Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

טכניקות מולקולריות ואימונולוגיות במודל עכבר מהונדס גנטית של גידול סטרומלי במערכת העיכול

Published: May 2, 2022 doi: 10.3791/63853
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Surgery, Hospital of the University of Pennsylvania

Summary

מטרת כתב יד זה היא לתאר את מודל העכבר Kit V558Δ/+ ואת הטכניקות לניתוח ועיבוד מוצלחים של דגימות עכברים.

Abstract

גידול סטרומלי במערכת העיכול (GIST) הוא הסרקומה האנושית הנפוצה ביותר והוא מונע בדרך כלל על ידי מוטציה אחת בקולטן KIT. על פני סוגי גידולים, פותחו מודלים רבים של עכברים על מנת לחקור את הדור הבא של הטיפולים בסרטן. עם זאת, ב- GIST, רוב מחקרי in vivo משתמשים במודלים של עכברי קסנוגרפט שיש להם מגבלות מובנות. כאן, אנו מתארים מודל עכברי בעל יכולת חיסונית, מהונדס גנטית, של גידול סטרומלי במערכת העיכול עם מוטציה של KitV558Δ/+ . במודל זה, KIT המוטנטי, האונקוגן האחראי על רוב ה-GISTs, מונע על ידי המקדם האנדוגני שלו המוביל ל-GIST המחקה את המראה ההיסטולוגי ואת החדירה החיסונית שנראית ב-GISTs אנושיים. יתר על כן, מודל זה שימש בהצלחה כדי לחקור הן טיפולים מולקולריים ממוקדים והן טיפולים חיסוניים. כאן, אנו מתארים את הרבייה והתחזוקה של מושבת עכברים Kit V558Δ/+ . בנוסף, מאמר זה מפרט את הטיפול והרכש של GIST, ניקוז בלוטות לימפה מזנטרית, וצקום צמוד בעכברי KitV558Δ/+ , כמו גם הכנה לדוגמה לניתוחים מולקולריים ואימונולוגיים.

Introduction

GIST היא הסרקומה הנפוצה ביותר בבני אדם עם שכיחות של כ -6,000 מקרים בארצות הברית של אמריקה1. נראה כי מקורו של GIST בתאי קוצב הלב במערכת העיכול הנקראים תאי הביניים של קאג'אל, והוא מונע בדרך כלל על ידי מוטציה בודדת בטירוזין קינאז KIT או PDGFRA2. ניתוח הוא עמוד התווך של הטיפול ב- GIST ויכול להיות מרפא, אך חולים עם מחלה מתקדמת עשויים להיות מטופלים עם מעכב טירוזין קינאז (TKI), imatinib. מאז הצגתו לפני למעלה מ-20 שנה, אימטיניב שינתה את פרדיגמת הטיפול ב-GIST, ושיפרה את ההישרדות במחלות מתקדמות מ-1 ליותר מ-5 שנים 3,4,5. למרבה הצער, imatinib הוא רק לעתים רחוקות מרפא בשל מוטציות KIT נרכש, ולכן יש צורך בטיפולים חדשים עבור גידול זה.

מודלים של עכברים הם כלי מחקרי חשוב בחקר טיפולים חדשניים בסרטן. מספר מודלים תת עוריים של קסנוגרפט וקסנוגרפט שמקורם בחולה פותחו ונחקרו ב-GIST 6,7. עם זאת, עכברים אימונו-יעילים אינם מייצגים באופן מלא את ה-GIST האנושי מכיוון ש-GISTs הם בעלי פרופיל חיסוני דיפרנציאלי בהתאם למוטציה האונקוגנית שלהם, ושינוי המיקרו-סביבה של הגידול במערכת העיכול משפר את ההשפעות של טיפול TKI 8,9. לעכבר KitV558Δ/+ יש מחיקה של חיידק הטרוזיגוטי ב-Kit exon 11, המקודדת את תחום ה-juxtamembrane, האתר בעל המוטציה הנפוצה ביותר ב-GIST10 האנושי. עכברי KitV558Δ/+ מפתחים GIST סקאל יחיד עם 100% חדירה, ולגידולים יש היסטולוגיה דומה, איתות מולקולרי, חדירה חיסונית ותגובה לטיפול כמו GIST 8,11,12,13 אנושי. כאן, אנו מתארים רבייה, טיפול ובידוד ועיבוד דגימות בעכברי KitV558Δ/+ לשימוש במחקר מולקולרי ואימונולוגי ב- GIST.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העכברים שוכנו בתנאים נטולי פתוגנים באוניברסיטת פנסילבניה על פי הנחיות NIH ובאישור אוניברסיטת פנסילבניה IACUC. המתת חסד בוצעה בעקבות נהלי ההפעלה הסטנדרטיים של משאבי בעלי חיים במעבדה של אוניברסיטת פנסילבניה.

