Dyrking og genetisk manipulering av entomopatogene nematoder

Summary

Entomopatogene nematoder lever i symbiose med bakterier, og sammen infiserer de insekter ved å undergrave deres medfødte immunsystem. For å fremme forskning på det genetiske grunnlaget for nematodeinfeksjon, beskrives metoder for å opprettholde og genetisk manipulere entomopatogene nematoder.

Abstract

Entomopatogene nematoder i slektene Heterorhabditis og Steinernema er obligatoriske parasitter av insekter som lever i jorda. Hovedkarakteristikken for deres livssyklus er den mutualistiske tilknytningen til henholdsvis bakteriene Photorhabdus og Xenorhabdus. Nematodeparasittene er i stand til å lokalisere og gå inn i egnede insektverter, undergrave insektets immunrespons og formere seg effektivt for å produsere neste generasjon som aktivt vil jakte på nye insektbytter for å infisere. På grunn av egenskapene til livssyklusen er entomopatogene nematoder populære biologiske kontrollmidler, som brukes i kombinasjon med insektmidler for å kontrollere ødeleggende i landbruket. Samtidig representerer disse parasittiske nematoder et forskningsverktøy for å analysere nematode patogenisitet og vert anti-nematode responser. Denne forskningen er hjulpet av den nylige utviklingen av genetiske teknikker og transkriptomiske tilnærminger for å forstå rollen som nematodeutskilte molekyler under infeksjon. Her er det gitt en detaljert protokoll for å opprettholde entomopatogene nematoder og bruke en gen knockdown-prosedyre. Disse metodene fremmer videre funksjonell karakterisering av entomopatogene nematodeinfeksjonsfaktorer.

Introduction

Forskning på entomopatogene nematoder (EPN) har intensivert de siste årene hovedsakelig på grunn av nytten av disse parasittene i integrerte skadedyrshåndteringsstrategier og deres engasjement i grunnleggende biomedisinsk forskning ^1,2. Nylige studier har etablert EPN som modellorganismer for å undersøke nematodegenetiske komponenter som aktiveres under de forskjellige stadiene av infeksjonsprosessen. Denne informasjonen gir kritiske ledetråder om naturen og antall molekyler som skilles ut av parasittene for å endre vertsfysiologi og destabilisere insektets medfødte immunrespons ^3,4. Samtidig blir denne kunnskapen ofte supplert med nye detaljer om typen insektvertens immunsignaleringsveier og funksjonene de regulerer for å begrense inntreden og spredning av patogenene ^5,6. Å forstå disse prosessene er avgjørende for å se for seg begge sider av det dynamiske samspillet mellom EPN og deres insektverter. Bedre forståelse av EPN-insekt vert forholdet vil utvilsomt lette lignende studier med pattedyr parasittiske nematoder, noe som kan føre til identifisering og karakterisering av infeksjonsfaktorer som forstyrrer det menneskelige immunsystemet.

EPN-nematodene Heterorhabditis sp. og Steinernema sp. kan infisere et bredt spekter av insekter, og deres biologi har blitt grundig studert tidligere. De to nematodeparasittene er forskjellige i reproduksjonsmodus med heterorhabditt som selvgjødslet og Steinernema gjennomgår amphimictisk reproduksjon, selv om S. hermafroditt nylig ble vist å reprodusere ved selvbefruktning av hermafroditter eller gjennom parthenogenese ^7,8,9. En annen forskjell mellom Heterorhabditis og Steinernema nematoder er deres symbiotiske mutualisme med to forskjellige slekter av Gram-negative bakterier, henholdsvis Photorhabdus og Xenorhabdus, som begge er potente patogener av insekter. Disse bakteriene finnes i det frittlevende og ikke-fôrende infeksiøse juvenile (IJ) -stadiet av EPN, som oppdager følsomme verter, får tilgang til insekthemokolen der de frigjør deres tilknyttede bakterier som replikerer raskt og koloniserer insektvev. Både EPN og deres bakterier produserer virulensfaktorer som avvæpner insektforsvar og svekker homeostase. Etter insektdød utvikler nematode-IJs seg til å bli voksen EPN og fullføre livssyklusen. En ny kohort av IJs dannet som svar på matmangel og overbefolkning i insektkadaveren dukker endelig opp i jorden for å jakte på^egnede verter 9,10,11,12.

Her beskrives en effektiv protokoll for å opprettholde, forsterke og genetisk manipulere EPN-nematoder. Spesielt skisserer protokollen replikasjonen av symbiotiske H. bacteriophora og S. carpocapsae IJs, genereringen av axenisk nematode IJs, produksjonen av H. bacteriophora hermafroditter for mikroinjeksjon, fremstilling av dsRNA og mikroinjeksjonsteknikken. Disse metodene er avgjørende for å forstå det molekylære grunnlaget for nematodepatogenitet og vertsanti nematodeimmunitet.

Protocol

1. Produksjon av symbiotiske nematodeinfeksiøse ungdommer Dekk et petriskål (10 cm) med et stykke filterpapir og tilsett ca. 10-15 Galleria mellonella larver (figur 1A). Bruk en pipette til å dispensere 2 ml vann som inneholder ca. 25-50 IJ per 10 μL suspensjon på voksormene. Oppbevar petriskålen i et skap ved romtemperatur. Avhengig av fuktigheten til filterpapiret, tilsett 1-2 ml vann hver 2. Waxworms infisert med IJs normalt vi…

Representative Results

For å vurdere statusen til H. bacteriophora nematoder som har gått gjennom axenization, ble tilstedeværelsen eller fraværet av P. luminescens bakteriekolonier i IJs bestemt. For å gjøre dette ble en pellet på ca. 500 IJs som tidligere hadde blitt overflatesterilisert og homogenisert i PBS samlet. Den positive kontrollbehandlingen besto av en pellet på ca. 500 IJ fra nematodekulturen som inneholdt symbiotiske P. luminescensbakterier . Pellets av axeniserte og positive kontroll nematoder …

Discussion

Å forstå det molekylære grunnlaget for entomopatogen nematodeinfeksjon og insektanti nematodeimmunitet krever separasjon av parasittene fra de mutualistisk assosierte bakteriene 13,15,16. De entomopatogene nematodene H. bacteriophora og S. carpocapsae lever sammen med de gramnegative bakteriene P. luminescens og X. nematophila, henholdsvis¹⁷. Begge bakterieartene har…

Materials

Agarose	VWR	97062-244
Ambion Megascript T7 Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1333
Ampicillin	Fisher Scientific	611770250
Cell culture flask T25	Fisher Scientific	156367
Cell culture flask T75	Fisher Scientific	156499
ChoiceTaq Mastermix	Denville Scientific	C775Y42
Corn oil	VWR	470200-112
Corn syrup	MP Biomedicals/VWR	IC10141301
Culture tube 10 mL	Fisher Scientific	14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips	Eppendorf	E5242956003
Ethanol	Millipore-Sigma	E7023
Falcon tube 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Femtojet Microinjector	Eppendorf	5252000021
Filter paper	VWR	28320-100
Galleria mellonella waxorms	Petco	–
Glass coverslip	Fisher Scientific	12-553-464	50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700	Sigma	H8898
Inoculating loop	VWR	12000-806
Kanamycin	VWR	97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-3	1.0 mm
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar miller powder 500 g
LB Broth	Fisher Scientific	BP1426-500	LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope	Microscope Central	–
MacConkey medium	Millipore-Sigma	M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1908
Microcentrifuge tube	VWR	76332-064	1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Needle syringe	VWR	BD305155	22G
Nutrient broth	Millipore-Sigma	70122-100G
Parafilm	VWR	52858-076
Partitioned Petri dish	VWR	490005-212
PBS	VWR	97062-732	Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers	Azenta	–
Pestle	Millipore-Sigma	BAF199230001	Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Petri dish 10 mm	VWR	10799-192	35 x 10 mm
Proteose Peptone #3	Thermo Fisher Scientific	211693
Yeast extract	Millipore-Sigma	Y1625