Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Brug af mikrofluidik og fluorescensmikroskopi til at studere samlingsdynamikken i enkeltaktinfilamenter og bundter

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63891
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

Summary

Vi præsenterer protokoller for enkle actinfilamentmikrofluidiske assays i kombination med fluorescensmikroskopi, der gør det muligt for en nøjagtigt at overvåge individuelle actinfilamenter i realtid, mens de sekventielt udsættes for forskellige proteinopløsninger.

Abstract

For at dechiffrere de komplekse molekylære mekanismer, der regulerer samlingen og demonteringen af actinfilamenter, er det et stort aktiv at overvåge individuelle reaktioner lever under velkontrollerede forhold. For at gøre dette er der opstået levende enkeltfilamenteksperimenter i løbet af de sidste 20 år, hovedsagelig ved hjælp af TIRF-mikroskopi (total internal reflection fluorescens), og har givet en række nøgleresultater. I 2011 introducerede vi enkle mikrofluidik i disse assays for yderligere at udvide mulighederne for disse eksperimenter og for at undgå tilbagevendende problematiske artefakter. Denne undersøgelse beskriver vores grundlæggende protokol, hvor individuelle actinfilamenter er forankret i den ene ende til den passiverede dækslipoverflade, justeres med strømmen og successivt kan udsættes for forskellige proteinopløsninger. Vi præsenterer også protokollerne til specifikke applikationer og forklarer, hvordan kontrollerede mekaniske kræfter kan påføres takket være den viskøse træk i den flydende opløsning. Vi fremhæver de tekniske forbehold i disse eksperimenter og præsenterer kort mulige udviklinger baseret på denne teknik. Disse protokoller og forklaringer sammen med nutidens tilgængelighed af brugervenligt mikrofluidikudstyr bør give ikke-specialister mulighed for at implementere dette assay i deres laboratorier.

Introduction

Samlingen og demonteringen af actinfilamenter og actinfilamentnetværk styres af flere biokemiske reaktioner og afhænger af den mekaniske kontekst. For at få indsigt i disse komplekse mekanismer er det uvurderligt at kunne observere individuelle reaktioner på individuelle filamenter (i tilstrækkeligt stort antal). I løbet af de sidste årtier har observation af dynamiske actinfilamenter i realtid, hovedsagelig ved hjælp af tirf-mikroskopi (Total Internal Reflection Fluorescence), vist sig som en nøgleteknik og har givet en imponerende liste over resultater, der ikke kunne have været opnået med biokemiske analyser i bulkopløsning1.

For at opnå dette skal man opretholde fluorescerende mærkede actinfilamenter tæt på overfladen af mikroskopdækslet, mens man udsætter dem for opløsninger af actinbindende proteiner (ABP'er), som også kan mærkes fluorescerende. Dette giver et middel til at overvåge begivenheder, der finder sted på individuelle filamenter under velkontrollerede biokemiske forhold, og dermed kvantificere reaktionshastigheder. Der bør dog overvejes en række specifikke begrænsninger. Kunstig vedligeholdelse af filamenter tæt på overfladen, ofte takket være flere forankringspunkter eller ved hjælp af et trængselsmiddel såsom methylcellulose, kan ændre deres adfærd (f.eks. Forårsage pauser i deres polymerisation og depolymerisering2). Sporing af konturen af hvert filament kan være udfordrende, især hvis nye filamenter eller filamentfragmenter akkumuleres i synsfeltet over tid. Reaktionerne finder sted i et endeligt volumen, hvor koncentrationen af actinmonomerer og ABP'er kan variere over tid, hvilket potentielt gør det vanskeligt at udlede nøjagtige hastighedskonstanter. Endelig er det vanskeligt at forny eller ændre opløsningen af ABP'er på mindre end 30 s og vil ofte føre til inhomogent proteinindhold i prøven.

For lidt over 10 år siden, inspireret af hvad der allerede blev gjort for at studere individuelle Deoxyribonukleinsyre (DNA) tråde3, introducerede vi en ny teknik baseret på mikrofluidik til at observere og manipulere individuelle actinfilamenter4. Det giver en mulighed for at omgå de førnævnte begrænsninger af klassiske enkeltfilamentteknikker. I disse mikrofluidiske assays dyrkes actinfilamenter fra spectrin-actinfrø adsorberet på dækslippen. Filamenter er således forankret i den ene ende kun til bunden af det mikrofluidiske kammer og svinger over overfladen uden at klæbe. Filamenter flugter med strømmen af indgående opløsninger, hvorved overvågningen af deres konturlængde lettes, og de opretholdes i et lavt område over dækslen, hvor TIRF kan anvendes. Forskellige opløsninger strømmer samtidig ind i kammeret uden blanding, og filamenterne kan udsættes for dem sekventielt og hurtigt.

Her foreslår vi en række grundlæggende protokoller til opsætning af enkelt-actin-filament mikrofluidik-assays i laboratoriet. Dækslips og mikrofluidikkamre kan fremstilles på forhånd (om en halv dag), og selve eksperimentet, hvor flere biokemiske forhold kan testes, udføres på mindre end en dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af mikrofluidkammer

  1. Vælg en SU-8 masterform med flere kammermønstre. Typiske kamre er krydsformede med tre indløb og et udløb, 20 μm højt og 800 μm bredt (figur 1). Sådanne masterforme kan købes hos eksterne virksomheder eller fremstilles i akademiske laboratorier (f.eks. Gicquel, Y. et al.5).
  2. Placer tape rundt om kanten af formen.
    1. Sæt ~ 50 cm lang, 19 mm bred, standard gennemsigtig kontortape (se Materialetabel) på en bænk, klæbrig side opad. Placer formen lodret i den ene ende og langs båndets midterlinje.
    2. Rul formen til den anden ende af båndet for at skabe en 1 cm kant rundt om formen. Fold båndet ned over bunden af formen.
  3. Forbered polydimethylsiloxan (PDMS) opløsning.
    1. I en engangsvejningsskål hældes direkte 25-30 g PDMS-base (materialetabel). Tilsæt 10% PDMS-hærdningsmiddel (materialetabel) med en pasteur-engangspipette af plast.
    2. Bland manuelt og grundigt med en plastikpind. Sørg for, at hærdningsmidlet er godt inkorporeret i PDMS-basen, selvom omrøring skaber masser af bobler.
  4. Afgas PDMS-opløsningen i en vakuumsikkator (materialetabel) i mindst 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Bobler vil udvide sig, stige til overfladen og briste, når vakuumet er brudt.
  5. Hæld PDMS-opløsningen over SU-8-formen. Brug en plastikpind til at skrabe og overføre så meget af blandingen som muligt.
  6. Degas PDMS for anden gang (5 min i vakuumdisikatoren). Sørg for at slippe af med de fleste bobler (et par små bobler på den øverste overflade er fine).
  7. Formen anbringes i en ovn ved 70 °C i mindst 5 timer, så PDMS kan retikuleres og størknes.
  8. Fjern faste PDMS-kamre fra formen.
    FORSIGTIG: Siliciumskiver til SU-8-forme er ekstremt skrøbelige, så der skal udvises stor forsigtighed, når PDMS adskilles fra wafere. Arbejd på en hård, plan overflade, og hold waferen flad på overfladen.
    1. Lav et cirkulært snit i PDMS med et barberblad, ca. 1 cm væk fra kanten af formen. Alle mønstre skal være mindst 0,5 cm inde i snittet. Skræl forsigtigt den centrale PDMS-blok af med blide slæbebåde.
      FORSIGTIG: Når du skræller af, skal du holde SU-8-formen flad på bordpladen for at forhindre, at den går i stykker.
    2. Placer PDMS på ren aluminiumsfolie, den støbte overflade vender mod aluminiumsfolien, for at beskytte overfladen mod støv og for at gøre mønstre mere synlige.
  9. Vælg og skær et kammer med et barberblad mindst 0,5 cm væk fra mønsteret. Den resulterende PDMS-blok er omkring 0,5 cm høj, 1,5 cm bred og 3 cm lang. Pierce tre indløb og et udløb med en biopsi punch 0,75 mm I.D. (Tabel over materialer).
  10. Rengør PDMS-kammeret med ultrarent ethanol (materialetabel) og lufttørret ved hjælp af en sikkerhedsblæsepistol (materialetabel). Placer PDMS med mønsteret opad i en ren petriskål, og luk fadet med låget.

