Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Odling och genetiskt manipulerande entomopatogena nematoder

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63885
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, The George Washington University, 2Department of Microbiology, Immunology, and Tropical Medicine, School of Medicine and Health Sciences, The George Washington University

Summary

Entomopatogena nematoder lever i symbios med bakterier och tillsammans infekterar de framgångsrikt insekter genom att undergräva deras medfödda immunförsvar. För att främja forskning om den genetiska grunden för nematodinfektion beskrivs metoder för att upprätthålla och genetiskt manipulera entomopatogena nematoder.

Abstract

Entomopatogena nematoder i släkten Heterorhabditis och Steinernema är obligatoriska parasiter av insekter som lever i jorden. Huvudkarakteristiken för deras livscykel är den mutualistiska föreningen med bakterierna Photorhabdus respektive Xenorhabdus. Nematodparasiterna kan lokalisera och komma in i lämpliga insektsvärdar, undergräva insektsimmunsvaret och föröka sig effektivt för att producera nästa generation som aktivt kommer att jaga nya insektsbyten att infektera. På grund av egenskaperna hos deras livscykel är entomopatogena nematoder populära biologiska bekämpningsmedel, som används i kombination med insekticider för att bekämpa destruktiva jordbruksinsekter. Samtidigt representerar dessa parasitiska nematoder ett forskningsverktyg för att analysera nematodpatogenitet och vara värd för anti-nematodsvar. Denna forskning stöds av den senaste utvecklingen av genetiska tekniker och transkriptomiska metoder för att förstå rollen som nematod utsöndrade molekyler under infektion. Här tillhandahålls ett detaljerat protokoll om upprätthållande av entomopatogena nematoder och användning av ett gen knockdown-förfarande. Dessa metoder främjar ytterligare den funktionella karakteriseringen av entomopatogena nematodinfektionsfaktorer.

Introduction

Forskning om entomopatogena nematoder (EPN) har intensifierats under de senaste åren, främst på grund av nyttan av dessa parasiter i integrerade skadedjursbekämpningsstrategier och deras engagemang i grundläggande biomedicinsk forskning 1,2. Nya studier har etablerat EPN som modellorganismer för att undersöka de nematodgenetiska komponenterna som aktiveras under de olika stadierna av infektionsprocessen. Denna information ger kritiska ledtrådar om arten och antalet molekyler som utsöndras av parasiterna för att förändra värdfysiologin och destabilisera insektens medfödda immunsvar 3,4. Samtidigt kompletteras denna kunskap vanligtvis med nya detaljer om typen av insektsvärds immunsignalvägar och de funktioner de reglerar för att begränsa patogenernas inträde och spridning 5,6. Att förstå dessa processer är avgörande för att föreställa sig båda sidor av det dynamiska samspelet mellan EPN och deras insektsvärdar. Bättre uppskattning av EPN-insektsvärdförhållandet kommer utan tvekan att underlätta liknande studier med däggdjursparasitiska nematoder, vilket kan leda till identifiering och karakterisering av infektionsfaktorer som stör det mänskliga immunsystemet.

EPN-nematoderna Heterorhabditis sp. och Steinernema sp. kan infektera ett brett spektrum av insekter, och deras biologi har studerats intensivt tidigare. De två nematodparasiterna skiljer sig åt i sitt reproduktionssätt med Heterorhabditis som självbefruktad och Steinernema genomgår amphimisk reproduktion, även om S. hermafroditum nyligen visade sig reproducera genom självbefruktning av hermafroditer eller genom partenogenes 7,8,9. En annan skillnad mellan Heterorhabditis och Steinernema nematoder är deras symbiotiska mutualism med två distinkta släkten av gramnegativa bakterier, Photorhabdus respektive Xenorhabdus, som båda är potenta patogener av insekter. Dessa bakterier finns i det fritt levande och icke-matande infektiösa juvenila (IJ) -stadiet i EPN, som upptäcker mottagliga värdar, får tillgång till insektshemokolen där de släpper ut sina associerade bakterier som replikerar snabbt och koloniserar insektsvävnader. Både EPN och deras bakterier producerar virulensfaktorer som avväpnar insektsförsvar och försämrar homeostasen. Efter insektsdöd utvecklas nematoden IJs till att bli vuxen EPN och slutföra sin livscykel. En ny kohort av IJs som bildats som svar på matbrist och överbeläggning inom insektskadavret dyker äntligen upp i jorden för att jaga lämpliga värdar 9,10,11,12.

Här beskrivs ett effektivt protokoll för att upprätthålla, förstärka och genetiskt manipulera EPN-nematoder. I synnerhet beskriver protokollet replikationen av symbiotiska H. bakterioforer och S. carpocapsae IJs, genereringen av axeniska nematode-IJs, produktionen av H. bakteriophora-hermafroditer för mikroinjektion, beredningen av dsRNA och mikroinjektionstekniken. Dessa metoder är väsentliga för att förstå den molekylära grunden för nematodpatogenitet och värd-anti-nematodimmunitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produktion av symbiotiska nematodinfektiva ungdomar

