Summary
Målet med detta manuskript är att beskriva KitV558Δ/+ musmodellen och tekniker för framgångsrik dissektion och bearbetning av musprover.
Abstract
Gastrointestinal stromal tumör (GIST) är den vanligaste humana sarkom och drivs vanligtvis av en enda mutation i KIT-receptorn. Över tumörtyper har många musmodeller utvecklats för att undersöka nästa generations cancerterapier. Men i GIST använder de flesta in vivo-studier xenograftmusmodeller som har inneboende begränsningar. Här beskriver vi en immunkompetent, genetiskt konstruerad musmodell av gastrointestinal stromal tumör som hyser en KitV558Δ/+ mutation. I denna modell drivs mutant KIT, onkogenen som är ansvarig för de flesta GIST, av sin endogena promotor som leder till en GIST som efterliknar det histologiska utseendet och immuninfiltrat som ses i mänskliga GIST. Dessutom har denna modell använts framgångsrikt för att undersöka både riktade molekylära och immunterapier. Här beskriver vi avel och underhåll av en KitV558Δ/+ muskoloni. Dessutom beskriver detta dokument behandling och upphandling av GIST, dränering av mesenterisk lymfkörtel och intilliggande cecum i KitV558Δ / + -möss, samt provberedning för molekylära och immunologiska analyser.
Introduction
GIST är den vanligaste sarkom hos människor med en förekomst av cirka 6 000 fall i USA1. GIST verkar härstamma från de gastrointestinala pacemakercellerna som heter de interstitiella cellerna i Cajal, och drivs vanligtvis av en enda mutation i tyrosinkinasen KIT eller PDGFRA2. Kirurgi är grundpelaren i behandlingen av GIST och kan vara botande, men patienter med avancerad sjukdom kan behandlas med tyrosinkinashämmaren (TKI), imatinib. Sedan introduktionen för över 20 år sedan har imatinib förändrat behandlingsparadigmet inom GIST och förbättrat överlevnaden vid avancerad sjukdom från 1 till över 5 år 3,4,5. Tyvärr är imatinib sällan botande på grund av förvärvade KIT-mutationer, så nya behandlingar behövs för denna tumör.
Musmodeller är ett viktigt forskningsverktyg i undersökningen av nya terapier vid cancer. Flera subkutana xenograft- och patientbaserade xenograftmodeller har utvecklats och undersökts i GIST 6,7. Immunbristmöss representerar emellertid inte helt human GIST eftersom GIST har differentiella immunprofiler beroende på deras onkogena mutation, och förändring av den gastrointestinala tumörmikromiljön förbättrar effekterna av TKI-terapi 8,9. KitV558Δ /+ -musen har en heterozygot bakterieradering i Kit exon 11, som kodar för juxtamembrandomänen, den vanligaste muterade platsen i mänsklig GIST10. KitV558Δ / + möss utvecklar en enda cecal GIST med 100% penetrans, och tumörer har liknande histologi, molekylär signalering, immuninfiltration och svar på terapi som human GIST 8,11,12,13. Här beskriver vi avel, behandling och provisolering och bearbetning i KitV558Δ /+ möss för användning i molekylär och immunologisk forskning inom GIST.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss inhystes under patogenfria förhållanden vid University of Pennsylvania enligt NIH-riktlinjer och med godkännande av University of Pennsylvania IACUC. Eutanasi utfördes enligt University of Pennsylvania Laboratory Animal Resources standardrutiner.
1. KitV558Δ/+ musavel
- Backcross the KitV558Δ/+ möss mer än 10 gånger på en C57BL/6J-bakgrund med C57BL/6J-möss. För att göra detta, avla de manliga KitV558Δ / + -mössen med kvinnliga C57BL / 6J-möss i förhållandet 1: 2.
OBS: Den homozygota KitV558Δ / V558Δ-genotypen är dödlig i livmodern. Det är möjligt att föda upp kvinnliga KitV558Δ /+ möss med manliga C57BL / 6J-möss, men kullstorleken är ungefär hälften som den som ses från kvinnliga vildtyp C57BL / 6J-möss. Dessutom producerar kvinnliga KitV558Δ / + -möss begränsade kullar efter 4 månaders ålder. - Genotypa valparna vid 7-14 dagars ålder genom tåklippning för att bekräfta närvaron av Genotypen KitV558Δ/+ . Använd den främre primern: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; reporter 1: CCTCGACAACCTTCCA; omvänd primer: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; och reporter 2: TCTCCTCGACCTTCCA för genotypning.
2. KitV558Δ / + musbehandling
- Ålder och kön matchar KitV558Δ/+möss före behandling. Använd ålders- och könsmatchade möss i kohorter eftersom tumörer från kvinnliga KitV558Δ / + -möss är större än hos hanmöss. Behandla mössen vid 8-12 veckors ålder, vid vilken tidpunkt tumörer etableras (Figur 1).
- Ge tyrosinkinashämmare oralt eller genom intraperitoneal (i.p.) injektion; KitV558Δ /+ tumörer är känsliga för tyrosinkinashämmare. Ge imatinib i en dos på 600 mg/l i dricksvatten eller i.p. injektioner på 45 mg/kg två gånger dagligen. Mät tumörviktreduktion med hjälp av digitala vågar efter dissektion av tumör som visas i steg 3, vilket är cirka 50% vid 1 vecka och 80% vid 4 veckor efter behandling med imatinib (figur 2).
3. KitV558Δ / + musorgelskörd
- Avliva möss medCO2-narkos med en flödeshastighet på 60% kammarvolym per min. Lämna möss i kammaren i minst 2 minuter efter att andningen har upphört och utför sedan cervikal dislokation för att bekräfta döden.
- Sterilisera alla instrument, använd handskar under hela proceduren och behåll ett sterilt fält. Förbered huden med 70% etanol. Gör ett 2 cm vertikalt snitt i mittlinjen med sax och gå in i bukhålan. Lysa kraftigt eventuella intra-abdominala vidhäftningar.
- För att ta bort den dränerande mesenteriska lymfkörteln, följ stegen som beskrivs nedan.
- Identifiera cecum och lyft dess mesenteri överlägset. Ungefär halvvägs till basen av kolonmesenteriet, identifiera den mesenteriska lymfkörteln och dissekera den kraftigt. Lymfkörteln är benvit och ca 0,5 cm x 0,5 cm stor.
- Dela lymfkörtelvävnad i tredjedelar för proteinisolering, histologi och encellssuspension, efter behov. För encellssuspensioner, placera lymfkörtelvävnad i 20 ml serumfria medier (RPMI) och håll den på is.
- För isolering av GIST och cecum, följ stegen som beskrivs nedan.
- Cecum i KitV558Δ / + möss ersätts mestadels av en GIST. Dela försiktigt den ileokoliska korsningen från tumörens bas. För att samla cecum, dela tjocktarmen igen, 2 cm proximal till tumörens bas.
- Hos 50%-60% av KitV558Δ/+ möss innehåller tumörhuvudet ett lock av cekal vävnad, som vanligtvis innehåller serös vätska men sällan kan innehålla pus (Figur 3). Dissekera kraftigt lockvävnaden bort från tumörvävnaden.
- Dela tumörvävnad och / eller cecum i tredjedelar för proteinisolering, histologi och encellssuspension, efter behov. För encellssuspensioner, placera tumörvävnad eller cecum i HBSS med 2% FCS, tillräckligt för att täcka provet och hålla på is.
4. Western blot-analys av GIST-vävnad
- Förbered vävnadslysbuffert innehållande 50 mM TrisHCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% nondenaturerande tvättmedel, 2 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 10 mM NaF och 20 μl/ml proteinashämmareblandning.
- Förbered en 1x Tris-buffrad saltlösning med 1% Tween 20 (TBST) genom att kombinera 1800 ml avjoniserat vatten, 2 ml Tween 20 och 200 ml 10x Tris-buffrad saltlösning (TBS).
- Resuspendera vävnad från steg 3.4.3 i ett FACS-rör i 5 ml/g vävnadslysbuffert och homogenisera två gånger med en mekanisk homogenisator vid 15 000 rpm i 15 s på is. Inkubera lysat i 30 min på is.
- Överför lysat till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera med maxhastighet i 20 min vid 4 °C. Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör.
- Kör lysater på en 4% till 15% gradientgel och överför sedan till ett nitrocellulosamembran, som beskrivs i14.
- Tvätta membranet en gång i 1x TBS i 5 min och blockera sedan membranet i 5% mjölk i 1 timme. Återigen, tvätta membranet en gång i 1x TBS i 10 minuter.
- Inkubera membran i primär antikropp utspädd 1:1000 i 5% BSA vid 4 °C över natten. Tvätta membran 3x i 1x TBST i 10 min vardera. Inkubera fläck med sekundär antikropp utspädd 1:2500 i 2,5% mjölk i 1 h vid rumstemperatur.
- Tvätta membranet en gång i 1x TBS i 5 min. Tillsätt tillräckligt med HRP-substrat för att täcka membran, vanligtvis 200-500 μL, och använd en digital bild för att detektera och kvantifiera kemiluminescens.
5. Immunohistokemi av GIST-vävnad
- Fixera vävnad från steg 3.3.2 eller 3.4.3 i 4% paraformaldehyd vid 4 °C över natten. Förvara vävnad i 70% EtOH tills den är klar för bearbetning. Bädda in och sektionsblock med en tjocklek på 5 μm på glasskivor, enligt beskrivningen15,16.
- Fullständig immunohistokemisk detektion med hjälp av ett grundläggande immundetektionssats, som tidigarebeskrivits 17.
6. Encellssuspension av mesenterisk lymfkörtel
- Häll RPMI-media med lymfkörtelprov från steg 3.3.2 över ett 100 μm filter. Flytta filtret till ny 50 ml konisk och mosa lymfkörtel med den mjuka änden av en 3 ml plastspruta. Tvätta filtret med 20 ml RPMI-media.
- Centrifugera filtratet vid 450 x g vid 4 °C i 5 minuter. Aspirera supernatanten.
- Resuspend pellet i 20 ml 1% FBS i PBS (pärlbuffert) och häll över ett 40 μm filter. Samla cellfiltrat. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer.
- Centrifugera filtratet vid 450 x g vid 4 °C i 5 minuter. Aspirera supernatanten. Resuspend i pärlbuffert vid 6 x 107 celler / ml för flödescytometri.
7. Encellssuspension av GIST
- Förbered kollagenasbufferten genom att tillsätta 250 mg kollagenas IV, en tablett EDTA-fri proteashämmare och 100 μl DNasE I till 50 ml HBSS. Rotera i 10 minuter vid rumstemperatur tills det är upplöst.
- Placera GIST i en steril skål och tillsätt 2,5 ml kollagenasbuffert. Hacka tumör med en steril skalpell och sax tills tumören är i fina fragment. Använd en pipett med stor borrning för att aspirera tumören och kollagenaset i ett 50 ml rör.
- Inkubera i en skakinkubator vid 100 rpm vid 37 °C i 30 min. Släck reaktion med 2 ml FBS.
- Häll kollagenas med GIST-prov över ett 100 μm filter och mosa tumör med den mjuka änden av en 3 ml plastspruta och samla i ett 50 ml rör. Tvätta filtret med 20 ml HBSS. Centrifugera filtratet vid 450 x g, 4 °C i 5 min. Aspirera supernatanten.
- Resuspend pelleten i 20 ml pärlbuffert och häll över ett 40 μm filter. Samla filtratet och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Centrifugera filtratet vid 450 x g, 4 °C i 5 min. Aspirera supernatanten. Resuspend i pärlbuffert vid 6 x 107 celler / ml för flödescytometri.
8. Encellssuspension av cecum
- Förbered kollagenasbufferten enligt steg 7.1. Använd sax och dela cecum i längdriktningen för att exponera den inre slemhinnan. Skär i 0,5 cm sektioner och placera i ett 50 ml rör med 5 ml HBSS med 2% FBS. Skaka kraftigt i 30 s, centrifugera vid 450 x g i 20 s och aspirera sedan supernatanten.
- Tillsätt 5 ml HBSS med 2 mM EDTA. Inkubera i en skakinkubator vid 37 °C vid 100 rpm i 15 min. Centrifugera vid 450 x g i 20 s. Aspirera supernatanten.
- Tillsätt 5 ml HBSS. Skaka kraftigt i 30 s, centrifugera vid 450 x g i 20 s och aspirera sedan supernatanten. Upprepa en gång till.
- Tillsätt 5 ml kollagenasbuffert. Inkubera i en skakinkubator vid 37 °C i 30 min vid 100 rpm. Skaka kraftigt var 10: e minut. Släck reaktion med 2 ml FBS.
- Häll kollagenas med cecumprov över ett 100 μm filter och mosa med den mjuka änden av en 3 ml plastspruta. Tvätta filtret med 20 ml HBSS. Samla filtrat.
- Centrifugera filtratet vid 450 x g i 5 min vid 4 °C. Aspirera supernatanten. Resuspend pellet i 20 ml pärlbuffert och häll över ett 40 μm filter. Samla filtrat och räkna celler med hjälp av en hemocytometer.
- Centrifugera filtratet vid 450 x g i 5 min vid 4 °C. Aspirera supernatanten. Resuspend i pärlbuffert vid 6 x 107 celler / ml för flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KitV558Δ/+ musmodellen möjliggör undersökning av terapier i en immunkompetent musmodell. KitV558Δ /+ möss har en genomsnittlig livslängd på 8 månader på grund av progressiv tarmobstruktion (figur 4). Tumörer från KitV558Δ/+ möss uttrycker kanoniska markörer för GIST inklusive tyrosinkinas KIT och transmembrankanalen DOG1 (figur 5), samt transkriptionsfaktorn ETV1 (visas inte). Tumörer kan studeras för förändringar i KIT-signalvägen, såsom nedströmsmarkörerna ERK och AKT (figur 6), eller immunmikromiljö som nära efterliknar human GIST 8,11,12,13. MRI8 eller CT (figur 7) kan också användas för att spåra tumörvolymen som en noggrann mätning av tumörsvaret. En obehandlad KitV558Δ/+-mus gavs 200 μL gastrograffin oralt 1 timme före avbildning. CT-avbildning slutfördes på en vivaCT 80-plattform. 3D-rekonstruktion utfördes med Fiji-programvara, som också kan mäta tumörvolymen.
Figur 1: Jämförelse av tumörvikter hos manliga och kvinnliga KitV558Δ/+ möss. Tumörer från 9 veckor gamla obehandlade KitV558Δ/+ han- och honmöss isolerades och vägdes (n = 15 möss/grupp). Data representerar medelvärdet ± medelvärdet av medelvärdet (SEM); p-värden beräknades med hjälp av en elevs t-test ; * = P < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Effekt av imatinib på tumörer från KitV558Δ/+ möss. KitV558Δ/+ möss behandlades med vehikel eller 600 mg/L imatinib i dricksvatten i 1 eller 4 veckor. Tumörer isolerades och vägdes (n = 4-5 möss/grupp). Data representerar medelvärdet ± SEM; p-värden beräknades med hjälp av en enkelriktad ANOVA-jämförelse med ett Bonferroni-eftertest för jämförelse av enskilda grupper; * = P < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: KitV558Δ/+ tumör med lock. Representativt foto av en tumör från en KitV558Δ / + mus med ett cecallock som innehåller serös vätska. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Livslängd för KitV558Δ/+ möss. Överlevnaden för obehandlade KitV558Δ/+ möss spårades i > 400 dagar (n = 43 möss). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Immunohistokemisk analys. Representativ histologi för en KitV558Δ/+ tumör där skalstrecket är 40 μm. Förkortningar: H&E = hematoxylin och eosinfärgning; Kit = ett kanoniskt märke av GIST och receptortyrosinkinas; Dog1 = en kanonisk markör för GIST med roll i anjontransport. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kit V558Δ/+ möss behandlades med vehikel eller 600 mg/L imatinib i dricksvatten i 1 vecka. Mössen fick en enda i.p. injektion av vehikel eller 45 mg/kg imatinib 6 timmar före analys. Proteinlysater från KitV558Δ/+ tumörer undersöktes av western blot (n = 2 möss/grupp). Förkortningar: P Kit = fosforylerat Kit receptor tyrosinkinas; T-kit = totalt Kit-receptortyrosinkinas; P ERK = fosforylerat mitogenaktiverat proteinkinas; T ERK = totalt mitogenaktiverat proteinkinas; P AKT = fosforylerat serin-treoninproteinkinas; T AKT = totalt serin-treoninproteinkinas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3D CT-rekonstruktion av en obehandlad KitV558Δ / + mus som visar en tumör (pil) i bäckenet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
KitV558Δ/+ musmodellen är ett kraftfullt forskningsverktyg inom molekylär och immunologisk analys av GIST. Även om avelsstrategin kräver ett enda kors, kräver användning av KitV558Δ / + muskohorter i experiment som analyserar tumörrespons omfattande avel. Möss bör ålders- och könsmatchas för att säkerställa liknande tumörvikter, och 10% av mössen dör före 8 veckors ålder när tumörer etableras. Mindre omfattande avelsstrategier är möjliga om man använder avancerade avbildningstekniker som CT eller MR för att spåra tumörvolymen hos enskilda möss. Ändå har KitV558Δ / + -möss framgångsrikt korsats till andra knock-out eller inducerbara musmodeller, vilket avslöjar viktiga immun- och molekylära mekanismer12.
Tumörceller från KitV558Δ /+ möss isoleras enkelt genom kolonnsortering för KIT (CD117) eller med flödescytometri18. Isolerade tumörceller från KitV558Δ/+ möss kan odlas in vitro12. Vid tidiga passager behåller isolerade tumörceller från KitV558Δ/+ möss KIT-uttryck och kan användas för in vitro-studier . Men efter flera passager förlorar dessa cellinjer KIT-uttryck, vilket begränsar deras tillämplighet. Liksom de flesta musmodeller metastaserar inte KitV558Δ / + tumörer, vilket begränsar studien av extraintestinell GIST. På samma sätt förekommer tumörer från KitV558Δ / + -möss endast i cecum, och celler isolerade från KitV558Δ / + tumörer växer inte när de isoleras och injiceras i levern eller mjälten, vilket begränsar utvärderingen av tumörmikromiljön från olika sjukdomsställen. KitV558Δ / + -mutationen har inte heller någon känd inverkan på den hematologiska utvecklingen av celler i denna musmodell.
Immunmikromiljön i tumörer från KitV558Δ /+ möss innehåller mestadels makrofager följt av T-celler, som nära efterliknar human GIST11. Det är dock absolut nödvändigt att cecallocket avlägsnas helt från tumören innan man bedömer tumörvikt eller immuninfiltrat, eftersom distinkta immunpopulationer finns i tumören kontra cecum. Enligt vår erfarenhet är tumörvikter jämförbara även bland dem med kepsar, och det finns ingen signifikant koppling mellan tyrosinkinashämmare och utvecklingen av en cecal cap. Dessutom har vi inte hittat någon signifikant skillnad i tumörmikromiljön som jämför tumörer med och utan cecal caps.
Många genetiskt modifierade musmodeller har utvecklats för användning inom cancerforskning, särskilt sedan crispr-genredigeringen kom. Medan många immunkompetenta modeller förlitar sig på cre-loxP-medierad aktivering av onkogener eller inaktivering av tumörsuppressorgener, drivs KitV558Δ / + tumörerna av deras endogena promotor. Följaktligen är resultaten i KitV558Δ / + musmodellen mycket översättbara till mänsklig sjukdom, särskilt vid utvärderingen av KIT-signalering19. Framöver bör KitV558Δ / + -musen fortsätta att fungera som en värdefull modell eftersom nya behandlingsstrategier inklusive kontrollpunktsblockad och CAR T-terapi fortsätter att utforskas för behandling av mjukvävnadstumörer inklusive GIST.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
KitV558Δ /+ möss var genetiskt konstruerade och delades av Dr. Peter Besmer10. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R01 CA102613 och T32 CA251063.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
References
- Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
- Joensuu, H., DeMatteo, R. P. The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy. Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).
- Blanke, C. D., et al. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT. Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).
- Demetri, G. D., et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).
- Gold, J. S. Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors. Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).
- Huynh, H., et al. Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Balachandran, V. P., et al. Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido. Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).
- Vitiello, G. A., et al. Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor. Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).
- Sommer, G., et al. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).
- Cavnar, M. J., et al. KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).
- Medina, B. D., et al. Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).
- Zhang, J. Q., et al. Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).
- General Protocol for Western Blotting. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf (2022).
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 253-268 (2019).
- Sy, J., Ang, L. -C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Biobanking: Methods and Protocols. , Springer. New York. 269-278 (2019).
- Seifert, A. M., et al. PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).
- Liu, M., et al. Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST. Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).
- Rossi, F., et al. Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).