2. Rengøring af glasovertræk

BEMÆRK: Her er en standard coverlip rengøringsprocedure, baseret på en række sonikeringstrin, detaljeret. Andre glasovertræk er beskrevet i mange andre publikationer, der kan opnå lignende tilfredsstillende resultater 6,7,8,9.

  1. Placer 10-20 dæksler (40 mm lange) på en polytetrafluorethylen (PTFE) holder (Materialebord). Dækslipsene sonikeres i 0,5 L 2% glasrensningsopløsning (materialetabel) i et 1 L glasbægerglas (35 °C, 30 min).
  2. Bortskaf glasrenseopløsningen, og dækslerne skylles grundigt med dH2O i mindst tre på hinanden følgende 0,5 L bade.
  3. 0,5 L 2 M KOH klargøres i et 1 L glasbægerglas. Soniker dækslips i KOH (RT, 30 min). Bortskaf KOH og skyl dækslerne med dH2O i mindst tre 0,5 L bade.
    FORSIGTIG: Brug passende laboratoriesikkerhedsbeskyttelsesudstyr (handsker, briller og kittel).
  4. Overfør og sonikere dækslerne i 0,5 L ultrarent ethanol (RT, 30 min). Coverslips kan opbevares i ethanol i op til 2 uger. Luk bægerglasset med termoplastisk film (materialetabel) for at forhindre fordampning. Før brug tørres dækslippen med luftstrøm.

3. PDMS-kammersamling

  1. Forvarm kogepladen til 100 °C. Anbring op til tre rengjorte PDMS-kamre og glasovertræk i en ren petriskål. Anbring den åbne petriskål i en dyb ultraviolet (UV) rengøringsmiddel (λ = 185 nm, se Materialetabel) og udsæt den for UV-lys i 3-5 min.
    BEMÆRK: Alternativt kan PDMS-kamre og dæksler udsættes for luft- eller iltplasma i 30 s.
  2. Placer FORSIGTIGT PDMS-kammeret over dækslen. Sørg for, at de to overflader, der er i kontakt, er direkte udsat for UV. PDMS klæber automatisk til glasset, og kammeret bliver tydeligt synligt.
  3. For at fjerne enhver luft, der er fanget ved PDMS-coverslip-grænsefladen, skal du trykke meget forsigtigt på overfladen med en finger. For en strammere binding skal du trykke stærkere over hjørner og sider. Sørg for, at kammerets loft ikke kommer i kontakt med glasoverfladen.
  4. Placer kammeret med glasbunden vendt mod kogepladen ved 100 °C i 5 min. Efter dette trin bliver glas-PDMS-bindingerne permanente, og kamre kan kun bruges én gang. Brug kammeret med det samme eller opbevar det i en ren petriskål i op til en uge.

4. [VALGFRIT] Direkte passivering og funktionalisering

BEMÆRK: Afhængigt af applikationen kan kamre passiveres og funktionaliseres enten når de er tilsluttet den mikrofluidiske styreanordning (se Materialetabel) eller ved manuelt at injicere opløsninger direkte i kammeret med en pipette, inden den tilsluttes den mikrofluidiske enhed. Sidstnævnte giver fordelen ved at forbruge mindre reagens og undgå potentiel forurening ved at strømme opløsningen gennem polyetheretherketon (PEEK) slangen af den mikrofluidiske enhed. I alle de følgende trin injiceres opløsninger ved direkte at stikke pipettespidsen ind i udløbet. For at undgå at skabe bobler inde i kammeret skal du sørge for at have en lille dråbe, der stikker ud af pipettespidsen, når spidsen sættes i PDMS-kammerets udløb. Fjern ligeledes pipettespidsen, før hele volumenet er blevet injiceret.

  1. Der injiceres 20 μL PLL-PEG (1 mg/ml i fosfatbufferet saltvand (PBS)). Inkuberes i mindst 1 time (eller natten over) ved RT. For at forhindre fordampning skal du placere PDMS-kammeret i en fugtig kasse (f.eks. En tom tipboks med vand i det nederste rum og PDMS-kammeret på tippeplatformen).
  2. 20 μL spectrin-actinfrø injiceres 100 pM (i F-buffer, se tabel 1 og tabel 2). Vent ikke mere end 1 minut. Juster frøkoncentrationen og timingen for at indstille frøoverfladetætheden, høj nok til stor statistik og lav nok til, at filamenter ikke overlapper hinanden.
    BEMÆRK: Alternativt, hvis spectrin-actinfrø ikke er tilgængelige, skal du bruge biotinfunktionaliserede korte filamentsegmenter, der vil blive immobiliseret på en strøptoavidinbelagt dækslip 9,10.
  3. [VALGFRIT] 20 μL 5 % bovint serumalbumin (BSA) injiceres i F-buffer. Forlad på RT i 10 min.
  4. [VALGFRIT] 20 μL 1 mg/ml β-kasein injiceres i F-buffer. Forlad på RT i 10 min.
    BEMÆRK: Følg trin 4.3 og/eller 4.4 for yderligere at passivisere kammeret. Valget af passivering afhænger af de anvendte proteiner og fungerer ikke lige godt på alle ABP'er. Ved brug af actin alene er PLL-PEG eller BSA tilstrækkelig.

5. Tilslut mikrofluidisk enhed

BEMÆRK: Brug et trykbaseret mikrofluidisk system med op til fire kanaler til at styre strømme i mikrofluidkammeret (figur 1A, se Materialetabel). For at undgå, at der dannes bobler i mikrofluidrøret og forstyrrer flowstabiliteten, afgasses alle løsninger. Der anbringes 5 ml dH20 og 10 ml F-buffermateriale i en vakuumsikkator, der er tilsluttet en vakuumpumpe (ultimativt vakuum <250 mbar), og afgasser i mindst 1 time ved RT.