1. ערכהV558Δ/+ גידול עכברים

  1. החזירו את עכברי ה-KitV558Δ/+ יותר מ-10 פעמים לרקע C57BL/6J באמצעות עכברי C57BL/6J. לשם כך, מגדלים את זכר עכברי KitV558Δ/+ עם נקבת עכברי C57BL/6J ביחס של 1:2.
    הערה: הגנוטיפ של הערכה ההומוזיגוטיתV558Δ/V558Δ היא קטלנית ברחם. ניתן לגדל נקבות קיטV558Δ/+ עכברים עם עכברי C57BL/6J זכרים, אך גודל הפסולת הוא כמחצית מזה שנראה מנקבת עכברי C57BL/6J. יתר על כן, נקבות עכברי KitV558Δ/+ מייצרות המלטות מוגבלות לאחר גיל 4 חודשים.
  2. גנוטיפ הגורים בגיל 7-14 ימים על ידי חיתוך הבוהן כדי לאשר את נוכחותו של הגנוטיפ של Kit V558Δ/+ . השתמש בפריימר הקדמי: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; כתב 1: CCTCGACAACCTTCCA; פריימר הפוך: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; וכתב 2: TCTCCTCGACCTTCCA לגנוטיפ.

2. ערכהV558Δ/+ טיפול בעכבר

  1. הגיל והמין תואמים את הערכהV558Δ/+עכברים לפני הטיפול. השתמש בעכברים תואמי גיל ומין בקבוצות, שכן גידולים מנקבת עכברי KitV558Δ/+ גדולים יותר מאלה שבעכברים זכרים. טפלו בעכברים בגיל 8-12 שבועות, ואז נוצרים גידולים (איור 1).
  2. תן מעכבי טירוזין קינאז בעל פה או על ידי הזרקה תוך-צפקית (i.p.); KitV558Δ/+ גידולים רגישים למעכבי טירוזין קינאז. ספקו אימטיניב במינון של 600 מ"ג/ל' במי שתייה או זריקות i.p. של 45 מ"ג/ק"ג פעמיים ביום. מדוד את הירידה במשקל הגידול באמצעות קשקשים דיגיטליים לאחר כריתת הגידול כפי שמוצג בשלב 3, שהם כ-50% בשבוע אחד ו-80% לאחר 4 שבועות לאחר הטיפול באימטיניב (איור 2).