  1. Täck en petriskål (10 cm) med en bit filterpapper och tillsätt cirka 10-15 Galleria mellonella larver (figur 1A).
  2. Använd en pipett, fördela 2 ml vatten innehållande cirka 25-50 IJs per 10 μL suspension på vaxmaskarna. Förvara petriskålen i ett skåp vid rumstemperatur.
  3. Beroende på filterpapperets fukt, tillsätt 1-2 ml vatten var 2: e dag. Vaxmaskar infekterade med IJs kommer normalt att dö inom 48 timmar.
  4. Förbered Whites vattenlås cirka 10 dagar efter att vaxmaskarna har infekterats med IJs8 (figur 1B, C). Överför försiktigt de döda insekterna till den osådda delen av filterpapperet. Använd kranvatten för att fylla botten petriskålen och placera ett lock på ett 15 ml rör som distans för ventilation.
  5. Överför de mjuka och ömtåliga vaxmaskarna försiktigt genom att lyfta dem långsamt från filterpapperet med ett par plasttångar. Använd kranvatten istället för avmineraliserat eller avjoniserat vatten. Den senare orsakar nematodaggregation.
    1. Se till att vattennivån i vattenlåset når ungefär hälften av petriskålens höjd. Förvänta dig att vattennivån kommer att förändras över tiden beroende på temperatur och luftfuktighet i rummet.
  6. När vattnet i den lilla petriskålen blir grumligt på grund av närvaron av nematoder, använd en pipett för att flytta den nya generationen IJs till en T25- eller T75-cellodlingskolv.
  7. Tillsätt kranvatten upp till cirka 40% av volymen tills lämplig densitet har uppnåtts (figur 1C). Undvik nematodbelastning och förvara cellodlingskolvarna horisontellt.
  8. Tillsätt mer vatten i botten petriskålen och upprepa steg 1.6 och 1.7 tills IJs slutar komma ut ur insektskropparna om cirka 3-5 dagar.

2. Produktion av axeniska nematodinfektiva ungdomar

OBS: Axeniska nematoder används eftersom efter att nematod-bakteriekomplexet dissocieras inuti insekten, framkallar varje mutualistisk partner ett distinkt värdimmunsvar5. Mutantstammen Ret16 av Photorhabdus temperata används eftersom dessa bakterier stöder tillväxten av H. bacteriophora men misslyckas med att kolonisera nematoden gut13,14.

