Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Använda mikrofluidik och fluorescensmikroskopi för att studera monteringsdynamiken hos enstaka aktinfilament och buntar

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63891
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

Summary

Vi presenterar protokoll för enkla aktinfilamentmikrofluidiska analyser, i kombination med fluorescensmikroskopi, som gör att man exakt kan övervaka enskilda aktinfilament i realtid samtidigt som man sekventiellt utsätter dem för olika proteinlösningar.

Abstract

För att dechiffrera de komplexa molekylära mekanismerna som reglerar montering och demontering av aktinfilament är det en stor tillgång att övervaka individuella reaktioner som lever under välkontrollerade förhållanden. För att göra det har levande experiment med enfilament dykt upp under de senaste 20 åren, mestadels med hjälp av total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi, och har gett en mängd viktiga resultat. Under 2011, för att ytterligare utöka möjligheterna med dessa experiment och för att undvika återkommande problematiska artefakter, introducerade vi enkla mikrofluidik i dessa analyser. Denna studie beskriver vårt grundläggande protokoll, där enskilda aktinfilament förankras i ena änden till den passiverade täckglasytan, anpassar sig till flödet och kan successivt utsättas för olika proteinlösningar. Vi presenterar också protokollen för specifika applikationer och förklarar hur kontrollerade mekaniska krafter kan appliceras tack vare den strömmande lösningens viskösa drag. Vi lyfter fram de tekniska försiktighetsåtgärderna för dessa experiment och presenterar kortfattat möjliga utvecklingar baserade på denna teknik. Dessa protokoll och förklaringar, tillsammans med dagens tillgång till lättanvänd mikrofluidikutrustning, bör göra det möjligt för icke-specialister att implementera denna analys i sina laboratorier.

Introduction

Montering och demontering av aktinfilament och aktinfilamentnätverk styrs av flera biokemiska reaktioner och beror på det mekaniska sammanhanget. För att få insikt i dessa komplexa mekanismer är det ovärderligt att kunna observera individuella reaktioner på enskilda filament (i tillräckligt stort antal). Under de senaste decennierna har observationen av dynamiska aktinfilament i realtid, mestadels med hjälp av total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi, framstått som en nyckelteknik och har gett en imponerande lista över resultat som inte kunde ha erhållits med biokemiska analyser av bulklösning1.

För att uppnå detta måste man behålla fluorescerande märkta aktinfilament nära ytan på mikroskopets täckglas medan man utsätter dem för lösningar av aktinbindande proteiner (ABP), som också kan märkas fluorescerande. Att göra det ger ett sätt att övervaka händelser som äger rum på enskilda filament under välkontrollerade biokemiska förhållanden och därmed kvantifiera reaktionshastigheter. Ett antal specifika begränsningar bör dock övervägas. Artificiellt underhåll av filament nära ytan, ofta tack vare flera förankringspunkter eller genom att använda ett trängselmedel såsom metylcellulosa, kan förändra deras beteende (t.ex. orsaka pauser i deras polymerisation och depolymerisation2). Att spåra konturen för varje filament kan vara utmanande, särskilt om nya filament eller filamentfragment ackumuleras i synfältet över tiden. Reaktionerna sker i en ändlig volym där koncentrationen av aktinmonomerer och ABP kan variera över tid, vilket potentiellt gör det svårt att härleda exakta hastighetskonstanter. Slutligen är det svårt att förnya eller ändra lösningen av ABPs på mindre än 30 s och leder ofta till inhomogent proteininnehåll i provet.

För drygt 10 år sedan, inspirerade av vad som redan gjorts för att studera enskilda DNA-strängar (Deoxyribonukleinsyra) 3, introducerade vi en ny teknik baserad på mikrofluidik för att observera och manipulera enskilda aktinfilament4. Det gör att man kan kringgå de ovan nämnda begränsningarna för klassiska tekniker med enfilament. I dessa mikrofluidikanalyser odlas aktinfilament från spektrin-aktinfrön adsorberade på täckglaset. Filament förankras således av ena änden endast till botten av den mikrofluidiska kammaren och fluktuerar ovanför ytan utan att fastna. Filamenten anpassar sig till flödet av inkommande lösningar, vilket underlättar övervakningen av deras konturlängd och bibehåller dem i ett grunt område ovanför täckglaset där TIRF kan användas. Olika lösningar flödas samtidigt in i kammaren utan blandning, och filamenten kan utsättas för dem sekventiellt och snabbt.

Här föreslår vi en serie grundläggande protokoll för att ställa in mikrofluidikanalyser med en aktinfilament i labbet. Coverslips och mikrofluidikkammare kan förberedas i förväg (på en halv dag), och själva experimentet, där flera biokemiska förhållanden kan testas, görs på mindre än en dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förberedelse av mikrofluidikkammare

  1. Välj en SU-8 masterform med flera kammarmönster. Typiska kamrar är korsformade med tre inlopp och ett utlopp, 20 μm högt och 800 μm brett (figur 1). Sådana huvudformar kan köpas från externa företag eller tillverkas i akademiska laboratorier (t.ex. Gicquel, Y. et al.5).
  2. Placera tejp runt formens kant.
    1. Lägg ~50 cm lång, 19 mm bred, standard transparent kontorstejp (se Materialtabell) på en bänk, klibbig sida uppåt. Placera formen vertikalt i ena änden och längs bandets mittlinje.
    2. Rulla formen till den andra änden av tejpen för att skapa en 1 cm kant runt formen. Vik ner tejpen över formens botten.
  3. Förbered polydimetylsiloxanlösning (PDMS).
    1. Häll 25-30 g PDMS-bas (materialtabell) direkt i en engångsvåg. Tillsätt 10% vikt / vikt PDMS-härdningsmedel (materialtabell) med en pasteurpipett av engångsplast.
    2. Blanda manuellt och noggrant med en plastpinne. Se till att härdningsmedlet är väl införlivat i PDMS-basen, även om omrörning skapar massor av bubblor.
  4. Avgasa PDMS-lösningen i en vakuumdesickator (materialtabell) i minst 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Bubblor kommer att expandera, stiga till ytan och brista när vakuumet bryts.
  5. Häll PDMS-lösningen över SU-8-formen. Använd en plastpinne för att skrapa och överföra så mycket av blandningen som möjligt.
  6. Degas PDMS för andra gången (5 min i vakuumdesickatorn). Se till att bli av med de flesta bubblor (några små bubblor på ovansidan är bra).
  7. Placera formen i en ugn vid 70 °C i minst 5 timmar för att PDMS ska retikuleras och stelna.
  8. Ta bort fasta PDMS-kamrar från formen.
    VARNING: Kiselskivor för SU-8-formar är extremt ömtåliga, så stor försiktighet måste iakttas när PDMS separeras från skivor. Arbeta på en hård, plan yta och håll skivan platt på ytan.
    1. Gör ett cirkulärt snitt i PDMS med ett rakblad, cirka 1 cm från formens kant. Alla mönster måste vara minst 0,5 cm inuti snittet. Skala försiktigt av det centrala PDMS-blocket med mjuka bogserbåtar.
      VARNING: När du skalar av, håll SU-8-formen platt på bänkskivan för att förhindra att den går sönder.
    2. Placera PDMS på ren aluminiumfolie, den gjutna ytan mot aluminiumfolien, för att skydda ytan från damm och för att göra mönster mer synliga.
  9. Välj och skär en kammare med ett rakblad minst 0,5 cm från mönstret. Det resulterande PDMS-blocket är cirka 0,5 cm högt, 1,5 cm brett och 3 cm långt. Pierce tre inlopp och ett utlopp med en biopsistans 0,75 mm ID (materialtabell).
  10. Rengör PDMS-kammaren med ultraren etanol (materialtabell) och lufttorka med en blåspistol (materialtabell). Placera PDMS med mönstret uppåt i en ren petriskål och stäng skålen med locket.

