Summary
الهدف من هذه المخطوطة هو وصف نموذج الماوس KitV558Δ/+ وتقنيات التشريح والمعالجة الناجحة لعينات الماوس.
Abstract
الورم اللحمي المعدي المعوي (GIST) هو الساركوما البشرية الأكثر شيوعا وعادة ما يكون مدفوعا بطفرة واحدة في مستقبلات KIT. عبر أنواع الأورام ، تم تطوير العديد من نماذج الفئران من أجل التحقيق في الجيل التالي من علاجات السرطان. ومع ذلك ، في GIST ، تستخدم معظم الدراسات في الجسم الحي نماذج فأر xenograft التي لها قيود متأصلة. هنا ، نصف نموذجا للفأر المختص بالمناعة والمعدل وراثيا لورم لحمية الجهاز الهضمي يؤوي طفرة KitV558Δ / +. في هذا النموذج ، يتم دفع KIT المتحور ، وهو الجين الورمي المسؤول عن معظم GISTs ، بواسطة مروجه الداخلي مما يؤدي إلى GIST الذي يحاكي المظهر النسيجي والتسلل المناعي الذي شوهد في GISTs البشرية. علاوة على ذلك ، تم استخدام هذا النموذج بنجاح للتحقيق في كل من العلاجات الجزيئية والمناعية المستهدفة. هنا ، نصف تربية وصيانة مستعمرة الفأر KitV558Δ / +. بالإضافة إلى ذلك ، تفصل هذه الورقة علاج وشراء GIST ، وتصريف العقدة الليمفاوية المساريقية ، والأعور المجاور في الفئران KitV558Δ / + ، بالإضافة إلى إعداد العينات للتحليلات الجزيئية والمناعية.
Introduction
GIST هو الساركوما الأكثر شيوعا في البشر مع حدوث حوالي 6000 حالة في الولايات المتحدة الأمريكية1. يبدو أن GIST ينشأ من خلايا تنظيم ضربات القلب المعدية المعوية المسماة الخلايا الخلالية في Cajal ، وعادة ما يكون مدفوعا بطفرة واحدة في مجموعة التيروزين كيناز أو PDGFRA2. الجراحة هي الدعامة الأساسية لعلاج GIST ويمكن أن تكون علاجية ، ولكن يمكن علاج المرضى الذين يعانون من مرض متقدم باستخدام مثبط التيروزين كيناز (TKI) ، إيماتينيب. منذ تقديمه منذ أكثر من 20 عاما ، قام imatinib بتحويل نموذج العلاج في GIST ، مما أدى إلى تحسين البقاء على قيد الحياة في الأمراض المتقدمة من 1 إلى أكثر من 5 سنوات 3,4,5. لسوء الحظ ، نادرا ما يكون إيماتينيب علاجيا بسبب طفرات KIT المكتسبة ، لذلك هناك حاجة إلى علاجات جديدة لهذا الورم.
نماذج الفئران هي أداة بحثية مهمة في التحقيق في العلاجات الجديدة في السرطان. تم تطوير العديد من نماذج xenograft تحت الجلد و xenograft المشتقة من المريض والتحقيق فيها في GIST 6,7. ومع ذلك ، فإن الفئران التي تعاني من نقص المناعة لا تمثل GIST البشري بشكل كامل لأن GISTs تؤوي ملفات تعريف مناعية تفاضلية اعتمادا على طفرتها الورمية ، وتغيير البيئة الدقيقة لورم الجهاز الهضمي يحسن من آثار العلاج TKI 8,9. يحتوي الماوس Kit V558Δ/+ على حذف خط جرثومي غير متجانس في Kit exon 11 ، والذي يشفر مجال juxtamembrane ، وهو الموقع الأكثر تحورا شيوعا في GIST10 البشري. تقوم الفئرانV558Δ / + بتطوير GIST سيكال واحد مع اختراق 100٪ ، والأورام لها أنسجة مماثلة ، وإشارات جزيئية ، وتسلل مناعي ، واستجابة للعلاج مثل GIST البشري 8,11,12,13. هنا ، نصف تربية وعلاج وعزل العينات ومعالجتها في الفئران KitV558Δ / + لاستخدامها في البحوث الجزيئية والمناعية في GIST.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إيواء جميع الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض في جامعة بنسلفانيا وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة وبموافقة جامعة بنسلفانيا IACUC. تم تنفيذ القتل الرحيم وفقا لإجراءات التشغيل القياسية للموارد الحيوانية في مختبر جامعة بنسلفانيا.