  1. Heterorhabditis bacteriophora smittsamma ungdomar
    1. Använd en steril pipettspets eller spatel och skrapa flera flingor av en frusen kultur av P. temperata Ret16 på en MacConkey-platta och strimma för enstaka kolonier. Inkubera plattan i 2–3 dagar vid 28 °C.
    2. Inokulera 10 ml LB-buljong med en koloni i ett 50 ml rör och inkubera kulturen över natten vid 28 °C i en skakinkubator. Använd endast de primära faskolonierna som är röda på MacConkey-agar. Kolonierna i sekundärfasen kommer att vara benvita på MacConkey-agar.
    3. Tvätta 100 μL över natten med 900 μL 1x PBS genom centrifugering i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör vid 17 900 x g. Dekantera supernatanten. Späd kulturen 10x i 1x PBS. Lämna röret på is.
    4. Sänk ner vaxmaskarna i en 70% etanollösning, torka insekterna med en pappershandduk och placera dem i ett 50 ml rör.
    5. Placera röret på is i 20 minuter för att immobilisera vaxmaskarna.
    6. Använd ett filterpapper för att täcka de övre och nedre halvorna på en petriskål (10 cm). Använd petriskålslocket täckt med filterpapper som basstöd för injektion. Fukta filterpapperet på botten petriskålen och överför på is för att hjälpa de injicerade vaxmaskarna att återhämta sig.
    7. Pipettera 50 μL iskalla bakterier på en bit parafilm och förbered 22 G nålsprutan. Tryck försiktigt på kolven för att ta bort luften vid nålspetsen.
    8. Håll en vaxmask nära den bakre änden under stereoskopet (figur 2).
    9. Injicera 50 μL av bakteriekulturen i ryggsidan av bröstkorgen, helst vid korsningen mellan två segment. För att minimera inre skador, injicera precis under nagelbandet, så parallellt med vaxmask som möjligt. Det är naturligt att en droppe hemolymf blöder ut när vaxmasken är genomborrad
    10. Överför de injicerade insekterna till återhämtningen Petriskålen.
    11. Upprepa steg 2.1.7-2.1.9 tills alla insekter injiceras med bakterierna. För att bedöva insekterna, lägg dem på is i 5 minuter.
    12. Placera petriskålen i mörkret (t.ex. låda eller skåp) och tillsätt kranvatten i filterpapperet om det verkar torrt. Vaxmaskar kommer att ge efter 2 dagar efter injektion och verkar tegelröda efter cirka 3-4 dagar. Om insekterna verkar bruna har bakterieinfektionen misslyckats.
    13. Vid 7 dagar efter infektion, överför insekterna med den karakteristiska tegelröda färgen till en ny filterpappersfodrad petriskål och fortsätt med "Produktion av symbiotiska nematodinfektiva ungdomar" från steg 1. Om du använder symbiotiska nematoder, upprepa proceduren från steg 2.1. med hjälp av de nyproducerade IJs från första omgången.
    14. Ytsteriliserande H. bakteriophora IJs
      1. Samla tillräckligt med symbiotiska H. bakterioforer och kandidataxeniska IJs genom centrifugering för att göra en 100 μL pellets i ett 1,5 ml centrifugrör.
      2. Tillsätt 500 μL 5% blekmedel till pelleten i varje mikrocentrifugrör och invertera. Inkubera i 10 min. Centrifugera vid 17 900 x g i 1 min. Ta bort supernatanten.
      3. Tvätta pelleten med 1 ml sterilt vatten och upprepa centrifugeringen. Ta bort supernatanten. Upprepa detta steg fyra gånger till.
    15. Verifiera axenicitet
      1. Pipettera 400 μl sterilt vatten till de tvättade symbiotiska och kandidataxeniska H. bakteriophora nematoderna.
      2. Placera nematoderna över insekterna i petriskålen och märk behandlingarna därefter.
      3. Placera petriskålarna med de infekterade insekterna i mörkret och kontrollera regelbundet om vaxmaskarna blir röda.
        OBS: Vaxmaskar infekterade med H. bakteriophora symbiotiska nematoder blir röda inom 2 dagar efter infektion. Vaxmask missfärgning beror på utsöndringen av olika föreningar som produceras av mutualistiska Photorhabdus-bakterier under infektionsprocessen. Brist på röd färg i de infekterade vaxmaskarna 4 dagar efter infektion bekräftar att H. bakteriofonen är axenisk. Detta beror på att P. temperata Ret16-bakterier inte finns i nematod tarmen.
    16. Alternativ metod för att verifiera axenicitet
      1. Ytsterilisera symbiotiska H. bakterioforer IJs och kandidataxeniska H. bakteriophora IJs enligt beskrivningen i steg 2.1.14.
      2. Homogenisera cirka 500 IJs i 500 μL steril 1x PBS i mikrofugerör med sterila pestlar. Snurra ner homogenatet, dekantera supernatanten och sprid det på LB-agar. Inkubera plattorna vid 28 °C i 24 timmar.
      3. Räkna de kolonibildande enheterna (CFU) för varje platta. Prover från axeniska H. bakterioforer kommer inte att bilda några kolonier av de symbiotiska P. luminescens-bakterierna .
  2. Steinernema carpocapsae Smittsamma ungdomar
    1. Beredning av lipidagarplattor (300 ml lösning gör cirka 20 delade plattor)
      1. Väg 2,4 g näringsbuljong, 4,5 g jästextrakt och 1,5 g agar och tillsätt dem till 267 ml avjoniserat vatten. Autoklavera lösningen.
      2. Tillsätt 3 ml 1 M MgCl2, 1,2 ml majsolja och 28,8 ml 7% majssirap.
      3. Bered och tillsätt 300 μl 30 mg/ml kanamycin och 300 μl 50 mg/ml ampicillin (steriliserat med 0,2 μm filter) till lösningen.
      4. Häll blandningen på ena halvan av en delad petriskål/delad tallrik.
    2. Beredning av X. nematophila (stam ΔrpoS) bakteriell gräsmatta
      1. Kultur X. nematophila (Xn) ΔrpoS direkt från ett fryst bakteriebestånd i 2 ml LB/kan/amp-lösning på en shaker vid 30 °C över natten.
      2. Inokulera 5 ml LB-medium innehållande 30 μg/ml kanamycin och 50 μg/ml ampicillin med 250 μl av nattkulturen och odla bakterierna över natten på en shaker.
        OBS: Xn-bakterier växer inte bra när de strimmas direkt på selektion lipidagarmedia från ett fryst lager. Vid behov kan primär och sekundär fas Xn först bekräftas på NBTA-media (näringsagar kompletterad med 25 mg bromothymolblå l−1 och 40 mg trifenyltetrazoliumklorid l−1) innan en ny flytande kultur påbörjas.
      3. Pipettera 100 μL av kulturen på lipidagarplattorna och sprid på hela plattan med en steril inokulerande slinga. Inkubera plattorna i 24 timmar vid 30 °C.
    3. Ytsteriliserande S. carpocapsae IJs
      1. Lämna en kolv som innehåller IJs i en sådan vinkel att IJs sjunker till ett hörn av kolven. Aspirera 1 ml av de sedimenterade IJsna i ett mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 17 900 x g i 10 s. Ta bort supernatanten.
      2. Tillsätt 1 ml 1% nyberedd blekmedelslösning. Invertera rören för att blanda noggrant. Inkubera i 1 min (långvarig blekmedelinkubation leder till IJ-död). Snurra igen i 10 s. Ta bort supernatanten.
      3. För att avlägsna blekmedelsrester, tvätta nematoderna med 1 ml sterilt destillerat vatten och centrifugera i 10 s. Ta bort supernatanten. Upprepa tvätten ytterligare fyra gånger.
      4. Uppskatta IJ-räkningen per ml genom att räkna 10-20 μl av de tvättade IJs under stereoskopet och justera koncentrationen av IJs därefter.
    4. Uppfödning av S. carpocapsae IJs
      1. Överför med en pipett cirka 1000 IJs till lipidagar split plattorna (figur 3, vänster bild). Placera plattorna i ett fuktat skåp eller låda. Använd fuktiga pappershanddukar för att öka fukten. Håll plattorna vid rumstemperatur (22-25 °C).
      2. Kontrollera pappershanddukarna varannan dag för att se till att de håller sig fuktiga. Tillsätt vid behov vatten varannan dag i pappershanddukarna för att bibehålla luftfuktigheten i skåpet eller lådan. Alternativt kan du placera ett vattenbad i botten av skåpet för att öka luftfuktigheten.
      3. När IJs bara visas, tillsätt vatten på andra sidan plattan och placera ett lager filterpapper över mitten av plattan (vattenlås, figur 3, höger bild). Samla upp detta vatten som innehåller de första runda IJs i en T75-cellodlingskolv. Dessa är Round I S. carpocapsae nematoder.
      4. Ytsterilisera med blekmedel (steg 2.2.3) igen och upprepa processen från steg 2.2 med hjälp av Round 1 S. carpocapsae nematoder. Resultatet blir Runda 2 S. carpocapsae nematoder.
      5. Kontrollera under ett stereoskop med några dagars mellanrum för att spåra utvecklingen av nematoderna.
    5. Verifiera det axeniska tillståndet för S. carpocapsae IJs
      1. Ytsterilisera Round 1, Round 2 och symbiotiska S. carpocapsae IJs med blekmedel enligt beskrivningen i steg 2.2.3.
      2. Homogenisera cirka 400-700 IJs i mikrofugerör med sterila plaststötar. Centrifugera homogenatet, dekantera supernatanten och sprid lösningen på LB-agarplattor. Förvara agarplattorna i en kuvös inställd på 28 °C i 24 timmar.
      3. Räkna bildandet av CFU för varje platta. Prover från axeniska nematoder kommer inte att ge någon bakterietillväxt.
    6. Verifiera det axeniska tillståndet för S. carpocapsae IJs med PCR
      1. Ytsterilisera Round 1, Round 2 och symbiotiska S. carpocapsae IJs med blekmedel enligt beskrivningen i steg 2.2.3.
      2. Extrahera DNA från homogenatet. Ett detaljerat extraktionsförfarande beskrivs i avsnitt 4.1.2 nedan.
      3. Utför PCR med XptA2-grundfärgerna med glödgningstemperatur 61 °C:
        XptA F: 5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3′.
        XptA R: 5′-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3′.
        OBS: Dessa primers förstärker den insekticidala genen XptA2 av X. nematophila, vilket ger en amplicon i storlek 231 bp. Cykelprogrammet var följande: 95 °C i 2 min, 34 cykler på 95 °C i 30 s, glödgningstemperatur på 61 °C i 1 min och 73 °C i 1 min följt av 72 °C i 10 min.
      4. Visualisera de förstärkta fragmenten genom separation i en 1,5% agarosgel. Axeniska ytsteriliserade prover kommer inte att bilda några band.

3. Uppfödning av H. bakteriofa-hermafroditer för mikroinjektion

  1. Förbered 6 cm petriskålar med NA+chol (1,5x näringsbuljong, 1,5% agar och 10 μg/ml kolesterol).
  2. Förbered 3 ml PP3-lösning (2% proteaspeton #3, PP3) i ett 10 ml odlingsrör.
  3. Använd en steril spets på 20 μl för att skrapa toppen av P. luminescens glycerol -beståndet (25 % vol/vol steril glycerol) som hålls vid -80 °C och släpp det i odlingsröret.
  4. Inkubera röret över natten i en temperaturkontrollerad skakapparat inställd på 28 °C, 200 rpm.
  5. Följande dag kommer kulturen att vara ljusröd i färgen. Platta 50 μL av kulturen på en 6 cm NA + kol petriskål och sprid den med en bakteriespridare på ett cirkulärt sätt.
  6. Placera plattorna i en 28 °C inkubator. P. luminescens gräsmatta kommer att vara klar i 24-36 timmar och kommer att se ljusröd ut i färgen.
  7. Inokulera plattan med 50-100 ytsteriliserade IJs och håll plattan vid 28 °C.
  8. Frisk L4 hermafrodit kommer att börja visas cirka 48-54 h efter ympning. Friska, icke-svälta sena L4 H. bakteriophora hermafroditer krävs för injektion.

4. Beredning av dsRNA

  1. Primer design
    1. Designa primers för dsRNA för att rikta in sig på ~ 500 baspar exonregioner av H. bakteriophora DNA.
      1. Primers för regioner av intresse kan bestämmas med hjälp av Primer3 (https://primer3.ut.ee) eller ett liknande program, välja för en optimal produktlängd på 500 baspar, Tm på 60 ° C och primerlängd på 22 nukleotider.
      2. Lägg till en T7-plats (TAATACGACTCACTATAGGG) i 5′-ändarna av varje framåtriktad primer för att möjliggöra in vitro-transkription.
  2. Genomisk DNA-isolering
    1. Använd genomiskt DNA isolerat från frysta pellets av ~ 50 000 H. bakteriophora IJs för dsRNA-syntes.
    2. Använd en IJ-pellet som återsuspenderas i 50 μl lysbuffert (50 mM KCl, 0,05% (w/v) gelatin, 10 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,45% Tween 20, 60 μg/ml Proteinase K, 2,5 mM MgCl2) placerad vid −80 °C i minst 30 min.
    3. Homogenisera pelleten med en liten rörstöt.
    4. Värm lösningen till rumstemperatur och inkubera vid 60 °C i 2 timmar, virvla var 15:e minut.
    5. Denaturera proteinaset K genom att inkubera den homogeniserade vävnaden i 15 minuter vid 95 °C.
    6. Kyl provet till 4 °C och centrifugera vid 3 400 x g i 1 min.
    7. Använd den resulterande supernatanten som en mall för efterföljande PCR.
    8. Ställ in en 50 μL PCR-reaktion med en kommersiell mastermix med 200 ng mall-DNA, 0,2 μM framåt och bakåt primer och tillverkarens föreslagna cykelförhållanden.
    9. Analysera PCR-reaktionen på en 1,2% agarosgel för att verifiera att reaktionerna producerade enstaka band av den förutsagda storleken.
  3. dsRNA-syntes
    1. Använd ett kommersiellt transkriptionskit.
    2. Använd en 5 μL PCR-reaktion för in vitro-transkription. Följ tillverkarens instruktioner.
    3. Inkubera reaktionen i 16 timmar vid 37 °C.
    4. Rengör transkriptionsreaktionerna in vitro med ett kommersiellt kit med ammoniumacetat / etanolutfällning för att koncentrera dsRNA.
    5. Suspendera det pelleterade dsRNA:t i 10 μl RNas-fritt vatten.
    6. Kvantifiera RNA med hjälp av en spektrofotometer.
    7. Bedöm kvaliteten genom att separera dsRNA på en 1,2% agarosgel

5. Mikroinjektion

OBS: En injektionsdyna är en glasöverdragslip med ett lager av 2% (w / v) agaros i mitten. När maskarna som ska injiceras överförs till dessa dynor, kommer agarosskiktet att immobilisera dem för proceduren. Normalt hålls extra dynor nära mikroskopet för allmänt bruk.

  1. Förbereda injektionsdynan
    1. Koka 2% agaros i vatten genom att tillsätta 0,2 g agaros till 10 ml vatten.
    2. Placera 1-4 droppar (~ 50 μL) på mitten av en 50 mm x 70 mm tunn glasöverdrag.
    3. Använd en annan täckglas för att platta ut droppen.
    4. Låt täckglaset torka i 2-3 min innan du skjuter av täckglaset i sidled.
    5. Markera med ett "R" höger sida av det uppåtvända täckglaset.
    6. Låt bilderna torka vid rumstemperatur i 1 dag innan du använder dem.
  2. Beredning av injektionsnålar
    1. Använd 1,0 mm glaskapillärer som innehåller en inre finfilament. Detta möjliggör effektiv fyllning av nålen.
      OBS: Alla kommersiella nåldragare (t.ex. Narishige PB-7) kan användas.
    2. Slå på nåldragaren.
    3. Se till att värmaren är inställd på max och att solenoiden är inställd på 8,40 för att säkerställa önskad nålskärpa och rätt längd.
    4. Sätt in kapillärröret i den övre vredryggen genom filamentet och dra åt den övre vredet. Toppen av kapillärröret kommer att vara i nivå med toppen av nåldragaren och värmefilamentet kommer att vara i mitten av kapillären.
    5. Flytta den nedre enheten till toppen och dra sedan åt den nedre ratten. Se till att kapillären är ordentligt placerad.
    6. Stäng locket på nåldragaren och tryck på start. Den gröna lampan tänds. Efter några minuter kommer kapillären att värmas upp och dras isär för att separera i två halvor.
      OBS: De två separerade nålarna är inte av samma längd, men de kan båda användas för injektionerna. Längre nålpunkter är att föredra.
    7. Ordna nålarna i vertikalt läge med sina punkter nedåt med en bit modelleringslera. Alternativt kan du förvara nålarna i en petriskål som hålls på plats av två remsor av modelleringslera.
  3. Laddar nålen
    OBS: Nukleinsyralösningen måste centrifugeras i minst 10 minuter vid 20 784 x g till pelletsföroreningar som kan finnas i suspensionen. Centrifugeringen av föroreningarna hindrar dem från att blockera flödet av injektionsnålen.
    1. Använd någon av de två metoderna för att ladda nukleinsyror i nålarna.
    2. Metod 1
      1. Använd en pipett för att överföra cirka 0,5 μL av det centrifugerade DNA-provet till injektionsnålens lossade ände. Detta kommer att visas som en liten droppe vätska som sitter ovanpå kapillärröret.
      2. Stå i 5 till 7 minuter så att vätskeprovet kan uppta nålens ände. Slutprodukten kommer att vara en fylld nål utan luftbubblor närvarande.
      3. Använd ett dissektionsmikroskop för att bekräfta närvaron av lösning i nålspetsen före injektion.
    3. Metod 2
      1. Använd laddningstips för mikroinjektorn.
      2. Använd denna laddningsspets och pipettera 5 μL av nukleinsyralösningen.
      3. Medan den dragna nålen är på nåldragaren, lossa den övre vredet, flytta den övre dragna nålen något uppåt och dra åt vredet igen.
      4. Sätt försiktigt in lastarens spets i kapillärröret och förläng den till botten av injektionsnålen.
      5. Pipettera nukleinsyralösningen i injektionsnålen.
      6. Ta bort lastaren från den dragna nålen och håll den separat för ytterligare belastning, om det behövs. Var noga med att byta ut lastare när du laddar en annan nukleinsyrablandning.
  4. Förbereda injektionsmikroskopet
    OBS: Ett inverterat mikroskop med diffus belysning från mikroskopbasen används för maskberedning, mikroinjektion och återhämtning. Användningen av ett högupplöst inverterat mikroskop med 10x och 40x mål beskrivs. Mikroskopet är utrustat med en nålmanipulator som håller nålen och sätter den på plats för injektionen. Mikroinjektionsolja används för att förhindra masken från snabb uttorkning medan den är på agarosskiktet på injektionsdynan. Den föreslagna oljan att använda är Halocarbon Oil 700.
    1. Slå på lampan och kalibrera ljusstyrkan med kontrollpanelen.
    2. Kontrollera numret på kondensorn Wollaston prisma; det kommer att motsvara det använda målet (40x).
    3. Bekräfta att DIC-tornet, markerat med "DIC", är i rätt läge.
    4. Se till att vredet på målet är inställt på noll (0).
    5. Vrid Ph-ringen åt höger till slutet.
    6. Justera polarisatorn på ett sådant sätt att pilen är i horisontellt läge.
    7. Lägg ett papper på scenen för att observera fokuspunkten (ljuset).
    8. Stäng fältmembranet så att det finns en plats på papperet.
    9. Använd ratten till vänster för att flytta kondensorn upp och ner till den punkt där en mycket skarp ljuspunkt på bitpappret ses.
    10. Öppna fältmembranet långsamt upp till den punkt att en liten cirkel av ljus är synlig.
    11. Ta bort papperet.
    12. Se till att ljuspunkten är i mitten av målet. Annars ställer du upp ljuspunkten med mitten av målet genom att justera silverskruvarna på toppen av kondensorn.
    13. Öppna fältmembranet helt.
    14. Kontrollera att analysatorns IKT/P är intryckt.
  5. Montering av injektionsnålen på mikroskopet
    1. Slå på kvävgasflödet till mikroinjektionsnålen. Gastrycket till nålen kommer att vara cirka 20 psi.
    2. Kontrollera att mikromanipulatorknapparna (den del av mikroskopet som flyttar nålen) är placerade i mitten, vilket möjliggör det bredaste rörelseområdet när nålen är monterad.
    3. Skruva loss enheten som håller metallstången för att ta bort den från nålhållaren.
    4. Sätt in den nya nålen i den övre delen av mikroskopet; installera sedan gummipackningen för att hålla nålen på plats.
    5. Säkra den nedre delen av nålhållaren genom att montera den på enheten.
    6. Sätt nålen i spåret på mikromanipulatorn och skruva fast den ordentligt för att hålla den stadig. Se till att skruven är ungefär 1 tum från mikromanipulatorns ände.
    7. Placera nålspetsen mitt i synfältet i ca 45° vinkel i förhållande till scenplattan med hjälp av vreden och grova kontroller från mikromanipulatorn. Det är viktigt att lämna nålspetsen tillräckligt hög så att den inte går sönder av misstag.
  6. Bryta nålarna
    1. Placera nålen i mikromanipulatorn där nålspetsen normalt går sönder för att låta nukleinsyralösningen strömma genom den.
    2. Bryt en kapillär och placera den ovanpå en glasskiva med en droppe mikroinjektionsolja.
    3. Placera bilden på mikroskopet och fokusera.
    4. För nålspetsen till samma nivå som kapillärens sida med hjälp av mikroskopets fina kontroller (figur 4).
    5. Slå på kväveflödet kort med fotställdonet för att bekräfta att nålspetsen inte är trasig. En snabb on-off räcker.
    6. Flytta nålen försiktigt så att den knappt rör vid kapillärens sida.
    7. Knacka lätt på sidan av mikroskopet för att bryta nålspetsen.
    8. Ta bort nålen från kapillären och sätt på kväveflödet för att kontrollera att nålen är ordentligt trasig.
    9. Nålen kommer att skapa ett litet injektionsfall som är ungefär fem gånger större än nålspetsen (figur 4). Om injektionsfallet är av mindre storlek, bryt spetsen ytterligare. Om injektionsdroppen är av större storlek, försök att använda en ny nål.

6. Mikroinjektion

  1. Pipettera en droppe mikroinjektionsolja på en injektionsplatta.
  2. Doppa en flamsteriliserad plockning i mikroinjektionsoljedroppen och samla en ung H. bakteriophora vuxen nematod från plattan.
  3. Plocka nematoderna från delar av plattan som inte ligger nära bakteriegräsmattan för att förhindra överföring av ett stort antal bakterieceller till injektionsdynan. Skörda också en nematod med välformade gonader.
  4. Flytta nematoderna till injektionsdynan och placera dem vertikalt så att gonaderna vetter mot nålen. Se till att vulvan pekar åt samma håll som injektionsnålen, och att de två distala gonadarmarna är i motsatt riktning och upp mot nematodens kroppsvägg.
    NOTERA: Liksom Pristionchus pacificus migrerar gonaden av H. bacteriophora dorsalt från den ventrala vulvalpositionen och migrerar sedan tillbaka till den ventrala positionen.
  5. Kontrollera att mängden olja är tillräcklig för att förhindra uttorkning av nematoder utan att låta nematoden vandra runt.
  6. Sätt nematoden i fokus med 10x-målet genom att hålla nålen långt ovanför bilden. I olja ses nematodgonaderna som två tydliga regioner nära maskens främre och bakre del. Se till att gonaderna är i fokus och inte de andra delarna av masken.
  7. Placera nematoden i en vinkel på 15° till 45° mot injektionsnålen, vilket ger mer utrymme till nålen inuti gonaden. Detta tillvägagångssätt förhindrar också att nålen passerar genom hela nematodkroppen när nålen införs inuti gonaden.
  8. Placera injektionsnålen och nematoden på samma nivå genom att gradvis sänka nålen tills den sätts i fokus (figur 5). Se till att när nålen sänks, förblir den bredvid nematoden och inte ovanför masken.
  9. Använd 40x-målet för att fokusera på nematodens synkytiella gonadarm.
  10. Flytta nålen upp och ner med finjusteraren tills spetsen är i fokus tillsammans med nematodsynkyttermen.
  11. Flytta nematoden långsamt mot nålen med hjälp av glidsteget. Tryck sedan försiktigt gonaden till position med nålen mot nematodens kroppsvägg, vilket kommer att resultera i effektiv nålpenetration inuti nematodkroppen.
  12. Stega kort på fotaktuatorn för att starta flödet av nukleinsyralösningen. En snabb on-off räcker. Om nålen är inne i gonaden kommer gonaden att fyllas med lösningen och svälla.
  13. När nålen är säkerställd i rätt läge fyller du gonaden med nukleinsyralösningen tills gonadens armar är fyllda. Det är viktigt att undvika utvisning av vätska från masken genom hålet där nålen punkterade den.
  14. Använd glidsteget och flytta försiktigt masken bort från nålen.
  15. Lyft nålen och vrid den moturs.
  16. Placera en droppe 1x PBS-buffert ovanpå masken för att få den att flyta.
  17. Använd den flamsteriliserade plockningen för att lyfta masken och placera den i en annan droppe M9 på en ny P. luminescensfröad platta för att befria masken från överflödig olja.
  18. Ta bort nematoden från M9 och placera den på andra sidan bakteriegräsmattan.
  19. Använd samma platta för att överföra flera injicerade nematoder.
  20. På 2-3 dagar, utvärdera den första generationens (F1) nematoder för den transgena fenotypen. Separera de transgena F1-nematoderna på enskilda plattor för att bestämma vilka maskar som kommer att generera stabila transgena linjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att bedöma statusen för H. bakteriophora nematoder som har gått igenom axeniseringen bestämdes närvaron eller frånvaron av P. luminescens bakteriekolonier i IJs. För att göra detta samlades en pellet på cirka 500 IJs som tidigare hade ytsteriliserats och homogeniserats i PBS. Den positiva kontrollbehandlingen bestod av en pellet av cirka 500 IJs från nematodkulturen innehållande symbiotiska P. luminescens-bakterier . Pellets av axeniserade och positiva kontrollnematoder homogeniserades i 1x PBS. Homogenaten pipetterades på agar och spreds för att underlätta tillväxten av enskilda kolonier. Agarplattorna inkuberades vid 28 °C i 24 timmar. Nästa dag observerades förekomsten av P. luminescenskolonier (CFU). Som förväntat bar H. bakteriofora från stamkulturen symbiotiska P. luminsecens-celler ; nematoder utan deras associerade P. luminecens-bakterier var dock axeniska och lagrade separat för framtida experiment (figur 6).

Knockdown av nol-5-genuttryck användes som ett exempel för att visa effekten av RNAi med hjälp av mikroinjektionsprocessen. Mikroinjektion utfördes i föräldragenerationen och effekten observerades i F1-avkomman. Knockdown av nol-5 med hjälp av RNAi-mikroinjektion resulterade i frånvaro av bakterielinje i gonaden hos 60% av avkomman (Figur 7).

Figure 1
Figur 1: Generering av infektiösa juveniler (fritt levande stadium av entomopatogena nematoder). (a) Infektion av Galleria mellonella insektslarver (förvaras i petriskål) med nematodinfektiva ungdomar (förvaras i vävnadsodlingskolv). b) Vikning av ett filterpapper för beredning av en vattenlås. c) Anordnande av en vattenfälla av entomopatogena nematoder med döda Galleria mellonella insektslarver som innehåller infektiösa ungfåglar (12 dagar efter nematodinfektion). Den nya generationens smittsamma ungdomar kommer att lämna de döda insekterna och flytta till vattnet, som sedan lagras i en vävnadsodlingskolv. Bilder görs med BioRender grafisk programvara (https://biorender.com). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Injektion av Galleria mellonella insektslarver med bakteriestammen Photorhabdus temperata Ret16. Vaxmaskar hålls i en petriskål, och de immobiliseras genom kallbehandling (dvs de placeras på is i några minuter). Den bakre delen av insektskroppen pressas med ett par pincett för att skapa en svullen yta som är lämplig för injektion. Injektionsvinkeln är grund för att förhindra att inre insektsvävnader skadas, vilket skulle leda till insektsdöd på grund av vårdslös hantering. Bilder görs med BioRender grafisk programvara (https://biorender.com). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Generering av axeniska Steinernema carpocapsae entomopatogena nematoder. Ena halvan av en uppdelad petriskål innehåller en gräsmatta av Xenorhabdus nematophila ΔrpoS-bakterier på lipidagar och infektiösa ungdomar av S. carpocapsae nematoder. Denna in vitro-metod inducerar de infektiösa ungarna att bli vuxna nematoder, som senare kommer att producera ägg som kommer att kläckas för att ge upphov till den nya generationen parasiter. När ett stort antal nygenererade S. carpocapsae-infektiösa ungdomar uppträder i denna del av den delade petriskålen tillsätts vatten till den andra halvan av skålen tillsammans med en bit filterpapper för att underlätta migreringen av nematoderna. Bilder är gjorda med BioRender grafisk programvara (https://biorender.com) Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Bild 4: Bryt nålspetsen. Nålens spets är vanligtvis stängd. Det korrekta flödet av nukleinsyralösningen kontrolleras innan den faktiska injektionen utförs. Placera en droppe halokarbonolja på en glasskiva. Placera ett kapillärrör som används för att göra nålen vertikalt som visas i figuren. Sätt kapillären i fokus vid 40x och för försiktigt ner nålen i plan med kapillären. Rör försiktigt nålspetsen mot kapillären. Detta skapar en öppning för det smidiga flödet av dsRNA. Om ingen vätska kommer ut, utför ett snabbt på-av-kväveflöde med hjälp av fotställdonet. Trycket från kvävet och nålspetsens kontakt med kapillären kommer att bryta nålen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Injektionsställe. Gonaden av H. bakteriophora migrerar dorsalt från den ventrala vulvalpositionen och migrerar sedan tillbaka till ventralpositionen. De migrerande armarna korsar varandra nära vulva och sträcker sig bortom vulva på vardera sidan. Vid cirka 48 h är de utsträckta armarna på gonaden hos en ung vuxen, odlad från IJ, synliga nära vulva. Mikroinjektion utförs vid denna position. Skalstreck: 0,1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Validering av Heterorhabditis bakteriophora axenisering. Framgången för axeniseringsförfarandet uppskattades genom att bekräfta frånvaron av Photorhabdus luminescens bakterieceller i behandlade H. bakteriofainfekterande ungdomar. För detta homogeniserades en pellet av cirka 500 ytsteriliserade maskar från stamkulturen (symbiotisk) eller maskar som hade genomgått axeniseringsprocessen (axenisk). Därefter spreds homogenatet på agarplattor och efter en 24-timmars inkubation övervakades utseendet på bakteriekolonier (kolonibildande enheter, CFU). Brist på bakteriekolonier på plattorna tyder på att H. bakteriophora nematoder är fria från sina P. luminescens symbiotiska bakterier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: RNAi-medierad knockdown av nol-5-genen . RNAi medierad knockdown av H. bacteriophora nol-5 gen resulterar i en fenotyp utan bakterielinje. Avkomman av en vild typ, icke-injicerad H. bakteriophora nematod (a) innehåller ägg i sina gonader. Avkomman av en vild typ, nol-5 RNAi injicerad H. bakteriophora nematod (b) innehåller inga ägg i sina tomma gonader på grund av knockdown av nol-5 RNA. Skalstreck: 0,1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Att förstå den molekylära grunden för entomopatogen nematodinfektion och insektsanti-nematodimmunitet kräver separation av parasiterna från de mutualistiskt associerade bakterierna 13,15,16. De entomopatogena nematoderna H. bacteriophora och S. carpocapsae lever tillsammans med de gramnegativa bakterierna P. luminescens respektive X. nematophila 17. Båda bakteriearterna har tidigare visat sig koda för faktorer som ger patogenicitet genom att rikta in sig på insektsvävnader och motverka det medfödda immunsystemet vid infektion18,19. Detta hindrar ansträngningarna att identifiera de strategier som nematoder har utvecklats för att interagera med insektsvärden. Därför kan identifiering och funktionell karakterisering genom gen knockdown av nematodkomponenterna som också deltar i infektionsprocessen underlättas genom generering av axeniska maskar. Här presenteras effektiva protokoll för att producera axeniska entomopatogena nematoder och utföra RNAi-gendämpning i H. bakteriofa.

Ett kritiskt steg i båda protokollen för att framgångsrikt generera axeniska nematoder är ytsterilisering av H. bakteriofora och S. carpocapsae IJs14,20. Denna del av metoden innefattar behandling av maskarna med blekmedelslösning och anses vara avgörande för axeniseringsprocessens framgång eftersom den tar bort P. luminescens och X. nematophila-bakterierna från nematodkutikeln. Detta är ett viktigt förfarande för att säkerställa att endast de mutualistiska bakterierna på maskarnas yta rensas och inte de som inuti parasiterna. Slutförandet av detta steg kräver uppmärksamhet eftersom förlängd blekmedelsbehandling kommer att påverka nematodens överlevnad.

En likhet med det nuvarande axeniseringsprotokollet för S. carpocapsae nematoder med en tidigare etablerad metod är användningen av X. nematophila ΔrpoS mutantbakterier som inte kan kolonisera maskarna21. En skillnad mellan den nuvarande metoden och ett tidigare rapporterat protokoll, som introducerade ytsteriliserade nematodägg på näringsagar22, är tillsatsen av antibiotika i odlingsmediet för att hämma mikrobiell kontaminering som sannolikt skulle påverka nematodtillväxt och kondition.

RNAi genom mikroinjektion är en enkel och pålitlig metod för att leverera RNA till oocyterna. Vätskesprängningen inuti gonaden ger visuell bekräftelse på frisättningen av nukleinsyralösningen under injektionsprocessen. Det visades att RNAi genom mikroinjektion är signifikant bättre än RNAi genom blötläggning. Detta beror förmodligen på RNAi-lösningens förmåga att nå oocyter som befinner sig i olika stadier av differentiering inuti gonaden.

När du optimerar processen rekommenderas att testa olika koncentrationer av RNA-lösning för bättre resultat. Olika koncentrationer av RNA från 50 ng/μl till 10 μg/μl testades. Det visade sig att en koncentration på 6 μg/μl fungerade bättre än andra koncentrationer. För att öka RNA-utbytet under in vitro-transkriptionssteget modifierades protokollet från en 4 timmars inkubationsperiod till 16 timmar. Detta resulterade i en betydande ökning av det slutliga utbytet av RNA. En av nyckelfaktorerna för framgångsrik mikroinjektion är den tid som en nematod spenderar på injektionsdynan. Mindre tid resulterar i en frisk överlevande nematod och frisk avkomma med ökad chans att observera den avsedda fenotypen.

Det nuvarande protokollet för odling och genetiskt manipulering av entomopatogena nematoder är ett viktigt bidrag för framtida studier inom områdena nematologi, immunologi och värd-parasitinteraktioner. Att kombinera tillvägagångssätt som möjliggör manipulation av entomopatogena nematoder kommer att leda till upptäckten av de genetiska faktorer som definierar samspelet mellan nematodeffektormolekyler och värdimmunsignalkomponenter som kodar för faktorer med anti-nematodegenskaper. Det kommer vidare att avgöra vilka viktiga nematodmolekylära komponenter som bestämmer det symbiotiska förhållandet med de relaterade bakterierna. Att svara på dessa frågor är viktigt för att förbättra jordbruksmetoder och utveckla nya medel för kontroll av mänskliga parasitiska nematoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Vi tackar medlemmar av institutionen för biologiska vetenskaper vid George Washington University för kritisk läsning av manuskriptet. Alla grafiska figurer gjordes med BioRender. Forskning i I. E., J. H. och D. O'H. laboratorier har fått stöd av George Washington University och Columbian College of Arts and Sciences som underlättar medel och tvärvetenskapliga forskningsfonder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose VWR 97062-244
Ambion Megascript T7 Kit Thermo Fisher Scientific AM1333
Ampicillin Fisher Scientific 611770250
Cell culture flask T25 Fisher Scientific 156367
Cell culture flask T75 Fisher Scientific 156499
ChoiceTaq Mastermix Denville Scientific C775Y42
Corn oil VWR 470200-112
Corn syrup MP Biomedicals/VWR IC10141301
Culture tube 10 mL Fisher Scientific 14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf E5242956003
Ethanol Millipore-Sigma E7023
Falcon tube 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Femtojet Microinjector Eppendorf 5252000021
Filter paper VWR 28320-100
Galleria mellonella waxorms Petco -
Glass coverslip Fisher Scientific 12-553-464 50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700 Sigma H8898
Inoculating loop VWR 12000-806
Kanamycin VWR 97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-3 1.0 mm
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500 LB agar miller powder 500 g
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500 LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope Microscope Central -
MacConkey medium Millipore-Sigma M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo Fisher Scientific AM1908
Microcentrifuge tube VWR 76332-064 1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Needle syringe VWR BD305155 22G
Nutrient broth Millipore-Sigma 70122-100G
Parafilm VWR 52858-076
Partitioned Petri dish VWR 490005-212
PBS VWR 97062-732 Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers Azenta -
Pestle Millipore-Sigma BAF199230001 Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm VWR 25384-092 60 x 15 mm
Petri dish 10 mm VWR 10799-192 35 x 10 mm
Proteose Peptone #3 Thermo Fisher Scientific 211693
Yeast extract Millipore-Sigma Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
  2. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
  3. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
  4. Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).
  5. Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
  6. Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202 (2021).
  7. Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
  8. Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
  9. Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), (2021).
  10. Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
  11. Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660 (2021).
  12. Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).
  13. Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
  14. Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
  15. Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
  16. Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
  17. Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
  18. Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
  19. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568 (2020).
  20. Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
  21. Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
  22. McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 181 entomopatogena nematoder heterorhabdit Steinernema parasitism värd-parasitinteraktioner
Odling och genetiskt manipulerande entomopatogena nematoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heryanto, C., Ratnappan, R.,… More

Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes. J. Vis. Exp. (181), e63885, doi:10.3791/63885 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter