Summary
この原稿の目的は、 KitV558Δ/+マウスモデルと、マウス標本の解剖と処理を成功させるための技術を説明することです。
Abstract
胃腸間質腫瘍(GIST)は最も一般的なヒト肉腫であり、典型的にはKIT受容体の単一の変異によって駆動される。腫瘍の種類を超えて、次世代のがん治療法を調査するために、多数のマウスモデルが開発されてきた。しかし、GISTでは、ほとんどの in vivo 研究は、固有の制限を有する異種移植マウスモデルを使用する。ここでは、 KitV558Δ/+ 変異を保有する消化管間質腫瘍の免疫能を有する遺伝子操作マウスモデルについて説明する。このモデルでは、ほとんどのGISTの原因となる癌遺伝子である変異KITは、その内因性プロモーターによって駆動され、ヒトGISTに見られる組織学的外観および免疫浸潤を模倣するGISTにつながる。さらに、このモデルは、標的分子療法と免疫療法の両方を調査するために首尾よく使用されています。ここでは、 キットV558Δ/+ マウスコロニーの飼育と維持について述べる。さらに、この論文では、 KitV558Δ/+ マウスにおけるGISTの治療と調達、腸間膜リンパ節の排出、隣接する盲腸、ならびに分子および免疫学的分析のためのサンプル調製について詳述します。
Introduction
GISTはヒトで最も一般的な肉腫であり、米国では約6,000例の発生率を有する1。GISTは、Cajalの間質細胞と名付けられた胃腸ペースメーカー細胞に由来するようであり、典型的にはチロシンキナーゼKITまたはPDGFRA2の単一の変異によって駆動される。手術はGISTの治療の柱であり、治癒的であり得るが、進行した疾患を有する患者は、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)、イマチニブで治療することができる。20年以上前に導入されて以来、イマチニブはGISTの治療パラダイムを変革し、進行した疾患の生存率を1年から5年以上に改善しました3,4,5。残念なことに、イマチニブは後天的なKIT変異のために治癒することはめったにないので、この腫瘍には新しい治療法が必要です。
マウスモデルは、がんにおける新規治療法の調査において重要な研究ツールである。複数の皮下異種移植片および患者由来異種移植片モデルが開発され、GIST6,7で調査されている。しかし、GISTは発癌性変異に応じて異なる免疫プロファイルを保有し、胃腸腫瘍微小環境の変化はTKI療法の効果を改善するため、免疫不全マウスはヒトGISTを完全には表していない8,9。KitV558Δ/+マウスは、ヒトGIST 10で最も一般的に変異した部位である並膜ドメインをコードするキットエクソン11においてヘテロ接合性生殖細胞系列欠失を有する。キットV558Δ/+マウスは、100%の浸透率を有する単一の盲腸GISTを発達させ、腫瘍はヒトGIST 8,11,12,13と同様の組織学、分子シグナル伝達、免疫浸潤、および治療に対する応答を有する。ここでは、GISTの分子・免疫学的研究に用いるキットV558Δ/+マウスの育種・治療・検体の単離・処理について述べる。
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Protocol
すべてのマウスを、NIHガイドラインに従い、ペンシルベニア大学IACUCの承認を得て、ペンシルベニア大学で病原体を含まない条件下で飼育した。安楽死は、ペンシルベニア大学実験動物資源の標準作業手順に従って実施した。
1. キットV558Δ/+ マウス飼育
- C57BL/6Jマウスを用いて 、キットV558Δ/+ マウスをC57BL/6Jバックグラウンド上に10回以上バッククロスした。これを行うには、雄の キットV558Δ/+ マウスと雌のC57BL/6Jマウスを1:2の比率で繁殖させます。
注:ホモ接合型キットV558 Δ/V558Δ遺伝子型は子宮内で致死的です。雌のキットV558Δ/+マウスと雄のC57BL/6Jマウスの交配は可能ですが、ごみの大きさは雌の野生型C57BL/6Jマウスの約半分です。さらに、雌のキットV558Δ/+マウスは、生後4ヶ月後に限られた同腹仔を産生する。 - つま先クリッピングにより生後7〜14日で仔犬を遺伝子型化し、 キットV558Δ/+ 遺伝子型の存在を確認した。フォワードプライマーを使用してください:TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA;報告者1:CCTCGACAACCTTCCA;リバースプライマー: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT;レポーター2:ジェノタイピングのためのTCTCCTCGACCTTCCAと。
2. キットV558Δ/+ マウス治療
- 年齢と性別は、治療前の キットV558Δ/+マウスと一致します。雌の KitV558Δ/+ マウスの腫瘍は雄マウスの腫瘍よりも大きいため、年齢および性別が一致したマウスをコホートで使用する。8〜12週齢でマウスを治療し、その時点で腫瘍が確立される(図1)。
- チロシンキナーゼ阻害剤を経口または腹腔内(i.p.)注射によって与える; キットV558Δ/+ 腫瘍はチロシンキナーゼ阻害剤に感受性である。飲料水中に600mg / Lの用量のイマチニブを提供するか、または1日2回45mg / kgのi.p.注射を行う。ステップ3に示すように、腫瘍の解剖後にデジタルスケールを使用して腫瘍重量の減少を測定し、イマチニブによる治療後、1週間で約50%、4週間で80%である(図2)。
3. キットV558Δ/+ マウス臓器収穫
- CO2麻薬によってマウスを毎分60%チャンバー容積の流速で安楽死させる。呼吸が止まった後、マウスを少なくとも2分間チャンバーに放置し、子宮頸部脱臼を行って死亡を確認する。
- すべての器具を滅菌し、手順全体を通して手袋を着用し、滅菌フィールドを維持します。70%エタノールで皮膚を調製する。はさみを使用して2cmの正中線垂直切開を行い、腹腔に入る。腹腔内癒着を鋭く溶解する。
- 排水する腸間膜リンパ節を除去するには、以下の手順に従ってください。
- 盲腸を特定し、その腸間膜を優位に持ち上げる。結腸腸間膜の基部のほぼ中間で、腸間膜リンパ節を同定し、それを鋭く解剖する。リンパ節はオフホワイトで、大きさは約0.5 cm x 0.5 cmです。
- 必要に応じて、リンパ節組織を3分の1に分割して、タンパク質単離、組織学、および単一細胞懸濁液を得る。単一細胞懸濁液の場合は、リンパ節組織を20mLの無血清培地(RPMI)に入れ、氷上に保ちます。
- GIST と盲腸を分離するには、以下の手順に従います。
- キットV558Δ/+マウスの盲腸は、ほとんどがGISTに置き換えられています。回腸骨接合部を腫瘍の基部から慎重に分割する。盲腸を採取するには、結腸を再び分割し、腫瘍の基部に近位2cmにする。
- KitV558Δ/+マウスの50%~60%では、腫瘍の頭部には盲腸組織のキャップがあり、通常は漿液を含むが、膿を含むことはめったにない(図3)。キャップ組織を腫瘍組織から遠ざけて鋭く解剖する。
- 必要に応じて、腫瘍組織および/または盲腸を3分の1に分割して、タンパク質単離、組織学、および単一細胞懸濁液を得る。単一細胞懸濁液の場合は、腫瘍組織または盲腸を2%FCSでHBSSに入れ、サンプルを覆い、氷の上に保つのに十分です。
4. GIST組織のウェスタンブロット解析
- 50 mM TrisHCl(pH 7.5)、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1% 非変性洗剤、2 mMNa3VO4、1 mM PMSF、10 mM NaF、および 20 μl/ml プロテイナーゼ阻害剤混合物を含む組織溶解バッファーを調製します。
- 1800 mLの脱イオン水、2 mLのTween 20、および200 mLの10xトリス緩衝生理食塩水(TBS)を組み合わせて、1%Tween 20(TBST)を含む1xトリス緩衝生理食塩水を調製します。
- ステップ3.4.3の組織をFACSチューブに5mL/gの組織溶解バッファーに再懸濁し、氷上で15,000rpmで15秒間機械式ホモジナイザーで2回ホモジナイズします。氷上で30分間溶解物をインキュベートする。
- 溶解液を1.5 mLの微量遠心チューブに移す。最高速度で4°Cで20分間遠心分離する。 上清を新しい微量遠心チューブに移します。
- 4%〜15%の勾配ゲル上で溶解物を実行し、次いで、14に記載されるようにニトロセルロース膜に転写する。
- 膜を1x TBSで1回5分間洗浄し、次に5%ミルクで膜を1時間ブロックします。ここでも、メンブレンを1x TBSに1回、10分間洗浄します。
- 膜を5%BSAで1:1000に希釈した一次抗体中で4°Cで一晩インキュベートする。メンブレンを1x TBSTで3xずつ10分間洗浄します。ブロットを2.5%牛乳で1:2500に希釈した二次抗体で室温で1時間インキュベートする。
- メンブレンを1x TBSに1回、5分間洗浄します。膜を覆うのに十分なHRP基質(通常は200〜500μL)を追加し、デジタルイメージャーを使用して化学発光を検出および定量します。
5. GIST組織の免疫組織化学
- ステップ3.3.2または3.4.3の組織を4%パラホルムアルデヒドで4°Cで一晩固定する。処理の準備ができるまで組織を70%EtOHに保管する。15、16に記載されているように、スライドガラス上に5μmの厚さでブロックを埋め込む。
- 基本的な免疫検出キットを用いた完全な免疫組織化学的検出は、先に記載したように、17.
6.腸間膜リンパ節の単一細胞懸濁液
- ステップ3.3.2のリンパ節検体を含むRPMI培地を100μmフィルターに注ぎます。フィルターを新しい50 mL円錐形リンパ節に移動し、3 mLプラスチックシリンジの柔らかい端でマッシュリンパ節にします。フィルターを 20 mL の RPMI 培地で洗浄します。
- 濾液を4°Cで450 x g で5分間遠心分離する。上清を吸引する。
- ペレットをPBS(ビーズバッファー)中の1%FBSの20mLに再懸濁し、40μmフィルターに注ぎます。細胞濾液を採取する。血球計数器を用いて細胞を計数する。
- 濾液を4°Cで450 x g で5分間遠心分離する。上清を吸引する。フローサイトメトリーのために6 x107 cells/mLのビーズバッファーに再懸濁します。
7. GISTの単一細胞懸濁液
- 250 mgのコラゲナーゼIV、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤1錠、および100 μLのDNase Iを50 mLのHBSSに添加してコラゲナーゼ緩衝液を調製します。溶解するまで室温で10分間回転させる。
- 滅菌皿にGISTを入れ、コラゲナーゼ緩衝液2.5mLを加える。腫瘍が微細な断片になるまで滅菌メスおよびはさみを用いて腫瘍をミンチする。大口径ピペットを使用して、腫瘍とコラゲナーゼを50mLチューブに吸引します。
- 37°Cで100rpmの振とうインキュベーター内で30分間インキュベートする。2mLのFBSによるクエンチ反応。
- GIST標本を含むコラゲナーゼを100μmフィルターに注ぎ、3mLプラスチックシリンジのソフトエンドで腫瘍をマッシュアップし、50mLチューブに集める。フィルターを20mLのHBSSで洗浄します。濾液を450 x g、4°Cで5分間遠心分離する。上清を吸引する。
- ペレットを20 mLのビーズバッファーに再懸濁し、40 μmフィルターに注ぎます。濾液を回収し、血球計数器を用いて細胞を計数する。濾液を450 x g、4°Cで5分間遠心分離する。上清を吸引する。フローサイトメトリーのために6 x107 cells/mLのビーズバッファーに再懸濁します。
8.盲腸の単一細胞懸濁液
- ステップ7.1のようにコラゲナーゼ緩衝液を調製する。はさみを用いて、盲腸を縦方向に分割し、内粘膜を露出させた。0.5 cmの切片に切断し、5 mLのHBSSと2%FBSの50 mLチューブに入れます。30秒間激しく振とうし、450 x g で20秒間遠心分離し、上清を吸引する。
- 5 mL の HBSS を 2 mM EDTA と共に加えます。37°Cの振とうインキュベーター内で100rpmで15分間インキュベートする。450 x g で 20 秒間遠心分離機。上清を吸引する。
- 5mLのHBSSを加える。30秒間激しく振とうし、450 x g で20秒間遠心分離し、上清を吸引する。もう一度繰り返します。
- 5mLのコラゲナーゼ緩衝液を加える。37°Cの振とうインキュベーター内で100rpmで30分間インキュベートする。10分ごとに激しく振る。2mLのFBSによるクエンチ反応。
- 100μmフィルターの上に盲腸標本を含むコラゲナーゼを注ぎ、3mLプラスチックシリンジの柔らかい端でマッシュアップする。フィルターを20mLのHBSSで洗浄します。ろ液を回収する。
- 濾液を450 x gで4°Cで5分間遠心分離する。 上清を吸引する。ペレットを20 mLのビーズバッファーに再懸濁し、40 μmフィルターに注ぎます。濾液を収集し、血球計数器を用いて細胞を計数する。
- 濾液を450 x gで4°Cで5分間遠心分離する。 上清を吸引する。フローサイトメトリーのために6 x107 cells/mLのビーズバッファーに再懸濁します。
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Representative Results
KitV558Δ/+マウスモデルは、免疫適格マウスモデルにおける治療薬の調査を可能にします。キットV558Δ/+マウスの平均寿命は、進行性の腸閉塞により8ヶ月である(図4)。KitV558Δ/+マウスの腫瘍は、チロシンキナーゼKITおよび膜貫通チャネルDOG1(図5)、ならびに転写因子ETV1(図示せず)を含むGISTの正準マーカーを発現する。腫瘍は、下流マーカーERKおよびAKT(図6)、またはヒトGIST8、11、12、13を密接に模倣する免疫微小環境などのKITシグナル伝達経路の変化について研究することができる。MRI8またはCT(図7)は、腫瘍応答の正確な測定として腫瘍体積を追跡するためにも使用され得る。未処置のキットV558Δ/+マウスに、イメージングの1時間前に200μLのガストログラフィンを経口投与した。CTイメージングはvivaCT 80プラットフォーム上で完了しました。3D再構成は、腫瘍体積も測定できるフィジーのソフトウェアで実施した。
図1:雄および雌キットV558Δ/+ マウスにおける腫瘍重量の比較。9週齢の未治療キットV558Δ/+雄および雌マウスから腫瘍を単離し、秤量した(n = 15マウス/群)。データは、平均±平均の標準誤差(SEM)を表します。p値は、学生のt検定を用いて計算した。* = P < 0.05.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2: キットV558Δ/+ マウスの腫瘍に対するイマチニブの効果。 キットV558Δ/+ マウスを、飲料水中のビヒクルまたは600mg/Lイマチニブで1週間または4週間処置した。腫瘍を単離し、秤量した(n = 4〜5匹のマウス/群)。データはSEM±平均を表します。p値は、個々の群の比較のためのボンフェローニ事後検定との一元配置分散分析比較を用いて計算した。* = P < 0.05. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3: キャップ付きキットV558Δ/+ 腫瘍。 漿液を含む盲腸キャップを有する キットV558Δ/+ マウスからの腫瘍の代表的な写真。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:キットV558Δ/+マウスの寿命 未処置キットV558Δ/+マウスの生存期間を>400日間追跡した(n = 43匹)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:免疫組織化学的分析 スケールバーが40μmである キットV558Δ/+ 腫瘍の代表的な組織像略:H&E =ヘマトキシリンおよびエオジン染色;キット=GISTおよび受容体型チロシンキナーゼの正準マーク;Dog1 = 陰イオン輸送における役割を持つGISTの正準マーカー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
キットV558Δ/+マウスをビヒクルまたは600mg/Lイマチニブを飲料水中で1週間処理した。マウスに、分析の6時間前にビヒクルまたは45mg/kgイマチニブの単回i.p.注射を投与した。KitV558Δ/+腫瘍由来のタンパク質溶解物をウェスタンブロット(n = 2マウス/群)で調べた。略語:P Kit=リン酸化キット受容体チロシンキナーゼ;Tキット=総キット受容体チロシンキナーゼ;P ERK=リン酸化マイトジェン活性化プロテインキナーゼ;T ERK=全マイトジェン活性化プロテインキナーゼ;P AKT = リン酸化セリン - スレオニンプロテインキナーゼ;T AKT = 総セリン - スレオニンプロテインキナーゼ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
未治療のキットV558Δ/+マウスの3D CT再構成により、骨盤内の腫瘍(矢印)が実証された。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
KitV558Δ/+ マウスモデルは、GIST の分子および免疫学的解析における強力な研究ツールです。育種戦略では単一の交配が必要ですが、腫瘍応答を分析する実験でKitV558Δ/+マウスコホートを使用するには、広範な交配が必要です。マウスは、同様の腫瘍重量を確保するために年齢と性別が一致している必要があり、腫瘍が確立された8週齢前にマウスの10%が死亡する。CTやMRIなどの高度なイメージング技術を使用して個々のマウス内の腫瘍体積を追跡する場合、それほど広範囲ではない繁殖戦略が可能です。それにもかかわらず、KitV558Δ/+マウスは他のノックアウトマウスモデルまたは誘導性マウスモデルとの交配に成功し、重要な免疫および分子メカニズムを明らかにしました12。
KitV558Δ/+マウスの腫瘍細胞は、KIT(CD117)のカラムソーティングまたはフローサイトメトリー18によって容易に単離できます。KitV558Δ/+マウスから単離された腫瘍細胞は、インビトロで増殖させることができる12。継代初期において、KitV558Δ/+マウスから単離された腫瘍細胞はKIT発現を保持し、インビトロ研究に使用することができる。しかしながら、数回の継代後、これらの細胞株はKIT発現を失い、それらの適用性を制限する。ほとんどのマウスモデルと同様に、KitV558Δ/+腫瘍は転移しないため、腸外GISTの研究が制限されます。同様に、Kit V558Δ/+マウスの腫瘍は盲腸でのみ発生し、KitV558Δ/+腫瘍から単離された細胞は、肝臓または脾臓に単離して注射しても増殖しないため、疾患の異なる部位からの腫瘍微小環境の評価が制限される。 また、KitV558Δ/+変異は、このマウスモデルにおける細胞の血液学的発達に既知の影響を及ぼさない。
KitV558Δ/+マウスの腫瘍における免疫微小環境は、主にマクロファージを含み、続いてヒトGIST11を厳密に模倣するT細胞が続く。しかし、腫瘍重量または免疫浸潤を評価する前に、盲腸キャップを腫瘍から完全に除去することが不可欠であり、腫瘍と盲腸には別個の免疫集団が存在する。私たちの経験では、腫瘍重量はキャップを有するものの間でも同等であり、チロシンキナーゼ阻害剤療法と盲腸キャップの開発との間に有意な関連性はない。さらに、盲腸キャップの有無にかかわらず腫瘍を比較する腫瘍微小環境において有意差は認められていない。
多くの遺伝子操作マウスモデルは、特にCRISPR遺伝子編集の出現以来、癌研究に使用するために開発されてきた。多くの免疫適格モデルがcre-loxP媒介による癌遺伝子の活性化または腫瘍抑制遺伝子の不活性化に依存しているが、 KitV558Δ/+腫瘍は内因性プロモーターによって駆動される。したがって、 KitV558Δ/+マウスモデルにおける知見は、ヒト疾患、特にKITシグナル伝達の評価において高度に翻訳可能である19。今後、 KitV558Δ/+マウスは、GISTを含む軟部組織腫瘍の治療のためにチェックポイント遮断やCAR T療法などの新しい治療戦略が引き続き探求されているため、貴重なモデルとして機能し続けるはずです。
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Disclosures
著者らは、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
キットV558Δ/+ マウスは遺伝子操作され、Peter Besmer10博士によって共有されました。この作業は、NIHの助成金R01 CA102613およびT32 CA251063によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
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