1. كيتV558Δ / + تربية الماوس
- قم بإرجاع الفئرانV558Δ/+ أكثر من 10 مرات على خلفية C57BL/6J باستخدام الفئران C57BL/6J. للقيام بذلك ، قم بتربية الفئران الذكور V558Δ / + مع الفئران C57BL / 6J الإناث بنسبة 1: 2.
ملاحظة: النمط الوراثي لمجموعة متماثلة الزيجوت V558 Δ/V558Δ قاتل في الرحم. من الممكن تربية إناث كيتV558Δ / + الفئران مع الفئران C57BL / 6J الذكور ، ولكن حجم القمامة حوالي نصف ما شوهد من الفئران البرية C57BL / 6J. علاوة على ذلك ، تنتج الفئران الإناث V558Δ / + كميات محدودة من الفضلات بعد 4 أشهر من العمر. - النمط الوراثي للجراء في عمر 7-14 يوما عن طريق قص إصبع القدم لتأكيد وجود النمط الوراثي KitV558Δ / +. استخدم التمهيدي الأمامي: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; مراسل 1: CCTCGACAACCTTCCA ؛ عكس التمهيدي: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; والمراسل 2: TCTCCTCGACCTTCCA للتنميط الجيني.
2. كيتV558Δ / + علاج الماوس
- يتطابق العمر والجنس مع مجموعةV558Δ/+ الفئران قبل العلاج. استخدم الفئران المتطابقة مع العمر والجنس في الأتراب لأن الأورام من الفئران الإناث V558Δ / + أكبر من تلك الموجودة في الفئران الذكور. علاج الفئران في عمر 8-12 أسبوعا ، وفي ذلك الوقت يتم إنشاء الأورام (الشكل 1).
- إعطاء مثبطات التيروزين كيناز عن طريق الفم أو عن طريق الحقن داخل الصفاق (i.p) ؛ مجموعةV558Δ / + الأورام حساسة لمثبطات التيروزين كيناز. توفير إيماتينيب بجرعة 600 ملغم/لتر في مياه الشرب أو حقن 45 مغ/كغ مرتين يوميا. قم بقياس انخفاض وزن الورم باستخدام المقاييس الرقمية بعد تشريح الورم كما هو موضح في الخطوة 3 ، والتي تبلغ حوالي 50٪ في أسبوع واحد و 80٪ في 4 أسابيع بعد العلاج باستخدام إيماتينيب (الشكل 2).
3. كيتV558Δ / + حصاد جهاز الماوس
- القتل الرحيم للفئران بواسطة مخدر CO2 بمعدل تدفق 60٪ من حجم الغرفة في الدقيقة. اترك الفئران في الغرفة لمدة 2 دقيقة على الأقل بعد توقف التنفس ، ثم قم بإجراء خلع عنق الرحم لتأكيد الوفاة.
- تعقيم جميع الأدوات ، وارتداء القفازات طوال العملية ، والحفاظ على حقل معقم. تحضير الجلد مع 70 ٪ من الإيثانول. قم بعمل شق عمودي في خط الوسط 2 سم باستخدام مقص وأدخل تجويف البطن. قم بتحليل أي التصاقات داخل البطن بشكل حاد.
- لإزالة العقدة الليمفاوية المساريقية المستنزفة، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
- تحديد الأعور ورفع مساريقه بشكل متفوق. في منتصف الطريق تقريبا إلى قاعدة المساريق القولون ، حدد العقدة الليمفاوية المساريقية وتشريحها بحدة. العقدة الليمفاوية بيضاء اللون ويبلغ حجمها حوالي 0.5 سم × 0.5 سم.
- قسم أنسجة العقدة الليمفاوية إلى أثلاثين لعزل البروتين والأنسجة وتعليق الخلية الواحدة ، حسب الحاجة. بالنسبة لمعلقات الخلايا المفردة ، ضع أنسجة العقدة الليمفاوية في 20 مل من الوسائط الخالية من المصل (RPMI) واحتفظ بها على الجليد.
- لعزل GIST والأعور ، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
- يتم استبدال الأعور في كيتV558Δ / + الفئران في الغالب ب GIST. تقسيم بعناية تقاطع اللفائفي من قاعدة الورم. لجمع الأعور ، قسم القولون مرة أخرى ، 2 سم بالقرب من قاعدة الورم.
- في 50٪ -60٪ من الفئران KitV558Δ / + ، يحتوي رأس الورم على غطاء من الأنسجة السيكالية ، والتي تحتوي عادة على سائل مصلي ولكن نادرا ما تحتوي على القيح (الشكل 3). تشريح أنسجة الغطاء بشكل حاد بعيدا عن أنسجة الورم.
- قسم أنسجة الورم و / أو الأعور إلى أثلاثين لعزل البروتين والأنسجة وتعليق الخلية الواحدة ، حسب الحاجة. بالنسبة لتعليق الخلية الواحدة ، ضع أنسجة الورم أو الأعور في HBSS مع 2٪ FCS ، وهو ما يكفي لتغطية العينة والحفاظ على الجليد.
4. تحليل اللطخة الغربية لأنسجة GIST
- تحضير المخزن المؤقت لتحلل الأنسجة الذي يحتوي على 50 ملليمتر TrisHCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 150 mM NaCl ، 5 mM EDTA ، 1٪ منظف غير محدد ، 2 mM Na3VO4 ، 1 mM PMSF ، 10 mM NaF ، و 20 ميكرولتر / مل خليط مثبطات البروتيناز.
- قم بإعداد محلول ملحي مخزن مؤقتا 1x Tris مع 1٪ Tween 20 (TBST) من خلال الجمع بين 1800 مل من الماء منزوع الأيونات ، و 2 مل من Tween 20 ، و 200 مل من محلول ملحي مخزن مؤقتا 10x Tris (TBS).
- أعد تعليق الأنسجة من الخطوة 3.4.3 في أنبوب FACS في 5mL / g من المخزن المؤقت لتحلل الأنسجة وتجانس مرتين باستخدام مجانس ميكانيكي عند 15000 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية على الجليد. احتضان الليزات لمدة 30 دقيقة على الجليد.
- نقل الليزات إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق 1.5 مل. جهاز طرد مركزي بسرعة قصوى لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. نقل supernatant إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق.
- قم بتشغيل lysates على هلام متدرج بنسبة 4٪ إلى 15٪ ، ثم انقله إلى غشاء نيتروسليلوز ، كما هو موضح في14.
- اغسل الغشاء مرة واحدة في 1x TBS لمدة 5 دقائق ثم احجب الغشاء في 5٪ من الحليب لمدة 1 ساعة. مرة أخرى ، اغسل الغشاء مرة واحدة في 1x TBS لمدة 10 دقائق.
- الغشاء الحاضن في الأجسام المضادة الأولية المخفف 1: 1000 في 5٪ BSA عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. اغسل الغشاء 3x في 1x TBST لمدة 10 دقائق لكل منهما. لطخة الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة 1: 2500 في الحليب 2.5 ٪ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الغشاء مرة واحدة في 1x TBS لمدة 5 دقائق. أضف ما يكفي من ركيزة HRP لتغطية الغشاء ، عادة 200-500 ميكرولتر ، واستخدم جهاز تصوير رقمي للكشف عن التلألؤ الكيميائي وقياسه كميا.
5. الكيمياء النسيجية المناعية لأنسجة GIST
- إصلاح الأنسجة من الخطوة 3.3.2 أو 3.4.3 في 4٪ بارافورمالديهايد عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تخزين الأنسجة في 70٪ EtOH حتى تصبح جاهزة للمعالجة. قم بتضمين كتل وتقسيمها بسماكة 5 ميكرومتر على شرائح زجاجية ، كما هو موضحفي 15,16.
- الكشف الكامل عن الكيمياء المناعية باستخدام مجموعة أساسية للكشف عن المناعة ، كما هو موضح سابقا17.
6. تعليق خلية واحدة من العقدة الليمفاوية المساريقية
- صب وسائط RPMI مع عينة العقدة الليمفاوية من الخطوة 3.3.2 على مرشح 100 ميكرومتر. انقل الفلتر إلى عقدة ليمفاوية مخروطية وهرسية جديدة سعة 50 مل مع الطرف الناعم لمحقنة بلاستيكية سعة 3 مل. فلتر الغسيل مع 20 مل من وسائط RPMI.
- الطرد المركزي للترشيح عند 450 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. شفط السوبرناتانت.
- أعد تعليق الكريات في 20 مل من FBS بنسبة 1٪ في PBS (المخزن المؤقت للخرزة) واسكبها على مرشح 40 ميكرومتر. جمع ترشيح الخلية. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
- الطرد المركزي للترشيح عند 450 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. شفط السوبرناتانت. أعد التعليق في المخزن المؤقت للخرزة عند 6 × 107 خلايا/مل لقياس التدفق الخلوي.
7. تعليق خلية واحدة من GIST
- تحضير الكولاجيناز المخزن المؤقت عن طريق إضافة 250 ملغ من الكولاجيناز الرابع ، قرص واحد من مثبط الأنزيم البروتيني الخالي من EDTA و 100 ميكرولتر من DNase I إلى 50 مل من HBSS. تدور لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة حتى تذوب.
- ضع GIST في طبق معقم وأضف 2.5 مل من الكولاجيناز العازل. افرم الورم باستخدام مشرط معقم ومقص حتى يصبح الورم في شظايا دقيقة. استخدم ماصة كبيرة التجويف لشفط الورم والكولاجيناز في أنبوب سعة 50 مل.
- احتضن في حاضنة تهتز عند 100 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بإخماد التفاعل باستخدام 2 مل من FBS.
- صب الكولاجيناز مع عينة GIST على مرشح 100 ميكرومتر وهرس الورم مع نهاية ناعمة من حقنة بلاستيكية 3 مل وجمعها في أنبوب 50 مل. اغسل الفلتر ب 20 مل من HBSS. جهاز الطرد المركزي للترشيح عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. شفط السوبرناتانت.
- أعد تعليق الكريات في 20 مل من المخزن المؤقت للخرز واسكبها على مرشح 40 ميكرومتر. جمع الخلايا المرشحة وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم. جهاز الطرد المركزي للترشيح عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. شفط السوبرناتانت. أعد التعليق في المخزن المؤقت للخرزة عند 6 × 107 خلايا/مل لقياس التدفق الخلوي.
8. تعليق خلية واحدة من الأعور
- تحضير الكولاجيناز المخزن المؤقت كما في الخطوة 7.1. باستخدام المقص ، قم بتقسيم الأعور طوليا لفضح الغشاء المخاطي الداخلي. تقطع إلى أقسام 0.5 سم وتوضع في أنبوب 50 مل مع 5 مل من HBSS مع 2٪ FBS. رج بقوة لمدة 30 ثانية ، وأجهزة الطرد المركزي في 450 × غرام لمدة 20 ثانية ، ثم استنشق السوبرناتان.
- أضف 5 مل من HBSS مع 2 mM EDTA. احتضان في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 20 ثانية. شفط السوبرناتانت.
- أضف 5 مل من HBSS. رج بقوة لمدة 30 ثانية ، وأجهزة الطرد المركزي في 450 × غرام لمدة 20 ثانية ، ثم استنشق السوبرناتان. كرر مرة أخرى.
- أضف 5 مل من الكولاجيناز العازل. احتضن في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة عند 100 دورة في الدقيقة. رجه بقوة كل 10 دقائق. قم بإخماد التفاعل باستخدام 2 مل من FBS.
- صب الكولاجيناز مع عينة الأعور على مرشح 100 ميكرومتر وهرس مع نهاية ناعمة من حقنة بلاستيكية 3 مل. اغسل الفلتر ب 20 مل من HBSS. جمع الترشيح.
- الطرد المركزي للترشيح عند 450 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. شفط السوبرناتانت. أعد تعليق الكريات في 20 مل من المخزن المؤقت للخرز واسكبها على مرشح 40 ميكرومتر. جمع الخلايا المرشحة وعدها باستخدام مقياس الدم.
- الطرد المركزي للترشيح عند 450 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. شفط السوبرناتانت. أعد التعليق في المخزن المؤقت للخرزة عند 6 × 107 خلايا/مل لقياس التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسمح نموذج الماوس KitV558Δ/+ بالتحقيق في العلاجات في نموذج الماوس المناعي. يبلغ متوسط عمر الفئران V558Δ/+ 8 أشهر بسبب انسداد الأمعاء التدريجي (الشكل 4). الأورام من KitV558Δ / + الفئران تعبر عن العلامات القانونية ل GIST بما في ذلك مجموعة التيروزين كيناز والقناة عبر الغشاء DOG1 (الشكل 5) ، وكذلك عامل النسخ ETV1 (غير معروض). يمكن دراسة الأورام بحثا عن التغيرات في مسار إشارات KIT ، مثل علامات المصب ERK و AKT (الشكل 6) ، أو البيئة الدقيقة المناعية التي تحاكي عن كثب GIST البشري 8,11,12,13. يمكن أيضا استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي8 أو التصوير المقطعي المحوسب (الشكل 7) لتتبع حجم الورم كقياس دقيق لاستجابة الورم. تم إعطاء فأرV558Δ/+ غير المعالج 200 ميكرولتر من gastrograffin عن طريق الفم قبل 1 ساعة من التصوير. تم الانتهاء من التصوير المقطعي المحوسب على منصة vivaCT 80. تم إجراء إعادة بناء 3D مع برنامج فيجي ، والذي يمكنه أيضا قياس حجم الورم.
الشكل 1: مقارنة أوزان الورم في الذكور والإناث مجموعةV558Δ / + الفئران. تم عزل ووزن الأورام من الفئران من الذكور والإناث من الذكور والإناث البالغة من العمر 9 أسابيع (n = 15 فأرا / مجموعة). تمثل البيانات متوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) ؛ تم حساب قيم p باستخدام اختبار t للطالب ؛ * = P < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تأثير إيماتينيب على الأورام من الفئران KitV558Δ/+. تمت معالجة الفئرانV558Δ / + مع السيارة أو 600 ملغ / لتر إيماتينيب في مياه الشرب لمدة 1 أو 4 أسابيع. تم عزل الأورام ووزنها (n = 4-5 فئران / مجموعة). تمثل البيانات متوسط ± SEM ؛ تم حساب قيم p باستخدام مقارنة ANOVA أحادية الاتجاه مع اختبار Bonferroni اللاحق لمقارنة المجموعات الفردية ؛ * = P < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: كيتV558Δ / + الورم مع غطاء. صورة تمثيلية لورم من فأر KitV558Δ / + مع غطاء سيكال يحتوي على سائل مصلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: عمر الفئران KitV558Δ/+. تم تتبع بقاء الفئران V558Δ/+ غير المعالجة لمدة > 400 يوم (n = 43 فأر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التحليل الكيميائي النسيجي المناعي. علم الأنسجة التمثيلي لورم KitV558Δ / + حيث يكون شريط المقياس 40 ميكرومتر. Kit = علامة قانونية ل GIST ومستقبلات التيروزين كيناز ؛ Dog1 = علامة قانونية ل GIST لها دور في نقل الأنيون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تحليل الإشارات الجزيئية. تمت معالجة الفئران KitV558Δ / + باستخدام مركبة أو 600 ملغم / لتر من الإيماتينيب في مياه الشرب لمدة 1 أسبوع. أعطيت الفئران حقنة i.p. واحدة من السيارة أو 45 مغ/كغ من إيماتينيب 6 ساعات قبل التحليل. تم فحص محللات البروتين من أورام KitV558Δ / + بواسطة لطخة غربية (n = 2 فئران / مجموعة). الاختصارات: P Kit = مستقبلات التيروزين كيناز المفسفرة ؛ T عدة = مجموع مجموعة مستقبلات التيروزين كيناز; P ERK = كيناز البروتين المنشط بالميتوجين المفسفر. T ERK = إجمالي كيناز البروتين المنشط بالميتوجين ؛ P AKT = كيناز بروتين سيرين ثريونين المفسفر. T AKT = إجمالي بروتين سيرين-ثريونين كيناز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تحليل التصوير المقطعي المحوسب. إعادة بناء التصوير المقطعي المحوسب 3D لفأر غير معالج من طراز KitV558Δ/+ يظهر ورما (سهما) في الحوض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد نموذج الماوس KitV558Δ/+ أداة بحث قوية في التحليل الجزيئي والمناعي ل GIST. على الرغم من أن استراتيجية التربية تتطلب صليبا واحدا ، إلا أن استخدام مجموعات الفئران Kit V558Δ / + في التجارب التي تحلل استجابة الورم يتطلب تربية واسعة النطاق. يجب أن تكون الفئران متطابقة مع العمر والجنس لضمان أوزان الورم المماثلة ، وتموت 10٪ من الفئران قبل 8 أسابيع من العمر عند إنشاء الأورام. استراتيجيات تربية أقل شمولا ممكنة إذا استخدمت تقنيات تصوير متقدمة مثل التصوير المقطعي المحوسب أو التصوير بالرنين المغناطيسي لتتبع حجم الورم داخل الفئران الفردية. ومع ذلك ، تم عبور الفئران KitV558Δ / + بنجاح إلى نماذج أخرى من الفئران بالضربة القاضية أو المستحثة ، مما كشف عن آليات مناعية وجزيئية مهمة12.
يتم عزل الخلايا السرطانية من الفئران KitV558Δ / + بسهولة عن طريق فرز العمود ل KIT (CD117) أو عن طريق قياس التدفق الخلوي18. يمكن زراعة الخلايا السرطانية المعزولة من الفئران KitV558Δ / + في المختبر12. في الممرات المبكرة ، تحتفظ الخلايا السرطانية المعزولة من الفئران KitV558Δ / + بتعبير KIT ويمكن استخدامها في الدراسات المختبرية. ومع ذلك ، بعد عدة مقاطع ، تفقد خطوط الخلايا هذه تعبير KIT ، مما يحد من قابليتها للتطبيق. مثل معظم نماذج الفئران ، لا تنتشر أورام KitV558Δ / + ، مما يحد من دراسة GIST خارج الأمعاء. وبالمثل ، فإن الأورام من الفئران Kit V558Δ / + تحدث فقط في الأعور ، ولا تنمو الخلايا المعزولة من أورام KitV558Δ / + عند عزلها وحقنها في الكبد أو الطحال ، مما يحد من تقييم البيئة الدقيقة للورم من مواقع مختلفة من المرض. أيضا ، ليس لطفرة KitV558Δ / + أي تأثير معروف على التطور الدموي للخلايا في نموذج الماوس هذا.
تحتوي البيئة الدقيقة المناعية في الأورام من الفئران KitV558Δ / + في الغالب على البلاعم تليها الخلايا التائية ، والتي تحاكي عن كثب GIST11 البشري. ومع ذلك ، من الضروري إزالة غطاء cecal بالكامل من الورم قبل تقييم وزن الورم أو التسلل المناعي ، حيث توجد مجموعات مناعية متميزة في الورم مقابل الأعور. في تجربتنا ، فإن أوزان الورم قابلة للمقارنة حتى بين تلك التي تحتوي على قبعات ، ولا يوجد ارتباط كبير بين العلاج بمثبطات التيروزين كيناز وتطوير غطاء سيكال. علاوة على ذلك ، لم نجد أي فرق كبير في البيئة الدقيقة للورم مقارنة الأورام مع وبدون قبعات cecal.
تم تطوير العديد من نماذج الفئران المعدلة وراثيا لاستخدامها في أبحاث السرطان ، خاصة منذ ظهور تحرير الجينات كريسبر. في حين أن العديد من النماذج المناعية تعتمد على التنشيط بوساطة cre-loxP للجينات السرطانية أو تعطيل الجينات المثبطة للورم ، فإن أورام KitV558Δ / + مدفوعة من قبل مروجها الداخلي. وبناء على ذلك، فإن النتائج التي تم التوصل إليها في نموذج الماوس KitV558Δ/+ قابلة للترجمة بدرجة كبيرة إلى أمراض بشرية، لا سيما في تقييم إشارات KIT19. وبالنظر إلى المستقبل، يجب أن يستمر الماوس KitV558Δ/+ في العمل كنموذج قيم حيث يستمر استكشاف استراتيجيات العلاج الجديدة بما في ذلك حصار نقاط التفتيش والعلاج CAR T لعلاج أورام الأنسجة الرخوة بما في ذلك GIST.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
تم هندسة مجموعةV558Δ / + الفئران وراثيا ومشاركتها من قبل الدكتور بيتر بيسمر10. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01 CA102613 و T32 CA251063.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
References
- Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
- Joensuu, H., DeMatteo, R. P. The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy. Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).
- Blanke, C. D., et al. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT. Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).
- Demetri, G. D., et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).
- Gold, J. S. Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors. Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).
- Huynh, H., et al. Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Balachandran, V. P., et al. Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido. Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).
- Vitiello, G. A., et al. Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor. Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).
- Sommer, G., et al. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).
- Cavnar, M. J., et al. KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).
- Medina, B. D., et al. Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).
- Zhang, J. Q., et al. Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).
- General Protocol for Western Blotting. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf (2022).
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 253-268 (2019).
- Sy, J., Ang, L. -C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 269-278 (2019).
- Seifert, A. M., et al. PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).
- Liu, M., et al. Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST. Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).
- Rossi, F., et al. Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).