2. Rengöring av glasöverdrag

OBS: Här är en standardrengöringsprocedur för täckglas, baserad på en serie ultraljudsbehandlingssteg, detaljerad. Andra glasöverdragsliprengöringsprocedurer har beskrivits i många andra publikationer som kan uppnå liknande tillfredsställande resultat 6,7,8,9.

  1. Placera 10-20 täckglas (40 mm långa) på en polytetrafluoretylenhållare (PTFE) (materialtabell). Ultraljudsbehandling av täckglasen i 0,5 L av 2% glasrengöringslösning (materialtabell) i en 1 L glasbägare (35 °C, 30 min).
  2. Kassera glasrengöringslösningen och skölj täckglasen noggrant med dH2O i minst tre på varandra följande 0,5 L-bad.
  3. Förbered 0,5 L 2 M KOH i en 1 L glasbägare. Ultraljudsbehandling av täckglass i KOH (RT, 30 min). Kassera KOH och skölj täckglassen med dH2O i minst tre 0,5 L bad.
    VARNING: Använd lämplig laboratoriesäkerhetsskyddsutrustning (handskar, glasögon och labbrock).
  4. Överför och ultraljudsera täckglasen i 0.5 L ultraren etanol (RT, 30 min). Täckglas kan förvaras i etanol i upp till 2 veckor. Stäng bägaren med termoplastisk film (materialtabell) för att förhindra avdunstning. Torka täckglaset med luftflöde före användning.

3. PDMS-kammarmontering

  1. Förvärm värmeplattan till 100 °C. Placera upp till tre rengjorda PDMS-kammare och glasöverdrag i en ren petriskål. Placera den öppna petriskålen i en djup ultraviolett (UV) rengöringsmedel (λ = 185 nm, se materialtabell) och utsätt den för UV-ljus i 3-5 minuter.
    OBS: Alternativt kan PDMS-kamrar och täckglas utsättas för luft eller syreplasma i 30 s.
  2. Placera försiktigt PDMS-kammaren över täckglaset. Se till att de två ytorna som kom i kontakt var direkt utsatta för UV. PDMS fastnar automatiskt på glaset och kammaren blir tydligt synlig.
  3. För att ta bort all luft som fångats vid PDMS-täckglasgränssnittet, tryck mycket försiktigt på ytan med ett finger. För en tätare bindning, tryck starkare över hörn och sidor. Se till att kammarens tak inte kommer i kontakt med glasytan.
  4. Placera kammaren med glasbotten mot värmeplattan vid 100 °C i 5 min. Efter detta steg blir glas-PDMS-bindningarna permanenta och kamrar kan bara användas en gång. Använd kammaren omedelbart eller förvara den i en ren petriskål i upp till en vecka.

4. [VALFRITT] Direkt passivering och funktionalisering

OBS: Beroende på applikation kan kamrar passiveras och funktionaliseras antingen när de är anslutna till den mikrofluidiska styranordningen (se materialtabell) eller genom att manuellt injicera lösningar direkt i kammaren med en pipett innan den ansluts till den mikrofluidiska anordningen. Det senare erbjuder fördelen att konsumera mindre reagens och undvika potentiell kontaminering genom att strömma lösningen genom polyetereterketon (PEEK) -slangen i mikrofluidikanordningen. I alla följande steg injiceras lösningar genom att pipettspetsen fästs direkt i utloppet. För att undvika att skapa bubblor inuti kammaren, se till att ha en liten droppe som sticker ut ur pipettspetsen när du ansluter spetsen till PDMS-kammarens utlopp. Ta också bort pipettspetsen innan hela volymen har injicerats.

  1. Injicera 20 μl PLL-PEG (1 mg/ml i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)). Inkubera i minst 1 timme (eller över natten) vid RT. För att förhindra avdunstning, placera PDMS-kammaren i en fuktig låda (t.ex. en tom spetslåda med vatten i det nedre facket och PDMS-kammaren på spetshållningsplattformen).
  2. Injicera 20 μl 100 pM spektrin-aktinfrön (i F-buffert, se tabell 1 och tabell 2). Vänta inte mer än 1 min. Justera frökoncentrationen och tidpunkten för att ställa in fröytans densitet, tillräckligt hög för stor statistik och tillräckligt låg för att filament inte ska överlappa varandra.
    OBS: Alternativt, om spectrin-aktinfrön inte är tillgängliga, använd biotinfunktionaliserade korta filamentsegment som kommer att immobiliseras på en streptavidinbelagd täckglas 9,10.
  3. [VALFRITT] Injicera 20 μl 5% bovint serumalbumin (BSA) i F-buffert. Lämna vid RT i 10 min.
  4. [VALFRITT] Injicera 20 μl 1 mg/ml β-kasein i F-buffert. Lämna vid RT i 10 min.
    OBS: Följ steg 4.3 och/eller 4.4 för att ytterligare passivera kammaren. Valet av passivering beror på de proteiner som används och fungerar inte lika bra på alla ABPs. Vid användning av enbart aktin är PLL-PEG eller BSA tillräckligt.

5. Anslut mikrofluidisk enhet

OBS: Använd ett tryckbaserat mikrofluidiskt system med upp till fyra kanaler för att styra flöden i mikrofluidiken (figur 1A, se materialtabell). För att undvika att bubblor bildas i mikrofluidiska slangar och stör flödesstabilitet, avgasa alla lösningar. Placera 5 ml dH20 och 10 ml F-buffertlager i en vakuumdesickator ansluten till en vakuumpump (ultimate vacuum <250 mbar) och avgasera i minst 1 timme vid rumstemperatur.