3. ערכהV558Δ/+ קצירת איברי עכבר

  1. המתת עכברים על ידי נרקוזה CO2 בקצב זרימה של 60% נפח תא לדקה. השאירו את העכברים בחדר לפחות 2 דקות לאחר הפסקת הנשימה, ואז בצעו נקע צוואר הרחם כדי לאשר את המוות.
  2. לעקר את כל המכשירים, ללבוש כפפות לאורך כל ההליך, ולשמור על שדה סטרילי. הכן את העור עם 70% אתנול. בצע חתך אנכי בקו האמצע של 2 ס"מ באמצעות מספריים והיכנס לחלל הבטן. בחדות למדוד כל הידבקויות תוך-בטניות.
  3. כדי להסיר את בלוטת הלימפה המזנטרית המתנקזת, בצע את השלבים המתוארים להלן.
    1. זהה את ה-cecum והרים את המזנטריה שלו בצורה מעולה. בערך באמצע הדרך לבסיס המזנטריה המעי הגסית, זהה את בלוטת הלימפה המזנטרית ונתח אותה בחדות. בלוטת הלימפה היא אוף-ווייט וגודלה כ-0.5 ס"מ על 0.5 ס"מ.
    2. מחלקים את רקמת בלוטות הלימפה לשלישים לבידוד חלבונים, היסטולוגיה ותרחיף של תאים בודדים, לפי הצורך. עבור תרחיפים של תאים בודדים, יש להניח את רקמת בלוטת הלימפה ב-20 מ"ל של מדיה נטולת סרום (RPMI) ולשמור על קרח.
  4. לבידוד של ה-GIST וה-cecum, בצע את השלבים המתוארים להלן.
    1. הצקום בעכברי KitV558Δ/+ מוחלף ברובו על ידי GIST. בזהירות לחלק את הצומת האילאוקולי מבסיס הגידול. כדי לאסוף את cecum, לחלק את המעי הגס שוב, 2 ס"מ פרוקסימלי לבסיס הגידול.
    2. ב-50%-60% מעכברי KitV558Δ/+ של Kit V558Δ/+ , ראש הגידול מכיל מכסה של רקמת צ'ק, שבדרך כלל מכילה נוזל סרוסי, אך לעתים רחוקות עשויה להכיל מוגלה (איור 3). לנתח בחדות את רקמת הכובע הרחק מרקמת הגידול.
    3. מחלקים את רקמת הגידול ו/או את ה-cecum לשלישים לצורך בידוד חלבונים, היסטולוגיה ותרחיף של תאים בודדים, לפי הצורך. עבור תרחיפים של תאים בודדים, יש למקם רקמת גידול או cecum ב-HBSS עם 2% FCS, מספיק כדי לכסות את הדגימה ולשמור על קרח.

4. ניתוח כתם מערבי של רקמת GIST

  1. הכינו מאגר ליזה של רקמות המכיל 50 mM TrisHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% חומר ניקוי שאינו מתכלה, 2 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 10 mM NaF ותערובת מעכבי פרוטאינאז של 20 μl/ml.
  2. הכינו תמיסת מלח משולשת אחת עם 1x Tween 20 (TBST) על ידי שילוב של 1800 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה, 2 מ"ל של Tween 20 ו-200 מ"ל של 10x מי מלח עם חיץ Tris (TBS).
  3. יש לבצע החייאה של רקמה משלב 3.4.3 בצינור FACS ב-5 מ"ל/גרם של חיץ ליזיס רקמתי ולהומוגניזציה פעמיים עם הומוגנייזר מכני ב-15,000 סל"ד במשך 15 שניות על קרח. דגירה ליזאטה במשך 30 דקות על קרח.
  4. מעבירים את הליזאט לצינור מיקרוצנטריפוג' בגודל 1.5 מ"ל. צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את ה-supernatant לתוך צינור מיקרו-צנטריפוג' חדש.
  5. הפעילו ליאסטים על ג'ל שיפוע של 4% עד 15%, ואז העבירו לקרום ניטרוצלולוז, כמתוארב-14.
  6. יש לשטוף את הממברנה פעם אחת ב-1x TBS למשך 5 דקות ולאחר מכן לחסום את הממברנה בחלב 5% למשך שעה אחת. שוב, לשטוף קרום פעם אחת 1x TBS במשך 10 דקות.
  7. ממברנת הדגירה בנוגדן ראשוני מדולל 1:1000 ב-5% BSA ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. יש לשטוף את הממברנה 3x ב-1x TBST למשך 10 דקות כל אחת. כתם דגירה עם נוגדן משני מדולל 1:2500 בחלב 2.5% למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  8. יש לשטוף את הממברנה פעם אחת ב-1x TBS למשך 5 דקות. הוסף מספיק מצע HRP כדי לכסות את הממברנה, בדרך כלל 200-500 μL, והשתמש בתמונה דיגיטלית כדי לזהות ולכמת chemiluminescence.

5. אימונוהיסטוכימיה של רקמת GIST

  1. תקן רקמה משלב 3.3.2 או 3.4.3 ב 4% paraformaldehyde ב 4 ° C לילה. אחסן רקמות ב-70% EtOH עד שיהיה מוכן לעיבוד. הטמעה וחתך בלוקים בעובי של 5 מיקרומטר על גבי מגלשות זכוכית, כמתואר15,16.
  2. זיהוי אימונוהיסטוכימי מלא באמצעות ערכת אימונודציה בסיסית, כפי שתואר קודם לכן17.