  1. Skyl indløb + udløbsrør med dH2O (500 μL, 300 mbar).
  2. Fyld alle 2 ml reservoirrør (se materialetabel) med 300 μL F-buffer. Indstil trykket til 300 mbar og lad fem til otte dråber gå til spilde. Gentag for hver kanal, og indstil trykket til 0.
  3. Tilslut stikkontakten og skyl kammeret grundigt.
    1. Indstil trykket for reservoirrøret 4 (udløb) til 50 mbar. Når en dråbe kommer ud fra slangeenden, skal du forbinde slangen til udløbet af PDMS-kammeret. Væsken fylder i kammeret og kommer ud af alle indløb.
    2. [VALGFRIT] Hvis kammeret er blevet direkte passiveret (afsnit 4), indstilles trykket til 100 mbar for at skylle kammeret med 50-100 μL F-buffer (3-5 min). Fjern overskydende væske ved indløb med et rengøringsvæv.
    3. Indstil trykket til 20 mbar.
  4. Tilslut indløb.
    1. Indstil trykket for reservoirrøret 1 til 50 mbar. For at undgå at indføre luftbobler skal du sikre dig, at der kommer en dråbe ud af slangen og PDMS-indløbet.
    2. Tilslut slangen til indløb 1 (de to dråber smelter sammen, når de tilsluttes). Indstil trykket til 30 mbar.
    3. Trin 5.4.1-5.4.2 gentages for at tilslutte indgang 2 og 3.
  5. Indstil trykket for alle indløb til 20 mbar og udløbstrykket til 0 mbar. Sørg for, at strømningshastighederne i indløbene er nogenlunde ens (se afsnittet Fejlfinding).

Figure 1
Figur 1: Injektion af opløsninger gennem et mikrofluidisk kammer. (A) Standard mikrofluidisk opsætning til enkelt actinfilamenter eksperimenter. Proteinopløsninger, der placeres i reservoirer 1-3, skubbes ind i kammeret ved at justere trykket i gasfasen. De genererede strømningshastigheder måles af flowmålere. Inde i de mikrofluidiske kamre blandes opløsninger ikke og optager plads afhængigt af de relative tryk, der påføres (her lige tryk på alle indløb). Typiske dimensioner: reservoirrør indeholder op til 2 ml opløsning. PEEK-rør (0,25 mm indvendig diameter) forbinder reservoirerne med flowmålerne (efter 10 cm slange) og derefter til PDMS-kammeret (efter yderligere 70 cm). Siliciumrør og rørkoblinger i rustfrit stål bruges til at forbinde PEEK-slangen til PDMS-indløbene. Den vigtigste mikrofluidiske kanal er 20-60 μm høj, omkring 1 mm bred og 1 cm lang. (B,C) Flowprofiler inde i det mikrofluidiske kammer. (B) Væsken genererer en parabolsk profil over kammerhøjden: v(z) = 6z(h-z)R/h3w, hvor h og w er kammerhøjden og bredden, og R er den samlede strømningshastighed. Bund: Enkelt actinfilament polymeriseret fra overfladeforankrede spectrin-actinfrø. (C) Når kammerbredden er betydeligt større end dens højde, er strømmen næsten ensartet over kammeret, undtagen ved PDMS-overfladerne, hvor den går til nul. Klik her for at se en større version af denne figur.

6. Konfiguration af opsætningen med standard flowhastigheder

BEMÆRK: Det computerstyrede tryksystem muliggør nem og præcis justering af trykket på alle indløb / stikkontakter, der er tilsluttet PDMS-kammeret, derfor styring af indgående og udgående strømningshastigheder. Forudindstillede konfigurationer kan gemmes og tændes / slukkes med et enkelt museklik. Nedenfor er de anbefalede konfigurationer (medmindre andet er angivet, er udløbstrykket indstillet til 0 mbar). Se tabel 3 for forventede flowhastigheder for disse forudindstillede konfigurationer. De tryk, der er angivet her, skal justeres afhængigt af kammergeometrien og systemkonfigurationen.

  1. Skift: Brug denne forudindstilling, når du skifter et eller flere reservoirer. Det skaber en mild bagstrøm i slangen af interesse for at forhindre introduktion af bobler.
    1. Indstil alle indløbstryk til 12 mbar og udløbstryk til 5 mbar (figur 2B).
  2. High Flow 'Alle': Brug denne forudindstilling til hurtigt at injicere tre opløsninger parallelt. De når kammeret inden for 4 min.
    1. Indstil alle indløbstryk til 150 mbar.
  3. High Flow 'x': Brug denne forudindstilling til hurtigt at injicere en opløsning. Det når kammeret inden for 3 minutter (figur 3A-C).
    1. Indstil indløbstrykket 'x' til 150 mbar (~ 15 μL / min). Trykket i de andre indløb justeres til omkring 100 mbar, således at den resulterende strømningshastighed i disse indløb er ~ 500 nL / min.
  4. Mid Flow 'Alle': Brug denne forudindstilling til at sætte systemet på pause.
    1. Indstil alle indløb til 20 mbar (figur 2A).
  5. Midtstrøm 'x': Brug denne forudindstilling til at lade løsningen 'x' udfylde det meste af hovedkanalbredden (se figur 2C, D), mens du begrænser de andre indløbsløsninger til kanalsiderne. Actinfilamenter i kammeret vil således kun blive udsat for den biokemiske tilstand, der pålægges af opløsning 'x'.
    1. Indstil indløbstrykket 'x' til 12 mbar. Indstil trykket i de andre indløb og juster til ~ 9 mbar, således at deres respektive strømningshastigheder er ~ 150 nL / min.

Figure 2
Figur 2: Det tryk, der påføres hvert reservoir, styrer skillevæggen/den rumlige fordeling af opløsninger inde i det mikrofluidiske kammer. (A) Med lige tryk på reservoirerne optager hver opløsning en tredjedel af kammeret. (B) Ved udskiftning af et reservoirrør (her reservoir 3) falder det effektive tryk ned til nul, hvilket skaber en bagudstrømning. (C,D) Forøgelse af det relative tryk på et af reservoirerne muliggør eksponering af glasoverfladen til en enkelt opløsning. Synsfeltet i midten af kammeret kan sekventielt eksponeres for opløsning 1 og 2 ved at skifte mellem konfiguration Mid Flow 1 (C) og Mid Flow 2 (D). Klik her for at se en større version af denne figur.

7. Ændring af løsning 'x'

BEMÆRK: Som vist i figur 3A-C er det vigtigt at huske på, at opløsninger tager minutter at strømme fra et reservoirrør til kammerets hovedkanal. Denne minimale "døde" tid pålægges af væskevolumenet i slangen og strømningsprofilen i slangen (figur 3A-C).

  1. Forbered 200-300 μL opløsning i et nyt reservoirrør. Indstil tryk til Skift indstilling (se afsnit 6).
  2. Skru reservoirrøret af indløb 'x'. Opløsningen i slangen vil langsomt strømme baglæns, fra kammeret til den frie slangespids. Den målte strømningshastighed bliver negativ (figur 2B).
  3. Når der er dannet en lille dråbe ved slangespidsen, skrues det nye rør i med den friske opløsning. Når røret er strammet korrekt til tryksystemet, vender indløbets strømningshastighed tilbage til positiv.
  4. Indstil trykindstillingen til High Flow 'x'.
  5. Afhængigt af den mikrofluidiske konfiguration og kammergeometrien skal du vente i 3-5 minutter på, at opløsningen fylder slangen helt ud og når kammeret.
  6. [VALGFRIT] Følg denne proces ved at måle stigningen i fluorescens over tid (figur 3C).

