Summary
Целью данной рукописи является описание мышиной модели KitV558Δ/+ и методов успешного вскрытия и обработки образцов мышей.
Abstract
Стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта (GIST) является наиболее распространенной саркомой человека и, как правило, обусловлена одной мутацией в рецепторе KIT. Для различных типов опухолей были разработаны многочисленные мышиные модели, чтобы исследовать следующее поколение методов лечения рака. Однако в GIST в большинстве исследований in vivo используются мышиные модели ксенотрансплантата, которые имеют присущие им ограничения. Здесь мы описываем иммунокомпетентную, генетически модифицированную мышиную модель стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта, содержащую мутацию KitV558Δ/+ . В этой модели мутантный KIT, онкоген, ответственный за большинство ГИСТ, управляется его эндогенным промотором, приводящим к GIST, который имитирует гистологический вид и иммунный инфильтрат, наблюдаемый в ГИСТ человека. Кроме того, эта модель была успешно использована для исследования как целевой молекулярной, так и иммунной терапии. Здесь мы описываем разведение и содержание колонии мышей KitV558Δ/+ . Кроме того, в этой статье подробно описывается лечение и закупка GIST, дренирование брыжеечного лимфатического узла и прилегающей слепой кишки у мышей KitV558Δ/+ , а также подготовка образцов для молекулярного и иммунологического анализа.
Introduction
GIST является наиболее распространенной саркомой у людей с заболеваемостью около 6000 случаев в Соединенных Штатах Америки1. GIST, по-видимому, происходит из клеток желудочно-кишечного кардиостимулятора, называемых интерстициальными клетками Cajal, и обычно обусловлен одной мутацией в тирозинкиназе KIT или PDGFRA2. Хирургия является основой лечения GIST и может быть лечебной, но пациенты с прогрессирующим заболеванием могут лечиться ингибитором тирозинкиназы (TKI), иматинибом. С момента своего появления более 20 лет назад иматиниб трансформировал парадигму лечения в GIST, улучшив выживаемость при запущенном заболевании с 1 до более чем 5 лет 3,4,5. К сожалению, иматиниб редко излечивается из-за приобретенных мутаций KIT, поэтому для этой опухоли необходимы новые методы лечения.
Мышиные модели являются важным исследовательским инструментом в исследовании новых методов лечения рака. Несколько моделей подкожных ксенотрансплантатов и ксенотрансплантатов, полученных от пациента, были разработаны и исследованы в GIST 6,7. Тем не менее, иммунодефицитные мыши не в полной мере представляют GIST человека, поскольку GIST имеют дифференциальные иммунные профили в зависимости от их онкогенной мутации, а изменение микроокружения опухоли желудочно-кишечного тракта улучшает эффекты терапии TKI 8,9. Мышь KitV558Δ/+ имеет гетерозиготную делецию зародышевой линии в Kit exon 11, которая кодирует домен juxtamembrane, наиболее часто мутировавший сайт в человеческом GIST10. У мышей KitV558Δ/+ развивается один слепой GIST со 100% пенетранцией, а опухоли имеют аналогичную гистологию, молекулярную сигнализацию, иммунную инфильтрацию и ответ на терапию, как и человеческий GIST 8,11,12,13. Здесь мы описываем разведение, обработку, выделение и обработку образцов на мышах KitV558Δ/+ для использования в молекулярных и иммунологических исследованиях в GIST.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все мыши были размещены в условиях, свободных от патогенов, в Университете Пенсильвании в соответствии с руководящими принципами NIH и с одобрения Университета Пенсильвании IACUC. Эвтаназия проводилась в соответствии со стандартными операционными процедурами Университета Пенсильвании по лабораторным животным.
1. КомплектV558Δ/+ разведение мышей
- Перекрещивайте мыши KitV558Δ/+ более 10 раз на фоне C57BL/6J с помощью мышей C57BL/6J. Для этого разводят самцов мышей KitV558Δ/+ с самками мышей C57BL/6J в соотношении 1:2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гомозиготный генотип комплектаV558Δ/V558Δ смертелен внутриутробно. Можно разводить самок мышей KitV558Δ/+ с самцами мышей C57BL/6J, но размер помета примерно вдвое меньше, чем у самок мышей дикого типа C57BL/6J. Кроме того, самки мышей KitV558Δ/+ производят ограниченные пометы после 4-месячного возраста. - Генотип детенышей в возрасте 7-14 дней путем обрезания пальцев ног для подтверждения наличия генотипа KitV558Δ/+ . Используйте прямую грунтовку: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; докладчик 1: CCTCGACAACCTTCCA; реверсивная грунтовка: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; и докладчик 2: TCTCCTCGACCTTCCA для генотипирования.
2. КомплектV558Δ/+ для обработки мыши
- Возраст и пол соответствуют мышам KitV558Δ/+до начала лечения. Используйте мышей, соответствующих возрасту и полу, в когортах, поскольку опухоли у самок мышей KitV558Δ/+ больше, чем у самцов мышей. Лечите мышей в возрасте 8-12 недель, когда опухоли устанавливаются (рисунок 1).
- Вводят ингибиторы тирозинкиназы перорально или путем внутрибрюшинной (в..) инъекции; Опухоли KitV558Δ/+ чувствительны к ингибиторам тирозинкиназы. Вводят иматиниб в дозе 600 мг/л в питьевую воду или в/в инъекции по 45 мг/кг два раза в день. Измерьте снижение массы опухоли с помощью цифровых весов после рассечения опухоли, как показано на этапе 3, что составляет примерно 50% через 1 неделю и 80% через 4 недели после лечения иматинибом (рисунок 2).
3. КомплектV558Δ/+ мышиное извлечение органов
- Усыпляют мышей наркозомCO2 со скоростью потока 60% объема камеры в минуту. Оставьте мышей в камере не менее чем на 2 мин после прекращения дыхания, затем выполните вывих шейки матки для подтверждения смерти.
- Стерилизуйте все инструменты, носите перчатки на протяжении всей процедуры и поддерживайте стерильное поле. Подготовьте кожу 70% этанолом. Сделайте вертикальный разрез средней линии 2 см с помощью ножниц и войдите в брюшную полость. Резко лизируют любые внутрибрюшные спайки.
- Чтобы удалить дренажный брыжеечный лимфатический узел, выполните действия, описанные ниже.
- Определите слепую кишку и поднимите ее брыжейку выше. Примерно на полпути к основанию брыжейки толстой кишки определите брыжеечный лимфатический узел и резко рассекните его. Лимфатический узел белый и размером около 0,5 см х 0,5 см.
- Разделите ткань лимфатических узлов на трети для выделения белка, гистологии и одноклеточной суспензии, по мере необходимости. Для одноклеточных суспензий поместите ткань лимфатических узлов в 20 мл свободной среды сыворотки (RPMI) и держите на льду.
- Для выделения GIST и слепой кишки выполните действия, описанные ниже.
- Слепая кишка в мышах KitV558Δ/+ в основном заменяется GIST. Осторожно отделите илеоколическое соединение от основания опухоли. Чтобы собрать слепую кишку, снова разделите толстую кишку, на 2 см проксимально к основанию опухоли.
- У 50%-60% мышей KitV558Δ/+ головка опухоли содержит колпачок ткани слепой кишки, который обычно содержит серозную жидкость, но редко может содержать гной (рисунок 3). Резко рассекните ткань колпачка от опухолевой ткани.
- Разделите опухолевую ткань и / или слепую кишку на трети для выделения белка, гистологии и одноклеточной суспензии, по мере необходимости. Для одноклеточных суспензий поместите опухолевую ткань или слепую кишку в HBSS с 2% FCS, достаточно, чтобы покрыть образец и держать на льду.
4. Вестерн-блоттинг ткани GIST
- Готовят буфер лизиса тканей, содержащий 50 мМ TrisHCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1% неденатурирующее детергент, 2 мМ Na3VO4, 1 мМ PMSF, 10 мМ NaF и 20 мкл/мл смеси ингибиторов протеиназы.
- Приготовьте 1x Tris-буферный физиологический раствор с 1% Tween 20 (TBST), объединив 1800 мл деионизированной воды, 2 мл Tween 20 и 200 мл 10x Tris-буферного физиологического раствора (TBS).
- Повторное суспендирование ткани со стадии 3.4.3 в пробирке FACS в 5 мл/г буфера лизиса ткани и гомогенизация дважды с помощью механического гомогенизатора при 15 000 об/мин в течение 15 с на льду. Инкубировать лизат в течение 30 мин на льду.
- Перенесите лизат в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Центрифуга на максимальной скорости в течение 20 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку.
- Запустите лизаты на градиентном геле от 4% до 15%, затем переведите на нитроцеллюлозную мембрану, как описано в14.
- Промыть мембрану один раз в 1x TBS в течение 5 мин, а затем блокировать мембрану в 5% молоке в течение 1 ч. Снова промыть мембрану один раз в 1x TBS в течение 10 мин.
- Инкубировать мембрану в первичном антителе разбавляют 1:1000 в 5% BSA при 4 °C в течение ночи. Промыть мембрану 3x в 1x TBST в течение 10 мин каждая. Инкубировать блот вторичным антителом разводят 1:2500 в 2,5% молоке в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Промывайте мембрану один раз в 1x TBS в течение 5 мин. Добавьте достаточное количество подложки HRP для покрытия мембраны, обычно 200-500 мкл, и используйте цифровой тепловизор для обнаружения и количественной оценки хемилюминесценции.
5. Иммуногистохимия ткани GIST
- Зафиксируйте ткань со стадии 3.3.2 или 3.4.3 в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение ночи. Храните ткань в 70% EtOH до готовности к обработке. Встраивание и секционирование блоков толщиной 5 мкм на стеклянные слайды, как описано15,16.
- Полное иммуногистохимическое обнаружение с использованием базового иммунодетекционного набора, как описано ранее17.
6. Одноклеточная суспензия брыжеечного лимфатического узла
- Налейте rpmI-среду образцом лимфатических узлов с этапа 3.3.2 на фильтр 100 мкм. Переместите фильтр на новый конический и мешанный лимфатический узел объемом 50 мл с мягким концом пластикового шприца объемом 3 мл. Промывочный фильтр с 20 мл среды RPMI.
- Центрифугировать фильтрат при 450 х г при 4 °C в течение 5 мин. Аспирировать супернатанта.
- Повторно суспендировать гранулы в 20 мл 1% FBS в PBS (шариковый буфер) и вылить на фильтр 40 мкм. Соберите фильтрат клеток. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Центрифугировать фильтрат при 450 х г при 4 °C в течение 5 мин. Аспирировать супернатанта. Повторное суспендирование в буфере бусин при 6 x 107 клетках/мл для проточной цитометрии.
7. Одноклеточная суспензия GIST
- Приготовьте буфер коллагеназы, добавив 250 мг коллагеназы IV, одну таблетку ингибитора протеазы без ЭДТА и 100 мкл ДНКазы I до 50 мл HBSS. Вращать в течение 10 мин при комнатной температуре до растворения.
- Поместите GIST в стерильную посуду и добавьте 2,5 мл коллагеназного буфера. Измельчите опухоль с помощью стерильного скальпеля и ножниц до тех пор, пока опухоль не окажется в мелких фрагментах. Используйте большую пипетку, чтобы аспирировать опухоль и коллагеназу в трубку объемом 50 мл.
- Инкубировать в встряхивающемся инкубаторе при 100 об/мин при 37 °С в течение 30 мин. Реакция закалки с 2 мл FBS.
- Налейте коллагеназу с образцом GIST на фильтр 100 мкм и разомните опухоль мягким концом пластикового шприца объемом 3 мл и соберите в пробирку объемом 50 мл. Промывочный фильтр с 20 мл HBSS. Центрифугировать фильтрат при 450 х г, 4 °C в течение 5 мин. Аспирировать супернатанта.
- Повторно суспендируйте гранулу в 20 мл шарикового буфера и перелейте фильтр 40 мкм. Соберите фильтрат и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Центрифугировать фильтрат при 450 х г, 4 °C в течение 5 мин. Аспирировать супернатанта. Повторное суспендирование в буфере бусин при 6 x 107 клетках/мл для проточной цитометрии.
8. Одноклеточная суспензия слепой кишки
- Подготовьте буфер коллагеназы, как показано в шаге 7.1. С помощью ножниц расщелите слепую кишку продольно, чтобы обнажить внутреннюю слизистую оболочку. Разрезать на участки по 0,5 см и поместить в трубку объемом 50 мл с 5 мл HBSS с 2% FBS. Энергично встряхните в течение 30 с, центрифугу при 450 х г в течение 20 с, затем аспирируйте супернатант.
- Добавьте 5 мл HBSS с 2 мМ ЭДТА. Инкубировать в встряхивающемся инкубаторе при 37 °C при 100 об/мин в течение 15 мин. Центрифуга при 450 х г в течение 20 с. Аспирировать супернатанта.
- Добавить 5 мл HBSS. Энергично встряхните в течение 30 с, центрифугу при 450 х г в течение 20 с, затем аспирируйте супернатант. Повторите еще раз.
- Добавьте 5 мл коллагеназного буфера. Инкубировать в встряхивающемся инкубаторе при 37 °C в течение 30 мин при 100 об/мин. Энергично встряхивать каждые 10 мин. Реакция закалки с 2 мл FBS.
- Налейте коллагеназу с образцом слепой кишки на фильтр 100 мкм и разомните мягким концом пластикового шприца объемом 3 мл. Промывочный фильтр с 20 мл HBSS. Соберите фильтрат.
- Центрифугировать фильтрат при 450 х г в течение 5 мин при 4 °C. Аспирировать супернатанта. Повторно суспендировать гранулы в 20 мл шарикового буфера и вылить на фильтр 40 мкм. Соберите фильтрат и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Центрифугировать фильтрат при 450 х г в течение 5 мин при 4 °C. Аспирировать супернатанта. Повторное суспендирование в буфере бусин при 6 x 107 клетках/мл для проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модель мыши KitV558Δ/+ позволяет исследовать терапевтические средства в иммунокомпетентной мышиной модели. Мыши KitV558Δ/+ имеют среднюю продолжительность жизни 8 месяцев из-за прогрессирующей непроходимости кишечника (рисунок 4).. Опухоли у мышей KitV558Δ/+ экспрессируют канонические маркеры GIST, включая тирозинкиназу KIT и трансмембранный канал DOG1 (Рисунок 5),а также транскрипционный фактор ETV1 (не показан). Опухоли могут быть изучены на предмет изменений в сигнальном пути KIT, таких как нисходящие маркеры ERK и AKT (рисунок 6), или иммунной микросреды, которая близко имитирует человеческий GIST 8,11,12,13. МРТ8 или КТ (рисунок 7) также могут использоваться для отслеживания объема опухоли в качестве точного измерения ответа опухоли. Необработанному наборуV558Δ/+ мыши давали 200 мкл гастрографина перорально за 1 ч до визуализации. Компьютерная томография была выполнена на платформе vivaCT 80. 3D-реконструкция была выполнена с помощью программного обеспечения Fiji, которое также может измерять объем опухоли.
Рисунок 1: Сравнение масс опухолей у самцов и самок KitV558Δ/+ мышей. Опухоли от 9-недельных необработанных мышей KitV558Δ/+ самцов и самок мышей были выделены и взвешены (n = 15 мышей на группу). Данные представляют собой среднее ± стандартной погрешности среднего значения (SEM); значения p рассчитывались с помощью теста t студента; * = P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Влияние иматиниба на опухоли у мышей KitV558Δ/+. МышейKit V558Δ/+ обрабатывали транспортным средством или 600 мг/л иматинибом в питьевой воде в течение 1 или 4 недель. Опухоли были выделены и взвешены (n = 4-5 мышей на группу). Данные представляют собой среднее ± SEM; значения p были рассчитаны с использованием одностороннего сравнения ANOVA с посттестом Бонферрони для сравнения отдельных групп; * = P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: КомплектV558Δ/+ опухоли с колпачком. Репрезентативная фотография опухоли от мыши KitV558Δ/+ с колпачком слепой кишки, содержащей серозную жидкость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Продолжительность жизни мышей KitV558Δ/+ . Выживаемость необработанных мышей KitV558Δ/+ отслеживалась в течение > 400 дней (n = 43 мыши). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Иммуногистохимический анализ. Репрезентативная гистология опухоли KitV558Δ/+ , где шкала бара составляет 40 мкм. Сокращения: H&E = окрашивание гематоксилина и эозина; Kit = канонический знак GIST и рецепторной тирозинкиназы; Dog1 = канонический маркер GIST с ролью в анионном транспорте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Анализ молекулярной сигнализации. KitV558Δ/+ мышей обрабатывали транспортным средством или 600 мг/л иматиниба в питьевой воде в течение 1 недели. Мышам давали однократную инъекцию в/транспортного средства или 45 мг/кг иматиниба за 6 ч до анализа. Белковые лизаты из опухолей KitV558Δ/+ исследовали с помощью вестерн-блоттинга (n = 2 мыши на группу). Сокращения: P Kit = фосфорилированная тирозинкиназа рецептора Kit; T kit = общая тирозинкиназа рецептора Kit; P ERK = фосфорилированная митоген-активированная протеинкиназа; T ERK = общая митоген-активированная протеинкиназа; P AKT = фосфорилированная серин-треонин протеинкиназа; T AKT = общая серин-треонин протеинкиназа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Анализ компьютерной томографии. 3D-КТ-реконструкция необработанной мыши KitV558Δ/+ , демонстрирующей опухоль (стрелку) в малом тазу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мышиная модель KitV558Δ/+ является мощным исследовательским инструментом в молекулярном и иммунологическом анализе GIST. Хотя стратегия разведения требует одного скрещивания, использование когорт мышей KitV558Δ/+ в экспериментах, анализирующих реакцию опухоли, требует обширного разведения. Мыши должны соответствовать возрасту и полу, чтобы обеспечить одинаковый вес опухоли, и 10% мышей умирают в возрасте до 8 недель, когда опухоли установлены. Менее обширные стратегии разведения возможны при использовании передовых методов визуализации, таких как КТ или МРТ, для отслеживания объема опухоли у отдельных мышей. Тем не менее, мыши KitV558Δ/+ были успешно скрещены с другими нокаутирующими или индуцируемыми моделями мышей, выявив важные иммунные и молекулярные механизмы12.
Опухолевые клетки мышей KitV558Δ/+ легко изолируются путем колоночной сортировки по KIT (CD117) или с помощью проточной цитометрии18. Изолированные опухолевые клетки мышей KitV558Δ/+ могут быть выращены in vitro12. На ранних стадиях изолированные опухолевые клетки мышей KitV558Δ/+ сохраняют экспрессию KIT и могут быть использованы для исследований in vitro . Однако после нескольких проходов эти клеточные линии теряют экспрессию KIT, ограничивая их применимость. Как и большинство моделей мышей, опухоли KitV558Δ/+ не метастазируют, что ограничивает изучение внекишечных GIST. Аналогичным образом, опухоли у мышей KitV558Δ/+ встречаются только в слепой кишке, а клетки, выделенные из опухолей KitV558Δ/+ , не растут при выделении и введении в печень или селезенку, что ограничивает оценку микроокружения опухоли из разных участков заболевания. Кроме того, мутация KitV558Δ/+ не оказывает какого-либо известного влияния на гематологическое развитие клеток в этой мышиной модели.
Иммунное микроокружение опухолей у мышей KitV558Δ/+ содержит в основном макрофаги, за которыми следуют Т-клетки, которые близко имитируют человеческий GIST11. Тем не менее, крайне важно, чтобы колпачок слепой кишки был полностью удален из опухоли до оценки веса опухоли или иммунного инфильтрата, поскольку в опухоли существуют различные иммунные популяции по сравнению с слепой кишкой. По нашему опыту, вес опухоли сопоставим даже среди тех, у кого есть колпачки, и нет значимой связи между терапией ингибиторами тирозинкиназы и развитием кекальной колпачка. Кроме того, мы не обнаружили существенной разницы в микроокружении опухоли, сравнивая опухоли с кекальными колпачками и без них.
Многие генетически модифицированные мышиные модели были разработаны для использования в исследованиях рака, особенно с появлением редактирования генов CRISPR. В то время как многочисленные иммунокомпетентные модели полагаются на опосредованную cre-loxP активацию онкогенов или инактивацию генов-супрессоров опухолей, опухоли KitV558Δ/+ управляются их эндогенным промотором. Соответственно, результаты в мышиной модели KitV558Δ/+ хорошо переносятся на заболевание человека, особенно при оценке передачи сигналов KIT19. Заглядывая в будущее, мышь KitV558Δ/+ должна продолжать служить ценной моделью, поскольку новые стратегии лечения, включая блокаду контрольных точек и терапию CAR T, продолжают изучаться для лечения опухолей мягких тканей, включая GIST.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мыши KitV558Δ/+ были генетически модифицированы и совместно использовались доктором Питером Бесмером10. Эта работа была поддержана грантами NIH R01 CA102613 и T32 CA251063.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
References
- Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
- Joensuu, H., DeMatteo, R. P. The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy. Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).
- Blanke, C. D., et al. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT. Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).
- Demetri, G. D., et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).
- Gold, J. S. Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors. Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).
- Huynh, H., et al. Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Balachandran, V. P., et al. Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido. Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).
- Vitiello, G. A., et al. Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor. Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).
- Sommer, G., et al. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).
- Cavnar, M. J., et al. KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).
- Medina, B. D., et al. Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).
- Zhang, J. Q., et al. Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).
- General Protocol for Western Blotting. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf (2022).
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 253-268 (2019).
- Sy, J., Ang, L. -C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 269-278 (2019).
- Seifert, A. M., et al. PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).
- Liu, M., et al. Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST. Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).
- Rossi, F., et al. Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).
