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Cancer Research

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल में आणविक और इम्यूनोलॉजिकल तकनीकें

Published: May 2, 2022 doi: 10.3791/63853
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Surgery, Hospital of the University of Pennsylvania

Summary

इस पांडुलिपि का लक्ष्य किटV558Δ/+ माउस मॉडल और माउस नमूनों के सफल विच्छेदन और प्रसंस्करण के लिए तकनीकों का वर्णन करना है।

Abstract

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर (जीआईएसटी) सबसे आम मानव सारकोमा है और आमतौर पर केआईटी रिसेप्टर में एक एकल उत्परिवर्तन द्वारा संचालित होता है। ट्यूमर प्रकारों में, कैंसर उपचार की अगली पीढ़ी की जांच करने के लिए कई माउस मॉडल विकसित किए गए हैं। हालांकि, जीआईएसटी में, विवो अध्ययनों में अधिकांश ज़ेनोग्राफ्ट माउस मॉडल का उपयोग करते हैं जिनकी अंतर्निहित सीमाएं हैं। यहां, हम गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर के एक प्रतिरक्षात्मक, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल का वर्णन करते हैं जो किटवी 558Δ / + उत्परिवर्तन को आश्रय देता है। इस मॉडल में, उत्परिवर्ती केआईटी, अधिकांश जीआईएसटी के लिए जिम्मेदार ऑन्कोजीन, इसके अंतर्जात प्रमोटर द्वारा संचालित होता है जो जीआईएसटी में देखी गई हिस्टोलॉजिकल उपस्थिति और प्रतिरक्षा घुसपैठ की नकल करता है। इसके अलावा, इस मॉडल का उपयोग लक्षित आणविक और प्रतिरक्षा उपचार दोनों की जांच के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। यहां, हम एक किटV558Δ/+ माउस कॉलोनी के प्रजनन और रखरखाव का वर्णन करते हैं। इसके अतिरिक्त, यह पेपर जीआईएसटी के उपचार और खरीद का विवरण देता है, मेसेंटेरिक लिम्फ नोड को सूखा देता है, और किटवी 558Δ/+ चूहों में आसन्न सीकम, साथ ही आणविक और इम्यूनोलॉजिकल विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी करता है।

Introduction

जीआईएसटी संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग 6,000 मामलों की घटनाओं के साथ मनुष्यों में सबसे आम सारकोमाहै 1. जीआईएसटी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल पेसमेकर कोशिकाओं से उत्पन्न होता है जिसे काजल की अंतरालीय कोशिकाओं का नाम दिया जाता है, और आमतौर पर टायरोसिन किनेज किट या पीडीजीएफआरए 2 में एक एकल उत्परिवर्तन द्वारा संचालितहोता है। सर्जरी जीआईएसटी के लिए उपचार का मुख्य आधार है और उपचारात्मक हो सकती है, लेकिन उन्नत बीमारी वाले रोगियों का इलाज टायरोसिन किनेज इनहिबिटर (टीकेआई), इमाटिनिब के साथ किया जा सकता है। 20 साल पहले इसकी शुरुआत के बाद से, इमातिनिब ने जीआईएसटी में उपचार प्रतिमान को बदल दिया है, उन्नत बीमारी में जीवित रहने में सुधार 1 से 5 साल 3,4,5 तक। दुर्भाग्य से, अधिग्रहित किट उत्परिवर्तन के कारण इमैटिनिब शायद ही कभी उपचारात्मक होता है, इसलिए इस ट्यूमर के लिए नए उपचार की आवश्यकता होती है।