Figure 3
Figur 3: Forsinket ankomst af opløsninger fra reservoirerne til PDMS-kammeret og hurtig ændring af biokemiske forhold. (A-C) Forsinket ankomst af opløsninger fra reservoirerne til PDMS-kammeret. (A) Afhængigt af kammergeometrien, rørlængden og det påførte tryk ved indløbet/indløbene er udskiftningen af en opløsning med en anden ikke øjeblikkelig. Efter ændring af reservoirrøret til et, der indeholder en fluorescerende opløsning (0 min), udfylder opløsningen gradvist slangen (0,4 min) og PDMS-kammeret (1-2 min). Vejledende timing er angivet for et 150 mbar påført tryk, 80 cm PEEK-rør og et 1600 μm bredt, 20 μm højt PDMS-kammer. (B) Den parabolske strømningsprofil inde i PEEK-slangen genererer en effektiv gradient af fluorescens langs slangens radiale profil og inde i kammeret (se også figur 1B). (C) Forsinket ankomst af opløsninger kan kvantificeres ved at måle baggrundsepisodenssignalet i kammeret som en funktion af tiden. Eksperimentelle betingelser: 0,5 μM 10% Alexa-568-mærket G-actin injiceres med 150 mbar gennem en flowmåler og 80 cm PEEK-slange. (D,E) Hurtig ændring af biokemiske forhold. (D) Mønster af indgående opløsninger under to Mid Flow-forhold. (E) Forøgelse af baggrundsfluorescens som aflæsning af actinkoncentrationen. Tid t = 0 indstilles som begyndelsen af fluorescensforøgelse. Løsning 1: 0,5 μM 10% Alexa-488-mærket G-actin, opløsning 2: F-buffer. (C,E) PDMS-kammer: 20 μm højt og 1600 μm bredt. Epifluorescensintensiteten, ~ 2 μm over overfladen, blev kvantificeret ved at beregne gennemsnittet af signalet over hele synsfeltet, normaliseret til 0 i fravær af fluorofor og 1 ved maksimal intensitet. Klik her for at se en større version af denne figur.

8. Grundlæggende enkeltfilamentforsøg: Adenosindiphosphat (ADP)-actin pigget endedepolymerisering

BEMÆRK: Dette afsnit forudsætter et ikke-funktionaliseret kammer (kun afsnit 5). Hvis kammeret er blevet direkte funktionaliseret (afsnit 4), skal du starte med trin 8.4.

  1. Overfladefunktionalisering med actinfilamentfrø:
    1. Opløsning 3 ændres til 200 μL 50 pM spectrin-actinfrø11 i F-buffer (se punkt 7).
      BEMÆRK: Alternativt, hvis spectrin-actinfrø ikke er tilgængelige, kan man bruge biotinfunktionaliserede korte filamentsegmenter, der vil blive immobiliseret på en strøptondadinbelagt dækslip (se 9,10 for detaljer).
    2. Injicer i 2 minutter med High Flow 3.
      BEMÆRK: Juster koncentrationen og tiden afhængigt af den endelige frøtæthed.
  2. Passivering af overfladen:
    1. Skift rør 3 med 300 μL 5% BSA i F-buffer.
    2. Injicer i 5 minutter ved High Flow 3, efterfulgt af 5 minutter ved Mid Flow 3. I løbet af dette andet trin skal du reducere trykket i kanal 1 og 2 til 7-8 mbar for at få et modflow ~ -100 nL / min, så hele kammeroverfladerne BSA-passiveres.
      BEMÆRK: Da BSA-opløsningen er mere tyktflydende, skal trykket justeres i overensstemmelse hermed.
  3. Skift rør 3 til F-buffer og skyl kanalen (5 min, High Flow 3).
  4. Forbered følgende 200-300 μL opløsninger, hvor alle proteiner fortyndes i F-buffer:
    Indløb 1, polymerisationsopløsning: 1 μM 10% Alexa-488 mærket G-actin, 1 μM profilin (tabel 1).
    Indløb 2, aldrende opløsning: 0,15 μM 10% Alexa-488 mærket G-actin.
    Indløb 3, depolymeriseringsopløsning: kun F-buffer.
    BEMÆRK: Profilin bruges her til at forhindre spontan kimdannelse og til at opretholde en konstant koncentration af G-actin.
  5. Skift rør 1 til 3 (afsnit 7). Injicer ved hjælp af forudindstillingen High Flow All i 3-4 min. De tre løsninger har nu fyldt PEEK-slangen og nået kammeret (figur 3A). Glasoverfladen kan udsættes for enhver indløbsopløsning uden dødtid (<1 s, figur 3D, E).
  6. Tænd for mikroskopet. Indstil indstillingerne: 150 mW 488 nm excitationslaser ved 10% -20% effekt, 100-200 ms kameraeksponeringstid, 200-300 nm TIRF-penetrationsdybde, 60x mål. Disse indstillinger bruges i hele manuskriptet.
  7. Polymerisation af filamenter (figur 4A):
    1. Indstil trykindstillingen til Mid Flow 1 i ~10 min.
    2. [VALGFRIT] Optag polymerisation (1 ramme / 20 s, TIRF). Filamenter skal polymerisere ved ca. 10 underenheder/sekund (sub/s)1,12.
  8. Filament aldring: Indstil trykindstillingen til Mid Flow 2 i 15 min. Ved den kritiske koncentration, 0,15 μM G-actin, forbliver filamentlængden konstant, og filamenter bliver til >99% ADP-F-actin4.
  9. Depolymerisering (figur 4A):
    1. Start anskaffelsen ved 1 frame/5 s i epifluorescens-tilstand. Da der er en meget lav fluorescensbaggrund i kanal 2 og 3, er det ikke nødvendigt at bruge TIRF.
    2. Efter en til to billeder skal du skifte til Mid Flow 3. Filamenter skal depolymeriseres ved omkring 10 sub/s (reference12).
  10. For at nulstille eksperimentet skal du bryde alle fluorescerende mærkede filamenter ved kontinuerligt at udsætte dem for laseren ved maksimal effekt i ~ 2 minutter. For at teste forskellige forhold skal du ændre opløsning 1, 2 eller 3 og injicere dem (High Flow, 3-4 min). Gentag trin 8.7-8.9.