6. השעיה חד-תאית של בלוטת המזנטרית

  1. יוצקים מדיית RPMI עם דגימת בלוטות לימפה משלב 3.3.2 מעל מסנן של 100 מיקרומטר. העבר את המסנן לבלוטות לימפה חרוטיות ומחתיות חדשות של 50 מ"ל עם הקצה הרך של מזרק פלסטיק 3 מ"ל. מסנן שטיפה עם 20 מ"ל של מדיית RPMI.
  2. צנטריפוגה את התסיס ב 450 x g ב 4 ° C במשך 5 דקות. לשאוף את הסופרנאטנט.
  3. גלולת Resuspend ב-20 מ"ל של 1% FBS ב-PBS (מאגר חרוזים) ושופכת מעל מסנן של 40 מיקרומטר. לאסוף את תפיח התא. לספור תאים באמצעות המוציטומטר.
  4. צנטריפוגה את התסיס ב 450 x g ב 4 ° C במשך 5 דקות. לשאוף את הסופרנאטנט. Resuspend במאגר חרוזים ב 6 x 107 תאים / מ"ל עבור ציטומטריה זרימה.

7. השעיה של תא יחיד של GIST

  1. הכינו את מאגר הקולג'אנאז על ידי הוספת 250 מ"ג של קולגן IV, טבליה אחת של מעכב פרוטאז ללא EDTA ו-100 μL של DNase I ל-50 מ"ל של HBSS. יש לסובב במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עד להמסה.
  2. מניחים את GIST במנה סטרילית ומוסיפים 2.5 מ"ל של מאגר קולגןאז. גידול טחון באמצעות אזמל סטרילי ומספריים עד שהגידול נמצא בשברים עדינים. השתמשו בפיפטה בור גדולה כדי לשאוף את הגידול ואת הקולגן לתוך צינור 50 מ"ל.
  3. דגירה באינקובטור רועד ב-100 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. תגובת מרווה עם 2 מ"ל של FBS.
  4. יוצקים קולגן עם דגימת GIST על מסנן של 100 מיקרומטר וגידול מחית עם הקצה הרך של מזרק פלסטיק 3 מ"ל ואסוף בצינור 50 מ"ל. לשטוף מסנן עם 20 מ"ל של HBSS. צנטריפוגה את התסיס ב 450 x g, 4 ° C במשך 5 דקות. לשאוף את הסופרנאטנט.
  5. בצעו החייאה של הכדור ב-20 מ"ל של מאגר חרוזים ושפכו מעל מסנן של 40 מיקרומטר. לאסוף את התסיסים ולספור את התאים באמצעות המוציטומטר. צנטריפוגה את התסיס ב 450 x g, 4 ° C במשך 5 דקות. לשאוף את הסופרנאטנט. Resuspend במאגר חרוזים ב 6 x 107 תאים / מ"ל עבור ציטומטריה זרימה.

8. השעיה של תא יחיד של cecum

  1. הכינו מאגר קולגן כמו בשלב 7.1. באמצעות מספריים, לפצל את cecum אורכית כדי לחשוף את הרירית הפנימית. חותכים למקטעים של 0.5 ס"מ ומניחים בצינור 50 מ"ל עם 5 מ"ל של HBSS עם 2% FBS. יש לנער במרץ במשך 30 שניות, לצנטריפוגה ב-450 x גרם במשך 20 שניות, ואז לשאוף לסופרנאטנט.
  2. הוסף 5 מ"ל של HBSS עם 2 mM EDTA. דגירה באינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-100 סל"ד למשך 15 דקות. צנטריפוגה ב 450 x g עבור 20 s. לשאוף את הסופרנאטנט.
  3. הוסף 5 מ"ל של HBSS. יש לנער במרץ במשך 30 שניות, לצנטריפוגה ב-450 x גרם במשך 20 שניות, ואז לשאוף לסופרנאטנט. חזור על הפעולה פעם נוספת.
  4. הוסיפו 5 מ"ל של מאגר קולגןאז. דגירה באינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב-100 סל"ד. לנער במרץ כל 10 דקות. תגובת מרווה עם 2 מ"ל של FBS.
  5. יוצקים קולגן עם דגימת cecum על מסנן של 100 מיקרומטר ומחית עם הקצה הרך של מזרק פלסטיק 3 מ"ל. לשטוף מסנן עם 20 מ"ל של HBSS. לאסוף תבעיר.
  6. צנטריפוגה את התסיס ב 450 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוף את הסופרנאטנט. גלולת Resuspend ב 20 מ"ל של מאגר חרוזים לשפוך מעל מסנן 40 מיקרומטר. לאסוף תסיסים ולספור תאים באמצעות המוציטומטר.
  7. צנטריפוגה את התסיס ב 450 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוף את הסופרנאטנט. Resuspend במאגר חרוזים ב 6 x 107 תאים / מ"ל עבור ציטומטריה זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מודל העכבר Kit V558Δ/+ מאפשר לחקור טיפולים במודל עכברים אימונו-תחרותי. לערכהV558Δ/+ לעכברים יש תוחלת חיים ממוצעת של 8 חודשים עקב חסימת מעיים מתקדמת (איור 4). גידולים מ-KitV558Δ/+ עכברים מבטאים סמנים קנוניים של GIST כולל הטירוזין קינאז KIT ותעלת הטרנס-ממברנה DOG1 (איור 5), כמו גם גורם השעתוק ETV1 (לא מוצג). ניתן לחקור גידולים לשינויים במסלול האיתות KIT, כגון הסמנים במורד הזרם ERK ו-AKT (איור 6), או מיקרו-סביבה חיסונית המחקה מקרוב את GIST 8,11,12,13 האנושי. MRI8 או CT (איור 7) יכולים לשמש גם למעקב אחר נפח הגידול כמדידה מדויקת של תגובת הגידול. עכבר KitV558Δ/+ שלא טופל קיבל 200 μL של גסטרוגרפין דרך הפה 1 שעה לפני ההדמיה. הדמיית CT הושלמה על פלטפורמת vivaCT 80. שחזור תלת מימד בוצע באמצעות תוכנת פיג'י, שיכולה גם למדוד את נפח הגידול.

Figure 1
איור 1: השוואת משקלי הגידול בזכר ובנקבה KitV558Δ/+ עכברים. גידולים של קיטV558Δ/+ עכברים זכרים ונקבות בני 9 שבועות לא מטופלים בודדו ונשקלו (n = 15 עכברים/קבוצה). הנתונים מייצגים שגיאת תקן ממוצעת ± של ממוצע (SEM); ערכי p חושבו באמצעות מבחן t של תלמיד; * = P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: השפעת האימטיניב על גידולים מעכברי KitV558Δ/+ . קיטV558Δ/+ עכברים טופלו ברכב או 600 מ"ג/ל' אימטיניב במי שתייה במשך שבוע או ארבעה. הגידולים בודדו ונשקלו (n = 4-5 עכברים/קבוצה). הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM; ערכי p חושבו באמצעות השוואת ANOVA חד-כיוונית עם מבחן בונפרוני לאחר הבדיקה לצורך השוואה בין קבוצות בודדות; * = P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: קיטV558Δ/+ גידול עם מכסה. תמונה מייצגת של גידול מעכבר Kit V558Δ/+ עם מכסה cecal המכיל נוזל סרוסי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: תוחלת החיים של עכברי KitV558Δ/+ . הישרדותם של עכברי KitV558Δ/+ שלא טופלו במעקב במשך >-400 יום (n = 43 עכברים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח אימונוהיסטוכימי. היסטולוגיה מייצגת של גידול קיטV558Δ/+ שבו סרגל קנה המידה הוא 40 μm. קיצורים: H&E = המטוקסילין וצביעת eosin; ערכה = סימן קנוני של GIST וקולטן טירוזין קינאז; Dog1 = סמן קנוני של GIST עם תפקיד בהובלת אניון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: ניתוח איתות מולקולרי. עכברי KitV558Δ/+ טופלו באמצעות כלי רכב או 600 מ"ג/ל' אימטיניב במי השתייה במשך שבוע אחד. עכברים קיבלו זריקת i.p. אחת של רכב או 45 מ"ג/ק"ג imatinib 6 שעות לפני הניתוח. ליסאטים חלבוניים מגידולי KitV558Δ/+ נבדקו על ידי כתם מערבי (n = 2 עכברים/קבוצה). קיצורים: P Kit = זרחן קולטן קיט טירוזין קינאז; ערכת T = סה"כ קולטן קיט טירוזין קינאז; P ERK = מיטוגן זרחני מופעל חלבון קינאז; T ERK = סך הכל מיטוגן מופעל חלבון קינאז; P AKT = זרחן סרין-תראונין חלבון קינאז; T AKT = סה"כ חלבון סרין-תראונין קינאז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: ניתוח הדמיית CT. שחזור CT תלת-ממדי של עכבר KitV558Δ/+ שלא טופל המדגים גידול (חץ) באגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודל העכבר Kit V558Δ/+ הוא כלי מחקר רב עוצמה בניתוח מולקולרי ואימונולוגי של GIST. למרות שאסטרטגיית הרבייה דורשת צלב יחיד, שימוש בקבוצת עכברים Kit V558Δ/+ בניסויים המנתחים את תגובת הגידול דורש רבייה נרחבת. עכברים צריכים להיות מותאמי גיל ומין כדי להבטיח משקל גידול דומה, ו -10% מהעכברים מתים לפני גיל 8 שבועות כאשר הגידולים נוצרים. אסטרטגיות רבייה פחות נרחבות אפשריות אם משתמשים בטכניקות הדמיה מתקדמות כגון CT או MRI כדי לעקוב אחר נפח הגידול בתוך עכברים בודדים. אף על פי כן, עכברי KitV558Δ/+ חצו בהצלחה למודלים אחרים של עכברים נוק-אאוט או בלתי ניתנים להשראה, וחשפו מנגנונים חיסוניים ומולקולריים חשובים12.

תאי גידול מעכברי KitV558Δ/+ מבודדים בקלות על ידי מיון עמודות עבור KIT (CD117) או על ידי ציטומטריה של זרימה18. ניתן לגדל תאי גידול מבודדים מ-KitV558Δ/+ עכברים במבחנה12. במעברים מוקדמים, תאי גידול מבודדים מעכברי KitV558Δ/+ שומרים על ביטוי KIT וניתן להשתמש בהם למחקרים במבחנה . עם זאת, לאחר מספר קטעים, קווי תאים אלה מאבדים את ביטוי KIT, ומגבילים את תחולתם. כמו רוב דגמי העכברים, גידולי KitV558Δ/+ אינם שולחים גרורות, מה שמגביל את המחקר של GIST מחוץ למעי הגס. באופן דומה, גידולים מעכברי KitV558Δ/+ מופיעים רק בצקום, ותאים המבודדים מגידולי KitV558Δ/+ אינם גדלים כאשר הם מבודדים ומוזרקים לכבד או לטחול, מה שמגביל את הערכת המיקרו-סביבה של הגידול מאתרי מחלה שונים. כמו כן, למוטציית KitV558Δ/+ אין כל השפעה ידועה על ההתפתחות ההמטולוגית של תאים במודל עכבר זה.

המיקרו-סביבה החיסונית בגידולים מעכברי KitV558Δ/+ מכילה בעיקר מקרופאגים ואחריהם תאי T, המחקים באופן הדוק את GIST11 האנושי. עם זאת, חובה להסיר לחלוטין את מכסה הצקל מהגידול לפני הערכת משקל הגידול או חדירת החיסון, שכן קיימות אוכלוסיות חיסוניות נפרדות בגידול לעומת הצקום. מניסיוננו, משקלי הגידול דומים גם בקרב אלה עם כובעים, ואין קשר משמעותי בין טיפול במעכבי טירוזין קינאז לבין התפתחות מכסה cecal. יתר על כן, לא מצאנו הבדל משמעותי במיקרו-סביבה של הגידול בהשוואת גידולים עם ובלי כובעי צקל.

מודלים רבים של עכברים מהונדסים גנטית פותחו לשימוש בחקר הסרטן, במיוחד מאז הופעתה של עריכת גנים של קריספר. בעוד שמודלים חיסוניים רבים מסתמכים על הפעלה בתיווך cre-loxP של אונקוגן או על השבתה של גנים מדכאי גידולים, גידולי KitV558Δ/+ מונעים על ידי המקדם האנדוגני שלהם. בהתאם לכך, הממצאים במודל העכבר Kit V558Δ/+ ניתנים לתרגום גבוה למחלות אנושיות, במיוחד בהערכת איתות KIT19. במבט קדימה, עכבר ה- KitV558Δ/+ אמור להמשיך לשמש כמודל בעל ערך כאשר אסטרטגיות טיפול חדשניות כולל חסימת מחסום וטיפול CAR T ממשיכות להיחקר לטיפול בגידולי רקמות רכות כולל GIST.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עכברי קיטV558Δ/+ הונדסו גנטית ושותפו על ידי ד"ר פיטר בסמר10. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01 CA102613 ו- T32 CA251063.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 micron filter EMSCO 1194-2360
1x RBC lysis buffer Life Technologies 00-4333-57
3mL syringe Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences 14823435
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl Bio-Rad 4561083
4% Paraformaldehyde Solution Thermo Fisher Scientific AAJ19943K2
40 micron filter EMSCO 1194-2340
5M NaCl Sigma Aldrich S6546
70 micron filter EMSCO 1194-2350
AKT antibody (C67E7) Cell Signaling 4691
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory
Collagenase IV Sigma Aldrich C5138
Complete mini edta free protease inhibitor Thomas Scientific C852A34
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific
Disposable Scalpels Thermo Fisher Scientific/Exel International 14-840-00
Dnase I Thomas Scientific C756V81
Dog1 antibody abcam ab64085
EDTA Sigma Aldrich E9884
ERK antibody (p44/42) Cell Signaling 9102
FBS Thomas Scientific C788U23
FIJI software FIJI https://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 Homogenizer Thermo Fisher Scientific 15-340-169
HBSS University of Pennsylvania Cell Center
Imatinib mesylate Selleck Chemicals S1026
KIT antibody (D13A2) Cell Signaling 3074
KitV558Δ/+ Genotyping Transnetyx
Microcentrifuge tubes (1.5mL) Thermo Fisher Scientific 05-408-129
Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic Vector Laboratories BMK-2202
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm Rio-Rad 1620145
Nonfat Dry Milk Thermo Fisher Scientific NC9121673
Nonidet P 40 Substitute Sigma Aldrich 74385
p-AKT antibody (S473) Cell Signaling 4060
p-ERK antibody (p44/42) Cell Signaling 9101
p-KIT antibody (Y719) Cell Signaling 3391
PMSF Protease Inhibitor Thermo Fisher Scientific 36978
Proeinase K Thermo Fisher Scientific BP170050
Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes Falcon/Thermo Fisher Scientific 14-959-2A
RPMI University of Pennsylvania Cell Center
Sodium fluoride (NaF) Sigma Aldrich 201154
Sodium orthovanadate (Na3VO4) Sigma Aldrich S6508
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate Thermo Fisher Scientific 34076
TBS buffer (10x) University of Pennsylvania Cell Center
Tissue culture dish (100mm2) Thermo Fisher Scientific/Falcon 08-772E
TrisHCL Thermo Fisher Scientific BP1757500
Tween 20 Rio-Rad 1706531
 vivaCT 80 platform Scanco medical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
  2. Joensuu, H., DeMatteo, R. P. The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy. Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).
  3. Blanke, C. D., et al. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT. Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).
  4. Demetri, G. D., et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).
  5. Gold, J. S. Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors. Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).
  6. Huynh, H., et al. Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).
  7. Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
  8. Balachandran, V. P., et al. Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido. Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).
  9. Vitiello, G. A., et al. Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor. Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).
  10. Sommer, G., et al. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).
  11. Cavnar, M. J., et al. KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).
  12. Medina, B. D., et al. Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).
  13. Zhang, J. Q., et al. Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).
  14. General Protocol for Western Blotting. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf (2022).
  15. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 253-268 (2019).
  16. Sy, J., Ang, L. -C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 269-278 (2019).
  17. Seifert, A. M., et al. PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).
  18. Liu, M., et al. Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST. Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).
  19. Rossi, F., et al. Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).

Tags

חקר הסרטן גיליון 183
טכניקות מולקולריות ואימונולוגיות במודל עכבר מהונדס גנטית של גידול סטרומלי במערכת העיכול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tieniber, A. D., Hanna, A. N., Do,… More

Tieniber, A. D., Hanna, A. N., Do, K., Wang, L., Rossi, F., DeMatteo, R. P. Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor. J. Vis. Exp. (183), e63853, doi:10.3791/63853 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter