Summary
חיידקי מעיים עשויים להשפיע באופן חיובי או שלילי על בריאות המארח שלהם באמצעות מנגנונים ספציפיים או שמורים. Caenorhabditis elegans היא פלטפורמה נוחה לסינון עבור חיידקים כאלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר סינון בתפוקה גבוהה של 48 חיידקים מבודדים להשפעה על עמידות לעקה של נמטודה, המשמשים כפרוקסי לבריאות התולעים.
Abstract
עם גודלו הקטן, תוחלת החיים הקצרה והגנטיקה הקלה שלו, Caenorhabditis elegans מציע פלטפורמה נוחה לחקר ההשפעה של מבודדים מיקרוביאליים על הפיזיולוגיה של המארח. הוא גם פלואורסצנטי בכחול בעת המוות, ומספק אמצעי נוח לאיתור מוות. נכס זה נוצל לפיתוח מבחני הישרדות C. elegans ללא תוויות בתפוקה גבוהה (LFASS). אלה כוללים רישום פלואורסצנטי בהילוך מהיר של אוכלוסיות תולעים הקבועות בלוחות מרובי בתים, שמהם ניתן לגזור את זמן המוות החציוני של האוכלוסייה. המחקר הנוכחי מאמץ את גישת LFASS לסינון מבודדים מיקרוביאליים מרובים בו-זמנית עבור ההשפעות על הרגישות של C. elegans לחום חמור ולעקות חמצוניות. כאן מדווח על צינור סינון מיקרוביאלי כזה, שניתן להשתמש בו בעיקר כדי לסנן מראש פרוביוטיקה, תוך שימוש בעמידות קשה ללחץ כפרוקסי לבריאות המארח. הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל הן את אוספי המיקרוביוטה המבודדת של המעיים C. elegans והן אוכלוסיות תולעים סינכרוניות במערכים מרובי תאים לפני שילובם למבחנים. הדוגמה שסופקה מכסה בדיקה של 47 חיידקים מבודדים וזן בקרה אחד על שני זני תולעים, בשני מבחני עקה במקביל. עם זאת, צינור הגישה ניתן להרחבה בקלות וישים לסינון של שיטות רבות אחרות. לפיכך, הוא מספק מערך רב-תכליתי לסקירה מהירה של נוף רב-פרמטרי של תנאים ביולוגיים וביוכימיים המשפיעים על בריאות C. elegans.
Introduction
בגוף האדם חיים כ-10-100 טריליון תאים מיקרוביאליים חיים (חיידקים, פטריות ארכאיות), המצויים בעיקר בסביבות המעיים, העור והרירית1. במצב בריא, אלה מספקים יתרונות למארח שלהם, כולל ייצור ויטמינים, התבגרות של מערכת החיסון, גירוי של תגובות חיסוניות מולדות ונרכשות לפתוגנים, ויסות חילוף החומרים של השומן, ויסות תגובות ללחץ ועוד, עם השפעה על גדילה והתפתחות, התפרצות מחלות והזדקנות 2,3,4,5 . גם המיקרוביוטה של המעיים מתפתחת במידה ניכרת במהלך החיים. האבולוציה הדרסטית ביותר מתרחשת במהלך הינקות והילדות המוקדמת6, אך שינויים משמעותיים מתרחשים גם עם הגיל, כולל ירידה בשפע ביפידובקטריום ועלייה במינים קלוסטרידיום, לקטובצילוס, אנטרובקטריה ואנטרוקוקוס 7. אורח חיים יכול לשנות עוד יותר את ההרכב המיקרוביאלי של המעיים ולהוביל לדיסביוזיס (אובדן חיידקים מועילים, צמיחת יתר של חיידקים אופורטוניסטיים), וכתוצאה מכך פתולוגיות שונות כגון מחלות מעי דלקתיות, סוכרת והשמנת יתר5, אך גם לתרום למחלות אלצהיימר ופרקינסון 8,9,10,11.
הבנה זו תרמה תרומה קריטית לעידון הרעיון של ציר המעי-מוח (GBA), שבו אינטראקציות בין הפיזיולוגיה של המעיים (כיום כולל המיקרובים שבתוכה) לבין מערכת העצבים נחשבות לווסת העיקרי של חילוף החומרים של בעלי החיים ולתפקודים פיזיולוגיים12. עם זאת, התפקיד המדויק של המיקרוביוטה באיתות בין המעי למוח ומנגנוני הפעולה הקשורים אליו רחוקים מלהיות מובנים במלואם13. מאחר שמיקרוביוטה של המעיים היא גורם מפתח להזדקנות בריאה, האופן שבו חיידקים מווסתים את תהליך ההזדקנות הפך לנושא למחקר אינטנסיבי ולמחלוקת 6,14,15.
עם ההדגמה שהתולעת העגולה Caenorhabditis elegans מארחת מיקרוביוטה של המעי בונפיד הנשלטת - כמו במינים אחרים - על ידי Bacteroidetes, Firmicutes ו- Actinobacteria 16,17,18,19,20, עלייתה המהירה כפלטפורמה ניסיונית לחקר אינטראקציות בין המעי המארח למעיים 21,22,23,24 ,25,26 הרחיב משמעותית את ארסנל החקירות שלנו26,27,28,29. בפרט, ניתן להתאים גישות ניסיוניות בעלות תפוקה גבוהה הזמינות עבור C. elegans לחקר תזונה גנטית, גנים-תרופות, גנים-פתוגנים וכו', כדי לחקור במהירות כיצד חיידקים מבודדים וקוקטיילים משפיעים על הבריאות וההזדקנות של C. elegans.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר צינור ניסיוני לסינון בבת אחת של מערכים של חיידקים מבודדים או תערובות שנקבעו בלוחות מרובי בתים להשפעות על עמידות ללחץ C. elegans כפרוקסי לבריאות, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות פרוביוטיקה. הוא מפרט כיצד לגדל אוכלוסיות תולעים גדולות ולטפל במערכי חיידקים בתבניות של לוחות 96 ו-384 בארות לפני עיבוד תולעים לניתוח אוטומטי של עמידות בפני עקה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטיים (איור 1). הגישה מבוססת על מבחני הישרדות אוטומטיים ללא תוויות (LFASS)30 המנצלים את תופעת פלואורסצנציית המוות31, לפיה תולעים גוססות מייצרות פרץ של פלואורסצנציה כחולה שניתן להשתמש בה כדי לאתר את זמן המוות. פלואורסצנציה כחולה נפלטת על ידי אסטרים של גלוקוזיל של חומצה אנתרנילית המאוחסנים בגרגרי מעיים של C. elegans (סוג של אברונים הקשורים לליזוזום), אשר מתפוצצים כאשר מפל נמק מופעל במעי התולעת עם המוות31.
איור 1: זרימת עבודה ניסיונית לסינון בתפוקה גבוהה של חיידקים מבודדים עם השפעה על עמידות C. elegans ללחץ . (A) ציר זמן לתחזוקה והגדרת בדיקה של תולעים וחיידקים. (B) מערך לוחות חיידקים 96 באר התקנה וטיפול. (C) 384-באר צלחת תולעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שני זני C. elegans ששימשו במקביל למחקר הנוכחי היו בריסטול N2 מסוג פראי ו-HT1890: daf-16(mgDf50), הגדלים בקצב דומה. עם זאת, ניתן לשכפל את הפרוטוקול עם כל שילוב של שני זנים בעלי קצב צמיחה דומה. שימו לב שכאשר בודקים זנים אחרים במקביל (למשל, מוטנטים מסוג wild ו-daf-2 שגדלים לאט), יש לקחת בחשבון קצבי גדילה שונים, ובהתאם לכך יש להתאים את הפרוטוקול. לוחות הזמנים והכמויות של תולעים וחיידקים בפרוטוקול הבא מותאמים לבדיקה מקבילה של 48 חיידקים מבודדים על שני זני תולעים בשני מבחני LFASS בטטרפליקטים. יידרשו התאמות אם ייבדקו תנאים נוספים במקביל. Escherichia coli זן החיידק OP50 התקבל מהמרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC), אוניברסיטת מינסוטה. 48 החיידקים המבודדים התקבלו ממעבדת שולנבורג והוחזקו על אגר LB.
1. C. elegans culturing על OP50 (ימים 1 - 8)
הערה: הגישה הנוכחית שואפת לגדל הרמפרודיטים של C. elegans על מדיום מוצק בכל השלבים ולהימנע משינויים תזונתיים מיותרים (כלומר, שימוש בזני E. coli חלופיים הגדלים מהר יותר כגון NA22 או מדיית גדילה עשירה יותר כגון צלחות ביצים) כדי להישאר קרובים ככל האפשר לתנאי הגידול הסטנדרטיים32,33 שעדיין נמצאים בשימוש נרחב. טמפרטורת גדילת התולעת (כאן נקבעת על 15 מעלות צלזיוס) תלויה בזנים C. elegans המשמשים וייתכן שיהיה צורך בכוונון (למשל, כדי למנוע או להפעיל ביטוי של פנוטיפ רגיש לטמפרטורה או סמן ביולוגי). למידע על גידול תולעים, ראו הפניהמס' 33.
- הכינו שמונה צלחות NGM בקוטר 6 ס"מ (10 מ"ל של אגר מדיה לגידול נמטודה, NGM, קובץ משלים 1)32,33 לכל זן תולעת ותנו להן להתייבש במשך יום אחד בטמפרטורת החדר.
- הכינו תרבית נוזלית רוויה של חיידקי E. coli OP50 על ידי זריעת שיבוט חיידקי יחיד מצלחת אגר מרק ליזוגני טרי (LB agar, קובץ משלים 1) ב-25 מ"ל של מדיום OP50 (קובץ משלים 1) בצינור חרוטי של 50 מ"ל. לגדל את התרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שייקר.
- יש לחסן את שמונה צלחות ה-NGM בקוטר 6 ס"מ לכל זן עם 100 μL של תרבית נוזלית רוויה של E. coli OP50 לכל צלחת ולשמור את הצלחות בטמפרטורה של 20°C למשך יומיים לפני השימוש.
- בעזרת אזמל, חותכים ומעבירים נתח אגר מרובע של 0.5 ס"מ עם תולעים מצלחת NGM שהורעבה לאחרונה על כל אחת משמונה צלחות ה-NGM המחוסנות בקוטר 6 ס"מ ומדגרים את הצלחות הללו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים (או עד שהתולעים מסיימות את האוכל).
- הכינו חמש צלחות NGM בקוטר 15 ס"מ לכל זן תולעת (30 מ"ל בינוני NGM לצלחת) וחסנו ב-3 מ"ל OP50. תנו לצלחות להתייבש לפני הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. יש לשמור את הצלחות על 20°C עד לשימוש בשלבים מאוחרים יותר.
- באמצעות פיפטה P-1000, הוסף עד 3 מ"ל של מאגר M9 סטרילי (קובץ משלים 1) ללוחות NGM בגודל 6 ס"מ (שלב 1.1.) כדי להשהות את התולעים, ואסוף את תמיסת התולעת מכל שמונה הצלחות לכל זן בצינור חרוטי יחיד של 15 מ"ל.
- צנטריפוגה ב 142 x גרם במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה P-5000 או משאבת מים המצוידת בפיפטה או קצה פסטר סטרילי. הוסף 10 מ"ל של חיץ M9 סטרילי כדי לשטוף את כדור התולעת. חזור על 2x.
- הסר את הסופר-נאטנט (ככל האפשר) והעבר את התולעים לצלחת NGM מחוסנת OP50 בגודל 15 ס"מ (שלב 1.5.) באמצעות פיפטה. הוסף 0.5 מ"ל של תרבית OP50 מרוכזת.
- כדי ליצור OP50 מרוכז, יש לחסן כל אחד מארבעת בקבוקי ה-LB בנפח 1 ליטר עם 2 מ"ל של תרבית המתנע OP50 (שהוכנה בשלב 1.2.), ולגדול באינקובטור רועד במשך 6 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-160 x גרם. גלולה את החיידקים ב 3057 x g ו 20 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. להשליך את supernatant, resuse את כדורי חיידקי עם 6 מ"ל של OP50 בינוני, ולאסוף בצינור סטרילי 50 מ"ל חרוטי.
הערה: ניתן לאחסן חיידקים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
- לגדל כל זן תולעת על צלחת NGM בקוטר 15 ס"מ במשך 3-4 ימים בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס על ידי הזנה מחדש של התולעים עם 0.5 מ"ל של OP50 מרוכז מדי יום.
- לאחר שהתולעים כמעט סיימו את המזון, אספו ושטפו במאגר M9 (שלב 1.6.1.), העבירו כל תרבית זן תולעים לשתי צלחות NGM בגודל 15 ס"מ (שלב 1.5.), והפיצו תולעים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד ~95% מהאוכלוסייה הם בוגרים גרבידיים (זה ייקח בערך 24 שעות עבור בריסטול N2 מסוג בר).
הערה: בוגרים גרבידים מאופיינים בנוכחות ביצים בתוך התולעת, והצלחת האידיאלית צריכה להכיל גם שפע של ביצים לא מבוקעות המוטלות על הצלחת ללא יותר מדי זחלים33.
- לאחר שהתולעים כמעט סיימו את המזון, אספו ושטפו במאגר M9 (שלב 1.6.1.), העבירו כל תרבית זן תולעים לשתי צלחות NGM בגודל 15 ס"מ (שלב 1.5.), והפיצו תולעים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד ~95% מהאוכלוסייה הם בוגרים גרבידיים (זה ייקח בערך 24 שעות עבור בריסטול N2 מסוג בר).
2. שמירה על אוספי מיקרוביוטה מבודדת של המעיים (יום 9)
- פסו את 48 החיידקים המבודדים על צלחות אגר בודדות של 6 ס"מ LB וגדלו במשך 48 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
הערה: ניתן לגדל חיידקים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 24-36 שעות במידת הצורך מוקדם יותר, אך הגדילה הארוכה יותר של 20 מעלות צלזיוס מאפשרת לזהות מזהמים פוטנציאליים. - סנכרן מספר רב של C. elegans.
- אקונומיקה גרבדה תולעים בוגרות על ידי ביצוע שיטת הכנת הביציםהסטנדרטית 33 והעברת הביצים על שתי צלחות NGM לא מזוהמות בגודל 15 ס"מ למשך 24 שעות ב-15 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לכל זחלי L1 לבקוע ולגדול באופן סינכרוני בשלבים הבאים.
התראה: היזהר בעת טיפול בתמיסות אקונומיקה.
- אקונומיקה גרבדה תולעים בוגרות על ידי ביצוע שיטת הכנת הביציםהסטנדרטית 33 והעברת הביצים על שתי צלחות NGM לא מזוהמות בגודל 15 ס"מ למשך 24 שעות ב-15 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לכל זחלי L1 לבקוע ולגדול באופן סינכרוני בשלבים הבאים.
3. גידול תרבויות C. elegans גדולות (יום 10)
- לאחר הבקיעה, אספו את זחלי L1 (משלב 2.2.1.) ב-3-4 מ"ל של M9 בצינור חרוטי נקי של 15 מ"ל. שופכים ארבע טיפות של 10 μL של תמיסת תולעת על שקופית או צלחת וסופרים את מספר התולעים בכל טיפה תחת סטריאומיקרוסקופ בהגדלה של פי 16. קבע את ריכוז התולעים של התמיסה על ידי ממוצע מספר הזחלים מכל טיפות תמיסת התולעת. הכפל ערך זה בנפח שנותר והערך את ספירת התולעים הכוללת עבור כל זן.
הערה: 46,000-50,000 זחלי L1 לכל זן נדרשים בשלב זה כדי למלא מאוחר יותר צלחת של 384 בארות או שני חצאי צלחות.- עבור כל זן, העבירו את כל זחלי L1 לשני לוחות NGM בקוטר 15 ס"מ (23,000-25,000 L1 לצלחת) שחוסנו בעבר ב-3 מ"ל של OP50 (שלב 1.5.) ונזרעו מחדש עם 0.5 מ"ל של OP50 מרוכז.
- יש לדגום בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס, עם 0.5 מ"ל של OP50 מרוכז מדי יום לפי הצורך עד שהתולעים מגיעות לשלב L4.
הערה: שלב L4 מאופיין במעי מעט כהה יותר ובכתם לבן בצורת חצי דיסק או סהר שבו הפות ייווצר בסופו של דבר32,33. - הכינו 96 צלחות NGM-agarose לפי השלבים הבאים.
- הכינו שמונה צלחות NGM-agarose בעלות 96 בארות על ידי מילוי כל באר ב-125 μL של NGM-agarose (ארבע צלחות בכל בדיקה).
הערה: מומלץ לצלוח כמה צלחות נוספות אם חלקן מזוהמות בשלבים הבאים. שני קוראי לוחות יידרשו להריץ מבחנים במקביל, אך הם עשויים גם להיות מופעלים ברצף החל מבדיקת עקת החום מכיוון שניתן להריץ אותה במשך 6 שעות בלבד. עבור צלחות אלה, אגר אפר <4% מוחלף באגרוז (ראו טבלת חומרים), מה שמאפשר ייבוש איטי ואחיד יותר על פני תקעי ה-NGM ומפחית את מחילה של התולעים להתאוששות טובה יותר. - יש לוודא שהבארות מלאות באופן שווה וללא בועות. השתמש בלוק חום שנקבע על 70 °C (עם העברת חום איטית דרך הפלסטיק של צלחת multiwell, NGM-agarose יכול רק להתחמם עד כ 55-60 ° C) כדי למנוע את התערובת מלהתמצק במהלך התהליך. כדי להסיר בועות בתוך בארות, השתמש במחט סטרילית מחוממת להבה.
- אפשרו ללוחות 96 הבארות להתייצב בטמפרטורת החדר בסביבה סטרילית לפני ההיפוך (המכסה כלפי מטה למניעת עיבוי) ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בקופסה נקייה עד הצורך.
- הכינו שמונה צלחות NGM-agarose בעלות 96 בארות על ידי מילוי כל באר ב-125 μL של NGM-agarose (ארבע צלחות בכל בדיקה).
- ביום 11, בדוק את התולעים משלב 3.2., וודא שלא הופיעו זיהומים והתולעים עדיין גדושות.
- ביום 12, בדוק את התולעים משלב 3.1., וודא שלא הופיעו זיהומים והתולעים עדיין גדושות. כמו כן, בדקו את השלב ההתפתחותי של התולעים.
הערה: המין/זן והשלב ההתפתחותי של התולעת, כגון L4 או L4 + 24 שעות שבהן נעשה שימוש, תלויים בטיפולים שהתולעים עוברות. כאן, הרמפרודיטים מסוג בר נחשפו לחיידקים מבודדים מ-L4 במשך 36 שעות.
4. הכנת אוספי מיקרוביוטה מבודדים של המעיים להאכלה מחדש של תולעים
- עקוב אחר צמיחת חיידקים על לוחות אגר LB משלב 2.1. ולהמשיך לדגור ב 20 מעלות צלזיוס.
הערה: למרות שזה לא אידיאלי, במקרה שחלק מהשיבוטים אינם גדלים או חושפים זיהומים, חיידקים עשויים להיות מפוספסים מחדש ממלאי נקי על צלחות של 6 ס"מ LB ולגדל אותם בטמפרטורה של 25-28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי להיות מוכנים לניסוי. - הגדר מערך של 96 בארות עבור איסוף החיידקים הנבדקים, ואפשר זריעת צלחות שיטתית וניתוח נתונים בשלבים הבאים (טבלה משלימה 1).
- אסוף את מסת החיידקים מכל צלחת חיידקים בגודל 6 ס"מ (שלב 4.1.), והעבר אותה לצינור מיקרוצנטריפוגה מסומן בגודל 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של מאגר M9. בצע זאת באמצעות לולאת פלסטיק סטרילית חד-פעמית בקוטר 2 מ"מ או לולאת מתכת בקוטר 5 מ"מ. יש לעקר את לולאת המתכת בין זני חיידקים על ידי טבילה ב-100% אתנול, בעירה והתקררות למשך 5 שניות.
- מערבבים את צינורות המיקרוצנטריפוגה עד שכדורי החיידקים עוברים החייאה מלאה (בהתאם לזן החיידקים, זה עשוי לקחת ~ 1-10 שניות).
- סובבו מטה ב-9,300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, הסירו 700 μL של סופר-נטנט, ושתו מחדש את כדור החיידקים על ידי מערבולת.
- העבר 200 μL של כל תרחיף חיידקים לתוך באר אחת של צלחת סטרילית ריקה 96-well בהתאם לפריסה שנקבעה בשלב 4.2.
- מצלחת זו, יש לחסן שמונה צלחות NGM-agarose בעלות 96 בארות (שהוכנו בשלב 3.3.) עם 10 μL של תמיסת חיידקים באמצעות פיפטה רב-ערוצית ודגירה עם המכסה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. אין לאטום את הלוחות כדי לאפשר ייבוש צלחות וצמיחה אירובית חיידקית וכדי למנוע עיבוי עודף.
- אטמו את לוחית המתלים בעלת 96 הבארות שהוכנה בשלב 4.6. עם סרט איטום דבק נקי (ראו טבלת חומרים), ולאחסן בטמפרטורה של 15°C למשך עד 5 ימים. זה ישמש להזנה מחדש של תולעים לפי הצורך.
5. הלם חום LFASS ומערך בדיקה חמצונית (ימים 13 - 14)
- כשמסתכלים על הצלחות משלב 3.5., מעריכים את השלב ההתפתחותי של התולעים. לאחר ש->90% מהתולעים הגיעו ל-L434, אספו את התולעים בעד 10 מ"ל של תמיסת M9 סטרילית בצינורות חרוטיים של 15 מ"ל.
- שטפו את התולעים באופן נרחב (לפחות 4x) על ידי סיבוב בטמפרטורה של 142 x g למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, הסרת הסופר-נטנט והוספת 10 מ"ל של M9 סטרילי טרי בין כל שטיפה כדי להיפטר מחיידקי OP50. לתלות את כדור התולעת ב 10 מ"ל של M9.
- העבר 50 μL של תמיסת תולעת לתוך צינור קשירה נמוך פני השטח (ראה טבלת חומרים) המכיל 950 μL של M9. לאחר ערבוב עדין של תכולת הצינור כדי למנוע שקיעה של תולעים, השתמש במהירות בקצה פיפטה רטוב בעל קשר נמוך כדי להעביר 3-4 טיפות נפרדות של 10 μL על שקופית זכוכית או צלחת NGM, וספור מספרי תולעים תחת סטריאומיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים) בהגדלה של פי 16. ממוצע הספירות מ-3-4 הטיפות וקביעת מספר התולעים למיקרוליטר בתמיסת התולעת (ראה שלב 3.1.).
- התאם את ריכוז התולעים בצינור 10 מ"ל כדי להגיע ל~ 120 תולעים ב 8 μL. אם הפתרון הוכן בשלב 5.2. אינו מרוכז מספיק, סובב את התולעים כלפי מטה והסר M9 בהתאם כדי להגיע ל -120 תולעים לכל 8 μL.
- העבר 8 μL של תמיסת תולעת (~ 120 תולעים) לתוך כל אחת מהבארות של שמונה לוחות NGM-agarose 96-well משלב 4.7., באמצעות פיפט רב ערוצי או פיפט חוזר. הקפד להשתמש בעצות שמירה נמוכות כדי להגביל את אובדן התולעים. ייתכן שיהיה צורך גם לחתוך את קצוות הקצוות כדי לאפשר לתולעים בוגרות גדולות להגביל את הלחץ המכני על תולעים בוגרות.
הערה: הבדיקה דורשת מינימום של 30 תולעים בריאות חיות כדי לעבוד באופן אמין, אך פועלת בצורה הטובה ביותר עם כ-100 תולעים לכל באר. - דגרו את צלחות ה-NGM-agarose של 96 זרעים של תולעת וחיידק בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 36 שעות.
- בדקו את הצלחות בין 12-24 שעות, וודאו שהתולעים נשארות גדושות לאורך כל הדרך. אם יש צורך בהזנה חוזרת, יש להשעות את החיידקים בתוך צלחת מערך החיידקים של 96 באר המאוחסנת בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס בשלב 4.8., ולהוסיף עד 10 μL של התמיסה החיידקית המתאימה ללוחות NGM-agarose 96-well שבהם התולעים נמצאות בסיכון לרעב לפני תום תקופת הדגירה של 36 שעות (תולעים מורעבות יפיקו תוצאות שונות בתכלית, אז זה מאוד חשוב).
הערה: השלבים הבאים צריכים להתבצע ביום 15. לפני תחילת הבדיקה, ייתכן שיהיה צורך לייעל את גובה הקריאה. הקריאה האופטימלית תושג 20-50 מיקרומטר מעל תחתית הבאר. זה יהיה תלוי בדגם של קורא הלוחות. חלקם מציעים את האפשרות של סריקת Z, בעוד שאחרים מאפשרים קלט גובה ידני. הגדר את הגובה האופטימלי ברמה שבה מזוהה האות הפלואורסצנטי הכחול הגבוה ביותר (365 ננומטר/430 ננומטר). קוראי לוחות מסוימים עשויים לפעול בגובה קבוע הממוטב למבחני תא דבק וייתכן שאינם אידיאליים למבחני LFASS. - לאחר 36 שעות, יש לחלק 30 μL של M9 לתוך כל באר של צלחת 96 באר.
הערה: עבור מבחני לחץ תרמי, קורא הלוחות צריך להגיע לטמפרטורה הנדרשת לביצוע הבדיקה וייתכן שיהיה צורך להפעיל אותו מראש. הפרוטוקול הנוכחי משתמש ב-42 מעלות צלזיוס כדי למקסם את מהירות ההרג, אך הגישה חלה על טמפרטורות אחרות מעל 30 מעלות צלזיוס. - העבירו תולעים (כ-20 μL) לצלחת 384 הבאר בהתאם לפריסות שנקבעו, תוך שימוש בקצוות בעלי שימור נמוך (שקלו לחתוך את קצה הקצוות כדי לאפשר לתולעים גדולות להפחית את הלחץ המכני עבור תולעים בוגרות).
הערה: במחקר הנוכחי, שתי הגדרות שונות של קורא צלחות משמשות עבור שני המבחנים המתוארים כאן (עקה תרמית ועקה חמצונית), ולכן דגימות המיועדות לשני מבחנים אלה אינן חייבות להיות מצופות באותה צלחת 384 באר. - ודא שקוראי הלוחות מוגדרים כהלכה (טבלה 1).
- השלם את לוחות 384 הבאר עם יותר M9, בשאיפה לנפח סופי של 60 μL לכל באר. עבור בדיקת עקה תרמית, הוסף 40 μL של M9, ועבור עקה חמצונית הנגרמת על-ידי t-BHP, הוסף 34 μl של M9 ב- 6 μl של t-BHP (ראה טבלת חומרים).
- התחל את הבדיקה תוך 2 דקות מהוספת t-BHP (באופן אידיאלי, כל התולעים חייבות להיות חשופות ל- t-BHP בו זמנית, כאשר רזולוציית זמן הבדיקה היא 2 דקות). אם הדבר אינו אפשרי, השתמש בטיימר כדי להעריך את הזמן המושקע בצנרת t-BHP לפני תחילת הבדיקה כדי לאפשר התאמה מאוחרת יותר של זמן המוות החציוני.
- סגרו את הצלחות עם המכסה השקוף שלהן. אטמו את הקצוות של לוחות 384 בארות עם סרט מיסוך (הקשה על הצלחת והמכסה), כדי לוודא שהסרט לא יעבור מעל המכסה או מתחת לצלחת. חותכים את הסרט בין המכסה לצלחת במרווחי זמן באמצעות אזמל כדי לאפשר חילופי אוויר תוך מזעור האידוי במהלך הבדיקה.
- הכנס את הלוח לקורא הלוחות (ראה טבלת חומרים) והתחל את הריצה. יש לשאוף להלהיב במהירות של 365 ננומטר ולזהות פליטה ב-435 ננומטר כל 2 דקות למשך 6-12 שעות (טבלה 1).
הערה: בדרך כלל, 6 שעות מספיקות למבחני עקת חום של 42 מעלות צלזיוס ו-8 שעות למבחני עקה חמצונית של t-BHP ב-7%.
6. טיפול בנתונים של קורא צלחות
- שמור את נתוני הפלואורסצנציה הגולמיים מקורא הלוחות כתבניות .txt, .csv או .xls /.xlsx המופרדות באמצעות פסיקים או טאבים, ולאחר מכן המר לתבנית xls /.xlsx. בהתאם לתבנית הנתונים, ארגן אותם מחדש כך שיתאימו לפריסת גיליון Excel הדרושה לניתוח LFASS. בצע את ההוראות המפורטות המופיעות בהפניה30.
הערה: בעוד שניתן לנתח נתונים באופן ידני, לנרמל כל סדרת זמן ולחפש את הזמן שבו פלואורסצנטיות המוות מגיעה למחצית המקסימום, ניתוח אוטומטי יכול להתבצע ב- Matlab המפעילה את שגרת LFASS30. - הורד והתקן את Matlab (גרסה 2014a ומעלה) ואת חבילת התוכנה LFASS מבית https://github.com/ABA80/LFASS. עקוב אחר ההנחיות והביאורים המופיעים בו.
הערה: איור 1C נותן תיאור קצר של הגישה. Matlab נדרשת להפעיל את שגרת LFASS. לחלופין, ניתן לתרגם את קוד Matlab ל-Oracle, למעט פונקציית ההתאמה, שהיא קניינית. ניתן לשכתב פונקציות החלקה וסיגמואידים חדשות כדי לאפשר שימוש בפלטפורמת קוד פתוח לחלוטין. - בין ניתוחי LFASS, העבר את הנתונים והתוצאות למיקום חדש מכיוון שניתוח LFASS יעבד את כל הקבצים בתיקיית הנתונים ויחליף קבצים בתיקיה 'תוצאות'.
7. בדיקת נתונים
- פתח את קובץ האקסל ותייג את השורות בהתאם למיקום הבאר בלוח 384 הבאר. קובץ משלים 2 מציג דוגמה לקובץ האקסל של נתוני הפלואורסצנציה הגולמיים שנוצרו עבור בדיקת הלם החום. השתמש במיקום הבאר על צלחת 384-well כדי לסמן את התולעת ואת זני החיידקים.
- לפני ניתוח Matlab, בדוק חזותית את הנתונים באקסל, והתווה עוצמת פלואורסצנטיות לאורך זמן עבור באר מייצגת. בהתאם לקורא הצלחות שבו נעשה שימוש, הנתונים עשויים להיות רועשים אך אמורים להציג שיא ברור. בפרט:
- קבע ערך פלואורסצנטי שמתחתיו שיא לא יהיה שונה באופן משמעותי מרעש (קביעת סף כזה ב- LFASS תאיץ את הניתוח על ידי אי הכללת בארות ריקות).
- שימו לב לנקודת הזמן המוקדמת ביותר שבה תנודות פלואורסצנטיות נרגעות לפני העלייה (בעלי חיים עשויים לדהור במרץ במשך עד 30 דקות, מה שמוביל לתנודות מהירות של קריאות פלואורסצנטיות כחולות).
הערה: ניתן לשפר את התאמת השיא על-ידי אי-הכללת נקודות זמן מוקדמות אלה מחלון התאמת העקומה. - שים לב לנקודות הזמן שביניהן צפויים לרדת ערכי פלואורסצנציה מינימליים ומקסימליים (עיין במספר בארות כדי לזהות טווחים אלה) מכיוון שהם ישמשו להתאמת עקומות.
- בדוק אם המשרעת של פסגות הפלואורסצנציה משתנות באופן משמעותי בין הבארות, לנרמל את הנתונים לפני ניתוח נוסף באמצעות הנוסחה הבאה:
פלואורסצנציה מנורמלת היטב n (t) = (פלואורסצנציה היטבn [t] - מינימום פלואורסצנציה היטב [Dt]) / (פלואורסצנציה מקסימלית היטב [Dt] - מינימום פלואורסצנציה היטב [Dt])
כאשר "n" הוא מספר הבאר הנוכחי, "t" הוא נקודת הזמן, ו- "Dt" היא סדרת נקודות הזמן עבור הבדיקה.
8. עיבוד נתונים LFASS
הערה: הפרטים מופיעים https://github.com/ABA80/LFASS ובחומרים המשלימים של הפניה30.
- צור שתי תיקיות משנה בתוך תיקיית LFASS, אחת לניתוח הנתונים ואחת לתוצאות, לדוגמה, "הנתונים שלי" ו"תוצאות ".
- העתק את קובץ הנתונים של Excel לבדיקת תיקיית המשנה LFASS "הנתונים שלי" לאחר בדיקת נתונים.
- הפעל את MATLAB, נווט לתיקיית LFASS , הקלד והפעל את fitfolder בחלון הפקודה (קובץ משלים 3). לאחר מכן בצע את ההוראות המופיעות על המסך.
- לאחר הקלדת "fitfolder", המערכת מבקשת את שם התיקייה שבה נמצא קובץ ה- Excel, לדוגמה, 'הנתונים שלי'. הקלד את שם תיקיית הנתונים שלך (בדוגמה זו, "הנתונים שלי").
- בצע את ההוראות המופיעות על המסך, וספק את הפרמטרים השונים המבוקשים.
- הזן "2" עבור מרווח הזמן בין מדידות עוקבות בפרוטוקול הנוכחי (ציון זה מאפשר לבטא את התוצאות בדקות במקום ביחידות נקודת זמן).
הערה: ניתן לשנות את מרווח הזמן כדי לבצע מדידות פלואורסצנטיות בתדירות גבוהה יותר או פחות (כדי להקטין או להגדיל את רזולוציית הזמן) וגם בהתאם ליכולות קורא הלוחות (כלומר, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את מרווח הזמן עבור קוראי לוחות שאינם יכולים לבצע מדידות מהירות מספיק). הקפידו תמיד להתאים את מרווח הזמן הניסיוני לשגרת LFASS. - הקצה את סף הסבילות העליון על ידי הקלדת "0.95" (ניתן לשנות זאת לפי הצורך כדי לשפר את ההתאמה) ואת סף הסבילות התחתון על ידי הקלדת "0.05" (ניתן לשנות זאת לפי הצורך כדי לשפר את ההתאמה) כדי להגביל את ההתאמה הסיגמואידית.
הערה: פרמטרי זמן אחרים מבוססים על הערות משתמש מבדיקת הנתונים (שלב 7.2.).
- הזן "2" עבור מרווח הזמן בין מדידות עוקבות בפרוטוקול הנוכחי (ציון זה מאפשר לבטא את התוצאות בדקות במקום ביחידות נקודת זמן).
- בחר אם להציג או לא להתאים ולהחליק עקומות על-ידי הקלדת "y" עבור YES או "n" עבור NO כאשר תתבקש לעשות זאת. כדי לבדוק חזותית את ההתאמות המתכנסות, בחר את הראשונה.
הערה: האחרון שימושי כדי להציג באופן חזותי את כל הנתונים שהוחלקו, אך בדרך כלל אינו נבחר מכיוון שהוא יוצר יותר מדי גרפים נפתחים. בעקבות זאת, Matlab תבצע את שגרת LFASS, שעשויה להימשך 1-10 דקות אם מספר קבצי אקסל מעובדים בבת אחת. חלונות קופצים עם עקומות יופיעו בהתאם לבחירה בשלב 8.6. קובץ משלים 4A מציג דוגמה לעקומה מותאמת. - בחר אם (1) לנתח עקומות המזוהות כרעש או (2) להתאים מחדש עקומות שאינן מותאמות היטב עם אפשרות [y/n]. הקלד y כדי לאשר ו - n כדי לדחות.
הערה: מומלץ לאשר התאמה מחדש, במיוחד אם יש הרבה עקומות לא מותאמות או לא מותאמות. זה יאפשר למשתמש לספק פרמטרים מותאמים להתאמת עקומה עבור כל עקומה כפי שהם מופיעים על המסך ולבקש רק גבולות מוקדמים ומאוחרים יותר עבור ההתאמה הסיגמואידית. ניתן לנסות זאת כמה פעמים שנדרש. - לאחר ניתוח הנתונים, סגור את Matlab ופתח את תיקיית LFASS .
- לחץ על תיקיית המשנה LFASS התוצאות שלי, מכיוון שקבצי התוצאות נשמרים באופן אוטומטי בתיקיה תוצאות כ- .txt.
הערה: Matlab יוצר שלושה קבצים .txt: "מותאם אצווה.txt", "אצווה ורעש מותאם.txt", ו "Refited.txt". שני הראשונים נשמרים כאמצעי זהירות במקרה של קריסת מחשב או שגיאת משתמש במהלך ההתאמה מחדש. הקובץ המכיל את הניתוח המלא המדויק ביותר הוא "Refitted.txt". - פתח את הקובץ מחדש.txt באמצעות Microsoft Excel ושמור כ- .xls לעיבוד נוסף. קובץ משלים 4B מציג דוגמה לקובץ תוצאות כזה.
הערה: עבור כל באר (מאורגנת בשורות), שלושה ערכים מסופקים בעמודות הנותנות אומדנים של זמן המוות החציוני של אוכלוסיית התולעים: "Raw": מדווח על הזמן המצטלב בחצי המקסימום של שיא הנתונים הניסויי; "מותקן אצווה": מדווח על הזמן להצטלב בחצי המקסימום של העקומה המותאמת לאצווה; "Refitted": מדווח על הזמן להצטלב בחצי המקסימום של העקומה המחודשת. - שמור את הקובץ בתבנית .xls כעותק במיקום בטוח. אם לא תעשה זאת, תסתכן בהחלפת הקבצים במהלך ההפעלה הבאה של שגרת LFASS.
הערה: לאחר מכן ניתן לעבד את התוצאות עוד יותר לצורך גרפים או ניתוח סטטיסטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מבחני LFASS מספקים סינון חזק, בעל תפוקה גבוהה ומהירה של תנאי בדיקה מרובים בו-זמנית, כגון סינון פרמטרים גנטיים ומיקרוביוטה רבים התורמים לעמידות ללחץ ולהזדקנות. לוקח רק 2-3 שבועות עד שהניסוי מקבל מערך נתונים נרחב של תנאי בדיקה מרובים. L4 + 36 שעות אוכלוסיות תולעי בר בוגרות נחשפו לעקה תרמית של 42 מעלות צלזיוס ול-7% עקה חמצונית הנגרמת על-ידי t-BHP לאחר תרבית של 36 שעות על 48 מבודדים מיקרוביאליים של המעיים במשך 36 שעות. הבדיקה בוצעה ארבע פעמים, כאשר כל תנאי שוכפל ארבע פעמים בכל בדיקה. בכל התנאים שנבדקו, זמן המוות החציוני נע בין 40-130 דקות עבור בדיקת העקה התרמית ובין 90-240 דקות עבור בדיקת העקה החמצונית המושרה על ידי t-BHP. מבחני עקה תרמית בבגרות מוקדמת מציגים בדרך כלל תוצאות עקביות יותר ופחות השתנות בין יום ותוך יום מאשר מבחני עקה חמצונית והם מנבאים טוב יותר לאריכות ימים לאחר מכן30. ההבדל בזמן המוות החציוני של תולעים הניזונות מדיאטות מיקרוביאליות שונות מדגים באופן חד-משמעי כיצד קומנסלים במעיים משפיעים על עמידות המארחים ללחץ. איור 2 מראה תוצאות אופייניות מ-16 שכפולים ביולוגיים עבור תולעים מסוג בר מסוג Bristol N2 על שני מבודדי מיקרוביוטה של המעיים המעניינים, וזן המעבדה הסטנדרטי E. coli OP50.
איור 2: תוצאות מייצגות של מבחני עמידות לחום/עקה חמצונית מזווגים מתולעים שגודלו על שני חיידקים מבודדים וזן בקרה . (A) בדיקת עקת חום. תולעים מסוג בר הוזנו במשך 36 שעות על חיידקי MYb11 (Pseudomonas lurida) או MYb115 (Pseudomonassp.) או חיידקי בקרה OP50. MYb11 הוביל לזמן חציוני מוקדם משמעותית של המוות (p < 0.001). (B) בדיקת עקה חמצונית. תולעים מסוג בר ניזונו במשך 36 שעות מחיידקי MYb11 או MYb115 מבודדים או מחיידקי בקרה מסוג OP50. MYb11 הוביל לזמן מוות חציוני מוקדם משמעותית (p < 0.05). 120-150 תולעים נותחו בארבע קבוצות של דגימות, וכל ניסוי בוצע בריבוע. בארות עם נתונים באיכות ירודה / מותאמים בצורה גרועה הובילו לערכים חסרים. ייצוגי התוויית תיבה מציינים ערכי באר בודדים, ערכי מינימום, חציון ומקסימום. *מציין מובהקות סטטיסטית ב- p < 0.05 ו - ***p < 0.001, עם ANOVA חד-כיווני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| A | |||
| פרמטר | הגדרה | תגובה | |
| טמפרטורה | 25 מעלות צלזיוס | ||
| עירור פלואורסצנטי | 365 נאנומטר | רוחב פס של 10 ננומטר | |
| פליטת פלואורסצנציה | 430 נאנומטר | רוחב פס של 20 ננומטר | |
| מספר הבזקים | 8 הבזקים, זמן שקיעה של 1ms | ||
| לקבל | 100 עד 130 | יש להתאים בהתאם למדגם. שאיפה לערך קריאה של 2-5 k בתחילת הבדיקה | |
| זמן השהיה | 1 מיקרון | ||
| זמן אינטגרציה | 30 מיקרון | ||
| מרווח זמן קריאה | כל 2 דקות | בהתאם לחומרת הלחץ, משך הזמן ומרווח הזמן עשויים להזדקק להתאמה (8 שעות מספיקות ב-7% t-BHP) | |
| משך | 8-12 שעות | ||
| קרא את הכיוון | מלמטה | ||
| B | |||
| פרמטר | הגדרה | תגובה | |
| טמפרטורה | 42 מעלות צלזיוס | ||
| עירור פלואורסצנטי | 365 נאנומטר | רוחב פס של 10 ננומטר | |
| פליטת פלואורסצנציה | 430 נאנומטר | רוחב פס של 20 ננומטר | |
| מספר הבזקים | 8 הבזקים, זמן שקיעה של 1ms | ||
| לקבל | 100 עד 130 | יש להתאים בהתאם למדגם. שאיפה לערך קריאה של 2-5 k בתחילת הבדיקה | |
| זמן השהיה | 1 מיקרון | ||
| זמן אינטגרציה | 30 מיקרון | ||
| מרווח זמן קריאה | כל 2 דקות | בהתאם לחומרת הלחץ, משך הזמן ומרווח הזמן עשויים להזדקק להתאמה (6 שעות מספיקות ב-42 מעלות צלזיוס) | |
| משך | 6-12 שעות | ||
| קרא את הכיוון | מלמטה | ||
טבלה 1: הגדרות בדיקה של חמצון ועקה חום. דוגמאות להגדרות המשמשות למבחני עקה חמצוניים (A) וחום (B) על קוראי לוחות פלואורסצנטיים ששימשו במחקר זה.
קובץ משלים 1: מדיה, מאגר ומתכוני תרבות. הרכב של מדיות, מאגרים ותרבויות שונות המשמשות במחקר הנוכחי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: נתוני פלואורסצנציה גולמיים מקורא הלוחות לאחר ייצוא והמרה לתבנית Excel .xls. (A) קובץ האקסל מציג את נתוני הפלואורסצנציה הגולמיים עבור בדיקת הלם חום. נתוני פלואורסצנציה גולמיים מוצגים במרווח זמן של 2 דקות. (B) העמודה עם "מיקום טוב" על צלחת 384 באר מודגשת, אשר ניתן להשתמש בה כדי לסמן את התולעת ואת זני החיידקים. (C) הקובץ מסומן בזני תולעים וחיידקים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 3: ניתוח LFASS באמצעות Matlab. (A) לאחר פתיחת תיקיית LFASS ב- Matlab, צץ חלון פקודה. (B) "fitfolder" מוקלד בחלון הפקודה כדי להפעיל את התוכנית, ושם התיקיה עם הקובץ לניתוח מצוין. (C) לאחר שהתוכנית מוצאת את קובץ האקסל של הנתונים לניתוח, על המשתמש לעקוב אחר ההוראות שעל המסך, תוך מתן הפרמטרים השונים המבוקשים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 4: ניתוח נתוני LFASS באמצעות Matlab. (A) דוגמה לעקומה המותאמת באמצעות ניתוח Matlab, כאשר הקו השחור מציין את נקודת הזמן המתאימה לגבול הזמן המוקדם יותר ואת הקו הכחול את גבול הזמן המאוחר יותר עבור התאמת העקומה. עקומת הסיגמואיד המותאמת מוצגת באדום. (B) קובץ התוצאות שנוצר על ידי Matlab נפתח בפורמט .xls. הערכים מודגשים ומוצגים בתבנית מספר. העמודה השנייה מספקת את הזמן שבו הערך בעקומת הנתונים הגולמיים עולה לראשונה על 50% מהערך המרבי. העמודה השלישית מספקת את הזמן שבו ערך העקומה המותאמת שווה ל- 50% מהערך המרבי, כפי שנקבע במהלך ניתוח התאמת האצווה. העמודה הרביעית מספקת את הזמן שבו הערך בעקומה המותאמת שווה ל- 50% מהערך המרבי לאחר ניתוח אצווה והתאמה מחדש סופית במידת הצורך. העמודה הרביעית צריכה, אם כן, לספק את התוצאה האמינה ביותר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 1: פריסות לוחות ניסיוניות לדוגמה. (A) פריסת לוחות 96 בארות לבדיקת 47 חיידקי מיקרוביוטה שונים של מעי תולעים מבודדים על שני זני תולעים נפרדים, כאשר OP50 חי משמש כבקרה. ארבעה עותקים של לוח זה נדרשים עבור כל בדיקה המופעלת. (B) פריסת באר 384 עבור מבחני חום או עקה חמצונית, המתאימה לבדיקת הלוחות הקודמת של 96 בארות ב-(A). התקנה זו מאפשרת לבצע טטרפליקטים עבור כל מצב, כאשר לכל זן תולעת יש בקרת OP50 משלו. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegans מציעה יתרונות רבים לסינון מהיר של מספר פרמטרים ניסיוניים בו זמנית, בשל גודלה הקטן, השקיפות, הפיתוח המהיר, תוחלת החיים הקצרה, הזולות וקלות הטיפול. הגנום, תוכנית הגוף, מערכת העצבים, המעיים והמיקרוביום הפשוטים הרבה יותר, אך מורכבים ודומים מספיק לבני אדם, הופכים אותו למודל פרה-קליני רב עוצמה, שבו ניתן להשיג תובנה מכניסטית תוך בדיקת יעילות ביו-אקטיבית או רעילות. ככל שגובר העניין בפיתוח התערבויות מיקרוביאליות למחלות 8,9,34,35, ניצול מודלים פרה-קליניים כאלה כדי לחקור במהירות פרוביוטיקה הוא אופציה אטרקטיבית עם הפוטנציאל הטיפולי הבלתי מנוצל והכמעט בלתי מוגבל של מיקרובים 34. הפרוטוקול המתואר כאן מתאים לחקר ההשפעה של חיידקים סביבתיים על בריאות C. elegans, אך ניתן להתאים אותו בקלות למטרות אחרות.
צדדיות
ניתן להתאים את ה"מודולים" השונים המרכיבים צינור זה כך שיתאימו לדרישות הספציפיות לניסוי או למעבדה. לדוגמה, ניתן להחליף חיידקים מבודדים בתערובות חיידקים, מוטציות חיידקיות או חיידקים מייצרי RNAi, וניתן להשתמש במערך כדי לסנן גנים חיידקיים המעורבים באינטראקציות בין חיידקים מארחים, לסנן גנים מארחים המעורבים בעמידות ללחץ, או לחקור את ההשפעה של מיקרובים בודדים כחלק מקהילות חיידקים מוגדרות. שיטה זו מתארת סריקה של מספר חיידקים מבודדים על רקע גנטי של תולעת אחת. עם זאת, הבדיקה ניתנת להרחבה, וניתן לחקור מספר גנוטיפים של מארחים וחיידקים בבת אחת. ניתן לשלב זאת גם עם טיפולים תרופתיים דיפרנציאליים ו/או משטרי תזונה כדי לקבל תובנה לגבי אינטראקציות בין גנים לחיידקים פונדקאים.
הפרוטוקול עדיין לא נוסה על מיני נמטודות אחרים, אך הוא צריך להיות ישים ישירות גם על C. remanei ו- C. briggsae, והוא עשוי לחול על מיני נמטודות טפיליות בשלב L3 החולקות תכונות מורפולוגיות, גודל ומוות פלואורסצנטיות עם C. elegans30. לבסוף, ניתן להשתמש בגורמי לחץ אחרים (juglone, paraquat, arsenate, טמפרטורות אחרות) באותו צינור כדי לספק מידע משלים או מאשר.
אתגרים פוטנציאליים
השקעת הזמן עד היום ה-12 לגידול תולעים וחיידקים לפני הבדיקות היא משמעותית, אך בשל התפוקה של הגישה, היא עולה בהרבה על רוחב הנתונים שנאספו. עם זאת, הקפדה על תכנון מבחנים כאלה חיונית כדי למנוע בזבוז זמן על ידי חזרה על שלבי ההכנה מכיוון שהחומרים אינם אופטימליים עד שהמבחנים יכולים להתחיל. הבעיות המוקדמות העיקריות כוללות זיהום דגימות (תולעים או חיידקים), אוכלוסיות תולעים לא מסונכרנות היטב, ומחסור בחומרים (אוכלוסיות תולעים אוכלות את המזון שלהן מהר מהצפוי ומאכילות מחדש או מעבירות בעלי חיים לעתים קרובות יותר מהמתוכנן).
הימנעות מזיהום
בשל היקפו ומשך הזמן של הפרוטוקול, בעיה פוטנציאלית מרכזית אחת היא זיהום על ידי פטריות וחיידקים, שהתרחשותם בהחלט תבלבל את התוצאות. המערך האידיאלי הוא, אם כן, חלל מעבדה ייעודי ממוזג ומסונן ללא זרימת אוויר ישירה מעל ספסל הניסוי, תוך שימוש בחומרים מתכלים סטריליים. עם זאת, שמירה על נהלי ניקוי קבועים (פירוק ספסלים לפני ואחרי העבודה, ניקוי קופסאות צלחות ושימוש בחומרים מתכלים סטריליים) ועבודה ליד להבה בחלל מכיל (הימנעו ממסדרונות, חללים ליד דלתות פתוחות וחלונות) מספיקים בדרך כלל כדי לשמור על סביבה נקייה. אם מתרחשים זיהומים קלים לפני הכנת הביציות בשלב 2.2.1., הליך ההלבנה יטפל בהם, והפרוטוקול יכול להתקדם כמתוכנן. לעומת זאת, זיהומים המשפיעים על אוכלוסיית התולעים הגדלה לפני העברתם לצלחות חיידקי בדיקה יסמלו את סופו של ניסיון זה, ויהיה צורך להפעיל מחדש את הפרוטוקול משלב 1. זיהומים מאוחרים יותר נוטים להשפיע על זני חיידקים בודדים או על תנאי בדיקה. בהתאם להיקף שלהם, זה עשוי להיות שווה להמשיך או להפעיל מחדש את הפרוטוקול.
סינכרון תולעת
כאשר העמידות בפני אתגרים תרמיים וחמצוניים משתנה כאשר תולעים מתפתחות וגדלות, לא ניתן להשוות בקלות תנאי בדיקה שמובילים לשלבי התפתחות שונים עד לביצוע בדיקות LFASS. חיוני להניב אוכלוסיות מסונכרנות היטב עבור מבחני נקודות קצה. מכיוון שהבדיקות מבוצעות על תולעים שנאספו בתפזורת בשלבים L4 או L4 + 48 שעות, בהיעדר סדרן תולעים או הליך מיון אחר לאיסוף תולעים בשלבים מושלמים, אוכלוסיות התולעים חייבות להיות מסונכרנות היטב ב- L1. יש לוודא כי האבקועים נשמרים מחוץ למזון מספיק זמן כדי שכל הביצים החיות יבקעו לפני גידול קבוצת הבדיקה (>15 שעות ב-20 מעלות צלזיוס ו->18 שעות ב-15 מעלות צלזיוס). גנוטיפ עשוי להשפיע על ההתפשטות בתזמון ההתפתחותי, המושפע גם מהטמפרטורה. אוכלוסיות תולעים גדלות בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס נותנות שליטה טובה יותר על כך תוך הגבלת ההשפעה של מוטציות רגישות לטמפרטורה בשלב התרחבות אוכלוסיית התולעים (במיוחד כאשר עובדים עם מוטציות איתות אינסולין). הסיבה העיקרית לחקור את ההשפעות של מיקרובים מ-L4 או L4 + 48 שעות היא לעקוף את ההשפעה ההתפתחותית של תזונה שונה ולחקור את ההשפעה של חיידקי מעיים חיים ולא את השפעתם על התזונה. תולעים שגדלו בשלב זחל מוקדם יותר על חיידקים מבודדים או תערובות שונות יובילו בהכרח לקצב התפתחות לא אחיד ולאובדן סינכרוניזציה.
ההשלכות של הסתמכות על פלואורסצנציה כחולה
היכולת לאתר מוות במבחני LFASS ללא צורך במעקב אחר תולעים בודדות או ריאגנטים נוספים כגון Sytox green36, אלא ניצול אות אנדוגני בטווח פלואורסצנטי שלא סביר שיחפוף עם סמנים ביולוגיים מסורתיים של תולעים, היא יתרון ברור. עם זאת, עדיין חיוני להבטיח שניתן יהיה לזהות באופן עקבי פלואורסצנטיות של מוות מתולעים בתנאי בדיקה רבים. בעוד שהבדיקה אינה מסתמכת על כימות פלואורסצנטי אלא על הדינמיקה שלה, פלואורסצנטיות מספקת עדיין צריכה להיפלט על ידי התולעים כדי להעריך את זמן המוות החציוני (TOD) במדויק. מכיוון שהמבחן אינו מאפשר פתרון של מוות מתולעת בודדת, התפרצויות הפלואורסצנטיות הכחולות הנפלטות על ידי אנשים גוססים צריכות להיות בעלות חפיפה זמנית מספקת עבור הצטברות פלואורסצנטית כדי לתת שיא פלואורסצנטי של אוכלוסייה אחת. רק אז ניתן להסיק במדויק את ה-TOD החציוני. משמעות הדבר היא שתולעים שאינן מסוגלות לייצר רמות מספיקות של פלואורסצנציה כחולה אינן יכולות לשמש בפרוטוקול זה, הכולל בעיקר כמה מוטנטים של מסלול הקינוריינין כגון tdo-2 ו- kynu-130,31, כמו גם בעלי חיים מורעבים. לכן, חשוב לוודא שהתולעים נשמרות בתנאים גדושים לאורך כל הדרך. זה יכול להוות בעיה במיוחד בעת ביצוע מסכי RNAi מונעי HT115 מכיוון שמדשאות HT115 על מדיום NGM בתוספת IPTG ואנטיביוטיקה נוטות להיות דקות יותר ממדשאות OP50. ניטור אספקת המזון של התולעים בימים המובילים לבדיקות הוא, אם כן, קריטי.
תוצאה נוספת של הדינמיקה של פלואורסצנציית המוות היא שככל שהבדיקה מהירה יותר, כך הרגישות טובה יותר, שכן תולעים מאותה אוכלוסייה ימותו באופן סינכרוני יותר וייצרו שיא פלואורסצנטי מוגדר יותר של מוות באוכלוסייה. לכן, ככל שהבדיקה ארוכה יותר, כך גודל האוכלוסייה היה גדול יותר כדי ליצור פסגות פלואורסצנטיות טובות של מוות. מוטנטים עם חילוף חומרים נמוך, כגון eat-2 ו- daf-230, גם יחלקו פחות פלואורסצנטיות וידרשו מספרים גבוהים יותר לכל באר. בעוד ש-10-15 תולעים מסוג בר לכל באר מספיקות לבדיקת עקה תרמית של 42 מעלות צלזיוס שהורגת את כולן תוך 4 שעות, כמות כמעט כפולה זו נדרשת עבור תולעי daf-2(e1370) באותה בדיקה, ו->100 תולעים מסוג בר נדרשות לבדיקה שתהרוג תולעים במשך תקופה של 24 שעות.
בהקשר של איזולטים של חיידקים סביבתיים, חילוף חומרים מיקרוביאלי שונה יכול גם להשפיע באופן דיפרנציאלי על מסלול הקינוריינין שמייצר את התרכובות הפלואורסצנטיות הכחולות. לפיכך, חלק מהחיידקים המבודדים מובילים לפלואורסצנטיות נמוכה יותר של מוות בשיא, בעוד שאחרים מובילים לפסגות גבוהות יותר מ-OP50. כתוצאה מכך, יש לשאוף למספיק תולעים לכל באר כדי להכיל את כל המקרים.
לבסוף, אופטימיזציה נכונה של פרמטרים לקריאת לוחות היא חיונית. פרוטוקול זה מכסה את ההגדרה של פרמטרים של עירור ופליטה פלואורסצנטית ואת העומק שבו יש לבצע קריאות באופן אידיאלי. עם טווח רחב של תפוקות פלואורסצנטיות מוות על פני תנאים מרובים בבדיקה אחת, חשוב לוודא כי אותות חלשים מזוהים אך גלאים לעולם אינם רוויים. מכשירים עם גלאים המתהדרים בטווחים דינמיים גבוהים יבצעו, אם כן, ביצועים טובים יותר.
מגבלות השיטה
השיטה המתוארת כאן היא חזקה וגמישה וניתנת להתאמה בקלות לתנאים שונים. מטעמי נוחות, הגבלות ומגבלות מרכזיות מוזכרות לאורך הפרוטוקול שבו הן נכנסות לתמונה. בקצרה, ההסתמכות על פלואורסצנטיות המוות כסמן אנדוגני למוות היא גם חוזק וגם מגבלה של מבחנים אלה.
תחת מספר מוגבל של מצבים תזונתיים ספציפיים (דיאטות טריפטופן נמוכות או רעב) ובתנאים מוטנטיים המשפיעים על חילוף החומרים של טריפטופן (כלומר, tdo-2, kynu-1, כמה אללים daf-2 ), פלואורסצנטיות המוות (DF) עשויה להיות מוחלשת מאוד, עד כדי כך שקשה לזהות את שיא הפלואורסצנציה והערכות TOD פחות אמינות.
לעומת זאת, מיקרובים מסוימים עשויים לייצר תרכובות פלואורסצנטיות כחולות שספקטרום העירור והפליטה שלהן חופפים לאותות DF (כלומר, Enterococcus faecalis). בעוד שהדינמיקה שלהם שונה מה-DF ולעתים קרובות ניתן לנתק אותה, הם עלולים לבלבל את הניתוח.
לאחר מכן, הבדיקות מסתמכות על הצטברות של אותות מתולעים בודדות גוססות, אך DF מרווה עם הזמן. לפיכך, אם תולעים מתות רחוק מדי זו מזו, פסגות פלואורסצנטיות בודדות לא יצליחו לייצר שיא אוכלוסייה, מה שימנע מדידה של TOD חציוני אוכלוסייה. ככל שהבדיקה הורגת לאט יותר, כך מספר התולעים הנדרש בכלבאר 30 גבוה יותר. לפיכך, 10-15 תולעים בוגרות לכל באר מספיקות לבדיקת עקת חום של 42 מעלות צלזיוס שהורגת מחצית מהתולעים תוך שעתיים, אך יותר מ-70 תולעים לכל באר נחוצות לבדיקה חיידקית שהורגת מחצית מהתולעים תוך 12 שעות.
לבסוף, משתמשים זקוקים לגישה לקורא לוחות כדי לבצע מבחנים כאלה שיכולים לבצע מדידות פלואורסצנטיות בהילוך מהיר באורכי הגל הנדרשים. אורכי גל של עירור ופליטה עשויים גם להשתנות מעט בין מערכות ולהשתנות בין מיני נמטודות, כאמור30.
השוואה והשלמה עם מבחני C. elegans אחרים
במהלך 10-15 השנים האחרונות, מבחנים רבים פותחו כדי להעריך את בריאות C. elegans במצבים מרובים בבת אחת, תוך שימוש במגוון אסטרטגיות והצעת רמות שונות של עומק נתונים ורוחב 30,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46. מספר מבחנים רבי עוצמה פותחו באופן בולט כדי לנטר באופן אוטומטי תולעים רבות בו-זמנית על מדיה מוצקה לאורך תוחלת החיים שלהן, באמצעות מערכי מצלמות וסורקים עם אלגוריתמים למעקב אחר תולעים מרובות ו/או מערכי תולעים בודדים מיקרו-פבריים 37,38,39,40,41,43 . בהקשר של אינטראקציות בין חיידקים מארחים, גישות דומות לפרוטוקול שתואר לעיל, אך לא בהסתמך על DF, אפשרו גם סריקת RNAi כלל-גנומית של גנים של C. elegans המעורבים בזיהומים חיידקיים46,47,48. עם זאת, בדיקות אלה בעלות תפוקה גבוהה מסתמכות על טיפול בתולעים בנוזל לכל אורכו, דבר שאינו רצוי כאשר מתמודדים עם סוגי חיידקים מרובים בו-זמנית בשל הסיכונים המוגברים לזיהום צולב ומכיוון שתרבית נוזלית משפיעה על חילוף החומרים של המארחים והמיקרוביאלים. לפיכך, במבחני זיהום מסורתיים, מתח, תוחלת חיים ואריכות ימים, C. elegans מתוחזקים ומתיישנים על מדשאות חיידקים הגדלים על מדיה מוצקה. כפי שקורה גם בפרוטוקול זה, תוצאות ממסכים שבוצעו עם צינור זה יכולות להיות קשורות בקלות רבה יותר ולחזות את התוצאות של ניסויים מאשרים במורד הזרם עם להיטים במסך.
היתרונות של גישת LFASS עצמה כוסו היטב בהתייחסות30. בהשוואה לתצורות הדמיה רציפה משוכללות יותר שניתן לשנות את ייעודן למחקרים דומים, LFASS זול יותר (בתנאי ש-TOD חציוני הוא הקריאה היחידה הדרושה), והפשטות שלו פירושה שהוא אינו דורש יכולת טכנית רבה או ציוד מיוחד. LFASS עוסק בעיקר ברוחב על פני עומק. נתוני LFASS אינם מספקים מידע מלבד זמן המוות החציוני של אוכלוסיית תולעים וקריאה עקיפה של פלט מסלול קינורנין. לעומת זאת, עם תפוקה נמוכה יותר אך עדיין סבירה, ניתן למדוד תכונות מורכבות ממבחנים אחרים 37,38,39,40,41,43 לאורך כל תוחלת החיים של תולעים, מה שהופך אותן לגישות מצוינות במורד הזרם לחקר פגיעות ממסך LFASS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ל- CGC מינסוטה (מדיסון, ארה"ב, NIH - P40 OD010440) על אספקת זני תולעים ו- OP50 ו- Pr. Hinrich Schulenburg (CAU, קיל, גרמניה) על אספקת כל המבודדים המיקרוביאליים הסביבתיים המתוארים כאן. עבודה זו מומנה על ידי מענק UKRI-BBSRC ל-AB (BB/S017127/1). JM ממומן על ידי מלגת דוקטורט FHM של אוניברסיטת לנקסטר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm diameter plates (Non-vented) | Fisher Scientific | 10720052 | Venting is not necessary for bacterial cultures |
| 15 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 168381 | |
| 384-well black, transparent flat bottom plates | Corning | 3712 or 3762 | Not essential to be sterile for fast stress assays |
| 6 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 150288 | Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia |
| 96-well transparent plates (Biolite) | Thermo | 130188 | |
| Agar (<4% ash) | Sigma-Aldrich | 102218041 | Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
| Avanti Centrifuge J-26 XP | Beckman coulter | ||
| Bleach | Honeywell | 425044 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| LB agar | Difco | 240110 | |
| LB broth | Invitrogen | 12795084 | |
| LoBind tips | VWR | 732-1488 | Lo-bind reduce worm loss during transfers |
| LoBind tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M/1100/53 | |
| Plate reader- infinite M nano+ | Tecan | Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used | |
| Plate reader- Spark | Tecan | ||
| Potassium phosphate monobasic | Honeywell | P0662 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S/3160/63 | |
| Stereomicroscope setup with transillumination base | Leica | MZ6, or M80 | Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast |
| t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide) | Sigma-Aldrich | 458139 | |
| Transparent adhesive seals Nunc | Fisher Scientific | 101706871 | It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays. |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | 1278-7099 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422 |
References
- Krishna, S., et al. Integrating microbiome network: establishing linkages between plants, microbes and human health. The Open Microbiology Journal. 13, 330-342 (2019).
- Amon, P., Sanderson, I.
- Belkaid, Y., Harrison, O. J.
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
- Vaga, S., et al. Compositional and functional differences of the mucosal microbiota along the intestine of healthy individuals. Scientific Reports. 10 (1), 14977 (2020).
- Nagpal, R., et al. Gut microbiome and aging: Physiological and mechanistic insights. Nutrition and Healthy Aging. 4 (4), 267-285 (2018).
- Mitsuoka, T.
- Bonfili, L., et al. Microbiota modulation as preventative and therapeutic approach in Alzheimer's disease. The FEBS Journal. 288 (9), 2836-2855 (2021).
- Vendrik, K. E. W., et al. Fecal microbiota transplantation in neurological disorders. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 98 (2020).
- Wang, Q., et al. The role of gut dysbiosis in Parkinson's disease: mechanistic insights and therapeutic options. Brain. 144 (9), 2571-2593 (2021).
- Zhu, X., et al. The relationship between the gut microbiome and neurodegenerative diseases. Neuroscience Bulletin. 37 (10), 1510-1522 (2021).
- Miller, I.
- Foster, J. A., Rinaman, L., Cryan, J. F. Stress & the gut-brain axis: Regulation by the microbiome. Neurobiology of Stress. 7, 124-136 (2017).
- Coman, V., Vodnar, D. C. Gut microbiota and old age: Modulating factors and interventions for healthy longevity. Experimental Gerontology. 141, 111095 (2020).
- Conway, J., Duggal, N. A. Ageing of the gut microbiome: Potential influences on immune senescence and inflammageing. Ageing Research Reviews. 68, 101323 (2021).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans Microbiome Resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Felix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Zimmermann, J., et al. The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans. The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2020).
- Dinic, M., et al. Host-commensal interaction promotes health and lifespan in Caenorhabditis elegans through the activation of HLH-30/TFEB-mediated autophagy. Aging. 13 (6), 8040-8054 (2021).
- Goya, M. E., et al. Probiotic Bacillus subtilis protects against alpha-Synuclein aggregation in C. elegans. Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).
- Hacariz, O., Viau, C., Karimian, F., Xia, J. The symbiotic relationship between Caenorhabditis elegans and members of its microbiome contributes to worm fitness and lifespan extension. BMC Genomics. 22 (1), 364 (2021).
- Shin, M. G., et al. Bacteria-derived metabolite, methylglyoxal, modulates the longevity of C. elegans through TORC2/SGK-1/DAF-16 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (29), 17142-17150 (2020).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Zhang, F., et al. High-throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Methods in Molecular Biology. 2144, 131-144 (2020).
- Chan, J. P., et al. Using bacterial transcriptomics to investigate targets of host-bacterial interactions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 5545 (2019).
- Hartsough, L. A., et al. Optogenetic control of gut bacterial metabolism to promote longevity. Elife. 9, 56849 (2020).
- Pryor, R., et al. Host-microbe-drug-nutrient screen identifies bacterial effectors of Metformin therapy. Cell. 178 (6), 1299-1312 (2019).
- Benedetto, A., et al. New label-free automated survival assays reveal unexpected stress resistance patterns during C. elegans aging. Aging Cell. 18 (5), 12998 (2019).
- Coburn, C., et al. Anthranilate fluorescence marks a calcium-propagated necrotic wave that promotes organismal death in C. elegans. PLOS Biology. 11 (7), 1001613 (2013).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T.
- Naomi, R., et al. Probiotics for Alzheimer's disease: a systematic review. Nutrients. 14 (1), 20 (2021).
- Zheng, S. Y., et al. Potential roles of gut microbiota and microbial metabolites in Parkinson's disease. Ageing Research Reviews. 69, 101347 (2021).
- Gill, M. S., Olsen, A., Sampayo, J. N., Lithgow, G. J. An automated high-throughput assay for survival of the nematode Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 35 (6), 558-565 (2003).
- Park, H. -E. H., Jung, Y., Lee, S. -J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 8 (1), 8-21 (2018).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Brown, A. E., Schafer, W. R. Unrestrained worms bridled by the light. Nature Methods. 8 (2), 129-130 (2011).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. Elife. 6, 26652 (2017).
- Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
- Nambyiah, P., Brown, A. E. X. Quantitative behavioural phenotyping to investigate anaesthesia induced neurobehavioural impairment. Scientific Reports. 11 (1), 19398 (2021).
- Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and automated high-throughput genome-wide RNAi screens in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (60), e3448 (2012).
- Zugasti, O., et al. Activation of a G protein-coupled receptor by its endogenous ligand triggers the innate immune response of Caenorhabditis elegans. Nature Immunology. 15 (9), 833-838 (2014).
- Zugasti, O., et al. A quantitative genome-wide RNAi screen in C. elegans for antifungal innate immunity genes. BMC Biology. 14, 35 (2016).