9. Andre forsøg med enkeltfilament

  1. Test af interaktioner mellem ABP'er og F-actin
    BEMÆRK: Mikrofluidik er med succes blevet brugt til at kvantificere aktiviteten af flere sidebindende ABP'er, såsom cofilin, tropomyosin og Arp2/3. Efter protokollen i afsnit 8:
    1. Skift kanal 3 til den fluorescerende ABP af interesse i F-buffer. Injicer (High Flow 3, 3 min).
    2. Filamentpolymerisation: Indstil trykindstillingen til Mid Flow 1 i 10 min.
    3. ABP-binding: Start erhvervelse med TIRF. Juster billedhastigheden afhængigt af ABP-koncentrationen. Efter 1-2 billeder skal du skifte til Mid Flow 3.
      BEMÆRK: Afhængigt af ABP kan det også være muligt hurtigt (f.eks. i mindre end 5 s) at skifte til Mid Flow 2 for yderligere at reducere baggrundsfluorescensen, når du tager et billede.
    4. ABP ikke bindende: Mens du fortsætter overtagelsen, skal du skifte til Mid Flow 2.
  2. Polymerisation med formin i den frie pigtrådsende
    BEMÆRK: Formins har vist sig at påvirke filament pigtrådspolymerisation. Mikrofluidik er specielt tilpasset til at måle forminbinding og ikke-bindende hastigheder og deres indvirkning på filamentforlængelse.
    1. Forbered følgende løsninger:
      Kanal 1: 10 nM formin i F-buffer (tabel 1).
      Kanal 2: 1 μM 10% Alexa-488 mærket G-actin, 4 μM profilin.
      Kanal 3: F-buffer.
    2. Skift rør 1, 2 og 3 (afsnit 7). Injicer ved hjælp af forudindstillingen High Flow All i 3-4 min.
    3. Initier filamentpolymerisation: Indstil trykindstillingen til Mid Flow 2 i 2 min.
    4. Forminbinding til filament pigtråd: Indstil trykindstillingerne til Mid Flow 1 i 30 s.
    5. Forminmedieret polymerisation: Indstil trykindstillingen til Mid Flow 2. Med formin mDia1 i deres pigtråd skal filamenter polymerisere ved omkring 50 sub / s 13,14,15.
  3. Polymerisation/depolymerisering fra overfladeforankret formin
    BEMÆRK: Polymerisations- og depolymerisationshastighederne for formindekorerede pigtrådsider har vist sig at afhænge af den spænding, der påføres filamentet. I mikrofluidik genererer friktionen af væskestrømmen langs filamentsiden en spænding, der er proportional med filamentlængden og strømningshastigheden14,16.
    1. Metoden i punkt 8, der er beskrevet ovenfor, anvendes, idet trin 8.1, 8.2 og 8.3 for overflade passivering erstattes med:
      1. Skift rør 3 til 1 μg /ml anti-his antistof i F-buffer. Injicer i 2 minutter med High Flow 3.
      2. Skift rør 3 med 5% BSA i F-buffer. Injicer i 5 minutter ved High Flow 3, efterfulgt af 5 minutter ved Mid Flow 3. I løbet af dette andet trin skal du reducere trykket i kanal 1 og 2 til 7-8 mbar for at få en modstrøm ~ -100 nL / min, så hele kammeroverfladerne BSA-passiveres.
      3. Skift rør 3 til 100 nM His-mærket formin i F-buffer. Injicer i 5 minutter med High Flow 3. Skift rør 3 med F-buffer. Injicer i 5 minutter med High Flow 3 for at sikre, at der ikke er formin tilbage i slangen.
    2. Følgende opløsninger fremstilles og injiceres (200-300 μL hver i F-buffer):
      Kanal 1: 1 μM 10% Alexa-488 mærket G-actin.
      Kanal 2: 1 μM umærket G-actin, 4 μM profilin.
      Kanal 3: Kun F-buffer.
    3. Filamentkernedannelse: Udsæt de overfladeforankrede formins til G-actin (indstilling Mid Flow 1).
    4. Filamentpolymerisation: Udsæt kammeret for profilin-actin ved hjælp af Mid Flow 2.
    5. Start erhvervelse: 1 ramme / 2 s, epifluorescens. Med formin mDia1 skal filamenter polymerisere ved 50-80 sub/s, afhængigt af filamentlængden og strømningshastigheden14.
    6. Filamentdepolymerisering: Start erhvervelse (1 ramme / 4 s, epifluorescens). Efter 1-2 rammer udsættes filamenterne for F-buffer, Mid Flow 3. Med formin mDia1 skal filamenter depolymerisere ved 5-15 sub/s, afhængigt af filamentlængden og strømningshastigheden14.
  4. Actinfilamenter med umærkede segmenter
    BEMÆRK: Actin fluorescerende mærkning skaber flere artefakter, såsom pauser under depolymerisering17 og ændret tropomyosinbinding18. En løsning på disse artefakter er at bruge mikrofluidik til at samle filamenter, der viser umærkede segmenter.
    1. Følgende opløsninger fremstilles og injiceres (200-300 μL i F-buffer):
      Kanal 1: 1 μM umærket G-actin, 1 μM profilin.
      Kanal 2: 0,3 μM 10% Alexa-488 mærket G-actin.
    2. Sekventielt udsætte overfladen for kanal 2 (5 min), kanal 1 (10 min) og kanal 2 (15 min) for at generere ADP-actin umærkede segmenter med fluorescerende mærkede segmenter i hver ende.
  5. Piggede endeforankrede filamenter med gelsolin
    BEMÆRK: Med spectrin-actinfrø polymeriserer filamenter i deres frie pigtrådsende, mens den spidse ende stabiliseres af spectrin-actinfrøet. Et alternativ er at forankre filamenter med en pigget endekapsler som gelsolin.
    1. Forbered en F-actinopløsning af 4 μM 10% Alexa-488 mærket G-actin i 20 μL F-buffer. Lad actin spontant nukleere og polymerisere ved RT i mindst 30 minutter på bænken. Pak røret ind i aluminiumsfolie for at beskytte det mod lys.
    2. I mellemtiden forberedes mikrofluidkammeret og passiveres overfladen med en blanding af 5% BSA og 1% biotin-BSA (se trin 8.2).
    3. Skyl kanal 3 med F-buffer (2 min ved High Flow 3). 10 μg/ml neutravidin injiceres i F-buffer (4 min ved High Flow 3).
    4. Skift rør til:
      Kanal 1: 10 nM biotin-gelsolin (tabel 1).
      Kanal 2: F-buffer.
      Kanal 3: 0,4 μM præpolymeriseret F-actin.
    5. Injicer alle opløsninger sammen ved hjælp af indstillingen High Flow All i 3 min.
    6. Udsæt hele kammeret for gelsolin (Mid Flow 1, 30 s).
    7. Fastgør filamenter til overfladen (Low Flow 3: Channel 3 ved 3 mbar, Kanal 1 og 2 ved ~ 2 mbar, i ca. 2 min).
    8. [VALGFRIT] Hvis glødetrådstætheden er for lav, gentages trin 9.5.6 og 9.5.7.
    9. Depolymerisering med spids ende: Start erhvervelse (1 ramme / 30 s, epifluorescens). Efter 1-2 rammer skal du kun udsætte filamenter for buffer, Mid Flow 2. Filamenter skal depolymeriseres ved omkring 0,2 sub/s.

10. Fascin-induceret filamentbundtdannelse og demontering af ADF / cofilin

BEMÆRK: For at danne actinfilamentbundter skal du sørge for at have en tilstrækkelig høj filamentfrøtæthed på overfladen af kammeret. Når de udsættes for fascinprotein, vil nabofilamenter, der svinger sideværts, dynamisk tværbundet af fascinproteiner. Da fascin hurtigt løsnes fra filamentsiden19, skal fascin konstant være til stede i hovedstrømmende opløsning for at opretholde filamentbundling.