  1. Skölj inlopp + utloppsslangar med dH2O(500 μL, 300 mbar).
  2. Fyll alla 2 ml reservoarrör (se materialtabell) med 300 μl F-buffert. Ställ in trycket på 300 mbar och låt fem till åtta droppar gå till spillo. Upprepa för varje kanal och ställ in trycket på 0.
  3. Anslut uttaget och skölj kammaren i stor utsträckning.
    1. Ställ in trycket för reservoarröret 4 (utlopp) till 50 mbar. När en droppe kommer ut från slangänden ansluter du slangen till PDMS-kammarens utlopp. Vätskan fylls i kammaren och kommer ut ur alla inlopp.
    2. [VALFRITT] Om kammaren har passiverats direkt (sektion 4), ställ in trycket på 100 mbar för att skölja kammaren med 50-100 μl F-buffert (3-5 min). Ta bort överskottsvätskan vid inlopp med en rengöringsvävnad.
    3. Ställ in trycket på 20 mbar.
  4. Anslut inlopp.
    1. Ställ in trycket för reservoarröret 1 till 50 mbar. För att undvika att införa luftbubblor, se till att en droppe kommer ut ur slangen och PDMS-inloppet.
    2. Anslut slangen till inlopp 1 (de två dropparna smälter samman vid anslutning). Ställ in trycket på 30 mbar.
    3. Upprepa steg 5.4.1-5.4.2 för att ansluta inloppen 2 och 3.
  5. Ställ in trycket på alla inlopp till 20 mbar och utloppstrycket till 0 mbar. Se till att flödeshastigheterna i inloppen är ungefär lika (se avsnittet Felsökning).

Figure 1
Figur 1: Injiceringslösningar genom en mikrofluidisk kammare. Proteinlösningar, placerade i reservoarer 1-3, skjuts in i kammaren genom att justera trycket i gasfasen. De genererade flödeshastigheterna mäts med flödesmätare. Inuti de mikrofluidiska kamrarna blandas inte lösningar och upptar utrymme beroende på det relativa trycket som appliceras (här lika tryck på alla inlopp). Typiska dimensioner: reservoarrör innehåller upp till 2 ml lösning. PEEK-slang (0,25 mm innerdiameter) ansluter behållarna till flödesmätarna (efter 10 cm slang) och sedan till PDMS-kammaren (efter ytterligare 70 cm). Silikonslangar och slangkopplingar i rostfritt stål används för att ansluta PEEK-slangen till PDMS-inloppen. Den huvudsakliga mikrofluidiska kanalen är 20-60 μm hög, cirka 1 mm bred och 1 cm lång. (B,C) Flödesprofiler inuti mikrofluidikkammaren. (B) Vätskan genererar en parabolisk profil över kammarhöjden: v(z) = 6z(h-z)R/h3w, där h och w är kammarens höjd och bredd, och R är den totala flödeshastigheten. Botten: Enstaka aktinfilament polymeriserat från ytförankrade spektrin-aktinfrön. (C) När kammarbredden är betydligt större än dess höjd är flödet nästan jämnt över kammaren, utom vid PDMS-ytorna, där det går till noll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

6. Konfigurera installationen med standardflödeshastigheter

OBS: Det datorstyrda trycksystemet möjliggör enkel och exakt justering av trycket i alla inlopp / utlopp som är anslutna till PDMS-kammaren, därför kontrollen av inkommande och utgående flödeshastigheter. Förinställda konfigurationer kan sparas och slås på / av med ett enda musklick. Nedan följer de rekommenderade konfigurationerna (om inget annat anges är utloppstrycket inställt på 0 mbar). Se tabell 3 för förväntade flödeshastigheter för dessa förinställda konfigurationer. De tryck som anges här måste justeras beroende på kammarens geometri och systemkonfiguration.

  1. Ändra: Använd den här förinställningen när du ändrar en eller flera reservoarer. Det skapar ett milt bakåtflöde i slangen av intresse för att förhindra att bubblor införs.
    1. Ställ in alla inloppstryck på 12 mbar och utloppstrycket på 5 mbar (figur 2B).
  2. High Flow 'All': Använd den här förinställningen för att snabbt injicera tre lösningar parallellt. De kommer att nå kammaren inom 4 minuter.
    1. Ställ in alla inloppstryck på 150 mbar.
  3. High Flow 'x': Använd den här förinställningen för att snabbt injicera en lösning. Den når kammaren inom 3 minuter (figur 3A-C).
    1. Ställ in inloppstrycket "x" på 150 mbar (~ 15 μL / min). Trycket i de andra inloppen justeras till cirka 100 mbar, så att den resulterande flödeshastigheten i dessa inlopp är ~ 500 nL / min.
  4. Mid Flow 'All': Använd den här förinställningen för att pausa systemet.
    1. Ställ in alla inlopp på 20 mbar (bild 2A).
  5. Mid Flow 'x': Använd den här förinställningen för att låta lösningen 'x' fylla i större delen av huvudkanalbredden (se figur 2C,D), samtidigt som du begränsar de andra inloppslösningarna till kanalsidorna. Aktinfilament i kammaren kommer således endast att utsättas för det biokemiska tillstånd som införs genom lösning 'x'.
    1. Ställ in inloppstrycket "x" på 12 mbar. Ställ in trycket i de andra inloppen och justera till ~ 9 mbar, så att deras respektive flödeshastigheter är ~ 150 nL / min.

Figure 2
Figur 2: Trycket som appliceras på varje behållare styr partitionen /den rumsliga fördelningen av lösningar inuti den mikrofluidiska kammaren. (B) Vid byte av ett reservoarrör (här reservoar 3) sjunker det effektiva trycket ner till noll, vilket skapar ett bakåtflöde. (C,D) Att öka det relativa trycket på en av behållarna möjliggör exponering av glasytan till en enda lösning. Synfältet i mitten av kammaren kan exponeras sekventiellt för lösningar 1 och 2 genom att växla mellan konfiguration Mid Flow 1 (C) och Mid Flow 2 (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

7. Ändra lösning 'x'

OBS: Som visas i figur 3A-C är det viktigt att komma ihåg att lösningar tar minuter att strömma från ett reservoarrör till kammarens huvudkanal. Denna minimala "döda" tid påförs av vätskevolymen i slangen och flödesprofilen i slangen (figur 3A-C).

  1. Förbered 200-300 μL lösning i ett nytt reservoarrör. Ställ in tryck på Ändra inställning (se avsnitt 6).
  2. Skruva loss reservoarröret för inloppet 'x'. Lösningen i slangen kommer långsamt att strömma bakåt, från kammaren till den fria slangspetsen. Det uppmätta flödet blir negativt (figur 2B).
  3. När en liten droppe har bildats vid slangspetsen, skruva in det nya röret med den färska lösningen. När röret är korrekt åtdraget till trycksystemet återgår inloppets flödeshastighet till positivt.
  4. Ställ in tryckinställningen på High Flow 'x'.
  5. Beroende på mikrofluidisk konfiguration och kammargeometri, vänta i 3-5 minuter tills lösningen fyller i slangen helt och når kammaren.
  6. [VALFRITT] Följ denna process genom att mäta ökningen av fluorescens över tid (figur 3C).

Figure 3
Figur 3: Försenad ankomst av lösningar från reservoarerna till PDMS-kammaren och snabb förändring av biokemiska förhållanden. (A-C) Försenad ankomst av lösningar från behållarna till PDMS-kammaren. (A) Beroende på kammarens geometri, rörlängden och det applicerade trycket vid inloppet eller inloppen är utbytet av en lösning med en annan inte omedelbar. Efter att ha bytt reservoarröret till ett som innehåller en fluorescerande lösning (0 min) fylls lösningen gradvis i slangen (0,4 min) och PDMS-kammaren (1-2 min). Indikativ timing anges för ett 150 mbar applicerat tryck, 80 cm PEEK-slang och en 1600 μm bred, 20 μm hög PDMS-kammare. (B) Den paraboliska flödesprofilen inuti PEEK-slangen genererar en effektiv gradient av fluorescens längs slangens radiella profil och inuti kammaren (se även figur 1B). (C) Fördröjd ankomst av lösningar kan kvantifieras genom att mäta bakgrundsepefluorescenssignalen i kammaren som en funktion av tiden. Experimentella förhållanden: 0,5 μM 10% Alexa-568-märkt G-aktin injiceras med 150 mbar genom en flödesmätare och 80 cm PEEK-slang. (D,E) Snabb förändring av biokemiska förhållanden. (D) Mönster för inkommande lösningar under två midflödesförhållanden. (E) Ökning av bakgrundsfluorescens som en avläsning av aktinkoncentrationen. Tiden t = 0 ställs in när uppkomsten av fluorescens ökar. Lösning 1: 0,5 μM 10% Alexa-488-märkt G-aktin, lösning 2: F-buffert. (C,E) PDMS-kammare: 20 μm hög och 1600 μm bred. Epifluorescensintensiteten, ~ 2 μm över ytan, kvantifierades genom att medelvärdet av signalen över hela synfältet normaliserades till 0 i frånvaro av fluorofor och 1 vid maximal intensitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

8. Grundläggande experiment med enstaka filament: Adenosindifosfat (ADP) -aktin taggad ändpolymerisation

OBS: Detta avsnitt förutsätter en icke-funktionaliserad kammare (endast avsnitt 5). Om kammaren har funktionaliserats direkt (avsnitt 4), börja med steg 8.4.

  1. Ytfunktionalisering med aktinfilamentfrön:
    1. Byt lösning 3 till 200 μl 50 pM spektrin-aktinfrön11 i F-buffert (se avsnitt 7).
      OBS: Alternativt, om spectrin-aktinfrön inte är tillgängliga, kan man använda biotinfunktionaliserade korta filamentsegment som kommer att immobiliseras på en streptavidinbelagd täckglas (se 9,10 för detaljer).
    2. Injicera i 2 min med High Flow 3.
      OBS: Justera koncentrationen och tiden beroende på den slutliga frödensiteten.
  2. Passivering av ytan:
    1. Byt rör 3 med 300 μl 5% BSA i F-buffert.
    2. Injicera i 5 min vid High Flow 3, följt av 5 min vid Mid Flow 3. Under detta andra steg, minska trycket i kanalerna 1 och 2 till 7-8 mbar för att få ett motflöde ~ -100 nL / min, så att hela kammarytorna BSA passiveras.
      OBS: Eftersom BSA-lösningen är mer viskös måste trycket justeras i enlighet därmed.
  3. Byt rör 3 till F-buffert och skölj kanalen (5 min, High Flow 3).
  4. Bered följande 200-300 μl lösningar, varvid alla proteiner späds ut i F-buffert:
    Inlopp 1, polymerisationslösning: 1 μM 10% Alexa-488 märkt G-aktin, 1 μM profilin (tabell 1).
    Inlopp 2, åldringslösning: 0,15 μM 10% Alexa-488 märkt G-aktin.
    Inlopp 3, depolymerisationslösning: Endast F-buffert.
    OBS: Profilin används här för att förhindra spontan kärnbildning och för att upprätthålla en konstant koncentration av G-aktin.
  5. Byt rör 1 till 3 (avsnitt 7). Injicera med förinställningen High Flow All i 3-4 minuter. De tre lösningarna har nu fyllt PEEK-slangen och nått kammaren (figur 3A). Glasytan kan utsättas för vilken inloppslösning som helst utan dödtid (<1 s, figur 3D,E).
  6. Slå på mikroskopet. Ställ in inställningarna: 150 mW 488 nm excitationslaser vid 10% -20% effekt, 100-200 ms kameraexponeringstid, 200-300 nm TIRF-penetrationsdjup, 60x mål. Dessa inställningar används i hela manuskriptet.
  7. Filamentpolymerisation (figur 4A):
    1. Ställ in tryckinställningen på Mid Flow 1 i ~ 10 min.
    2. [VALFRITT] Spela in polymerisation (1 ram / 20 s, TIRF). Filament bör polymeriseras vid cirka 10 underenheter/sekund (sub/s)1,12.
  8. Filamentåldring: Ställ in tryckinställningen på Mid Flow 2 i 15 min. Vid den kritiska koncentrationen, 0,15 μM G-aktin, kommer filamentlängden att förbli konstant och filamenten kommer att vända sig till >99% ADP-F-aktin4.
  9. Depolymerisation (figur 4A):
    1. Starta förvärvet vid 1 ram / 5 s, i epifluorescensläge. Eftersom det finns en mycket låg fluorescensbakgrund i kanalerna 2 och 3 är det inte nödvändigt att använda TIRF.
    2. Efter en till två bildrutor växlar du till Mid Flow 3. Filament bör depolymeriseras vid cirka 10 sub/s (referens12).
  10. För att återställa experimentet, bryt alla fluorescerande märkta filament genom att kontinuerligt utsätta dem för lasern med maximal effekt i ~ 2 minuter. För att testa olika förhållanden, ändra lösning 1, 2 eller 3 och injicera dem (High Flow, 3-4 min). Upprepa steg 8.7–8.9.

9. Andra experiment med enfilament

  1. Testa interaktionerna mellan ACP:er och F-aktin
    OBS: Mikrofluidik har framgångsrikt använts för att kvantifiera aktiviteten hos flera sidobindande ABPs, såsom cofilin, tropomyosin och Arp2/3. I enlighet med protokollet i avsnitt 8:
    1. Byt kanal 3 till den fluorescerande ABP av intresse för F-buffert. Injicera (högt flöde 3, 3 min).
    2. Filamentpolymerisation: Ställ in tryckinställningen på Mid Flow 1 i 10 min.
    3. ABP-bindning: Starta förvärv med TIRF. Justera bildhastigheten beroende på ABP-koncentrationen. Efter 1-2 bilder växlar du till Mid Flow 3.
      OBS: Beroende på ABP kan det också vara möjligt att snabbt (t.ex. i mindre än 5 s) växla till Mid Flow 2 för att ytterligare minska bakgrundsfluorescensen när du tar en bild.
    4. ABP-avbindning: Medan du fortsätter förvärvet, byt till Mid Flow 2.
  2. Polymerisation med formin vid den fria taggänden
    OBS: Forminer har visat sig påverka filament taggad ändpolymerisation. Mikrofluidik är särskilt anpassad för att mäta forminbindnings- och obindningshastigheter och deras inverkan på filamentförlängning.
    1. Förbered följande lösningar:
      Kanal 1: 10 nM formin i F-buffert (tabell 1).
      Kanal 2: 1 μM 10% Alexa-488 märkt G-aktin, 4 μM profilin.
      Kanal 3: F-buffert.
    2. Byt rör 1, 2 och 3 (avsnitt 7). Injicera med förinställningen High Flow All i 3-4 minuter.
    3. Initiera filamentpolymerisation: Ställ in tryckinställningen på Mid Flow 2 i 2 min.
    4. Forminbindning till filament taggände: Ställ in tryckinställningarna på Mid Flow 1 i 30 s.
    5. Forminmedierad polymerisation: Ställ in tryckinställningen på Mid Flow 2. Med formin mDia1 i sin taggände bör filament polymerisera vid cirka 50 sub /s 13,14,15.
  3. Polymerisation/depolymerisation från ytförankrad formin
    OBS: Polymerisations- och depolymerisationshastigheterna för formindekorerade taggändar har visat sig bero på spänningen som appliceras på filamentet. I mikrofluidik genererar friktionen av vätskeflödet längs filamentsidan en spänning som är proportionell mot filamentets längd och flödeshastigheten14,16.
    1. Använd metoden i avsnitt 8 som beskrivs ovan och ersätt steg 8.1, 8.2 och 8.3 för ytpassering med:
      1. Byt rör 3 till 1 μg/ml anti-His-antikropp i F-buffert. Injicera i 2 min med High Flow 3.
      2. Byt rör 3 med 5% BSA i F-buffert. Injicera i 5 min vid High Flow 3, följt av 5 min vid Mid Flow 3. Under detta andra steg, minska trycket i kanalerna 1 och 2 till 7-8 mbar för att få ett motflöde ~ -100 nL / min så att hela kammarytorna BSA-passiveras.
      3. Byt rör 3 till 100 nM His-märkt formin i F-buffert. Injicera i 5 min med High Flow 3. Byt rör 3 med F-buffert. Injicera i 5 min med High Flow 3 för att säkerställa att inga forminer finns kvar i slangen.
    2. Förbered och injicera följande lösningar (200–300 μl vardera, i F-buffert):
      Kanal 1: 1 μM 10% Alexa-488 märkt G-aktin.
      Kanal 2: 1 μM omärkt G-aktin, 4 μM profilin.
      Kanal 3: Endast F-buffert.
    3. Filamentkärnbildning: Utsätt de ytförankrade forminerna för G-aktin (inställning av mittflöde 1).
    4. Filamentpolymerisation: Utsätt kammaren för profilin-aktin med hjälp av Mid Flow 2.
    5. Starta förvärv: 1 ram / 2 s, epifluorescens. Med formin mDia1 bör filament polymerisera vid 50-80 sub / s, beroende på filamentlängden och flödeshastigheten14.
    6. Filamentdepolymerisering: Starta förvärv (1 ram / 4 s, epifluorescens). Efter 1-2 ramar, utsätt filamenten för F-buffert, midflöde 3. Med formin mDia1 bör filament depolymeriseras vid 5-15 sub / s, beroende på filamentets längd och flödeshastighet14.
  4. Aktinfilament med omärkta segment
    OBS: Aktin fluorescerande märkning skapar flera artefakter, såsom pauser under depolymerisering17 och förändrad tropomyosinbindning18. En lösning för dessa artefakter är att använda mikrofluidik för att montera filament som visar omärkta segment.
    1. Förbered och injicera följande lösningar (200-300 μl i F-buffert):
      Kanal 1: 1 μM omärkt G-aktin, 1 μM profilin.
      Kanal 2: 0,3 μM 10% Alexa-488 märkt G-aktin.
    2. Exponera ytan sekventiellt för kanal 2 (5 min), kanal 1 (10 min) och kanal 2 (15 min) för att generera ADP-aktin omärkta segment med fluorescerande märkta segment i varje ände.
  5. Taggiga ändförankrade filament med gelsolin
    OBS: Med spectrin-aktinfrön polymeriseras filament vid sin fria taggände medan den spetsiga änden stabiliseras av spectrin-aktinfröet. Ett alternativ är att förankra filament med en taggad ändkapslar som gelsolin.
    1. Förbered en F-aktinlösning av 4 μM 10% Alexa-488 märkt G-aktin i 20 μL F-buffert. Låt aktinet spontant kärnbildas och polymeriseras vid RT i minst 30 min på bänken. Vik in röret i aluminiumfolie för att skydda det mot ljus.
    2. Under tiden bered du mikrofluidkammaren och passiverar ytan med en blandning av 5% BSA och 1% biotin-BSA (se steg 8.2).
    3. Skölj kanal 3 med F-buffert (2 min vid High Flow 3). Injicera 10 μg/ml neutravidin i F-buffert (4 min vid högt flöde 3).
    4. Byt rör till:
      Kanal 1: 10 nM biotin-gelsolin (Tabell 1).
      Kanal 2: F-buffert.
      Kanal 3: 0,4 μM prepolymeriserat F-aktin.
    5. Injicera alla lösningar tillsammans med inställningen High Flow All i 3 minuter.
    6. Utsätt hela kammaren för gelsolin (Mid Flow 1, 30 s).
    7. Fäst filament på ytan (Lågt flöde 3: Kanal 3 vid 3 mbar, Kanaler 1 och 2 vid ~ 2 mbar, i ca 2 min).
    8. [VALFRITT] Om glödtrådens densitet är för låg, upprepa steg 9.5.6 och 9.5.7.
    9. Depolymerisering av spetsiga ändar: Starta förvärv (1 ram / 30 s, epifluorescens). Efter 1-2 bilder, exponera filamenten endast för buffring, Mid Flow 2. Filament bör depolymeriseras vid cirka 0,2 sub / s.

10. Fascininducerad bildning och demontering av filamentbunt med ADF/cofilin

OBS: För att bilda aktinfilamentbuntar, se till att ha en tillräckligt hög filamentfrödensitet vid kammarens yta. När de utsätts för fascinprotein kommer angränsande filament som fluktuerar i sidled att vara dynamiskt tvärbundna av fascinproteiner. Eftersom fascin snabbt lossnar från filamentsidan19 måste fascin ständigt finnas i den huvudsakliga flödeslösningen för att bibehålla buntning av filament.

  1. Följ steg 8.1-8.3.
  2. Förbered följande lösningar (200-300 μl i F-buffert):
    Kanal 1, polymerisationslösning: 1 μM 10% Alexa-488 märkt G-aktin, 1 μM profilin.
    Kanal 2, Buntningslösning: 200 nM fascin (Tabell 1), 0,15 μM 10% Alexa-488 märkt G-aktin.
    Kanal 3, Demonteringslösning: 200 nM ADF /cofilin (tabell 1), 100 nM fascin, 0,15 μM 10% Alexa-488 märkt G-aktin.
  3. Byt rör 1 till 3 (avsnitt 7). Injicera med förinställningen High Flow All i 3-4 minuter.
  4. Filamentpolymerisation: Ställ in tryckinställningen på Mid Flow 1 i ~ 10 min. Polymerisation kan avbildas med TIRF.
  5. Filamentbuntning (bild 4C): Starta bildinsamling (1 bildruta/5 s, epifluorescens). Efter 1-2 ramar ställer du in tryckinställningen på Mid Flow 2 och observerar filamentbuntning.
  6. Paketfragmentering: Starta bildinsamling (1 bildruta/5 s, epifluorescens). Efter 1-2 ramar ställer du in tryckinställningen på Mid Flow 3 och observerar den kofilininducerade demonteringen av både enstaka filament och buntar.

11. Rengöringsprocedur för mikrofluidikanordning

OBS: För att undvika kontaminering från ett experiment till ett annat är det viktigt att rengöra och helt torka alla slangar och flödesmätare efter varje experiment.

  1. Koppla bort alla slangar från PDMS-kammaren och kassera kammaren.
  2. För att rengöra PEEK-slangar och flödesmätare, tejpa slangändarna i ett tomt 15 ml plaströr och injicera följande lösningar vid maximalt tryck tills behållaren är nästan tom:
    400 μl F-buffert.
    400 μL 0,5 M NaOH.
    400 μl rent vatten.
    200 μl isopropanol.
  3. Byt ut mot en tom behållare och blås luft tills slangarna är helt torra (~ 2-4 min, maximalt tryck).

12. Bildanalys

OBS: Medan detta manuskript fokuserar på metoden för att montera, manipulera och visualisera enstaka aktinfilament i mikrofluidik, tillhandahålls en kort metod för att analysera förvärvade filmer här. Analysen utförs på 16-bitars bilder med hjälp av ImageJ, enligt avsnitt 8.

  1. Bildbehandling är minimal:
    1. Importera polymerisations- eller depolymerisationsbildstacken.
    2. [VALFRITT] Homogenisera bildintensiteten med funktionen Subtrahera bakgrund (standardinställningar (dvs. 'Rolling ball radius' = 50 pixlar)). Detta är särskilt användbart om bakgrundsfluorescensen ändras under en film eller om fluorescensbelysningen inte är homogen över synfältet.
    3. Justera ljusstyrka och kontrast (bakgrund nära noll, filament nära maximalt).
  2. Skapa filament kymograf:
    1. Välj ett filament som inte pausar, går sönder eller lossnar. Välj inte baserat på beteende annars. Rita en linje 1–2 pixlar ovanför (verktyget Rak linje). Spara filamentnumret (Lägg till i ROI Manager).
    2. Använd funktionen Reslice (antal segment: 5 pixlar). Beräkna den maximala intensiteten (funktion Zprojection).
  3. Mät polymerisations-/depolymerisationshastigheten:
    1. Rita en linje längs den trådtrådiga änden på kymografen (verktyget Rak linje , figur 4A). Mät linjens bredd och höjd (funktion Mått).
  4. Upprepa steg 12.2-12.3 över flera filament. Beräkna polymerisations-/depolymerisationshastigheterna (figur 4A):
    Equation 1, där v är hastigheten (i sub/s), w linjebredden (pixlar), pix pixelstorleken (nm), h linjehöjden (ramar) och dt tiden mellan bildrutor (i andra). Här motsvarar 2, 7 nm det effektiva bidraget från en aktinunderenhet till filamentlängden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För alla experiment som beskrivs ovan bör fluorescerande märkta aktinfilament vara tydligt synliga, med god kontrast, vilket indikerar låg bakgrundsfluorescens från ytan (figur 4, se tilläggsfil 1 för felsökning av vanliga problem). Aktinfilament bör inte heller hålla fast vid ytan: när den dominerande flödeshastigheten är låg bör aktinfilamentens laterala fluktuationer vara märkbara när man observerar dem levande och låta en tydligt bestämma att de endast är förankrade av en av deras ändar. På samma sätt, när man använder TIRF-avbildning, bör deras vertikala fluktuationer vara synliga genom förändringar i intensitet längs deras längd och tid. Beroende på de tillämpade flödeshastigheterna kan man behöva justera TIRF-penetrationsdjupet för att optimera bildkvaliteten hos aktinfilamenten som erhållits av TIRF.

Vid exponering av filament för polymerisationsförhållanden (se avsnitt 8) bör filamentförlängningen vara regelbunden (dvs. töjningen i slutet av glödtråden hindras inte av ytinteraktion eller permanent stickning). Dessutom bör den uppmätta taggtrådsändens töjningshastighet matcha det förväntade värdet enligt aktinkoncentrationen i röret 1,20, vilket indikerar att rörlösningen har flödats korrekt upp till mikrofluidikens kammare (figur 4A). På samma sätt bör filament, när de utsätts för en buffertlösning, depolymeriseras stadigt med en hastighet som återspeglar deras ADP-innehåll4 (figur 4A). När redan odlade aktinfilament utsätts för en lösning av fluorescerande märkt cofilin, kommer cofilinkluster att kärnas och växa mot både de spetsiga och taggiga ändarna (figur 4B) med en hastighet som är beroende av kofilinkoncentrationen. Vid bedömning av en potentiell tvärbindningsaktivitet hos en ABP, såsom fascin (figur 4C), kommer närliggande aktinfilament som bildar buntar lätt att detekteras genom deras högre fluorescensintensitet och en förändring i deras laterala fluktuationer.

Vätskeflödet applicerar en viskös friktionskraft på aktinfilament som är förankrade på ytan av den mikrofluidiska kammaren. Friktionskraftkoefficienten på F-aktin är η = 6,10-4 pN·s/μm2, uttryckt per glödtrådsmikronlängd14. Vid mellanliggande flödeshastigheter, eftersom glödtrådens höjd fluktuerar runt ett konstant medelvärde på 250 nm över ytan, finns det en kraftgradient från den fritt flytande änden upp till glödtrådens förankringspunkt. Man kan därför beräkna den applicerade spänningen vid vilken punkt som helst längs filamentet, med hjälp av F = 6ηπLv, där v är den lokala flödeshastigheten 250 nm över ytan (figur 1B) och L är nedströms filamentsegmentlängden (dvs. från den betraktade punkten upp till den fria änden). För högre flödeshastigheter är glödtrådens genomsnittliga höjd inte konstant utan ökar linjärt från förankringspunkten till den fria änden, förblir under 250 nm i genomsnitt och varierar beroende på flödeshastigheterna, vilket leder till en mer komplex spänningskraftprofil längs glödtråden21.

Figure 4
Figur 4: Representativa resultat. Typiska experiment där aktinfilament polymeriseras från spektrin-aktinfrön och utsätts för olika ABP. För tydlighetens skull visas bara en bråkdel av synfältet. (A) Resultat från det grundläggande polymerisations-depolymerisationsexperimentet (avsnitt 8). Filament polymeriseras med en lösning av 0,8 μM 10% Alexa-488 märkt G-aktin, åldras i 15 minuter för att konvertera alla underenheter till ADP-aktin (visas inte) och depolymeriseras endast när de utsätts för F-buffert. Botten: kymografer som används för att kvantifiera polymerisations- och depolymerisationshastigheterna. Förvärvad vid 1 ram / 5 s, 200 ms exponeringstid, 150 mW 488 nm laser vid 9% effekt, TIRF (laserpenetrationsdjup 250 nm). (B) Fragmentering av enstaka aktinfilament med 500 nM mCherry-cofilin-1. Actin är märkt med ATP-ATTO48822 (gul) och cofilin-1 smälts till mCherry (blå). Överst: bråkdel av ett synfält. Obs: proteinaggregat på ytan. Botten: kymograf som visar bindningen av cofilin-1 till ett filament (pilspetsar visar cofilin-1-domänkärnpunkter), vilket leder till en fragmenteringshändelse (blixtsymbol). Förvärvad vid 1 ram / 4 s, 200 ms exponering, 150 mW 488 nm laser vid 16% och 100 mW 561 nm laser vid 12% effekt, epifluorescens. C) Buntning av aktinfilament med fascin (avsnitt 10.5). Filament polymeriserades först med 0,8 μM 5% Alexa-488 märkt G-aktin och buntades med 200 nM fascin. Jämfört med enstaka filament verkar filamentbuntar två- till trefaldigt ljusare och inte perfekt anpassade till flödet. Förvärvad vid 1 ram / 10 s, 200 ms exponering, 20% 200 W Kvicksilverlampans intensitet, epifluorescens. (A-C) Bakgrunden subtraherades med ImageJ:s ad hoc-funktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protein namn art Uniprot ref (sekvens) ursprungligt reningsprotokoll ref. Kommentarer
aktin kanin P68135 (fullängdare) 23 För fluorescerande märkning, se ref 24
profilin1 mänsklig P07737 (fullängdare) 25 se även ref 11
Spektrin-aktinfrö mänsklig Ej tillämpligt 26, 27 se även ref 11
cofilin1 mus P18760 (fullängdare) 28
gelsolin mänsklig P06396 (fullängdare) 29
mDia1 formin mus O08808 (aa 552–1255) 13 mer detaljerat protokoll i ref 24
fascin1 mänsklig Q16658 (fullängdare) 30

Tabell 1: Aktin och aktinbindande proteiner 23,24,25,26,27,28,29,30

Reagens koncentration
Tris-HCl pH 7,4 5 mM
KCl 50 mM
MgCl2 1 mM
EGTS 0,2 mM
ATP 0,2 mM
DTT 10 mM
DABCO 1 mM

Tabell 2: F-buffertsammansättning. DABCO och en relativt hög koncentration av DTT används för att begränsa fotoinducerad skada på filament på grund av ljusexponering under fluorescensmikroskopiexperiment.

Ställa in namn Tryck (mBar) Flödeshastighet (nL/min)
Max tryck 300 ~ 30 000 (i dominerande kanal)
Högt tryck 150 ~ 15 000 (i dominerande kanal)
Mitt i trycket 12 ~ 1500 (i dominerande kanal)
"Ändra" tryck 12 för alla inlopp,
5 för uttag		 ~ 500 (i varje inlopp)

Tabell 3: Korrespondens mellan anbringade tryck och uppmätta flöden. De resulterande flödeshastigheterna beror mycket på den experimentella installationen. Värden anges för en mikrofluidisk kammare med en 1 cm lång huvudkanal med tvärsnitt 20 μm x 800 μm (höjd x bredd), ansluten till varje behållare med 80 cm lång PEEK-slang.

Tilläggsfil 1: Klassiska problem, orsaker och lösningar. De stötte ofta på problem när de arbetade med mikrofluidik och / eller enstaka aktinfilament. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Jämfört med vanliga metoder med enfilament där aktinfilament förankras på ytan med flera punkter längs deras längd eller hålls nära den av ett trängselmedel såsom metylcellulosa, erbjuder mikrofluidik ett antal fördelar. Eftersom interaktioner med ytan är minimala undviks de konstgjorda pauser som dessa interaktioner kan inducera under både förlängning och depolymerisation. Filamenten är inriktade på flödet, parallellt med varandra, vilket underlättar deras övervakning och mätning av deras längder. Lösningen runt filamenten förnyas ständigt och utsätter dem för konstanta proteinkoncentrationer. Att snabbt (<1 s, figur 3D,E) kunna växla mellan olika proteinlösningar som filamenten utsätts för gör att man kan utföra tidsstyrda sekventiella experiment, som ofta är instrumentella för kinetiska studier. Slutligen kan det viskösa drag som utövas av den strömmande lösningen på filamenten utnyttjas för att applicera kontrollerad mekanisk spänning på filamenten (avsnittet Representativa resultat). Man bör notera att måttliga vätskeflöden (mid flow-tryckinställningar) för filament tillräckligt nära ytan (~ 250 nm) för att effektivt avbilda dem med TIRF samtidigt som de genererar minimal spänning (<1 pN)14.

Jämfört med klassiska analyser med en filament kommer mikrofluidik dock att kräva större volymer proteinlösningar: vanligtvis några 100 μL, när ett standardexperiment kan göras med mindre än 10 μL. Detta kan vara en begränsning när du använder värdefulla proteiner. Klassiska experiment kan användas för att fastställa relevanta experimentella förhållanden (t.ex. absoluta eller relativa koncentrationer av olika proteiner) innan en serie mikrofluidiska experiment påbörjas. En annan begränsning, som för alla andra tekniker med enfilament in vitro, kommer från den ofullkomliga passiveringen av täckglasytan. Reproducerbarhet vid rengöring och bindning av passiveringsskiktet (BSA, PEGylation, etc.) är alltid svårt att kontrollera. En passiveringsteknik i ett steg baserad på PEG-silan ytbehandling har blivit den teknik som valts i många laboratorier 7,15. Som sådan kan den effektiva densiteten hos filamentfrön variera mellan experimenten med ungefär två gånger, även när den upprepas så exakt som möjligt. Man bör sträva efter ett tillfredsställande intervall av filamentets ytdensitet och vara beredd att upprepa experimentet om det behövs. Vanliga problem vid arbete med mikrofluidik och/eller enstaka aktinfilament diskuteras i tilläggsfil 1.

