Summary
O objetivo deste manuscrito é descrever o modelo de mouse KitV558Δ/+ e técnicas para dissecção e processamento bem-sucedidos de amostras de camundongos.
Abstract
O tumor estromal gastrointestinal (GIST) é o sarcoma humano mais comum e é tipicamente impulsionado por uma única mutação no receptor KIT. Entre os tipos de tumores, inúmeros modelos de camundongos foram desenvolvidos para investigar a próxima geração de terapias contra o câncer. No entanto, no GIST, a maioria dos estudos in vivo usa modelos de mouse xenoenxerto que têm limitações inerentes. Aqui, descrevemos um modelo de camundongos imunocompetente, geneticamente modificado, de tumor estromal gastrointestinal que abriga uma mutação KitV558Δ/+ Neste modelo, o KIT mutante, o oncogene responsável pela maioria dos GISTs, é impulsionado por seu promotor endógeno que leva a um GIST que imita a aparência histológica e o infiltrado imunológico visto em GISTs humanos. Além disso, este modelo tem sido usado com sucesso para investigar terapias moleculares e imunológicas direcionadas. Aqui, descrevemos a criação e manutenção de uma colônia de ratos KitV558Δ/+ Além disso, este artigo detalha o tratamento e a aquisição de GIST, drenando linfonodos mesentéricos e ceco adjacente em camundongos KitV558Δ/+ , bem como preparação de amostras para análises moleculares e imunológicas.
Introduction
GIST é o sarcoma mais comum em humanos com uma incidência de cerca de 6.000 casos nos Estados Unidos da América1. GIST parece se originar das células pacemaker gastrointestinal chamadas células intersticiais de Cajal, e é tipicamente impulsionado por uma única mutação no KIT de quinase tyrosina ou PDGFRA2. A cirurgia é o pilar do tratamento para GIST e pode ser curativa, mas pacientes com doença avançada podem ser tratados com o inibidor de tyrosina quinase (TKI), imatinib. Desde sua introdução, há mais de 20 anos, o imatinib transformou o paradigma do tratamento em GIST, melhorando a sobrevida em doenças avançadas de 1 para mais de 5 anos 3,4,5. Infelizmente, o imatinib raramente é curativo devido às mutações adquiridas do KIT, por isso novos tratamentos são necessários para este tumor.
Os modelos de camundongos são uma importante ferramenta de pesquisa na investigação de novas terapias em câncer. Múltiplos modelos de xenoenxerto subcutâneo e xenoenxerto derivados do paciente foram desenvolvidos e investigados em GIST 6,7. No entanto, camundongos imunodeficientes não representam totalmente o GIST humano, uma vez que os GISTs abrigam perfis imunológicos diferenciais dependendo de sua mutação oncogênica, e alterar o microambiente tumoral gastrointestinal melhora os efeitos da terapia TKI 8,9. O mouse KitV558Δ/+ tem uma exclusão germinal heterozigous em Kit exon 11, que codifica o domínio justxtamembrano, o local mais comumente mutado no GIST10 humano. Os camundongos KitV558Δ/+ desenvolvem um único cecal GIST com 100% de penetração, e os tumores têm histologia semelhante, sinalização molecular, infiltração imunológica e resposta à terapia como GIST 8,11,12,13. Aqui, descrevemos a reprodução, o tratamento e o isolamento e processamento de espécimes em camundongos KitV558Δ/+ para uso em pesquisas moleculares e imunológicas em GIST.
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Protocol
Todos os camundongos foram alojados em condições livres de patógenos na Universidade da Pensilvânia de acordo com as diretrizes do NIH e com a aprovação da IACUC da Universidade da Pensilvânia. A eutanásia foi realizada após os procedimentos operacionais padrão do Laboratório de Recursos Animais da Universidade da Pensilvânia.
1. KitV558Δ/+ reprodução de camundongos
- Backcross do KitV558Δ/+ ratos mais de 10 vezes em um fundo C57BL/6J usando ratos C57BL/6J. Para isso, crie o kitmacho V558Δ/+ com camundongos C57BL/6J fêmeas a uma proporção de 1:2.
NOTA: O genótipo homozigoso kitV558Δ/V558Δ é letal no útero. É possível criar camundongos kitV558Δ/+ fêmeas com camundongos C57BL/6J machos, mas o tamanho da ninhada é cerca de metade do visto de camundongos fêmeas selvagens C57BL/6J. Além disso, camundongos kitV558Δ/+ fêmeas produzem ninhadas limitadas após 4 meses de idade. - Genótipo os filhotes aos 7-14 dias de idade por recorte do dedo do pé para confirmar a presença do genótipo kitV558Δ/+ Use o primer para a frente: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; repórter 1: CCTCGACAACCTTCCA; primer reverso: TTGCGTCGGGTCTATATTAAACAT; e repórter 2: TCTCCTCGACCTTCCA para genotipagem.
2. KitV558Δ/+ tratamento do mouse
- Idade e sexo combinam com o KitV558Δ/+camundongos antes do tratamento. Use os camundongos com idade e sexo em coortes, pois os tumores de camundongos kitV558Δ/+ femininos são maiores do que os de camundongos machos. Trate os camundongos com 8-12 semanas de idade, momento em que os tumores são estabelecidos (Figura 1).
- Dar inibidores de tyrosina quinase oralmente ou por injeção intraperitoneal (i.p.); Os tumores kit V558Δ/+ são sensíveis aos inibidores da quinase de tirasina. Forneça imatinibe em uma dose de 600 mg/L em água potável ou injeções i.p. de 45 mg/kg duas vezes por dia. Meça a redução do peso tumoral utilizando escamas digitais após a dissecção do tumor, como mostrado na etapa 3, que é de aproximadamente 50% em 1 semana e 80% em 4 semanas após o tratamento com imatinibe (Figura 2).
3. KitV558Δ/+ colheita de órgãos do rato
- Eutanize camundongos por narcose CO2 a uma taxa de fluxo de 60% de volume de câmara por minuto. Deixe os ratos na câmara por pelo menos 2 minutos após a respiração ter cessado, em seguida, realizar luxação cervical para confirmar a morte.
- Esterilize todos os instrumentos, use luvas durante todo o procedimento e mantenha um campo estéril. Prepare a pele com 70% de etanol. Faça uma incisão vertical de 2 cm usando uma tesoura e entre na cavidade abdominal. Lise severamente qualquer aderência intra-abdominal.
- Para remover o linfonodo mesentérico drenante, siga os passos descritos abaixo.
- Identifique o ceco e levante sua mesenteria superiormente. Aproximadamente no meio do caminho até a base da mesenteria colonia, identifique o linfonodo mesentérico e dissefique-o bruscamente. O linfonodo é off-white e cerca de 0,5 cm x 0,5 cm de tamanho.
- Divida o tecido linfático em terços para isolamento de proteínas, histologia e suspensão de células únicas, conforme necessário. Para suspensões de células únicas, coloque tecido linfático em 20 mL de mídia livre de soro (RPMI) e mantenha no gelo.
- Para o isolamento do GIST e do ceco, siga os passos descritos abaixo.
- O ceco em camundongos KitV558Δ/+ é substituído principalmente por um GIST. Divida cuidadosamente a junção ileocólica da base do tumor. Para coletar o ceco, divida o cólon novamente, 2 cm proximal à base do tumor.
- Em 50%-60% dos camundongos KitV558Δ/+ , a cabeça do tumor contém uma tampa de tecido cecal, que normalmente contém fluido sêmérico, mas raramente pode conter pus (Figura 3). Disseca o tecido da tampa para longe do tecido tumoral.
- Divida o tecido tumoral e/ou ceco em terços para isolamento de proteínas, histologia e suspensão de células únicas, conforme necessário. Para suspensões unicelulares, coloque tecido tumoral ou ceco no HBSS com 2% de FCS, o suficiente para cobrir a amostra e manter no gelo.
4. Análise de manchas ocidentais do tecido GIST
- Prepare o tampão de lise tecidual contendo 50 mM TrisHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, detergente 1% não dedesaturado, 2 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 10 mM NaF e 20 μl/ml mistura inibidora de proteínaase.
- Prepare uma solução salina tamponada 1x Tris com 1% de Tween 20 (TBST) combinando 1800 mL de água deionizada, 2 mL de Tween 20 e 200 mL de soro fisiológico 10x Tris-tamponado (TBS).
- Resuspend tecido a partir do passo 3.4.3 em um tubo FACS em 5mL/g de tampão de lise tecidual e homogeneizar duas vezes com um homogeneizador mecânico a 15.000 rpm para 15 s no gelo. Incubar lysate por 30 minutos no gelo.
- Transfira para um tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL. Centrifugar em velocidade máxima por 20 min a 4 °C. Transfira supernante para um novo tubo de microcentrífuga.
- Execute lysates em um gel de 4% a 15% de gradiente, depois transfira para uma membrana de nitrocelulose, como descrito em14.
- Lave a membrana uma vez em 1x TBS por 5 min e depois bloqueie a membrana em 5% de leite por 1h. Novamente, lave a membrana uma vez em 1x TBS por 10 minutos.
- Incubar membrana em anticorpo primário diluído 1:1000 em 5% BSA a 4 °C durante a noite. Lave a membrana 3x em 1x TBST por 10 min cada. Incubar a mancha com anticorpo secundário diluído 1:2500 em 2,5% de leite por 1h à temperatura ambiente.
- Lave a membrana uma vez em 1x TBS por 5 min. Adicione substrato HRP suficiente para cobrir a membrana, tipicamente 200-500 μL, e use um imager digital para detectar e quantificar a quemiluminescência.
5. Imunohistoquímica do tecido GIST
- Fixar tecido a partir da etapa 3.3.2 ou 3,4,3 em 4% de paraformaldeído a 4 °C durante a noite. Armazene tecido em 70% EtOH até estar pronto para processamento. Blocos de incorporação e seção com 5 μm de espessura em lâminas de vidro, como descrito15,16.
- Detecção imunohistoquímica completa usando um kit básico de imunodetecção, como descrito anteriormente17.
6. Suspensão celular única do linfonodo mesenérico
- Despeje a mídia RPMI com a amostra do linfonodo da etapa 3.3.2 sobre um filtro de 100 μm. Mova o filtro para o novo linfonodo cônico de 50 mL e mash com a extremidade macia de uma seringa de plástico de 3 mL. Lave o filtro com 20 mL de mídia RPMI.
- Centrifugar o filtrado a 450 x g a 4 °C por 5 min. Aspire o supernatante.
- Resuspend pelotas em 20 mL de 1% FBS em PBS (tampão de contas) e despeje sobre um filtro de 40 μm. Pegue o filtrado da célula. Conte células usando um hemócito.
- Centrifugar o filtrado a 450 x g a 4 °C por 5 min. Aspire o supernatante. Resuspend em tampão de contas a 6 x 107 células/mL para citometria de fluxo.
7. Suspensão de célula única do GIST
- Prepare o tampão de colagenase adicionando 250 mg de colagenase IV, um comprimido de inibidor de protease sem EDTA e 100 μL de DNase I a 50 mL de HBSS. Gire por 10 minutos à temperatura ambiente até dissolver.
- Coloque GIST em um prato estéril e adicione 2,5 mL de tampão de colagenase. Tumor mince usando um bisturi estéril e uma tesoura até que o tumor esteja em fragmentos finos. Use uma pipeta grande para aspirar o tumor e colagenase em um tubo de 50 mL.
- Incubar em uma incubadora a tremer a 100 rpm a 37 °C por 30 min. Sacie a reação com 2 mL de FBS.
- Despeje colagenase com espécime GIST sobre um filtro de 100 μm e tumor de purê com a extremidade macia de uma seringa plástica de 3 mL e colete em um tubo de 50 mL. Lave o filtro com 20 mL de HBSS. Centrifugar o filtrado a 450 x g, 4 °C por 5 min. Aspire o supernatante.
- Resuspenda a pelota em 20 mL de tampão de contas e despeje sobre um filtro de 40 μm. Colete o filtrado e conte células usando um hemócito. Centrifugar o filtrado a 450 x g, 4 °C por 5 min. Aspire o supernatante. Resuspend em tampão de contas a 6 x 107 células/mL para citometria de fluxo.
8. Suspensão de célula única do ceco
- Prepare o tampão de colagenase como na etapa 7.1. Usando uma tesoura, divida o ceco longitudinalmente para expor a mucosa interna. Corte em seções de 0,5 cm e coloque em um tubo de 50 mL com 5 mL de HBSS com 2% de FBS. Agite vigorosamente por 30 s, centrífuga a 450 x g por 20 s, depois aspire o supernatante.
- Adicione 5 mL de HBSS com 2 mM EDTA. Incubar em uma incubadora de agitação a 37 °C a 100 rpm por 15 min. Centrifugar a 450 x g para 20 s. Aspire o supernatante.
- Adicione 5 mL de HBSS. Agite vigorosamente por 30 s, centrífuga a 450 x g por 20 s, depois aspire o supernatante. Repita mais uma vez.
- Adicione 5 mL de tampão de colagenase. Incubar em uma incubadora a 37 °C por 30 min a 100 rpm. Agite vigorosamente a cada 10 minutos. Sacie a reação com 2 mL de FBS.
- Despeje colagenase com espécime de ceco sobre um filtro de 100 μm e amasse com a extremidade macia de uma seringa plástica de 3 mL. Lave o filtro com 20 mL de HBSS. Coletar filtrado.
- Centrifugar o filtrado a 450 x g por 5 min a 4 °C. Aspire o supernatante. Resuspend pelotas em 20 mL de tampão de contas e despeje sobre um filtro de 40 μm. Coletar células filtras e contar usando um hemótmetro.
- Centrifugar o filtrado a 450 x g por 5 min a 4 °C. Aspire o supernatante. Resuspend em tampão de contas a 6 x 107 células/mL para citometria de fluxo.
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Representative Results
O modelo de mouse KitV558Δ/+ permite a investigação de terapêutica em um modelo de camundongo imunocompetente. Os camundongos KitV558Δ/+ têm uma vida útil média de 8 meses devido à obstrução intestinal progressiva (Figura 4). Tumores do KitV558Δ/+ camundongos expressam marcadores canônicos de GIST incluindo o KIT de quinase tyrosina e o canal transmembrano DOG1 (Figura 5), bem como o fator de transcrição ETV1 (não mostrado). Tumores podem ser estudados para alterações na via de sinalização kit, como os marcadores a jusante ERK e AKT (Figura 6), ou microambiente imunológico que imita de perto o GISThumano 8,11,12,13. A ressonância magnética8 ou tomografia (Figura 7) também pode ser usada para rastrear o volume do tumor como uma medição precisa da resposta do tumor. Um rato KitV558Δ/+ não tratado recebeu 200 μL de gastrograffin oralmente 1 h antes da imagem. A imagem da tomografia computadorizada foi concluída em uma plataforma vivaCT 80. A reconstrução 3D foi realizada com o software Fiji, que também pode medir o volume do tumor.
Figura 1: Comparação dos pesos tumorais em camundongos do KitV558Δ/+ masculino e feminino. Tumores de camundongos não tratados de 9 semanas de idade do Kit V558Δ/+ foram isolados e pesados (n = 15 camundongos/grupo). Os dados representam erro médio ± de média (MEI); p os valores foram calculados utilizando-se o teste t de um aluno; * = P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeito de imatinibe em tumores de camundongos KitV558Δ/+ Os camundongos kit V558Δ/+ foram tratados com veículo ou 600 mg/L imatinib em água potável por 1 ou 4 semanas. Os tumores foram isolados e pesados (n = 4-5 camundongos/grupo). Os dados representam ± MÉDIAS MEI; p os valores foram calculados utilizando-se uma comparação unidirecional de ANOVA com um pós-teste bonferroni para comparação de grupos individuais; * = P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: KitV558Δ/+ tumor com tampa. Foto representativa de um tumor de um rato KitV558Δ/+ com uma tampa cecal contendo fluido sérico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Vida útil dos ratos KitV558Δ/+ A sobrevivência de camundongos não tratados do Kit V558Δ/+ foi rastreada por > 400 dias (n = 43 ratos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise imunohistoquímica. Histologia representativa de um tumor KitV558Δ/+ onde a barra de escala é de 40 μm. Abreviaturas: H&E = hematoxilina e eosina; Kit = uma marca canônica de GIST e quinase tyrosina receptora; Dog1 = um marcador canônico de GIST com papel no transporte de ânion. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Análise de sinalização molecular. Os camundongos KitV558Δ/+ foram tratados com veículo ou 600 mg/L imatinib em água potável por 1 semana. Os camundongos receberam uma única injeção i.p. do veículo ou 45 mg/kg imatinib 6 h antes da análise. Os lises proteicos do KitV558Δ/+ foram examinados por mancha ocidental (n = 2 camundongos/grupo). Abreviaturas: Kit P = kit fosforilado receptor tyrosine quinase; Kit T = receptor total do kit tyrosine quinase; P ERK = mitogênio fosforilado ativado pela proteína quinase; T ERK = kinase total de proteína ativada por mitogênio; P AKT = kinase da proteína de soro-threonina fosforilada; T AKT = total quinase da proteína serina-threonina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Análise de imagem ct. Reconstrução 3D CT de um rato KitV558Δ/+ não tratado demonstrando um tumor (seta) na pelve. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O modelo de mouse KitV558Δ/+ é uma poderosa ferramenta de pesquisa na análise molecular e imunológica do GIST. Embora a estratégia de reprodução exija uma única cruz, o uso de coortes de camundongos KitV558Δ/+ em experimentos que analisam a resposta ao tumor requer uma reprodução extensiva. Os camundongos devem ter idade e sexo compatível para garantir pesos tumorais semelhantes, e 10% dos camundongos morrem antes das 8 semanas de idade quando os tumores são estabelecidos. Estratégias de reprodução menos extensas são possíveis se usar técnicas avançadas de imagem, como tomografia computadorizada ou ressonância magnética para rastrear o volume de tumores em camundongos individuais. No entanto, os camundongos KitV558Δ/+ foram cruzados com sucesso para outros modelos de camundongos eliminados ou indutíveis, revelando importantes mecanismos imunológicos e moleculares12.
As células tumorais do KitV558Δ/+ são facilmente isoladas pela triagem de colunas para KIT (CD117) ou por citometriade fluxo 18. Células tumorais isoladas de camundongos KitV558Δ/+ podem ser cultivadas in vitro12. Nas passagens iniciais, células tumorais isoladas do KitV558Δ/+ camundongos retêm a expressão KIT e podem ser usadas para estudos in vitro . No entanto, após várias passagens, essas linhas de celular perdem a expressão KIT, limitando sua aplicabilidade. Como a maioria dos modelos de camundongos, os tumores kitV558Δ/+ não metástases, o que limita o estudo do GIST extraintestinal. Da mesma forma, tumores do KitV558Δ/+ camundongos só ocorrem no ceco, e as células isoladas dos tumores kitV558Δ/+ não crescem quando isoladas e injetadas no fígado ou baço, o que limita a avaliação do microambiente tumoral de diferentes locais da doença. Além disso, a mutação KitV558Δ/+ não tem nenhum impacto conhecido no desenvolvimento hematológico das células neste modelo de mouse.
O microambiente imunológico em tumores de camundongos KitV558Δ/+ contém principalmente macrófagos seguidos por células T, que imita de perto o GIST11 humano. No entanto, é imperativo que a tampa cecal seja completamente removida do tumor antes de avaliar o peso tumoral ou infiltração imunológica, uma vez que existem populações imunes distintas no tumor versus o ceco. Em nossa experiência, os pesos tumorais são comparáveis mesmo entre aqueles com tampas, e não há associação significativa entre a terapia inibidora de tyrosina quinase e o desenvolvimento de uma tampa cecal. Além disso, não encontramos diferença significativa no microambiente tumoral comparando tumores com e sem tampas cecal.
Muitos modelos de camundongos geneticamente modificados foram desenvolvidos para uso em pesquisas sobre câncer, especialmente desde o advento da edição de genes CRISPR. Enquanto inúmeros modelos imunocompetuntes dependem da ativação mediada de cre-loxP de oncogenes ou inativação de genes supressores tumorais, os tumores KitV558Δ/+ são impulsionados por seu promotor endógeno. Assim, os achados no modelo de mouse KitV558Δ/+ são altamente traduzíveis para doenças humanas, particularmente na avaliação da sinalização KIT19. Olhando para o futuro, o mouse KitV558Δ/+ deve continuar a servir como um modelo valioso, pois novas estratégias de tratamento, incluindo bloqueio de checkpoint e terapia CAR T continuam a ser exploradas para o tratamento de tumores de tecido mole, incluindo GIST.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Os camundongos KitV558Δ/+ foram geneticamente modificados e compartilhados pelo Dr. Peter Besmer10. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R01 CA102613 e T32 CA251063.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
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