  1. Følg trin 8.1-8.3.
  2. Forbered følgende opløsninger (200-300 μL i F-buffer):
    Kanal 1, polymerisationsopløsning: 1 μM 10% Alexa-488 mærket G-actin, 1 μM profilin.
    Kanal 2, Bundling-opløsning: 200 nM fascin (tabel 1), 0,15 μM 10% Alexa-488 mærket G-actin.
    Kanal 3, Demonteringsløsning: 200 nM ADF/cofilin (tabel 1), 100 nM fascin, 0,15 μM 10% Alexa-488 mærket G-actin.
  3. Skift rør 1 til 3 (afsnit 7). Injicer ved hjælp af forudindstillingen High Flow All i 3-4 min.
  4. Filamentpolymerisation: Indstil trykindstillingen til Mid Flow 1 i ~ 10 min. Polymerisering kan afbildes med TIRF.
  5. Filamentbundling (figur 4C): Start billedoptagelse (1 ramme/5 s, epifluorescens). Efter 1-2 billeder skal du indstille trykindstillingen til Mid Flow 2 og observere filamentbundling.
  6. Bundtfragmentering: Start billedoptagelse (1 ramme /5 s, epifluorescens). Efter 1-2 billeder indstilles trykindstillingen til Mid Flow 3 og observeres den cofilininducerede demontering af både enkeltfilamenter og bundter.

11. Rengøringsprocedure for mikrofluidisk enhed

BEMÆRK: For at undgå forurening fra et eksperiment til et andet er det afgørende at rengøre og tørre alle slanger og flowmålere grundigt efter hvert eksperiment.

  1. Frakobl alle slanger fra PDMS-kammeret, og kassér kammeret.
  2. For at rengøre PEEK-slanger og flowmålere skal du tape slangens ender i et tomt 15 ml plastrør og injicere følgende opløsninger ved maksimalt tryk, indtil reservoiret er næsten tomt:
    400 μL F-buffer.
    400 μL af 0,5 M NaOH.
    400 μL rent vand.
    200 μL isopropanol.
  3. Udskift med et tomt reservoir og blæs luft, indtil slangerne er helt tørre (~ 2-4 min, maksimalt tryk).

12. Billedanalyse

BEMÆRK: Mens dette manuskript fokuserer på metoden til at samle, manipulere og visualisere enkelt actinfilamenter i mikrofluidik, findes en kort metode til analyse af erhvervede film her. Analysen udføres på 16-bit billeder ved hjælp af ImageJ efter afsnit 8.

  1. Billedbehandling er minimal:
    1. Importer polymerisations- eller depolymeriseringsbilledstakken.
    2. [VALGFRIT] Homogeniser billedintensitet med funktionen Subtraher baggrund (standardindstillinger (dvs. 'Rullende kugleradius' = 50 pixels)). Dette er især nyttigt, hvis baggrundsfluorescensen ændres i løbet af en film, eller hvis fluorescensbelysningen ikke er homogen over synsfeltet.
    3. Juster lysstyrke og kontrast (baggrund nær nul, filamenter nær maksimum).
  2. Opret filament kymograf:
    1. Vælg et filament, der ikke sætter det på pause, går i stykker eller løsnes. Vælg ikke baseret på adfærd ellers. Tegn en linje 1-2 pixels over (straight line værktøj). Gem filamentnummeret (Tilføj ROI Manager).
    2. Anvend funktionen Reslice (Udsnit: 5 pixel). Beregn den maksimale intensitet (funktion Zprojection).
  3. Polymerisations-/depolymerisationshastigheden måles:
    1. På kymografen tegnes en linje langs filamentbjælkeenden (straight line-værktøj , figur 4A). Mål linjebredden og højden (funktion Mål).
  4. Trin 12.2-12.3 gentages over flere filamenter. Polymerisations-/depolymerisationshastighederne beregnes (figur 4A):
    Equation 1, hvor v er hastigheden (i sub/s), w linjebredden (pixels), pix pixelstørrelsen (nm), h linjehøjden (frames) og dt tiden mellem frames (i sekund). Her svarer 2,7 nm til det effektive bidrag fra en actin-underenhed til filamentlængden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For alle de ovenfor beskrevne eksperimenter skal fluorescerende mærkede actinfilamenter være tydeligt synlige med god kontrast, hvilket indikerer lav baggrundsfluorescens fra overfladen (figur 4, se Supplerende fil 1 for fejlfinding af almindelige problemer). Actinfilamenter bør heller ikke klæbe til overfladen: Når den dominerende strømningshastighed er lav, skal actinfilamenternes laterale udsving være mærkbare, når man observerer dem levende og give en mulighed for klart at bestemme, at de kun er forankret i en af deres ender. På samme måde bør deres lodrette udsving være synlige ved ændringer i intensitet langs deres længde og tid, når de anvendes TIRF-billeddannelse. Afhængigt af de anvendte strømningshastigheder skal man muligvis justere TIRF-penetrationsdybden for at optimere billedkvaliteten af de actinfilamenter, der er erhvervet af TIRF.

Ved eksponering af filamenter for polymerisationsbetingelser (se afsnit 8) skal filamentforlængelse være regelmæssig (dvs. forlængelsen i enden af filamentet hindres ikke af overfladeinteraktion eller permanent klæbning). Desuden bør den målte filamenttrådsforlængelsesforlængelseshastighed svare til den forventede værdi i henhold til actinkoncentrationen i røret 1,20, hvilket indikerer, at røropløsningen er blevet korrekt strømmet op til mikrofluidkammeret (figur 4A). Tilsvarende, når de udsættes for en bufferopløsning, skal filamenter depolymeriseres støt med en hastighed, der afspejler deres ADP-indhold4 (figur 4A). Ved udsættelse af allerede dyrkede actinfilamenter for en opløsning af fluorescerende mærket cofilin, vil cofilinklynger blive nukleeret og vokse mod både spidse og piggede ender (figur 4B) med en hastighed, der er afhængig af cofilinkoncentrationen. Ved vurdering af en potentiel tværbindingsaktivitet af en ABP, såsom fascin (figur 4C), vil tæt ved actinfilamenter, der danner bundter, let blive detekteret af deres højere fluorescensintensitet og en ændring i deres laterale udsving.

Væskestrømmen påfører en viskøs friktionskraft på actinfilamenter, der er forankret til overfladen af det mikrofluidiske kammer. Friktionskraftkoefficienten på F-actin er η = 6,10-4 pN·s/μm2, udtrykt pr. filamentmikronlængde14. Ved mellemstrømningshastigheder, da filamenthøjden svinger omkring et konstant gennemsnit på 250 nm over overfladen, eksisterer der en kraftgradient fra den fritflydende ende op til filamentforankringspunktet. Man kan derfor beregne den påførte spænding på et hvilket som helst punkt langs filamentet ved hjælp af F = 6ηπLv, hvor v er den lokale strømningshastighed 250 nm over overfladen (figur 1B) og L er den nedstrøms filamentsegmentlængde (dvs. fra det betragtede punkt op til den frie ende). For højere strømningshastigheder er filamentets gennemsnitshøjde ikke konstant, men stiger lineært fra forankringspunktet til den frie ende, forbliver under 250 nm i gennemsnit og vil variere afhængigt af strømningshastighederne, hvilket fører til en mere kompleks spændingskraftprofil langs filamentet21.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative resultater. Typiske eksperimenter, hvor actinfilamenter polymeriseres fra spectrin-actinfrø og udsættes for forskellige ABP'er. Af klarhedshensyn vises kun en brøkdel af synsfeltet. (A) Resultat af det grundlæggende polymerisations-depolymerisationseksperiment (afsnit 8). Filamenter polymeriseres med en opløsning af 0,8 μM 10% Alexa-488 mærket G-actin, alderen i 15 minutter for at konvertere alle underenheder til ADP-actin (ikke vist) og depolymeriseres, når de kun udsættes for F-buffer. Nederst: kymografer, der bruges til at kvantificere polymerisations- og depolymerisationshastighederne. Erhvervet ved 1 ramme /5 s, 200 ms eksponeringstid, 150 mW 488 nm laser ved 9% effekt, TIRF (laserpenetration dybde 250 nm). (B) Fragmentering af enkeltaktinfilamenter med 500 nM mCherry-cofilin-1. Actin er mærket med ATP-ATTO48822 (gul) og cofilin-1 er smeltet til mCherry (blå). Øverst: brøkdel af et synsfelt. Bemærk: proteinaggregater på overfladen. Nederst: kymograf, der viser bindingen af cofilin-1 til et filament (pilespidser viser cofilin-1 domænekernedannelseshændelser), hvilket fører til en fragmenteringshændelse (lynsymbol). Erhvervet ved 1 ramme/4 s, 200 ms eksponering, 150 mW 488 nm laser ved 16% og 100 mW 561 nm laser ved 12% effekt, epifluorescens. C) Bundtning af actinfilamenter med fascin (punkt 10.5). Filamenter blev først polymeriseret med 0,8 μM 5% Alexa-488 mærket G-actin og bundtet med 200 nM fascin. Sammenlignet med enkeltfilamenter ser filamentbundter to til tredobbelt lysere ud og ikke perfekt justeret med strømmen. Erhvervet ved 1 ramme / 10 s, 200 ms eksponering, 20% 200 W Mercury lampeintensitet, epifluorescens. (A-C) Baggrunden blev trukket fra med ImageJ's ad hoc-funktion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protein navn art Uniprot ref (sekvens) original rensningsprotokol ref. kommentarer
Actin kanin P68135 (fuld længde) 23 For fluorescerende mærkning, se ref 24
Profilin1 menneskelig P07737 (fuld længde) 25 se også ref 11
Spectrin-actin frø menneskelig Nielsen 26, 27 se også ref 11
cofilin1 mus P18760 (fuld længde) 28
Gelsolin menneskelig P06396 (fuld længde) 29
mDia1 formin mus O08808 (aa 552-1255) 13 mere detaljeret protokol i ref 24
Fascin1 menneskelig Q16658 (fuld længde) 30

Tabel 1: Actin- og actinbindende proteiner 23,24,25,26,27,28,29,30

Reagens koncentration
Tris-HCi pH 7,4 5 mM
KCl 50 mM
MgCl2 1 mM
Egta 0,2 mM
Atp 0,2 mM
DTT 10 mM
DABCO 1 mM

Tabel 2: Sammensætning af F-buffer. DABCO og en relativt høj koncentration af DTT bruges til at begrænse fotoinduceret skade på filamenter på grund af lyseksponering under fluorescensmikroskopiforsøg.

Indstilling af navne Tryk (mBar) Strømningshastighed (nL/min)
Max tryk 300 ~ 30 000 (i dominerende kanal)
Højt tryk 150 ~ 15 000 (i dominerende kanal)
Midtertryk 12 ~ 1500 (i dominerende kanal)
'Skift' pres 12 for alle indløb
5 til udløb		 ~ 500 (i hvert indløb)

Tabel 3: Overensstemmelse mellem påførte tryk og målte strømningshastigheder. De resulterende strømningshastigheder afhænger i høj grad af den eksperimentelle opsætning. Værdier er angivet for et mikrofluidisk kammer med en 1 cm lang hovedkanal med tværsnit 20 μm x 800 μm (højde x bredde), forbundet til hvert reservoir med 80 cm lang PEEK-slange.

Supplerende fil 1: Klassiske problemer, årsager og løsninger. De stødte ofte på problemer, når de arbejdede med mikrofluidik og / eller enkelt actinfilamenter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenlignet med standard enkeltfilamentmetoder, hvor actinfilamenter forankres til overfladen med flere punkter langs deres længde eller opretholdes tæt på den af et trængselsmiddel såsom methylcellulose, giver mikrofluidik en række fordele. Da interaktioner med overfladen er minimale, undgås de kunstige pauser, som disse interaktioner kan fremkalde under både forlængelse og depolymerisering. Filamenterne er justeret af strømmen parallelt med hinanden, hvilket letter deres overvågning og måling af deres længder. Opløsningen omkring filamenterne fornyes konstant og udsætter dem for konstante proteinkoncentrationer. At være i stand til hurtigt (<1 s, figur 3D, E) at skifte mellem forskellige proteinopløsninger, som filamenterne udsættes for, gør det muligt for en at udføre tidsstyrede sekventielle eksperimenter, som ofte er medvirkende til kinetiske undersøgelser. Endelig kan det viskøse træk, der udøves af den flydende opløsning på filamenterne, udnyttes til at påføre kontrolleret mekanisk belastning på filamenterne (afsnittet Repræsentative resultater). Man skal bemærke, at moderate væskestrømme (Mid Flow-trykindstillinger ) bringer filamenter tæt nok på overfladen (~ 250 nm) til effektivt at afbilde dem med TIRF, mens de genererer minimal spænding (<1 pN)14.

Sammenlignet med klassiske enkeltfilamentassays vil mikrofluidik imidlertid kræve større mængder proteinopløsninger: typisk et par 100 μL, når et standardforsøg kunne udføres med mindre end 10 μL. Dette kan være en begrænsning, når du bruger dyrebare proteiner. Klassiske eksperimenter kan bruges til at hjælpe med at etablere de relevante eksperimentelle betingelser (f.eks. Absolutte eller relative koncentrationer af forskellige proteiner), inden der påbegyndes en række mikrofluidiske eksperimenter. En anden begrænsning, som for alle andre enkeltfilamentteknikker in vitro, kommer fra den ufuldkomne passivering af dækslipoverfladen. Reproducerbarhed i dæksliprensning og binding af passiveringslaget (BSA, PEGylation osv.) er altid svært at kontrollere. En et-trins passiveringsteknik baseret på PEG-silan overfladebehandling er blevet den foretrukne teknik i mange laboratorier 7,15. Som sådan kan den effektive tæthed af filamentfrø variere mellem eksperimenter med omtrent dobbelt, selv når de gentages så præcist som muligt. Man bør sigte mod et tilfredsstillende interval af filamentoverfladetæthed og være parat til at gentage forsøget, hvis det er nødvendigt. Almindeligt forekommende problemer ved arbejde med mikrofluidik og /eller enkelt actinfilamenter diskuteres i supplerende fil 1.