För det grundläggande protokollet som presenteras här bör man notera att spektrin-aktinfrön, som kan ses som korta stabiliserade filament, är slumpmässigt orienterade när de håller sig till ytan. Som en konsekvens, när filamenten som odlas från dessa frön överensstämmer med flödet, kommer deras del närmast fröet att böjas kraftigt, var och en med sin egen vinkel. Längden över vilken filament böjs är vanligtvis mycket liten när filament utsätts för mellan- eller höga flöden. Faktum är att denna längd i allmänhet kommer att vara mindre än diffraktionsgränsen (~ 200 nm) och kommer därför inte lätt att detekteras. Viktigt är att ABPs som är känsliga för filamentkrökning kommer att binda och fungera annorlunda i detta mycket böjda område. För att undvika partiska resultat är det enklaste att utesluta denna region från analysen21.

Innan vi började använda mikrofluidik för att manipulera och visualisera enstaka aktinfilament hade det redan använts för att studera enstaka DNA-filament3, som är mycket mer flexibla. Detta kan ge upphov till anmärkningsvärda skillnader, eftersom flödet dramatiskt kan varva ner DNA och ändra dess uppenbara längd dramatiskt. Mikrofluidik kan också användas, mycket på samma sätt som den metod som presenteras här, för att studera mikrotubuli; dessa är mycket styvare men kan ändå göras för att anpassa sig till flödet för att mäta deras förlängning och depolymerisering, dra nytta av den snabba omkopplingen av förhållandena31,32, eller böjas av ett vinkelrätt flöde för att mäta mikrotubuli plasticitet7.

Vi har här presenterat protokollet för grundexperimentet, där filament endast förankras i ena änden och där flödesriktningen i synfältet är densamma under hela experimentet. Dessa två egenskaper kan varieras. Till exempel kan filament förankras av flera punkter för att generera en annan kraftprofil längs filamentet. På samma sätt kan flödesriktningen varieras (i närheten av korsningen mellan ingångskanalerna, i flödeskammaren) för att lokalt böja filament, eftersom den oanchorerade delen kommer att peka i en annan riktning än det förankrade filamentsegmentet21. Filament som förlängs från slumpmässigt förankrade spektrin-aktinfrön kan också exponeras för tvärbindande proteiner för att bilda buntar33 (se avsnitt 10). Genom att kombinera mikrofluidik med andra tekniker (mikropatterning, optisk pincett, etc.) eller designa mikrofluidiska kamrar med fack för att modifiera flödeslinjer, kan flera konfigurationer skapas för att studera specifik ABP-aktivitet på enstaka filament eller för att bilda små aktinnätverk34. Antalet kombinationer, tillsammans med fördelen och mångsidigheten hos mikrofluidik, erbjuder många verktyg för forskare för att dechiffrera den spatio-temporala regleringen av aktinnätverk på molekylär skala.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot B. Ladoux och R.-M. Mège lab för användning av deras UV-renare utrustning, och J. Heuvingh och 0. du Roure för den inledande utbildningen vi fick om att förbereda formar på kiselskivor och ge tips om mikrofluidik. Vi erkänner finansiering från European Research Council Grant StG-679116 (till AJ) och Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin och Conformin (till G.R.-L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-Casein Merck C6905 Used at 8 mg/mL
Biopsy punch (with plunger) Ted Pella 15115-2 ID 0.75 mm, OD 1.07 mm
Biotin-BSA Merck A8549 Used at 1 mg/mL
BSA Merck A8022 Used at 50 mg/mL
Coverslip Mini-Rack
Teflon holder		 Invitrogen C14784 for 8 coverslips
Coverslips 22x40mm
Thickness #1.5		 Menzel Gläser 631-1370
DABCO Merck D27802 component in f-buffer
DTT Euromedex EU0006-D component in f-buffer
Ester NHS Alexa Fluor 488 Invitrogen A20000 Fluorophore for actin labeling on Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific 21338 To biotinylate actin on Lys328
Hellmanex III Hellma 9-307-011-4-507 Glass cleaning detergent
ImageJ NIH N/A open source software
Laboport KNF 811kn.18 vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)
Magic invisible tape Scotch 7100024666 standard transparent office tape
Micrewtube Simport T341-6T 2 mL microfluidic reservoir tubes
Microfluidic device Part 1: Flow Unit S Fluigent FLU-S-D-PCKB Flowmeter
Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL Fluigent 14002001PCK Reservoir holder
Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ Fluigent EZ-11000001
EZ-00345001		 Pressure controller
Model 42 - UVO-Cleaner Jelight Inc. 42-220 Ultraviolet cleaner
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 Jena Bioscience NU-805-488 ATP-ATTO used to label actin
neutravidin Thermo Scientific 31000
PLL-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) Use at 1 mg/mL in PBS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer Dow Corning 1673921 Contains PDMS base and curing agent
Polyetheretherketone (PEEK) tubing Merck Z226661 “Blue” : I.D. = 0.25 mm
Safety blow gun Coilhose Pneumatics 700-S filtered air
Silicon tubing VWR 228-0701P connect PEEK to coupler
Stainless steel catheter coupler Prime Bioscience SC22/15 Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing
Thermoplastic film Sigma Aldrich PM996 Standard "parafilm"
Ultrapure ethanol VWR 64-17-5
Ultrasonic cleaning bath VWR USC200TH To accomodate 1 L beakers
Vacuum dessicator SP Bel-Art F42022-0000 to degas the PDMS or solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).
  3. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  4. Jégou, A., et al. Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin. PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).
  5. Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
  6. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  7. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  8. Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins. Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).
  9. Funk, J., et al. Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth. eLife. 8, 50963 (2019).
  10. Pandit, N. G., et al. Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).
  11. Wioland, H., et al. ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends. Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).
  12. Pollard, T. D., Mooseker, M. S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).
  13. Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. Cell. 124 (2), 423-435 (2006).
  14. Jégou, A., Carlier, M. -F., Romet-Lemonne, G. Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments. Nature Communications. 4, 1883 (2013).
  15. Breitsprecher, D., et al. Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging. Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).
  16. Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).
  17. Niedermayer, T., et al. Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).
  18. Gateva, G., et al. Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro. Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).
  19. Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia. Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).
  20. Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. The Journal of Cell Biology. 103, Pt 2 2747-2754 (1986).
  21. Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).
  22. Colombo, J., et al. A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics. Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).
  23. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  24. Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly. Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).
  25. Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms. European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).
  26. Lin, D. C., Lin, S. Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).
  27. Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments. The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).
  28. Kremneva, E., et al. Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres. Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).
  29. Le Clainche, C., Carlier, M. -F. Actin-based motility assay. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 12 1-20 (2004).
  30. Vignjevic, D., et al. Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).
  31. Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. eLife. 5, 13470 (2016).
  32. Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
  33. Suzuki, E. L., et al. Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity. Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).
  34. Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).

Tags

Biokemi utgåva 183
Använda mikrofluidik och fluorescensmikroskopi för att studera monteringsdynamiken hos enstaka aktinfilament och buntar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wioland, H., Ghasemi, F.,… More

Wioland, H., Ghasemi, F., Chikireddy, J., Romet-Lemonne, G., Jégou, A. Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63891, doi:10.3791/63891 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter