu nedenle, yöntemin incelenen türlerin uzun süreli hayatta kalması için uygun olmadığı veya Kızıldeniz'den P. verrucosa mercanları için tekniğin daha iyi uyarlanması gerektiği sonucuna varılabilir. Bildirilen sonuçlar, poliplerin yüksek tuzluluktaki suyun damlamasına maruz kaldıklarında, tuzluluktaki kademeli artışa dayanan yöntemlerle daha uzun bir hayatta kalma süresi elde edildiğini göstermiştir. Bu yöntem, evaporasyon yönteminden daha tuzlulukta daha kontrollü bir artış sağlayabilir, aynı zamanda mercan metabolik atıkları da dahil olmak üzere deniz suyunda bulunan ve organizma için potansiyel olarak toksik olan diğer maddelerin konsantrasyonundaki artıştan sorumlu değildir. Tüm bu nedenlerden dolayı, bu yöntem sağlıklı poliplerin korunması için daha güvenli bir alternatif olarak önerilmiştir27. Her ne kadar bu yöntemin polip sağlığı için daha güvenli olduğu ve daha uzun yaşayan polipler üretebildiği varsayılmış olsa da, bu mevcut yayında doğrulanan bir gerçek, bunu doğrulamak için ek araştırmalara ihtiyaç vardır. Her iki yüksek tuzluluğa bağlı kurtarma deneyi, tuzluluk 24 saatte 59 PSU'ya ulaştıktan sonra poliplerin tamamen ayrıldığını göstermiştir. Tuzluluk, kurtarma işleminin tamamlandığı seviyenin üzerine çıkarsa, poliplere daha fazla stres neden olur, hayatta kalma ve akut stres tedavisinden kurtulma şanslarını azaltır. Bu nedenle, poliplerin bu tuzluluk seviyelerinde daha uzun süre tutulması önerilmez. Kurtarma indüksiyon yöntemini kalsiyumsuz deniz suyuna maruz bırakarak gerçekleştirirken, kalsiyum içermeyen yapay deniz suyunda 3 saatlik bir inkübasyondan tam bir ayrılma elde edildi, bu da bu ortama daha fazla maruz kalmanın da önerilmediği anlamına geliyor.
Laboratuvar / in vitro araştırmalarda mercan poliplerinin incelenmesi için daha yeterli olan yöntemleri ele almak için, bu çalışma sadece kurtarma sürecinin tamamlanması için 24 saate yakın süren üç prosedüre odaklandı ve skleraktin mercanlarından mercan poliplerinin uzun süreli bakımını içeren çalışmalarda kullanıldı. Bu süreden önemli ölçüde daha uzun sürdüğü bildirilen diğer yöntemler devreye girmedi. Farklı ortamlara aktarılabilen veya tek kullanımlık pipetler kullanılarak analizler için kolayca toplanabilen poliplerin üretilmesine odaklanan bu çalışmada poliplerin bir substrata yerleştirilmesi denenmemiştir. Sonuçlar, mercan türü P. verrucosa'dan gelen poliplerin, ilişkili zooxanthellae hücreleri, sağlıklı görme durumu ve korunmuş bir brüt dış anatomik yapı ile, bir substrata bağlanmadan bile 8 haftaya kadar canlı tutulduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, bu çalışmada gösterilen tekniklerin bazılarını kullanarak tek mercan parçalarından daha fazla biyolojik replikasyonun üretilebileceğini göstermektedir. Bu tür biyolojik replikalar kontrollü ortamlarda (Petri kapları ve hücre şişeleri gibi) tutulabilir ve aylarca süren deneyler için laboratuvar koşullarında tutulabilir ve çeşitli amaçlar için kullanılabilir.
Polip kurtarma paketinin ilk tesadüfi açıklamalarından bu yana42,43, polip salınımını indüklemek ve gelecekteki araştırma uygulamaları için kullanılabilecek bu polipleri canlı tutmak için daha standartlaştırılmış yöntemler bulmak için yeni protokoller oluşturulmuştur. Bunlar, mercan holobiont fizyolojisi 44 ve konakçı-mikrobiyom etkileşimleri45, mercan ağartmada yer alan moleküler mekanizmalar5,25 ve mercan holobiontunun sağlığı, esnekliği ve korunması ile ilişkili farklı yönlerin araştırılmasını içerir12,13,46,47 . Dahası, salınan mercan polipleri, araştırma alanı dışındaki uygulamalar için kullanılabilir ve bir substrata bağlanabilen ve büyüyebilen propagüller oluşturmak için yararlı olduğu öne sürülmüştür, potansiyel olarak kurtarma için standartlaştırılmış protokoller yaygınlaştığında restorasyon amacıyla kullanılabilecek birden fazla mercan bireyiyaratmaktadır28 . Genel olarak, metodolojiyi standartlaştırmak için kurtarılmış polipler kullanılarak daha derinlemesine deneyler yapılması gerekmesine rağmen, polip kurtarmanın, mercan araştırmalarında çeşitli amaçlar için bir araç olarak uygulanabilecek tekrarlanabilir bir yaklaşım olduğu gösterilmiştir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Adam Barno ve Francisca Garcia'ya mercan poliplerinin deneyleri ve izlenmesindeki destekleri için teşekkür ederiz. Ayrıca KAUST Kıyı ve Deniz Kaynakları Çekirdek Laboratuvarı'na akvaryum bakımı ve altyapısı ile ilgili yardımları için teşekkür ederiz. Çalışma KAUST hibe numarası BAS/1/1095-01-01 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5560 Conductivity/Temperature Probe | YSI | 5560 | Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter |
| Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers | Ace Hardware | 2004083 | Used to cut coral fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | Used in DMEM medium. |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41965-039 | Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method |
| Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene | Thermo Fisher Scientific | FB0875713A | Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium. |
| Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt | Schego | 548 | Heaters used in aquarium |
| Leica Application Suite Version 4.2 | Leica Microsystems | NA | Software used for image capture in demonstrative results |
| Leica IC80 HD | Leica Microsystems | 12730216 | Camera used to take demonstrative results pictures |
| Leica MDG33 | Leica Microsystems | 10 450 123 | Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures |
| Leica Z6 APO | Leica Microsystems | NA | Macroscope used to take demonstrative results pictures |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific | 7487-88-9 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | HV-77602-10 | Peristaltic pump head. |
| Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller | Masterflex | EW-07557-00 | Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol. |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft | Masterflex | HV-96410-16 | Tubing for peristaltic pump. |
| Millex 33 mm PVDF 0.22 µm Sterile RUO | Sigma-Aldrich | SLGVR33RS | Used to filter artificial sea water. |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 156499 | Flask usually used for cell culture used for polyp culture. |
| Orbital shaker, Advanced 5000, VWR | VWR | 444-2916 | Shaker used inside incubator. |
| Percival Incubator - I-22VL | Percival | NA | Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks. |
| Plankton net 200 µm mesh size | KC Denmark | NA | Used for covering petri dishes containing coral polyps. |
| Potassium Chloride | VWR Chemicals | 7447-40-7 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| ProQuatro Multiparameter Meter | YSI | 606950 | Used for measuring salinity thoughout the protocol |
| RADION XR15 G5 PRO | Ecotech | NA | Lights used in aquarium |
| Red Sea Salt Premium grade, moderate Alkalinity |
Red Sea | NA | Used to prepare 40 PSU artifical sea water. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| Sodium Sulfate Anhydrous | VWR Chemicals | 7757-82-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
| TRD 112 thermostat | Schego | NA | Thermostat used in aquarium |
| Turbelle Nanostream 6025 | Tunze | 6025 000 | Pumps used in aquarium |
References
- Goffredo, S., Dubinsky, Z. The Cnidaria, Past, Present and Future: The World of Medusa and her Sisters. , Springer. (2016).
- Knowlton, N., et al. Rebuilding coral reefs: a decadal grand challenge. International Coral Reef Society and Future Earth Coasts. , 56 (2021).
- Brown, B. Coral bleaching: causes and consequences. Coral Reefs. 16 (1), 129-138 (1997).
- Douglas, A.
- Nielsen, D. A., Petrou, K., Gates, R. D. Coral bleaching from a single cell perspective. The ISME Journal. 12 (6), 1558-1567 (2018).
- Oakley, C. A., Davy, S. K. Coral Bleaching: Patterns, Processes, Causes and Consequences. Coral Bleaching Book. , Springer. 189-211 (2018).
- Donner, S. D., Heron, S. F., Skirving, W. J. Future scenarios: a review of modelling efforts to predict the future of coral reefs in an era of climate change. Coral Bleaching. , 159-173 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O. Climate change, coral bleaching and the future of the world's coral reefs. Marine and Freshwater Research. 50 (8), 839-866 (1999).
- Hughes, T. P., et al. Global warming impairs stock-recruitment dynamics of corals. Nature. 568 (7752), 387-390 (2019).
- Moore, J. A., et al. Unprecedented mass bleaching and loss of coral across 12 of latitude in Western Australia in 2010-11. PLoS One. 7 (12), 51807 (2012).
- Duarte, G. A., et al. Heat waves are a major threat to turbid coral reefs in Brazil. Frontiers in Marine Science. 7, 179 (2020).
- Santoro, E. P., et al. Coral microbiome manipulation elicits metabolic and genetic restructuring to mitigate heat stress and evade mortality. Science Advances. 7 (33), (2021).
- Voolstra, C. R., et al. Extending the natural adaptive capacity of coral holobionts. Nature Reviews Earth & Environment. 2 (11), 747-762 (2021).
- Debergh, P. C., Read, P. E. Micropropagation. 1, Kluwer Academic Publishers. 1-13 (1991).
- Nitish, K., Reddy, M. P. In vitro plant propagation: a review. Journal of Forest and Environmental Science. 27 (2), 61-72 (2011).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 354 (4), 1095-1100 (2007).
- Yao, T., Asayama, Y. Animal-cell culture media: history, characteristics, and current issues. Reproductive Medicine and Biology. 16 (2), 99-117 (2017).
- Merten, O. W. Introduction to animal cell culture technology-past, present and future. Cytotechnology. 50 (1-3), 1 (2006).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. P. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Goldstein, B., King, N. The future of cell biology: emerging model organisms. Trends in Cell Biology. 26 (11), 818-824 (2016).
- Lecointe, A., et al. Scleractinian coral cell proliferation is reduced in primary culture of suspended multicellular aggregates compared to polyps. Cytotechnology. 65 (5), 705-724 (2013).
- Nowotny, J. D., Connelly, M. T., Traylor-Knowles, N. Novel methods to establish whole-body primary cell cultures for the cnidarians Nematostella vectensis and Pocillopora damicornis. Scientific Reports. 11 (1), 1-9 (2021).
- Kawamura, K., Nishitsuji, K., Shoguchi, E., Fujiwara, S., Satoh, N. Establishing sustainable cell lines of a coral, Acropora tenuis. Marine Biotechnology. 23, 373-388 (2021).
- Pang, A. -P., Luo, Y., He, C., Lu, Z., Lu, X. A polyp-on-chip for coral long-term culture. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
- Shapiro, O. H., Kramarsky-Winter, E., Gavish, A. R., Stocker, R., Vardi, A. A coral-on-a-chip microfluidic platform enabling live-imaging microscopy of reef-building corals. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Tambutté, S., et al. Coral biomineralization: From the gene to the environment. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 408 (1-2), 58-78 (2011).
- Chuang, P. -S., Mitarai, S. Signaling pathways in the coral polyp bail-out response. Coral Reefs. 39 (6), 1535-1548 (2020).
- Schweinsberg, M., Gösser, F., Tollrian, R. The history, biological relevance, and potential applications for polyp bail-out in corals. Ecology and Evolution. 11 (13), 8424-8440 (2021).
- Rakka, M., et al. First description of polyp bail-out in cold-water octocorals under aquaria maintenance. Coral Reefs. 38 (1), 15-20 (2019).
- Wells, C. D., Tonra, K. J. Polyp bail-out and reattachment of the abundant Caribbean octocoral Eunicea flexuosa. Coral Reefs. 40 (1), 27-30 (2021).
- Coppari, M., et al. Unveiling asexual reproductive traits in black corals: polyp bail-out in Antipathella subpinnata. Coral Reefs. 39 (6), 1517-1523 (2020).
- Chuang, P. S., Ishikawa, K., Mitarai, S. Morphological and genetic recovery of coral polyps after bail-out. Frontiers in Marine Science. 8, 280 (2021).
- Serrano, E., Coma, R., Inostroza, K., Serrano, O. Polyp bail-out by the coral Astroides calycularis (Scleractinia, Dendrophylliidae). Marine Biodiversity. 48 (3), 1661-1665 (2018).
- Kopecky, E. J., Ostrander, G. K. Isolation and primary culture of viable multicellular endothelial isolates from hard corals. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 35 (10), 616-624 (1999).
- Kvitt, H., et al. Breakdown of coral colonial form under reduced pH conditions is initiated in polyps and mediated through apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (7), 2082-2086 (2015).
- Gösser, F., Raulf, A., Mosig, A., Tollrian, R., Schweinsberg, M. Signaling pathways of heat-and hypersalinity-induced polyp bail-out in Pocillopora acuta. Coral Reefs. 40 (6), 1713-1728 (2021).
- Fordyce, A. J., Camp, E. F., Ainsworth, T. D. Polyp bail-out in Pocillopora damicornis following thermal stress. F1000Research. 6, 687 (2017).
- Wecker, P., et al. Exposure to the environmentally-persistent insecticide chlordecone induces detoxification genes and causes polyp bail-out in the coral P. Damicornis. Chemosphere. 195, 190-200 (2018).
- Schmidt-Roach, S., Miller, K. J., Lundgren, P., Andreakis, N. With eyes wide open: a revision of species within and closely related to the Pocillopora damicornis species complex (Scleractinia; Pocilloporidae) using morphology and genetics. Zoological Journal of the Linnean Society. 170 (1), 1-33 (2014).
- Gélin, P., Postaire, B., Fauvelot, C., Magalon, H. Reevaluating species number, distribution and endemism of the coral genus Pocillopora Lamarck, 1816 using species delimitation methods and microsatellites. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 430-446 (2017).
- Capel, K. C. C., Migotto, A., Zilberberg, C., Kitahara, M. V. Another tool towards invasion? Polyp "bail-out" in Tubastraea coccinea. Coral Reefs. 33 (4), 1165 (2014).
- Kawaguti, S. Materials for the study of reef-building corals III. Science of the South Sea (Kagaku Nanyo). 5, 95-106 (1942).
- Goreau, T. F., Goreau, N. I. The physiology of skeleton formation in corals. II. Calcium deposition by hermatypic corals under various conditions in the reef. Biological Bulletin. 117, 239-250 (1959).
- Swain, T. D., et al. Physiological integration of coral colonies is correlated with bleaching resistance. Marine Ecology Progress Series. 586, 1-10 (2018).
- Sweet, M., et al. Insights into the cultured bacterial fraction of corals. mSystems. 6 (3), 01249 (2020).
- Peixoto, R. S., Rosado, P. M., Leite, D. C. dA., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial microorganisms for corals (BMC): proposed mechanisms for coral health and resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341 (2017).
- Peixoto, R. S., et al. Coral probiotics: premise, promise, prospects. Annual Review of Animal Biosciences. 9, 265-288 (2021).