माउस मॉडल कैंसर में उपन्यास चिकित्सा की जांच में एक महत्वपूर्ण अनुसंधान उपकरण हैं। जीआईएसटी 6,7 में कई चमड़े के नीचे के ज़ेनोग्राफ्ट और रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट मॉडल विकसित और जांच की गई है। हालांकि, इम्यूनोडेफिशिएंट चूहे पूरी तरह से मानव जीआईएसटी का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं क्योंकि जीआईएसटी अपने ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्तन के आधार पर अंतर प्रतिरक्षा प्रोफाइल को बंद करते हैं, और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को बदलने से टीकेआई थेरेपी 8,9 के प्रभावमें सुधार होता है। + माउस में किट एक्सॉन 11 में एक विषमयुग्मजी जर्मलाइन विलोपन है, जो मानव जीआईएसटी10 में सबसे अधिक उत्परिवर्तित साइट जक्सटामेम्ब्रेन डोमेन को एन्कोड करता है। + चूहों में 100% प्रवेश के साथ एक एकल सीकल जीआईएसटी विकसित होता है, और ट्यूमर में मानव जीआईएसटी 8,11,12,13 के समान ऊतक विज्ञान, आणविक सिग्नलिंग, प्रतिरक्षा घुसपैठ और चिकित्सा की प्रतिक्रिया होती है। यहां, हम जीआईएसटी में आणविक और इम्यूनोलॉजिकल अनुसंधान में उपयोग के लिए किटवी 558Δ/+ चूहों में प्रजनन, उपचार और नमूना अलगाव और प्रसंस्करण का वर्णन करते हैं।

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Protocol

सभी चूहों को एनआईएच दिशानिर्देशों के अनुसार और पेंसिल्वेनिया आईएसीयूसी विश्वविद्यालय के अनुमोदन के साथ पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था। पेंसिल्वेनिया प्रयोगशाला पशु संसाधन मानक संचालन प्रक्रियाओं के विश्वविद्यालय के बाद इच्छामृत्यु का प्रदर्शन किया गया था।

1. किटV558Δ/+ माउस प्रजनन

  1. सी57 बीएल / 6 जे चूहों का उपयोग करके सी 57 बीएल / 6 जे पृष्ठभूमि पर 10 से अधिक बार किट वी 558Δ / + चूहों को बैकक्रॉस करें। ऐसा करने के लिए, 1: 2 अनुपात में मादा सी 57 बीएल / 6 जे चूहों के साथ नर किटवी 558Δ / + चूहों को नस्ल दें।
    नोट: समरूप किटV558Δ/V558Δ जीनोटाइप गर्भाशय में घातक है। नर सी 57 बीएल / 6 जे चूहों के साथ मादा किटवी 558Δ /+ चूहों को प्रजनन करना संभव है, लेकिन कूड़े का आकार मादा वाइल्डटाइप सी 57 बीएल / 6 जे चूहों से देखा गया लगभग आधा है। इसके अलावा, मादा किटV558Δ/+ चूहे 4 महीने की उम्र के बाद सीमित लिटर का उत्पादन करते हैं।
  2. किटV558Δ/+ जीनोटाइप की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पैर की अंगुली कतरन द्वारा 7-14 दिनों की उम्र में पिल्ले को जीनोटाइप करें। फॉरवर्ड प्राइमर का उपयोग करें: टीसीटीसीसीसीसीएटीसीटीएए; रिपोर्टर 1: सीसीटीसीजीएसीएसीटीटीसीसीए; रिवर्स प्राइमर: टीटीजीसीजीजीजीटीजीटीएएटीएएसीएटी; और रिपोर्टर 2: जीनोटाइपिंग के लिए टीसीटीसीसीटीसीजीटीसीटीसीसीए।

2. किटV558Δ/+ माउस उपचार

  1. उम्र और लिंग उपचार से पहले किटV558Δ/+ चूहों से मेल खाते हैं। मादा किटV558Δ/+ चूहों से ट्यूमर के रूप में सहकर्मियों में उम्र और लिंग मिलान चूहों का प्रयोग पुरुष चूहों में उन लोगों की तुलना में बड़ा कर रहे हैं। 8-12 सप्ताह की उम्र में चूहों का इलाज करें, जिस समय ट्यूमर स्थापित किए जाते हैं (चित्रा 1)।
  2. टायरोसिन किनेज अवरोधकों को मौखिक रूप से या इंट्रापेरिटोनियल (आई.पी.) इंजेक्शन द्वारा दें; किटवी 558Δ/+ ट्यूमर टायरोसिन किनेज अवरोधकों के प्रति संवेदनशील हैं। पीने के पानी में 600 मिलीग्राम / एल की खुराक में इमातिनिब या 45 मिलीग्राम / किलो के आईपी इंजेक्शन दिन में दो बार प्रदान करें। चरण 3 में दिखाए गए अनुसार ट्यूमर के विच्छेदन के बाद डिजिटल तराजू का उपयोग करके ट्यूमर वजन में कमी को मापें, जो इमाटिनिब (चित्रा 2) के साथ उपचार के बाद 1 सप्ताह में लगभग 50% और 4 सप्ताह में 80% है।

3. किटV558Δ/+ माउस अंग फसल

  1. प्रति मिनट 60% कक्ष मात्रा की प्रवाह दर पर सीओ2 नार्कोसिस द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु दें। श्वसन बंद होने के बाद कम से कम 2 मिनट के लिए कक्ष में चूहों को छोड़ दें, फिर मृत्यु की पुष्टि करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था करें।
  2. सभी उपकरणों को निष्फल करें, पूरी प्रक्रिया में दस्ताने पहनें, और एक बाँझ क्षेत्र बनाए रखें। 70% इथेनॉल के साथ त्वचा तैयार करें। कैंची का उपयोग करके 2 सेमी मिडलाइन ऊर्ध्वाधर चीरा बनाएं और पेट की गुहा में प्रवेश करें। किसी भी इंट्रा-पेट आसंजन को तेजी से लाइज करें।
  3. ड्रेनिंग मेसेंटेरिक लिम्फ नोड को हटाने के लिए, नीचे वर्णित चरणों का पालन करें।
    1. सीकम की पहचान करें और उसकी मेसेंटरी को बेहतर ढंग से उठाएं। कॉलोनिक मेसेंटरी के आधार के लगभग बीच में, मेसेंटेरिक लिम्फ नोड की पहचान करें और इसे तेजी से विच्छेदित करें। लिम्फ नोड ऑफ-व्हाइट और आकार में लगभग 0.5 सेमी x 0.5 सेमी है।
    2. आवश्यकतानुसार प्रोटीन अलगाव, ऊतक विज्ञान और एकल कोशिका निलंबन के लिए लिम्फ नोड ऊतक को तिहाई में विभाजित करें। एकल कोशिका निलंबन के लिए, सीरम मुक्त मीडिया (आरपीएमआई) के 20 मिलीलीटर में लिम्फ नोड ऊतक रखें और बर्फ पर रखें।
  4. जीआईएसटी और सीकुम के अलगाव के लिए, नीचे वर्णित चरणों का पालन करें।
    1. किटV558Δ/+ चूहों में सेकुम को ज्यादातर जीआईएसटी द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। ट्यूमर के आधार से इलियोकोलिक जंक्शन को सावधानीपूर्वक विभाजित करें। सीकुम को इकट्ठा करने के लिए, बृहदान्त्र को फिर से विभाजित करें, ट्यूमर के आधार पर 2 सेमी समीपस्थ।
    2. + चूहों के 50% -60% में, ट्यूमर के सिर में सीकल ऊतक की एक टोपी होती है, जिसमें आमतौर पर सीरस तरल पदार्थ होता है लेकिन शायद ही कभी मवाद (चित्रा 3) हो सकता है। तेजी से ट्यूमर ऊतक से दूर टोपी ऊतक विच्छेदन।
    3. या सीकम को प्रोटीन अलगाव, ऊतक विज्ञान और एकल कोशिका निलंबन के लिए तिहाई में विभाजित करें, आवश्यकतानुसार। एकल कोशिका निलंबन के लिए, एचबीएसएस में ट्यूमर ऊतक या सीकम को 2% एफसीएस के साथ रखें, जो नमूने को कवर करने और बर्फ पर रखने के लिए पर्याप्त है।

4. जीआईएसटी ऊतक का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण

  1. 50 एमएम ट्रिएसएचसीएल (पीएच 7.5), 150 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम ईडीटीए, 1% नॉनडेनेचरिंग डिटर्जेंट, 2 एमएम एनए3वीओ4, 1 एमएम पीएमएसएफ, 10 एमएम एनएएफ, और 20 μl /
  2. 1800 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी, ट्वीन 20 के 2 एमएल, और 10 एक्स ट्रिस-बफर खारा (टीबीएस) के 200 एमएल के संयोजन से 1% ट्वीन 20 (टीबीएसटी) के साथ 1 एक्स ट्रिस-बफर खारा समाधान तैयार करें।
  3. जी ऊतक लाइसिस बफर में एक एफएसीएस ट्यूब में चरण 3.4.3 से ऊतक को फिर से निलंबित करें और बर्फ पर 15 एस के लिए 15,000 आरपीएम पर यांत्रिक होमोजेनाइज़र के साथ दो बार होमोजेनाइज करें। बर्फ पर 30 मिनट के लिए लाइसेट सेते हैं।
  4. लाइसेट को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अधिकतम गति पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला को एक नए माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. 4% से 15% ढाल जेल पर लाइसेट्स चलाएं, फिर नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित करें, जैसा कि14 में वर्णित है।
  6. 5 मिनट के लिए 1x टीबीएस में एक बार झिल्ली धो लें और फिर 1 घंटे के लिए 5% दूध में झिल्ली को अवरुद्ध करें। फिर, 10 मिनट के लिए 1x टीबीएस में एक बार झिल्ली धो लें।
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी में झिल्ली सेते हैं 1: 1000 5% बीएसए में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पतला। प्रत्येक 10 मिनट के लिए 1x टीबीएसटी में झिल्ली 3x धो लें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 2.5% दूध में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला 1: 2500 के साथ धब्बा सेते हैं।
  8. 5 मिनट के लिए 1x टीबीएस में एक बार झिल्ली धो लें। झिल्ली को कवर करने के लिए पर्याप्त एचआरपी सब्सट्रेट जोड़ें, आमतौर पर 200-500 μL, और केमिलुमिनेसेंस का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक डिजिटल इमेजर का उपयोग करें।

5. जीआईएसटी ऊतक की इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में चरण 3.3.2 या 3.4.3 से ऊतक को ठीक करें। प्रसंस्करण के लिए तैयार होने तक 70% ईटीओएच में ऊतक स्टोर करें। 15,16 वर्णित के रूप में ग्लास स्लाइड पर 5 μm मोटाई पर एम्बेड और अनुभाग ब्लॉक।
  2. एक बुनियादी इम्यूनोडिटेक्शन किट का उपयोग करके पूर्ण इम्यूनोहिस्टोकेमिकल डिटेक्शन, जैसा कि पहलेवर्णित है 17.

6. मेसेंटेरिक लिम्फ नोड का एकल कोशिका निलंबन

  1. एक 100 μm फिल्टर पर कदम 3.3.2 से लिम्फ नोड नमूना के साथ आरपीएमआई मीडिया डालो। नए 50 मिलीलीटर शंक्वाकार के लिए फिल्टर ले जाएँ और एक 3 एमएल प्लास्टिक सिरिंज के नरम अंत के साथ लिम्फ नोड मैश। आरपीएमआई मीडिया के 20 एमएल के साथ फिल्टर धो लें।
  2. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 x g पर छानना अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें।
  3. पीबीएस (मनका बफर) में 1% एफबीएस के 20 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें और 40 μm फिल्टर पर डालें। सेल छानना ले लीजिए। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  4. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 x g पर छानना अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें। प्रवाह साइटोमेट्री के लिए 6 x 107 कोशिकाओं / एमएल पर मनका बफर में पुन: निलंबित।

7. जीआईएसटी का एकल सेल निलंबन

  1. एचबीएसएस के 50 एमएल के लिए 250 मिलीग्राम कोलेजनेज चतुर्थ, ईडीटीए मुक्त प्रोटीज अवरोधक की एक गोली और डीएनएएसई आई के 100 μL जोड़कर कोलेजनेज बफर तैयार करें। भंग होने तक कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए घुमाएं।
  2. एक बाँझ पकवान में जीआईएसटी रखें और कोलेजनेज बफर के 2.5 एमएल जोड़ें। एक बाँझ स्केलपेल और कैंची का उपयोग करके कीमा ट्यूमर जब तक ट्यूमर ठीक टुकड़ों में नहीं है। एक 50 एमएल ट्यूब में ट्यूमर और कोलेजनेज की आकांक्षा करने के लिए एक बड़े बोर पिपेट का उपयोग करें।
  3. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 100 आरपीएम पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में सेते हैं। एफबीएस के 2 एमएल के साथ बुझाने की प्रतिक्रिया।
  4. एक 100 μm फिल्टर पर जीआईएसटी नमूने के साथ कोलेजनेज डालो और एक 3 एमएल प्लास्टिक सिरिंज के नरम अंत के साथ ट्यूमर मैश और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा। एचबीएसएस के 20 एमएल के साथ फिल्टर धो लें। 5 मिनट के लिए 450 एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर छानना अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें।
  5. मनका बफर के 20 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें और 40 μm फिल्टर पर डालें। छानना ले लीजिए और एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती। 5 मिनट के लिए 450 एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर छानना अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें। प्रवाह साइटोमेट्री के लिए 6 x 107 कोशिकाओं / एमएल पर मनका बफर में पुन: निलंबित।

8. सीकुम का एकल कोशिका निलंबन

  1. चरण 7.1 के रूप में कोलेजनेज बफर तैयार करें। कैंची का उपयोग करके, आंतरिक श्लेष्म को उजागर करने के लिए सीकम को अनुदैर्ध्य रूप से विभाजित करें। 0.5 सेमी वर्गों में कटौती करें और 2% एफबीएस के साथ एचबीएसएस के 5 एमएल के साथ 50 एमएल ट्यूब में रखें। 30 एस के लिए सख्ती से हिलाएं, 20 एस के लिए 450 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र करें, फिर सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें।
  2. 2 एमएम ईडीटीए के साथ एचबीएसएस के 5 एमएल जोड़ें। 15 मिनट के लिए 100 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में सेते हैं। 20 एस के लिए 450 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें।
  3. एचबीएसएस के 5 एमएल जोड़ें। 30 एस के लिए सख्ती से हिलाएं, 20 एस के लिए 450 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र करें, फिर सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें। इसे एक बार फिर दोहराएं।
  4. कोलेजनेज बफर के 5 एमएल जोड़ें। 100 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में सेते हैं। हर 10 मिनट में जोर से हिलाएं। एफबीएस के 2 एमएल के साथ बुझाने की प्रतिक्रिया।
  5. 100 μm फिल्टर पर सीकुम नमूने के साथ कोलेजनेज डालो और 3 एमएल प्लास्टिक सिरिंज के नरम अंत के साथ मैश करें। एचबीएसएस के 20 एमएल के साथ फिल्टर धो लें। छानना लीजिए।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 एक्स जी पर छानना अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें। मनका बफर के 20 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें और 40 μm फिल्टर पर डालें। एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके छानना और गिनती कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 एक्स जी पर छानना अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें। प्रवाह साइटोमेट्री के लिए 6 x 107 कोशिकाओं / एमएल पर मनका बफर में पुन: निलंबित।

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Representative Results

किट V558Δ/+ माउस मॉडल एक प्रतिरक्षा सक्षम माउस मॉडल में चिकित्सीय की जांच के लिए अनुमति देता है। + चूहों प्रगतिशील आंत्र रुकावट (चित्रा 4) के कारण 8 महीने का औसत जीवनकाल है। + चूहों से ट्यूमर टाइरोसिन किनेज किट और ट्रांसमेम्ब्रेन चैनल डीओजी 1 (चित्रा 5) के साथ-साथ प्रतिलेखन कारक ईटीवी 1 (नहीं दिखाया गया है) सहित जीआईएसटी के विहित मार्करों को व्यक्त करते हैं। ट्यूमर को केआईटी सिग्नलिंग मार्ग में परिवर्तन के लिए अध्ययन किया जा सकता है, जैसे कि डाउनस्ट्रीम मार्कर ईआरके और एकेटी (चित्रा 6), या प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट जो मानव जीआईएसटी 8,11,12,13 की बारीकी से नकल करता है। एमआरआई8 या सीटी (चित्रा 7) का उपयोग ट्यूमर प्रतिक्रिया के सटीक माप के रूप में ट्यूमर की मात्रा को ट्रैक करने के लिए भी किया जा सकता है। + माउस इमेजिंग से पहले मौखिक रूप से गैस्ट्रोग्राफिन के 200 μL दिया गया था। सीटी इमेजिंग एक मौखिक 80 मंच पर पूरा किया गया था। फिजी सॉफ्टवेयर के साथ 3 डी पुनर्निर्माण किया गया था, जो ट्यूमर की मात्रा को भी माप सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: नर और मादा किटV558Δ/+  चूहों में ट्यूमर वजन की तुलना। + नर और मादा चूहों से ट्यूमर को अलग किया गया और वजन (एन = 15 चूहों / समूह) किया गया। डेटा माध्य ± माध्य की मानक त्रुटि (एसईएम) का प्रतिनिधित्व करता है; पी मानों की गणना एक छात्र के टी परीक्षण का उपयोग करके की गई थी; * = पी 0.05 <। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: किटV558Δ/+ चूहों से ट्यूमर पर इमैटिनिब का प्रभाव। किट V558Δ/+ चूहों को 1 या 4 सप्ताह के लिए पीने के पानी में वाहन या 600 मिलीग्राम / एल इमातिनिब के साथ इलाज किया गया था। ट्यूमर को अलग और तौला गया (एन = 4-5 चूहों / डेटा माध्य ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है; पी मानों की गणना व्यक्तिगत समूहों की तुलना के लिए बोनफेरोनी पोस्ट-टेस्ट के साथ एक तरफा एनोवा तुलना का उपयोग करके की गई थी; * = पी 0.05 <। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: टोपी के साथ किटV558Δ/+ ट्यूमर। सीरस तरल पदार्थ युक्त एक सीकल टोपी के साथ एक किटV558Δ/+ माउस से एक ट्यूमर के प्रतिनिधि फोटो। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: किटV558Δ/+ चूहों का जीवनकाल। + चूहों की उत्तरजीविता > 400 दिनों (एन = 43 चूहों) के लिए ट्रैक किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण। एक किट V558Δ/+ ट्यूमर का प्रतिनिधि ऊतक विज्ञान जहां स्केल बार 40 μm है। संक्षिप्त नाम: एच एंड ई = हेमटॉक्सिलिन और इओसिन धुंधला; किट = जीआईएसटी और रिसेप्टर टायरोसिन किनेज का एक विहित चिह्न; कुत्ता 1 = आयनों परिवहन में भूमिका के साथ जीआईएसटी का एक विहित मार्कर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: आणविक सिग्नलिंग विश्लेषण किट V558Δ/+ चूहों को 1 सप्ताह के लिए पीने के पानी में वाहन या 600 मिलीग्राम / एल इमातिनिब के साथ इलाज किया गया था। विश्लेषण से 6 घंटे पहले चूहों को वाहन का एक एकल आईपी इंजेक्शन या 45 मिलीग्राम / किटV558Δ/+ ट्यूमर से प्रोटीन लाइसेट्स की जांच पश्चिमी धब्बा (एन = 2 चूहों/समूह) द्वारा की गई थी। संक्षिप्त नाम: पी किट = फॉस्फोराइलेटेड किट रिसेप्टर टायरोसिन किनेज; टी किट = कुल किट रिसेप्टर टायरोसिन किनेज; पी ईआरके = फॉस्फोराइलेटेड माइटोजन सक्रिय प्रोटीन किनेज; टी ईआरके = कुल माइटोजेन सक्रिय प्रोटीन किनेज; पी एकेटी = फॉस्फोराइलेटेड सेरीन-थ्रेओनिन प्रोटीन किनेज; टी एकेटी = कुल सेरीन-थ्रेओनिन प्रोटीन किनेज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: सीटी इमेजिंग विश्लेषण. श्रोणि में एक ट्यूमर (तीर) का प्रदर्शन एक अनुपचारित किटV558Δ/+ माउस के 3 डी सीटी पुनर्निर्माण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

किट V558Δ/+ माउस मॉडल जीआईएसटी के आणविक और प्रतिरक्षाविज्ञानी विश्लेषण में एक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण है। यद्यपि प्रजनन रणनीति को एक एकल क्रॉस की आवश्यकता होती है, ट्यूमर प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने वाले प्रयोगों में किटवी 558Δ /+ माउस कोहोर्ट्स का उपयोग करने के लिए व्यापक प्रजनन की आवश्यकता होती है। चूहों को समान ट्यूमर वजन सुनिश्चित करने के लिए उम्र और लिंग-मिलान किया जाना चाहिए, और ट्यूमर स्थापित होने पर 8 सप्ताह की उम्र से पहले 10% चूहों की मृत्यु हो जाती है। व्यक्तिगत चूहों के भीतर ट्यूमर की मात्रा को ट्रैक करने के लिए सीटी या एमआरआई जैसी उन्नत इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करते समय कम व्यापक प्रजनन रणनीतियां संभव हैं। फिर भी, किटV558Δ/+ चूहों को सफलतापूर्वक अन्य नॉक-आउट या प्रेरक माउस मॉडल में पार किया गया है, जो महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा और आणविक तंत्र12 का खुलासा करता है।

+ चूहों से ट्यूमर कोशिकाओं को आसानी से केआईटी (सीडी 117) के लिए कॉलम सॉर्टिंग या प्रवाह साइटोमेट्री18 द्वारा अलग किया जाता है। किटV558Δ/+ चूहों से पृथक ट्यूमर कोशिकाओं कृत्रिम परिवेशीय12 में उगाया जा सकता है। प्रारंभिक मार्ग में, किटV558Δ/+ चूहों से पृथक ट्यूमर कोशिकाएं केआईटी अभिव्यक्ति को बनाए रखती हैं और इन विट्रो अध्ययनों के लिए उपयोग की जा सकती हैं। हालांकि, कई मार्गों के बाद, ये सेल लाइनें केआईटी अभिव्यक्ति खो देती हैं, जिससे उनकी प्रयोज्यता सीमित हो जाती है। अधिकांश माउस मॉडल की तरह, किटवी 558Δ/+ ट्यूमर मेटास्टेसाइज नहीं करते हैं, जो एक्स्ट्राइंटेस्टाइनल जीआईएसटी के अध्ययन को सीमित करता है। इसी तरह, किटV558Δ/+ चूहों से ट्यूमर केवल सीकुम में होते हैं, और किटV558Δ/+ ट्यूमर से पृथक कोशिकाएं यकृत या प्लीहा में पृथक और इंजेक्शन लगाने पर नहीं बढ़ती हैं, जो रोग के विभिन्न स्थलों से ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के मूल्यांकन को सीमित करती हैं। इसके अलावा, किटV558Δ/+ उत्परिवर्तन का इस माउस मॉडल में कोशिकाओं के हेमेटोलॉजिकल विकास पर कोई ज्ञात प्रभाव नहीं पड़ता है।

किटवी 558Δ/+ चूहों से ट्यूमर में प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट में ज्यादातर मैक्रोफेज होते हैं, जिसके बाद टी कोशिकाएं होती हैं, जो मानव जीआईएसटी11 की बारीकी से नकल करती हैं। हालांकि, यह जरूरी है कि ट्यूमर के वजन या प्रतिरक्षा घुसपैठ का आकलन करने से पहले सीकल कैप को ट्यूमर से पूरी तरह से हटा दिया जाए, क्योंकि ट्यूमर बनाम सीकम में अलग-अलग प्रतिरक्षा आबादी मौजूद है। हमारे अनुभव में, ट्यूमर वजन कैप वाले लोगों के बीच भी तुलनीय हैं, और टायरोसिन किनेज इनहिबिटर थेरेपी और सीकल कैप के विकास के बीच कोई महत्वपूर्ण संबंध नहीं है। इसके अलावा, हमें सीकल कैप्स के साथ और बिना ट्यूमर की तुलना में ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं मिला है।

कैंसर अनुसंधान में उपयोग के लिए कई आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल विकसित किए गए हैं, खासकर सीआरआईएसपीआर जीन संपादन के आगमन के बाद से। जबकि कई प्रतिरक्षात्मक मॉडल ऑन्कोजीन के क्रे-लॉक्सपी मध्यस्थता सक्रियण या ट्यूमर शमन जीन की निष्क्रियता पर भरोसा करते हैं, किटवी 558Δ /+ ट्यूमर उनके अंतर्जात प्रमोटर द्वारा संचालित होते हैं। तदनुसार, किटV558Δ/+ माउस मॉडल में निष्कर्ष मानव रोग के लिए अत्यधिक अनुवाद योग्य हैं, विशेष रूप से केआईटी सिग्नलिंग19 के मूल्यांकन में। आगे देखते हुए, किटवी 558Δ/+ माउस को एक मूल्यवान मॉडल के रूप में काम करना जारी रखना चाहिए क्योंकि चेकपॉइंट नाकाबंदी और सीएआर टी थेरेपी सहित उपन्यास उपचार रणनीतियों को जीआईएसटी सहित नरम ऊतक ट्यूमर के उपचार के लिए खोजा जाना जारी है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

किट V558Δ/+ चूहों को आनुवंशिक रूप से इंजीनियर किया गया था और डॉ पीटर बेसमर10 द्वारा साझा किया गया था। इस काम को एनआईएच अनुदान आर 01 सीए 102613 और टी 32 सीए 251063 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 micron filter EMSCO 1194-2360
1x RBC lysis buffer Life Technologies 00-4333-57
3mL syringe Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences 14823435
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl Bio-Rad 4561083
4% Paraformaldehyde Solution Thermo Fisher Scientific AAJ19943K2
40 micron filter EMSCO 1194-2340
5M NaCl Sigma Aldrich S6546
70 micron filter EMSCO 1194-2350
AKT antibody (C67E7) Cell Signaling 4691
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory
Collagenase IV Sigma Aldrich C5138
Complete mini edta free protease inhibitor Thomas Scientific C852A34
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific
Disposable Scalpels Thermo Fisher Scientific/Exel International 14-840-00
Dnase I Thomas Scientific C756V81
Dog1 antibody abcam ab64085
EDTA Sigma Aldrich E9884
ERK antibody (p44/42) Cell Signaling 9102
FBS Thomas Scientific C788U23
FIJI software FIJI https://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 Homogenizer Thermo Fisher Scientific 15-340-169
HBSS University of Pennsylvania Cell Center
Imatinib mesylate Selleck Chemicals S1026
KIT antibody (D13A2) Cell Signaling 3074
KitV558Δ/+ Genotyping Transnetyx
Microcentrifuge tubes (1.5mL) Thermo Fisher Scientific 05-408-129
Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic Vector Laboratories BMK-2202
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm Rio-Rad 1620145
Nonfat Dry Milk Thermo Fisher Scientific NC9121673
Nonidet P 40 Substitute Sigma Aldrich 74385
p-AKT antibody (S473) Cell Signaling 4060
p-ERK antibody (p44/42) Cell Signaling 9101
p-KIT antibody (Y719) Cell Signaling 3391
PMSF Protease Inhibitor Thermo Fisher Scientific 36978
Proeinase K Thermo Fisher Scientific BP170050
Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes Falcon/Thermo Fisher Scientific 14-959-2A
RPMI University of Pennsylvania Cell Center
Sodium fluoride (NaF) Sigma Aldrich 201154
Sodium orthovanadate (Na3VO4) Sigma Aldrich S6508
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate Thermo Fisher Scientific 34076
TBS buffer (10x) University of Pennsylvania Cell Center
Tissue culture dish (100mm2) Thermo Fisher Scientific/Falcon 08-772E
TrisHCL Thermo Fisher Scientific BP1757500
Tween 20 Rio-Rad 1706531
 vivaCT 80 platform Scanco medical

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References

  1. Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
  2. Joensuu, H., DeMatteo, R. P. The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy. Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).
  3. Blanke, C. D., et al. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT. Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).
  4. Demetri, G. D., et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).
  5. Gold, J. S. Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors. Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).
  6. Huynh, H., et al. Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).
  7. Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
  8. Balachandran, V. P., et al. Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido. Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).
  9. Vitiello, G. A., et al. Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor. Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).
  10. Sommer, G., et al. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).
  11. Cavnar, M. J., et al. KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).
  12. Medina, B. D., et al. Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).
  13. Zhang, J. Q., et al. Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).
  14. General Protocol for Western Blotting. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf (2022).
  15. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 253-268 (2019).
  16. Sy, J., Ang, L. -C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 269-278 (2019).
  17. Seifert, A. M., et al. PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).
  18. Liu, M., et al. Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST. Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).
  19. Rossi, F., et al. Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).

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कैंसर अनुसंधान अंक 183
गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल में आणविक और इम्यूनोलॉजिकल तकनीकें
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Tieniber, A. D., Hanna, A. N., Do, K., Wang, L., Rossi, F., DeMatteo, R. P. Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor. J. Vis. Exp. (183), e63853, doi:10.3791/63853 (2022).

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