For den grundlæggende protokol, der præsenteres her, skal man bemærke, at spectrin-actinfrø, der kan ses som korte stabiliserede filamenter, er tilfældigt orienteret, når de klæber til overfladen. Som følge heraf, da filamenterne dyrket fra disse frø stemmer overens med strømmen, vil deres del tættest på frøet være skarpt bøjet, hver med sin egen vinkel. Længden, over hvilken filamenter er bøjet, er normalt meget lille, når filamenter udsættes for mellem- eller høje strømme. Faktisk vil denne længde generelt være mindre end diffraktionsgrænsen (~ 200 nm) og vil derfor ikke let kunne detekteres. Det er vigtigt, at de ABP'er, der er følsomme over for filamentkrumning, binder og fungerer forskelligt i dette stærkt bøjede område. For at undgå skæve resultater er det enkleste at udelukke denne region fra analysen21.

Før vi begyndte at bruge mikrofluidik til at manipulere og visualisere enkelt actinfilamenter, var det allerede blevet brugt til at studere enkelte DNA-filamenter3, som er langt mere fleksible. Dette kan give anledning til bemærkelsesværdige forskelle, da strømmen dramatisk kan afvikle DNA og ændre dets tilsyneladende længde dramatisk. Mikrofluidik kan også bruges, meget lig den metode, der præsenteres her, til at studere mikrotubuli; disse er meget stivere, men kan ikke desto mindre bringes til at justere med strømmen for at måle deres forlængelse og depolymerisering ved at drage fordel af den hurtige skift af betingelser31,32 eller bøjes af en vinkelret strømning for at måle mikrotubulus plasticitet7.

Vi har her præsenteret protokollen for grundeksperimentet, hvor filamenter kun er forankret i den ene ende, og hvor strømningsretningen i synsfeltet er den samme gennem hele eksperimentet. Disse to egenskaber kan varieres. For eksempel kan filamenter forankres af flere punkter for at generere en anden kraftprofil langs filamentet. Ligeledes kan strømningsretningen varieres (i nærheden af krydset mellem indgangskanalerne, i strømningskammeret) til lokalt bøjede filamenter, da den uanchorerede del peger i en anden retning end det forankrede filamentsegment21. Filamenter, der forlænges fra tilfældigt forankrede spectrin-actinfrø, kan også udsættes for tværbindende proteiner til dannelse af bundter33 (se afsnit 10). Ved at kombinere mikrofluidik med andre teknikker (mikropatterning, optisk pincet osv.) eller designe mikrofluidiske kamre med rum til ændring af strømningslinjer kan der oprettes flere konfigurationer for at studere specifik ABP-aktivitet på enkeltfilamenter eller for at danne små actinnetværk34. Antallet af kombinationer sammen med fordelen og alsidigheden af mikrofluidik giver mange værktøjer til forskere for at dechiffrere den spatio-temporale regulering af actinnetværk på molekylær skala.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for B. Ladoux og R.-M. Mège lab for brugen af deres UV-renere udstyr, og J. Heuvingh og 0. du Roure for den indledende træning, vi modtog om forberedelse af forme på siliciumskiver og give tip til mikrofluidik. Vi anerkender finansiering fra European Research Council Grant StG-679116 (til AJ) og Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin og Conformin (til G.R.-L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-Casein Merck C6905 Used at 8 mg/mL
Biopsy punch (with plunger) Ted Pella 15115-2 ID 0.75 mm, OD 1.07 mm
Biotin-BSA Merck A8549 Used at 1 mg/mL
BSA Merck A8022 Used at 50 mg/mL
Coverslip Mini-Rack
Teflon holder		 Invitrogen C14784 for 8 coverslips
Coverslips 22x40mm
Thickness #1.5		 Menzel Gläser 631-1370
DABCO Merck D27802 component in f-buffer
DTT Euromedex EU0006-D component in f-buffer
Ester NHS Alexa Fluor 488 Invitrogen A20000 Fluorophore for actin labeling on Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific 21338 To biotinylate actin on Lys328
Hellmanex III Hellma 9-307-011-4-507 Glass cleaning detergent
ImageJ NIH N/A open source software
Laboport KNF 811kn.18 vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)
Magic invisible tape Scotch 7100024666 standard transparent office tape
Micrewtube Simport T341-6T 2 mL microfluidic reservoir tubes
Microfluidic device Part 1: Flow Unit S Fluigent FLU-S-D-PCKB Flowmeter
Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL Fluigent 14002001PCK Reservoir holder
Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ Fluigent EZ-11000001
EZ-00345001		 Pressure controller
Model 42 - UVO-Cleaner Jelight Inc. 42-220 Ultraviolet cleaner
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 Jena Bioscience NU-805-488 ATP-ATTO used to label actin
neutravidin Thermo Scientific 31000
PLL-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) Use at 1 mg/mL in PBS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer Dow Corning 1673921 Contains PDMS base and curing agent
Polyetheretherketone (PEEK) tubing Merck Z226661 “Blue” : I.D. = 0.25 mm
Safety blow gun Coilhose Pneumatics 700-S filtered air
Silicon tubing VWR 228-0701P connect PEEK to coupler
Stainless steel catheter coupler Prime Bioscience SC22/15 Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing
Thermoplastic film Sigma Aldrich PM996 Standard "parafilm"
Ultrapure ethanol VWR 64-17-5
Ultrasonic cleaning bath VWR USC200TH To accomodate 1 L beakers
Vacuum dessicator SP Bel-Art F42022-0000 to degas the PDMS or solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).
  3. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  4. Jégou, A., et al. Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin. PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).
  5. Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
  6. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  7. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  8. Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins. Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).
  9. Funk, J., et al. Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth. eLife. 8, 50963 (2019).
  10. Pandit, N. G., et al. Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).
  11. Wioland, H., et al. ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends. Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).
  12. Pollard, T. D., Mooseker, M. S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).
  13. Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. Cell. 124 (2), 423-435 (2006).
  14. Jégou, A., Carlier, M. -F., Romet-Lemonne, G. Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments. Nature Communications. 4, 1883 (2013).
  15. Breitsprecher, D., et al. Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging. Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).
  16. Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).
  17. Niedermayer, T., et al. Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).
  18. Gateva, G., et al. Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro. Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).
  19. Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia. Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).
  20. Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. The Journal of Cell Biology. 103, Pt 2 2747-2754 (1986).
  21. Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).
  22. Colombo, J., et al. A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics. Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).
  23. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  24. Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly. Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).
  25. Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms. European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).
  26. Lin, D. C., Lin, S. Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).
  27. Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments. The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).
  28. Kremneva, E., et al. Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres. Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).
  29. Le Clainche, C., Carlier, M. -F. Actin-based motility assay. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 12 1-20 (2004).
  30. Vignjevic, D., et al. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).
  31. Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. eLife. 5, 13470 (2016).
  32. Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
  33. Suzuki, E. L., et al. Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity. Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).
  34. Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).

Tags

Biokemi udgave 183
Brug af mikrofluidik og fluorescensmikroskopi til at studere samlingsdynamikken i enkeltaktinfilamenter og bundter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wioland, H., Ghasemi, F.,… More

Wioland, H., Ghasemi, F., Chikireddy, J., Romet-Lemonne, G., Jégou, A. Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63891, doi:10.3791/63891 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter