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Biochemistry

एकल एक्टिन फिलामेंट्स और बंडलों की असेंबली गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63891
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

Summary

हम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में सरल एक्टिन फिलामेंट माइक्रोफ्लुइडिक परख के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो किसी को वास्तविक समय में व्यक्तिगत एक्टिन फिलामेंट्स की सटीक निगरानी करने की अनुमति देता है, जबकि क्रमिक रूप से उन्हें विभिन्न प्रोटीन समाधानों के संपर्क में लाता है।

Abstract

जटिल आणविक तंत्र को समझने के लिए जो एक्टिन फिलामेंट्स की असेंबली और विघटन को विनियमित करते हैं, यह अच्छी तरह से नियंत्रित परिस्थितियों में रहने वाली व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं की निगरानी करने के लिए एक महान संपत्ति है। ऐसा करने के लिए, पिछले 20 वर्षों में लाइव सिंगल-फिलामेंट प्रयोग उभरे हैं, ज्यादातर कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए, और प्रमुख परिणामों का एक ट्रोव प्रदान किया है। 2011 में, इन प्रयोगों की संभावनाओं को और बढ़ाने और आवर्ती समस्याग्रस्त कलाकृतियों से बचने के लिए, हमने इन परखों में सरल माइक्रोफ्लुइडिक्स पेश किए। यह अध्ययन हमारे मूल प्रोटोकॉल का विवरण देता है, जहां व्यक्तिगत एक्टिन फिलामेंट्स निष्क्रिय कवरस्लिप सतह पर एक छोर से लंगर डाले जाते हैं, प्रवाह के साथ संरेखित होते हैं, और क्रमिक रूप से विभिन्न प्रोटीन समाधानों के संपर्क में आ सकते हैं। हम विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत करते हैं और बताते हैं कि नियंत्रित यांत्रिक बलों को कैसे लागू किया जा सकता है, बहने वाले समाधान के चिपचिपा खींचें के लिए धन्यवाद। हम इन प्रयोगों की तकनीकी चेतावनियों को उजागर करते हैं और संक्षेप में इस तकनीक के आधार पर संभावित विकास प्रस्तुत करते हैं। इन प्रोटोकॉल और स्पष्टीकरण, उपयोग में आसान माइक्रोफ्लुइडिक्स उपकरणों की आज की उपलब्धता के साथ, गैर-विशेषज्ञों को अपनी प्रयोगशालाओं में इस परख को लागू करने की अनुमति देनी चाहिए।

Introduction

एक्टिन फिलामेंट्स और एक्टिन फिलामेंट नेटवर्क की असेंबली और विघटन को कई जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है और यांत्रिक संदर्भ पर निर्भर करता है। इन जटिल तंत्रों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, व्यक्तिगत फिलामेंट्स (पर्याप्त रूप से बड़ी संख्या में) पर व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं का निरीक्षण करने में सक्षम होना अमूल्य है। पिछले दशकों में, वास्तविक समय में गतिशील एक्टिन फिलामेंट्स का अवलोकन, ज्यादातर कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, एक प्रमुख तकनीक के रूप में उभरा है और परिणामों की एक प्रभावशाली सूची प्रदान की है जो थोक समाधान जैव रासायनिक परख1 के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता था।

इसे प्राप्त करने के लिए, किसी को एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन (एबीपी) के समाधान के लिए उजागर करते हुए माइक्रोस्कोप कवरस्लिप की सतह के करीब फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एक्टिन फिलामेंट्स को बनाए रखने की आवश्यकता होती है, जिसे फ्लोरोसेंटली लेबल भी किया जा सकता है। ऐसा करने से अच्छी तरह से नियंत्रित जैव रासायनिक स्थितियों में व्यक्तिगत फिलामेंट्स पर होने वाली घटनाओं की निगरानी करने का एक साधन प्रदान करता है, और इस प्रकार प्रतिक्रिया दरों को निर्धारित करता है। हालांकि, कई विशिष्ट सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए। कृत्रिम रूप से सतह के करीब फिलामेंट्स को बनाए रखना, अक्सर कई एंकरिंग बिंदुओं के लिए धन्यवाद या मिथाइलसेल्यूलोज जैसे भीड़ एजेंट का उपयोग करके, उनके व्यवहार को बदल सकता है (उदाहरण के लिए, उनके पोलीमराइजेशन और डिपोलिमराइजेशन2 में विराम पैदा करना)। प्रत्येक फिलामेंट के समोच्च को ट्रैक करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, खासकर अगर समय के साथ देखने के क्षेत्र में नए फिलामेंट्स या फिलामेंट टुकड़े जमा होते हैं। प्रतिक्रियाएं एक परिमित मात्रा में होती हैं जहां एक्टिन मोनोमर्स और एबीपी की एकाग्रता समय के साथ भिन्न हो सकती है, जिससे संभावित रूप से सटीक दर स्थिरांक प्राप्त करना मुश्किल हो जाता है। अंत में, एबीपी के समाधान को नवीनीकृत या बदलना 30 एस से कम समय में प्राप्त करना मुश्किल है और अक्सर नमूने में असजातीय प्रोटीन सामग्री का कारण होगा।

10 साल पहले, व्यक्तिगत डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (डीएनए) किस्में3 का अध्ययन करने के लिए पहले से ही क्या किया गया था, इससे प्रेरित होकर, हमने व्यक्तिगत एक्टिन फिलामेंट्स 4 का निरीक्षण और हेरफेर करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स के आधार पर एक नई तकनीक पेशकी। यह शास्त्रीय एकल-फिलामेंट तकनीकों की उपरोक्त सीमाओं को दरकिनार करने की अनुमति देता है। इन माइक्रोफ्लुइडिक्स परखों में, एक्टिन फिलामेंट्स को कवरस्लिप पर अधिशोषित स्पेक्ट्रिन-एक्टिन बीजों से उगाया जाता है। फिलामेंट्स इस प्रकार केवल माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष के नीचे एक छोर से लंगर डाले जाते हैं और चिपके बिना सतह के ऊपर उतार-चढ़ाव करते हैं। फिलामेंट्स आने वाले समाधानों के प्रवाह के साथ संरेखित होते हैं, जिससे उनकी समोच्च लंबाई की निगरानी आसान हो जाती है और उन्हें कवरस्लिप के ऊपर एक उथले क्षेत्र में बनाए रखा जाता है जहां टीआईआरएफ का उपयोग किया जा सकता है। विभिन्न समाधानों को मिश्रण के बिना एक साथ कक्ष में प्रवाहित किया जाता है, और फिलामेंट्स को क्रमिक रूप से और तेजी से उनके संपर्क में लाया जा सकता है।

यहां, हम प्रयोगशाला में एकल-एक्टिन-फिलामेंट माइक्रोफ्लुइडिक्स परख स्थापित करने के लिए बुनियादी प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला का प्रस्ताव करते हैं। कवरलिप्स और माइक्रोफ्लुइडिक्स कक्षों को पहले से (आधे दिन में) तैयार किया जा सकता है, और प्रयोग ही, जहां कई जैव रासायनिक स्थितियों का परीक्षण किया जा सकता है, एक दिन से भी कम समय में किया जाता है।

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Protocol

1. माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर की तैयारी

  1. कई कक्ष पैटर्न के साथ एक एसयू -8 मास्टर मोल्ड का चयन करें। विशिष्ट कक्षों तीन इनलेट्स और एक आउटलेट, 20 μm उच्च और 800 μm चौड़ा (चित्रा 1) के साथ पार आकार के होते हैं। इस तरह के मास्टर मोल्ड बाहरी कंपनियों से खरीदे जा सकते हैं या अकादमिक प्रयोगशालाओं में बनाए जा सकते हैं (उदाहरण के लिए, गिकेल, वाई।
  2. मोल्ड के किनारे के चारों ओर टेप रखें।
    1. एक बेंच पर ~ 50 सेमी लंबा, 1 9 मिमी चौड़ा, मानक पारदर्शी कार्यालय टेप ( सामग्री की तालिका देखें) रखें, चिपचिपा पक्ष ऊपर। मोल्ड को एक छोर पर और टेप की मध्य रेखा के साथ लंबवत रखें।
    2. मोल्ड के चारों ओर 1 सेमी सीमा बनाने के लिए मोल्ड को टेप के दूसरे छोर पर रोल करें। मोल्ड के तल पर टेप को मोड़ो।
  3. पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) समाधान तैयार करें।
    1. एक डिस्पोजेबल वजन पकवान में, सीधे 25-30 ग्राम पीडीएमएस बेस (सामग्री की तालिका) डालें। एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक पाश्चर विंदुक के साथ 10% वजन /वजन पीडीएमएस इलाज एजेंट (सामग्री की तालिका) जोड़ें।
    2. प्लास्टिक की छड़ी के साथ मैन्युअल रूप से और अच्छी तरह से मिलाएं। सुनिश्चित करें कि इलाज एजेंट पीडीएमएस बेस में अच्छी तरह से शामिल है, भले ही सरगर्मी बहुत सारे बुलबुले बनाती है।
  4. कमरे के तापमान (आरटी) पर कम से कम 5 मिनट के लिए वैक्यूम डिसिकेटर (सामग्री की तालिका) में पीडीएमएस समाधान को डिगास करें। बुलबुले विस्तार करेंगे, सतह पर बढ़ेंगे, और वैक्यूम टूटने पर फट जाएंगे।
  5. एसयू -8 मोल्ड पर पीडीएमएस समाधान डालो। जितना संभव हो उतना मिश्रण को खुरचने और स्थानांतरित करने के लिए प्लास्टिक की छड़ी का उपयोग करें।
  6. दूसरी बार के लिए पीडीएमएस डीगास (वैक्यूम डिसिकेटर में 5 मिनट)। अधिकांश बुलबुले से छुटकारा पाना सुनिश्चित करें (शीर्ष सतह पर कुछ छोटे बुलबुले ठीक हैं)।
  7. पीडीएमएस को जालीदार और जमने के लिए कम से कम 5 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में मोल्ड रखें।
  8. मोल्ड से ठोस पीडीएमएस कक्षों को हटा दें।
    सावधानी: एसयू -8 मोल्ड्स के लिए सिलिकॉन वेफर्स बेहद नाजुक हैं, इसलिए पीडीएमएस को वेफर्स से अलग करते समय व्यापक देखभाल की जानी चाहिए। एक कठिन, सपाट सतह पर काम करें और वेफर को सतह पर सपाट रखें।
    1. रेजर ब्लेड के साथ, पीडीएमएस में एक गोलाकार कटौती करें, मोल्ड के किनारे से लगभग 1 सेमी दूर। सभी पैटर्न कट के अंदर कम से कम 0.5 सेमी होना चाहिए। कोमल टग्स के साथ केंद्रीय पीडीएमएस ब्लॉक को धीरे से छील लें।
      सावधानी: छीलते समय, इसे तोड़ने से रोकने के लिए बेंचटॉप पर एसयू -8 मोल्ड फ्लैट बनाए रखें।
    2. साफ एल्यूमीनियम पन्नी पर पीडीएमएस रखें, एल्यूमीनियम पन्नी का सामना करने वाली ढाला सतह, धूल से इसकी सतह की रक्षा करने और पैटर्न को अधिक दृश्यमान बनाने के लिए।
  9. चुनें और पैटर्न से कम से कम 0.5 सेमी दूर एक रेजर ब्लेड के साथ एक कक्ष काट लें। परिणामस्वरूप पीडीएमएस ब्लॉक लगभग 0.5 सेमी ऊंचा, 1.5 सेमी चौड़ा और 3 सेमी लंबा है। बायोप्सी पंच 0.75 मिमी आईडी (सामग्री की तालिका) के साथ तीन इनलेट और एक आउटलेट पियर्स करें।
  10. अल्ट्राप्योर इथेनॉल (सामग्री की तालिका) के साथ पीडीएमएस कक्ष को साफ करें और सुरक्षा ब्लोगन (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके हवा-सूखा। पीडीएमएस को एक साफ पेट्री डिश में सामना करने वाले पैटर्न के साथ रखें, और पकवान को इसके ढक्कन के साथ बंद करें।

2. ग्लास कवरस्लिप सफाई

नोट: यहां, सोनिकेशन चरणों की एक श्रृंखला के आधार पर एक मानक कवरस्लिप सफाई प्रक्रिया विस्तृत है। अन्य ग्लास कवरस्लिप-सफाई प्रक्रियाओं को कई अन्य प्रकाशनों में वर्णित किया गया है जो समान संतोषजनक परिणाम 6,7,8,9 प्राप्त कर सकते हैं।

  1. पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) धारक (सामग्री की तालिका) पर 10-20 कवरलिप्स (40 मिमी लंबा) रखें। एक 1 एल ग्लास बीकर (35 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट) में 2% ग्लास सफाई समाधान (सामग्री की तालिका) के 0.5 एल में कवरलिप्स को सोनीकेट करें।
  2. ग्लास सफाई समाधान का निपटान करें और कम से कम तीन लगातार 0.5 एल स्नान में डीएच 2 ओ के साथ कवरलिप्स को बड़े पैमाने पर कुल्लाएं।
  3. 1 एल ग्लास बीकर में 2 एम केओएच के 0.5 एल तैयार करें। केओएच (आरटी, 30 मिनट) में कवरलिप्स को सोनीकेट करें। केओएच का निपटान करें और कम से कम तीन 0.5 एल स्नान में डीएच 2 ओ के साथ कवरलिप्स कुल्ला।
    सावधानी: उचित प्रयोगशाला सुरक्षा सुरक्षा उपकरण (दस्ताने, चश्मा और प्रयोगशाला कोट) का उपयोग करें।
  4. अल्ट्राप्योर इथेनॉल (आरटी, 30 मिनट) के 0.5 एल में कवरलिप्स को स्थानांतरित और सोनिकेट करें। कवरलिप्स को इथेनॉल में 2 सप्ताह तक रखा जा सकता है। वाष्पीकरण को रोकने के लिए थर्माप्लास्टिक फिल्म (सामग्री की तालिका) के साथ बीकर को बंद करें। उपयोग करने से पहले, कवरस्लिप को हवा के प्रवाह के साथ सुखाएं।

3. पीडीएमएस चैंबर असेंबली

  1. गर्म प्लेट को 100 डिग्री सेल्सियस तक पहले से गरम करें। एक साफ पेट्री डिश में तीन साफ पीडीएमएस कक्षों और ग्लास कवरलिप्स तक रखें। एक गहरी पराबैंगनी (यूवी) क्लीनर में खुले पेट्री डिश रखें (λ = 185 एनएम, सामग्री की तालिका देखें) और इसे 3-5 मिनट के लिए यूवी प्रकाश में उजागर करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, पीडीएमएस कक्षों और कवरलिप्स को 30 एस के लिए हवा या ऑक्सीजन प्लाज्मा के संपर्क में लाया जा सकता है।
  2. धीरे से कवरस्लिप पर पीडीएमएस कक्ष की स्थिति। सुनिश्चित करें कि संपर्क में रखी गई दो सतहें सीधे यूवी के संपर्क में थीं। पीडीएमएस स्वचालित रूप से कांच से चिपक जाता है और कक्ष स्पष्ट रूप से दिखाई देता है।
  3. पीडीएमएस-कवरस्लिप इंटरफ़ेस पर फंसी किसी भी हवा को हटाने के लिए, बहुत धीरे से सतह को एक उंगली से दबाएं। एक तंग बंधन के लिए, कोनों और पक्षों पर अधिक दृढ़ता से दबाएं। सुनिश्चित करें कि कक्ष की छत कांच की सतह के संपर्क में नहीं आती है।
  4. 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट का सामना करना पड़ ग्लास तल के साथ कक्ष रखें। इस चरण के बाद, ग्लास-पीडीएमएस बांड स्थायी हो जाते हैं, और कक्षों का उपयोग केवल एक बार किया जा सकता है। कक्ष का तुरंत उपयोग करें या इसे एक सप्ताह तक एक साफ पेट्री डिश में स्टोर करें।

4. [वैकल्पिक] प्रत्यक्ष निष्क्रियता और कार्यात्मकता

नोट: आवेदन के आधार पर, कक्षों को निष्क्रिय और कार्यात्मक किया जा सकता है या तो एक बार माइक्रोफ्लुइडिक नियंत्रण डिवाइस से जुड़ा हुआ है ( सामग्री की तालिका देखें) या मैन्युअल रूप से माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस से कनेक्शन से पहले एक पिपेट के साथ कक्ष में सीधे समाधान इंजेक्ट करके। उत्तरार्द्ध माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के पॉलीथर ईथर कीटोन (पीक) ट्यूबिंग के माध्यम से समाधान को प्रवाहित करके कम अभिकर्मक का उपभोग करने और संभावित संदूषण से बचने का लाभ प्रदान करता है। निम्नलिखित सभी चरणों में, समाधान सीधे आउटलेट में विंदुक टिप चिपकाकर इंजेक्ट कर रहे हैं। कक्ष के अंदर बुलबुले बनाने से बचने के लिए, पीडीएमएस कक्ष के आउटलेट में टिप को प्लग करते समय पिपेट टिप से चिपकने वाली एक छोटी बूंद होना सुनिश्चित करें। इसी तरह, पूरे वॉल्यूम इंजेक्शन से पहले पिपेट टिप को हटा दें।

  1. पीएलएल-पीईजी के 20 μL इंजेक्ट करें (फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 1 मिलीग्राम / आरटी पर कम से कम 1 घंटे (या रात भर) के लिए सेते हैं। वाष्पीकरण को रोकने के लिए, पीडीएमएस कक्ष को एक आर्द्र बॉक्स में रखें (उदाहरण के लिए, निचले डिब्बे में पानी के साथ एक खाली टिप बॉक्स और टिप-होल्डिंग प्लेटफॉर्म पर पीडीएमएस कक्ष)।
  2. 100 पीएम स्पेक्ट्रिन-एक्टिन बीज के 20 μL इंजेक्ट करें (एफ-बफर में, तालिका 1 और तालिका 2 देखें)। 1 मिनट से अधिक समय तक प्रतीक्षा न करें। बीज की सतह घनत्व को ट्यून करने के लिए बीज एकाग्रता और समय समायोजित करें, बड़े आंकड़ों के लिए पर्याप्त उच्च और फिलामेंट्स को ओवरलैप न करने के लिए पर्याप्त कम।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, यदि स्पेक्ट्रिन-एक्टिन बीज उपलब्ध नहीं हैं, तो बायोटिन-कार्यात्मक लघु फिलामेंट सेगमेंट का उपयोग करें जो स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित कवरस्लिप 9,10 पर स्थिर हो जाएंगे।
  3. [वैकल्पिक] एफ-बफर में 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 20 μL इंजेक्ट करें। 10 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ दें।
  4. [वैकल्पिक] एफ-बफर में 1 मिलीग्राम / एमएल β-कैसिइन के 20 μL इंजेक्ट करें। 10 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ दें।
    नोट: कक्ष को आगे निष्क्रिय करने के लिए चरण 4.3 और / या 4.4 का पालन करें। निष्क्रियता की पसंद उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन पर निर्भर करती है और सभी एबीपी पर समान रूप से अच्छी तरह से काम नहीं करती है। अकेले एक्टिन का उपयोग करते समय, पीएलएल-पीईजी या बीएसए पर्याप्त है।

5. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस कनेक्ट करें

नोट: माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष (चित्रा 1 ए, सामग्री की तालिका देखें) में प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए चार चैनलों के साथ एक दबाव-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली का उपयोग करें। माइक्रोफ्लुइडिक ट्यूबिंग और परेशान प्रवाह स्थिरता में बनने वाले बुलबुले से बचने के लिए, सभी समाधानों को कम करें। एक वैक्यूम पंप (अंतिम वैक्यूम <250एमबीएआर) से जुड़े वैक्यूम डिसिकेटर में डीएच 2 0 और 10 एमएल एफ-बफर स्टॉक के 5 एमएल रखें और आरटी पर कम से कम 1 घंटे के लिए डिगैस रखें।

  1. डीएच2ओ (500 μL, 300 mbar) के साथ इनलेट + आउटलेट ट्यूबिंग कुल्ला।
  2. एफ-बफर के 300 μL के साथ सभी 2 एमएल जलाशय ट्यूबों ( सामग्री की तालिका देखें) भरें। 300 एमबार पर दबाव सेट करें और पांच से आठ बूंदों को बेकार जाने दें। प्रत्येक चैनल के लिए दोहराएं और दबाव 0 पर सेट करें।
  3. आउटलेट कनेक्ट करें और कक्ष को बड़े पैमाने पर कुल्ला।
    1. जलाशय ट्यूब 4 (आउटलेट) के लिए दबाव 50 एमबार पर सेट करें। एक बार जब ट्यूबिंग अंत से एक छोटी बूंद बाहर आती है, तो ट्यूबिंग को पीडीएमएस कक्ष के आउटलेट से कनेक्ट करें। तरल कक्ष में भरता है और सभी इनलेट से बाहर आता है।
    2. [वैकल्पिक] यदि कक्ष सीधे निष्क्रिय हो गया है (धारा 4), एफ-बफर (3-5 मिनट) के 50-100 μL के साथ कक्ष कुल्ला करने के लिए 100 mbar के लिए दबाव सेट करें। एक सफाई ऊतक के साथ इनलेट पर अतिरिक्त तरल निकालें।
    3. दबाव 20 एमबार पर सेट करें।
  4. इनलेट कनेक्ट करें।
    1. जलाशय ट्यूब 1 से 50 एमबार के लिए दबाव सेट करें। हवा के बुलबुले पेश करने से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि ट्यूबिंग और पीडीएमएस इनलेट से एक बूंद निकलती है।
    2. ट्यूबिंग को इनलेट 1 से कनेक्ट करें (कनेक्ट करते समय दो बूंदें विलय हो जाती हैं)। दबाव को 30 एमबार पर सेट करें।
    3. इनलेट 2 और 3 कनेक्ट करने के लिए चरण 5.4.1-5.4.2 दोहराएँ।
  5. सभी इनलेट के दबाव को 20 एमबार और आउटलेट दबाव को 0 एमबार पर सेट करें। सुनिश्चित करें कि इनलेट में प्रवाह दर लगभग बराबर हैं (समस्या निवारण अनुभाग देखें)।

Figure 1
चित्रा 1: एक माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर के माध्यम से समाधान इंजेक्शन लगाना (ए) एकल एक्टिन फिलामेंट्स प्रयोगों के लिए मानक माइक्रोफ्लुइडिक सेटअप। प्रोटीन समाधान, जलाशयों 1-3 में रखा जाता है, गैस चरण में दबाव को समायोजित करके कक्ष में धकेल दिया जाता है। उत्पन्न प्रवाह दरों को प्रवाह मीटर द्वारा मापा जाता है। माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों के अंदर, समाधान लागू सापेक्ष दबावों के आधार पर मिश्रण और स्थान पर कब्जा नहीं करते हैं (यहां, सभी इनलेट्स पर समान दबाव)। विशिष्ट आयाम: जलाशय ट्यूबों में 2 मिलीलीटर तक समाधान होता है। पीक ट्यूबिंग (0.25 मिमी आंतरिक व्यास) जलाशयों को प्रवाह मीटर (ट्यूबिंग के 10 सेमी के बाद) और फिर पीडीएमएस चैंबर (एक और 70 सेमी के बाद) से जोड़ता है। सिलिकॉन ट्यूबिंग और स्टेनलेस स्टील ट्यूबिंग कप्लर्स का उपयोग पीडीएमएस इनलेट्स से पीक ट्यूबिंग को जोड़ने के लिए किया जाता है। मुख्य माइक्रोफ्लुइडिक चैनल 20-60 μm ऊंचा, लगभग 1 मिमी चौड़ा और 1 सेमी लंबा है। (बी, सी) माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष के अंदर प्रवाह प्रोफाइल। (बी) द्रव कक्ष ऊंचाई में एक परवलयिक प्रोफ़ाइल उत्पन्न करता है: वी (जेड) = 6 जेड (एच-जेड) आर / एच3डब्ल्यू, जहां एच और डब्ल्यू कक्ष ऊंचाई और चौड़ाई हैं, और आर कुल प्रवाह दर है। नीचे: सतह-लंगर वाले स्पेक्ट्रिन-एक्टिन बीज से बहुलकीकृत एकल एक्टिन फिलामेंट। (सी) जब कक्ष की चौड़ाई इसकी ऊंचाई से काफी बड़ी होती है, तो पीडीएमएस सतहों को छोड़कर, जहां यह शून्य हो जाता है, कक्ष में प्रवाह लगभग समान होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

6. मानक प्रवाह दरों के साथ सेटअप कॉन्फ़िगर करना

नोट: कंप्यूटर-नियंत्रित दबाव प्रणाली पीडीएमएस कक्ष से जुड़े सभी इनलेट /आउटलेट के दबावों के आसान और सटीक समायोजन की अनुमति देती है, इसलिए आने वाली और आने वाली प्रवाह दरों का नियंत्रण। प्रीसेट कॉन्फ़िगरेशन को सहेजा जा सकता है और एक माउस क्लिक के साथ चालू / नीचे अनुशंसित कॉन्फ़िगरेशन हैं (जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है, आउटलेट दबाव 0 एमबार पर सेट किया गया है)। इन पूर्व निर्धारित कॉन्फ़िगरेशन के लिए अपेक्षित प्रवाह दरों के लिए तालिका 3 देखें। यहां इंगित दबावों को कक्ष ज्यामिति और सिस्टम कॉन्फ़िगरेशन के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए।

  1. बदलें: एक या अधिक जलाशय (जलाशयों) को बदलते समय इस प्रीसेट का उपयोग करें। यह बुलबुले पेश करने से रोकने के लिए ब्याज की ट्यूबिंग में एक हल्का पिछड़ा प्रवाह बनाता है।
    1. 12 एमबार और आउटलेट दबाव 5 एमबार (चित्रा 2 बी) के लिए सभी इनलेट दबाव सेट करें।
  2. उच्च प्रवाह 'सभी': समानांतर में तेजी से तीन समाधान इंजेक्ट करने के लिए इस पूर्व निर्धारित का उपयोग करें। वे 4 मिनट के भीतर कक्ष में पहुंच जाएंगे।
    1. सभी इनलेट दबावों को 150 एमबार पर सेट करें।
  3. उच्च प्रवाह 'एक्स': तेजी से एक समाधान इंजेक्ट करने के लिए इस पूर्व निर्धारित का उपयोग करें। यह 3 मिनट (चित्रा 3 ए-सी) के भीतर कक्ष तक पहुंच जाएगा।
    1. 150 एमबार (~ 15 μL / मिनट) के लिए इनलेट 'एक्स' दबाव सेट करें। अन्य इनलेट में दबाव को लगभग 100 एमबार में समायोजित किया जाता है, जैसे कि इनलेट्स में परिणामी प्रवाह दर ~ 500 एनएल /
  4. मिड फ्लो 'ऑल': सिस्टम को रोकने के लिए इस प्रीसेट का उपयोग करें।
    1. सभी इनलेट को 20 एमबार (चित्रा 2 ए) पर सेट करें।
  5. मध्य प्रवाह 'एक्स': समाधान 'एक्स' को चैनल पक्षों के लिए अन्य इनलेट समाधानों को प्रतिबंधित करते हुए अधिकांश मुख्य चैनल चौड़ाई ( चित्रा 2 सी, डी देखें) को भरने की अनुमति देने के लिए इस प्रीसेट का उपयोग करें। चैंबर में एक्टिन फिलामेंट्स इस प्रकार केवल समाधान 'एक्स' द्वारा लगाए गए जैव रासायनिक स्थिति के संपर्क में आएंगे।
    1. इनलेट 'एक्स' दबाव को 12 एमबार पर सेट करें। अन्य इनलेट में दबाव सेट करें और ~ 9 एमबीएआर को समायोजित करें, जैसे कि उनकी संबंधित प्रवाह दर ~ 150 एनएल /

Figure 2
चित्रा 2: प्रत्येक जलाशय पर लागू दबाव माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष के अंदर समाधानों के विभाजन/स्थानिक वितरण को नियंत्रित करता है। (ए) जलाशयों पर लागू समान दबाव के साथ, प्रत्येक समाधान कक्ष के एक तिहाई हिस्से पर कब्जा कर लेता है। (बी) जलाशय ट्यूब (यहां जलाशय 3) को बदलते समय, प्रभावी दबाव शून्य तक गिर जाता है, जिससे पिछड़ा प्रवाह बनता है। (सी, डी) जलाशयों में से एक पर सापेक्ष दबाव बढ़ाने से कांच की सतह को एक ही समाधान के संपर्क में आने की अनुमति मिलती है। चैंबर के बीच में देखने का क्षेत्र क्रमिक रूप से कॉन्फ़िगरेशन मिड फ्लो 1 (सी) और मिड फ्लो 2 (डी) के बीच बारी-बारी से समाधान 1 और 2 के संपर्क में आ सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

7. समाधान 'एक्स' बदलना

नोट: जैसा कि चित्रा 3 ए-सी में दिखाया गया है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि समाधान जलाशय ट्यूब से कक्ष के मुख्य चैनल में प्रवाह करने में मिनट लगते हैं। यह न्यूनतम 'मृत' समय ट्यूबिंग में निहित तरल मात्रा और ट्यूबिंग (चित्रा 3 ए-सी) के भीतर प्रवाह प्रोफ़ाइल द्वारा लगाया जाता है।

  1. एक नए जलाशय ट्यूब में समाधान के 200-300 μL तैयार करें। सेटिंग परिवर्तित करने के लिए दबाव सेट करें (अनुभाग 6 देखें)।
  2. इनलेट 'एक्स' की जलाशय ट्यूब को अनस्क्रू करें। ट्यूबिंग में समाधान धीरे-धीरे पीछे की ओर प्रवाहित होगा, कक्ष से मुक्त ट्यूबिंग टिप तक। मापा प्रवाह दर नकारात्मक हो जाता है (चित्रा 2 बी)।
  3. एक बार जब ट्यूबिंग टिप पर एक छोटी बूंद बन जाती है, तो ताजा समाधान के साथ नई ट्यूब में पेंच करें। एक बार ट्यूब को दबाव प्रणाली में सही ढंग से कड़ा कर दिया जाता है, तो इनलेट की प्रवाह दर सकारात्मक हो जाती है।
  4. दबाव सेटिंग को उच्च प्रवाह 'एक्स' पर सेट करें।
  5. माइक्रोफ्लुइडिक कॉन्फ़िगरेशन और चैंबर ज्यामिति के आधार पर, समाधान के लिए पूरी तरह से ट्यूबिंग में भरने और कक्ष तक पहुंचने के लिए 3-5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  6. [वैकल्पिक] समय के साथ प्रतिदीप्ति में वृद्धि को मापने के द्वारा इस प्रक्रिया का पालन करें (चित्रा 3 सी)।

Figure 3
चित्रा 3: जलाशयों से पीडीएमएस कक्ष में समाधान के विलंबित आगमन और जैव रासायनिक स्थितियों का तेजी से परिवर्तन। (ए-सी) जलाशयों से पीडीएमएस चैंबर में समाधान के देरी से आगमन। (ए) कक्ष ज्यामिति, ट्यूब की लंबाई और इनलेट (ओं) पर लागू दबाव के आधार पर, एक समाधान का दूसरे द्वारा प्रतिस्थापन तात्कालिक नहीं है। एक फ्लोरोसेंट समाधान (0 मिनट) युक्त जलाशय ट्यूब को बदलने के बाद, समाधान उत्तरोत्तर ट्यूबिंग (0.4 मिनट) और पीडीएमएस कक्ष (1-2 मिनट) में भर जाता है। सांकेतिक समय एक 150 एमबार लागू दबाव, 80 सेमी पीक ट्यूबिंग, और एक 1600 μm चौड़ा, 20 μm उच्च पीडीएमएस कक्ष के लिए दिया जाता है। (बी) पीक ट्यूबिंग के अंदर परवलयिक प्रवाह प्रोफ़ाइल ट्यूबिंग रेडियल प्रोफाइल के साथ और कक्ष के अंदर प्रतिदीप्ति का एक प्रभावी ढाल उत्पन्न करता है (चित्रा 1 बी भी देखें)। (सी) समाधान के विलंबित आगमन को समय के एक समारोह के रूप में कक्ष में पृष्ठभूमि एपिफ्लोरेसेंस सिग्नल को मापकर मात्रा निर्धारित की जा सकती है। प्रायोगिक स्थितियां: 0.5 μM 10% एलेक्सा-568-लेबल जी-एक्टिन को एक प्रवाह मीटर और 80 सेमी पीक ट्यूबिंग के माध्यम से 150 एमबार के साथ इंजेक्ट किया जाता है। (डी, ई) जैव रासायनिक स्थितियों का तेजी से परिवर्तन। (डी) दो मध्य प्रवाह स्थितियों में आने वाले समाधानों का पैटर्न। (ई) एक्टिन एकाग्रता के रीडआउट के रूप में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में वृद्धि। समय टी = 0 प्रतिदीप्ति वृद्धि की शुरुआत के रूप में सेट किया गया है। समाधान 1: 0.5 μM 10% एलेक्सा-488-लेबल जी-एक्टिन, समाधान 2: एफ-बफर। (सी, ई) पीडीएमएस कक्ष: 20 μm उच्च और 1600 μm चौड़ा। एपिफ्लोरेसेंस तीव्रता, सतह के ऊपर ~ 2 μm, देखने के पूर्ण क्षेत्र पर संकेत औसत करके मात्रा निर्धारित की गई थी, फ्लोरोफोर की अनुपस्थिति में 0 और अधिकतम तीव्रता पर 1 के लिए सामान्यीकृत किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

8. बुनियादी एकल फिलामेंट प्रयोग: एडेनोसिन डिफॉस्फेट (एडीपी) -एक्टिन कांटेदार अंत डिपोलिमराइजेशन

नोट:: यह खंड एक गैर-कार्यात्मक कक्ष (केवल अनुभाग 5) मानता है। यदि कक्ष को सीधे कार्यात्मक किया गया है (धारा 4), चरण 8.4 पर शुरू करें।

  1. एक्टिन फिलामेंट बीज के साथ सतह कार्यात्मकता:
    1. एफ-बफर में 50 पीएम स्पेक्ट्रिन-एक्टिन बीज11 के समाधान 3 से 200 μL बदलें (अनुभाग 7 देखें)।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, यदि स्पेक्ट्रिन-एक्टिन बीज उपलब्ध नहीं हैं, तो कोई बायोटिन-कार्यात्मक लघु फिलामेंट सेगमेंट का उपयोग कर सकता है जो स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित कवरस्लिप पर स्थिर हो जाएगा (विवरण के लिए 9,10 देखें)।
    2. उच्च प्रवाह 3 के साथ 2 मिनट के लिए इंजेक्ट करें।
      नोट: अंतिम बीज घनत्व के आधार पर एकाग्रता और समय समायोजित करें।
  2. सतह निष्क्रियता:
    1. एफ बफर में 5% बीएसए के 300 μL के साथ ट्यूब 3 बदलें।
    2. उच्च प्रवाह 3 पर 5 मिनट के लिए इंजेक्ट करें, इसके बाद मध्य प्रवाह 3 पर 5 मिनट। इस दूसरे चरण के दौरान, एक काउंटर प्रवाह ~ -100 एनएल / मिनट प्राप्त करने के लिए चैनल 1 और 2 से 7-8 एमबार में दबाव कम करें, ताकि पूरे कक्ष सतहों को बीएसए निष्क्रिय किया जा सके।
      नोट: चूंकि बीएसए समाधान अधिक चिपचिपा है, इसलिए दबाव को तदनुसार समायोजित करने की आवश्यकता है।
  3. एफ बफर करने के लिए ट्यूब 3 बदलें और चैनल कुल्ला (5 मिनट, उच्च प्रवाह 3)।
  4. निम्नलिखित 200-300 μL समाधान तैयार करें, सभी प्रोटीन एफ-बफर में पतला हो रहे हैं:
    इनलेट 1, पोलीमराइजेशन समाधान: 1 μM 10% एलेक्सा -488 लेबल जी-एक्टिन, 1 μM प्रोफिलिन (तालिका 1)।
    इनलेट 2, उम्र बढ़ने का समाधान: 0.15 μM 10% एलेक्सा -488 लेबल जी-एक्टिन।
    इनलेट 3, डिपोलिमराइजेशन समाधान: केवल एफ-बफर।
    नोट: प्रोफिलिन का उपयोग यहां सहज न्यूक्लिएशन को रोकने और जी-एक्टिन की निरंतर एकाग्रता बनाए रखने के लिए किया जाता है।
  5. ट्यूब 1 से 3 (धारा 7) बदलें। 3-4 मिनट के लिए उच्च प्रवाह सभी पूर्व निर्धारित का उपयोग कर इंजेक्ट करें। तीन समाधान अब पीक ट्यूबिंग भर दिया है और कक्ष (चित्रा 3 ए) तक पहुंच गया है। कांच की सतह को डेडटाइम (<1 एस, चित्रा 3 डी, ई) के बिना किसी भी इनलेट समाधान के संपर्क में लाया जा सकता है।
  6. माइक्रोस्कोप पर स्विच करें। सेटिंग्स सेट करें: 10% -20% शक्ति, 100-200 एमएस कैमरा एक्सपोजर समय, 200-300 एनएम टीआईआरएफ प्रवेश गहराई, 60x उद्देश्य पर 150 मेगावाट 488 एनएम उत्तेजना लेजर। इन सेटिंग्स का उपयोग पूरे पांडुलिपि में किया जाता है।
  7. फिलामेंट पोलीमराइजेशन (चित्रा 4 ए):
    1. ~ 10 मिनट के लिए मिड फ्लो 1 के लिए दबाव सेटिंग सेट करें।
    2. [वैकल्पिक] रिकॉर्ड पोलीमराइजेशन (1 फ्रेम / 20 एस, टीआईआरएफ)। फिलामेंट्स को लगभग 10 सबयूनिट्स / सेकंड (उप / एस) 1,12 पर पोलीमराइज करना चाहिए।
  8. फिलामेंट उम्र बढ़ने: 15 मिनट के लिए मिड फ्लो 2 के लिए दबाव सेटिंग सेट करें। महत्वपूर्ण एकाग्रता पर, 0.15 μM जी-एक्टिन, फिलामेंट लंबाई स्थिर रहेगी, और फिलामेंट्स >99% एडीपी-एफ-एक्टिन4 में बदल जाएंगे।
  9. डिपोलिमराइजेशन (चित्रा 4 ए):
    1. एपिफ्लोरेसेंस मोड में 1 फ्रेम/5 एस पर अधिग्रहण शुरू करें। चूंकि चैनल 2 और 3 में बहुत कम प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि है, इसलिए टीआईआरएफ का उपयोग करना आवश्यक नहीं है।
    2. एक से दो फ्रेम के बाद, मिड फ्लो 3 पर स्विच करें। फिलामेंट्स को लगभग 10 उप /सेकंड (संदर्भ12) पर डीपोलीमराइज़ करना चाहिए।
  10. प्रयोग को रीसेट करने के लिए, ~ 2 मिनट के लिए अधिकतम शक्ति पर लेजर को लगातार उजागर करके सभी फ्लोरोसेंटली लेबल फिलामेंट्स को तोड़ दें। विभिन्न स्थितियों का परीक्षण करने के लिए, समाधान 1, 2, या 3 बदलें और उन्हें इंजेक्ट करें (उच्च प्रवाह, 3-4 मिनट)। चरण 8.7-8.9 दोहराएँ।

9. अन्य एकल-फिलामेंट प्रयोग

  1. एफ-एक्टिन के साथ एबीपी की बातचीत का परीक्षण करना
    नोट: माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग कई साइड-बाइंडिंग एबीपी की गतिविधि को मापने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है, जैसे कि कोफिलिन, ट्रोपोमायोसिन और एआरपी 2/3। धारा 8 में प्रोटोकॉल का पालन करें:
    1. एफ-बफर में ब्याज के फ्लोरोसेंट एबीपी के लिए चैनल 3 बदलें। इंजेक्शन (उच्च प्रवाह 3, 3 मिनट)।
    2. फिलामेंट पोलीमराइजेशन: 10 मिनट के लिए मिड फ्लो 1 पर दबाव सेटिंग सेट करें।
    3. एबीपी बाइंडिंग: टीआईआरएफ के साथ अधिग्रहण शुरू करें। एबीपी एकाग्रता के आधार पर फ्रेम दर समायोजित करें। 1-2 फ्रेम के बाद, मिड फ्लो 3 पर स्विच करें।
      नोट: एबीपी के आधार पर, छवि लेते समय पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को और कम करने के लिए मिड फ्लो 2 पर तेजी से (उदाहरण के लिए, 5 एस से कम के लिए) स्विच करना भी संभव हो सकता है।
    4. एबीपी अनबाइंडिंग: अधिग्रहण जारी रखते हुए, मिड फ्लो 2 पर स्विच करें।
  2. मुक्त कांटेदार अंत में फॉर्मिन के साथ पोलीमराइजेशन
    नोट: फॉर्मिन को फिलामेंट कांटेदार अंत पोलीमराइजेशन को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। माइक्रोफ्लुइडिक्स को विशेष रूप से मापने के लिए अनुकूलित किया जाता हैमिन बाइंडिंग और अनबाइंडिंग दरें और फिलामेंट बढ़ाव पर उनका प्रभाव।
    1. निम्न समाधान तैयार करें:
      चैनल 1: एफ-बफर (तालिका 1) में 10 एनएम फॉर्मिन।
      चैनल 2: 1 μM 10% एलेक्सा -488 ने जी-एक्टिन, 4 μM प्रोफिलिन लेबल किया।
      चैनल 3: एफ-बफर।
    2. ट्यूब 1, 2, और 3 बदलें (धारा 7)। 3-4 मिनट के लिए उच्च प्रवाह सभी पूर्व निर्धारित का उपयोग कर इंजेक्ट करें।
    3. फिलामेंट पोलीमराइजेशन शुरू करें: 2 मिनट के लिए मिड फ्लो 2 पर दबाव सेटिंग सेट करें।
    4. फिलामेंट कांटेदार अंत के लिए फॉर्मिन बाइंडिंग: दबाव सेटिंग्स को 30 एस के लिए मिड फ्लो 1 पर सेट करें।
    5. फॉर्मिन-मध्यस्थता पोलीमराइजेशन: दबाव सेटिंग को मिड फ्लो 2 पर सेट करें। अपने कांटेदार छोर पर फॉर्मिन एमडीआईए 1 के साथ, फिलामेंट्स को लगभग 50 उप / एस 13,14,15 पर बहुलकीकृत करना चाहिए।
  3. सतह-लंगर वाले फॉर्मिन से पोलीमराइजेशन /
    नोट: फॉर्मिन-सजाए गए कांटेदार सिरों के पोलीमराइजेशन और डिपोलिमराइजेशन दरों को फिलामेंट पर लागू तनाव पर निर्भर करने के लिए दिखाया गया है। माइक्रोफ्लुइडिक्स में, फिलामेंट पक्ष के साथ द्रव प्रवाह का घर्षण फिलामेंट लंबाई और प्रवाह दर14,16 के आनुपातिक तनाव उत्पन्न करता है।
    1. ऊपर वर्णित अनुभाग 8 में विधि का उपयोग करें, सतह निष्क्रियता के लिए चरण 8.1, 8.2 और 8.3 की जगह:
      1. एफ-बफर में ट्यूब 3 से 1 μg/mL एंटी-हिज एंटीबॉडी बदलें। उच्च प्रवाह 3 के साथ 2 मिनट के लिए इंजेक्ट करें।
      2. एफ-बफर में 5% बीएसए के साथ ट्यूब 3 बदलें। उच्च प्रवाह 3 पर 5 मिनट के लिए इंजेक्ट करें, इसके बाद मध्य प्रवाह 3 पर 5 मिनट। इस दूसरे चरण के दौरान, एक काउंटर प्रवाह ~ -100 एनएल / मिनट प्राप्त करने के लिए चैनल 1 और 2 से 7-8 एमबार में दबाव कम करें ताकि पूरे कक्ष सतहों को बीएसए निष्क्रिय किया जा सके।
      3. एफ-बफर में ट्यूब 3 से 100 एनएम हिज-टैग किए गए फॉर्मिन को बदलें। उच्च प्रवाह 3 के साथ 5 मिनट के लिए इंजेक्ट करें। एफ बफर के साथ ट्यूब 3 बदलें। उच्च प्रवाह 3 के साथ 5 मिनट के लिए इंजेक्ट सुनिश्चित करें कि कोई फॉर्मिन टयूबिंग में रहते हैं।
    2. निम्नलिखित समाधान तैयार करें और इंजेक्ट करें (200-300 μL प्रत्येक, एफ-बफर में):
      चैनल 1: 1 μM 10% एलेक्सा -488 ने जी-एक्टिन लेबल किया।
      चैनल 2: 1 μM अनलेबल जी-एक्टिन, 4 μM प्रोफिलिन।
      चैनल 3: केवल एफ-बफर।
    3. फिलामेंट न्यूक्लिएशन: सतह-लंगर वाले फॉर्मिन को जी-एक्टिन ( मिड फ्लो 1 सेट करना) में उजागर करें।
    4. फिलामेंट पोलीमराइजेशन: मिड फ्लो 2 का उपयोग करके प्रोफिलिन-एक्टिन के लिए चैंबर का पर्दाफाश करें।
    5. अधिग्रहण शुरू करें: 1 फ्रेम /2 एस, एपिफ्लोरेसेंस। फॉर्मिन एमडीआईए 1 के साथ, फिलामेंट्स को फिलामेंट लंबाई और प्रवाह दर14 के आधार पर 50-80 उप /
    6. फिलामेंट डीपोलीमराइजेशन: अधिग्रहण शुरू करें (1 फ्रेम / 1-2 फ्रेम के बाद, फिलामेंट्स को एफ-बफर, मिड फ्लो 3 में उजागर करें। फॉर्मिन एमडीआईए 1 के साथ, फिलामेंट्स को फिलामेंट लंबाई और प्रवाह दर 14 के आधार पर5-15 उप /
  4. बिना लेबल वाले खंडों के साथ एक्टिन फिलामेंट्स
    नोट: एक्टिन फ्लोरोसेंट लेबलिंग कई कलाकृतियों को बनाता है, जैसे कि डिपोलिमराइजेशन17 के दौरान विराम और परिवर्तित ट्रोपोमायोसिन बाइंडिंग18। इन कलाकृतियों के लिए एक वर्कअराउंड बिना लेबल वाले खंडों को प्रदर्शित करने वाले फिलामेंट्स को इकट्ठा करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग करना है।
    1. तैयार करें और निम्नलिखित समाधान (एफ-बफर में 200-300 μL) इंजेक्ट करें:
      चैनल 1: 1 μM अनलेबल जी-एक्टिन, 1 μM प्रोफिलिन।
      चैनल 2: 0.3 μM 10% एलेक्सा -488 ने जी-एक्टिन लेबल किया।
    2. क्रमिक रूप से प्रत्येक छोर पर फ्लोरोसेंटली लेबल वाले खंडों के साथ एडीपी-एक्टिन अनलेबल सेगमेंट उत्पन्न करने के लिए चैनल 2 (5 मिनट), चैनल 1 (10 मिनट), और चैनल 2 (15 मिनट) के लिए सतह को उजागर करें।
  5. जेलसोलिन के साथ कांटेदार अंत-लंगर वाले फिलामेंट्स
    नोट: स्पेक्ट्रिन-एक्टिन बीज के साथ, फिलामेंट्स अपने मुक्त कांटेदार छोर पर बहुलकीकरण करते हैं जबकि नुकीले छोर को स्पेक्ट्रिन-एक्टिन बीज द्वारा स्थिर किया जाता है। एक विकल्प जेलसोलिन जैसे कांटेदार अंत कैपर के साथ फिलामेंट्स को लंगर देना है।
    1. एफ-बफर के 20 μL में 4 μM 10% एलेक्सा -488 लेबल जी-एक्टिन का एफ-एक्टिन समाधान तैयार करें। बेंच पर कम से कम 30 मिनट के लिए आरटी पर एक्टिन को अनायास न्यूक्लिएट और पॉलीमराइज़ करने दें। प्रकाश से बचाने के लिए ट्यूब को एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें।
    2. इस बीच, माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष तैयार करें और 5% बीएसए और 1% बायोटिन-बीएसए के मिश्रण के साथ सतह को निष्क्रिय करें (चरण 8.2 देखें)।
    3. एफ बफर के साथ चैनल 3 कुल्ला ( उच्च प्रवाह 3 पर 2 मिनट)। एमएल न्यूट्राविडिन एफ-बफर में इंजेक्ट करें ( उच्च प्रवाह 3 पर 4 मिनट)।
    4. ट्यूबों को इससे परिवर्तित करें:
      चैनल 1: 10 एनएम बायोटिन-जेलसोलिन (तालिका 1)।
      चैनल 2: एफ-बफर।
      चैनल 3: 0.4 μM प्रीपोलिमराइज्ड एफ-एक्टिन।
    5. 3 मिनट के लिए उच्च प्रवाह सभी सेटिंग का उपयोग कर सभी समाधान एक साथ इंजेक्ट करें।
    6. पूरे कक्ष को जेलसोलिन (मध्य प्रवाह 1, 30 एस) में उजागर करें।
    7. सतह पर फिलामेंट्स संलग्न करें (कम प्रवाह 3: चैनल 3 पर 3 एमबार, चैनल 1 और 2 ~ 2 एमबार पर, लगभग 2 मिनट के लिए)।
    8. [वैकल्पिक] यदि फिलामेंट घनत्व बहुत कम है, तो चरण 9.5.6 और 9.5.7 दोहराएं।
    9. नुकीला अंत डीपोलीमराइजेशन: अधिग्रहण शुरू करें (1 फ्रेम / 1-2 फ्रेम के बाद, फिलामेंट्स को केवल बफर करने के लिए उजागर करें, मध्य प्रवाह 2। फिलामेंट्स को लगभग 0.2 उप / सेकंड पर डीपोलीमराइज करना चाहिए।

10. एडीएफ /कोफिलिन द्वारा फासिन-प्रेरित फिलामेंट बंडल गठन और विघटन

नोट: एक्टिन फिलामेंट बंडलों को बनाने के लिए, कक्ष की सतह पर पर्याप्त रूप से उच्च फिलामेंट बीज घनत्व सुनिश्चित करें। फासीन प्रोटीन के संपर्क में आने पर, पड़ोसी फिलामेंट्स जो पार्श्व रूप से उतार-चढ़ाव करते हैं, गतिशील रूप से फासीन प्रोटीन द्वारा क्रॉस-लिंक किए जाएंगे। जैसा कि फासीन फिलामेंट साइड19 से जल्दी से अनबाइंड करता है, फिलामेंट बंडलिंग को बनाए रखने के लिए फासीन को मुख्य बहने वाले समाधान में लगातार मौजूद होना चाहिए।

  1. 8.1-8.3 चरणों का पालन करें।
  2. निम्नलिखित समाधान तैयार करें (एफ-बफर में 200-300 μL):
    चैनल 1, पोलीमराइजेशन समाधान: 1 μM 10% एलेक्सा -488 लेबल जी-एक्टिन, 1 μM प्रोफिलिन।
    चैनल 2, बंडलिंग समाधान: 200 एनएम फासीन (तालिका 1), 0.15 μM 10% एलेक्सा -488 लेबल जी-एक्टिन।
    चैनल 3, विघटन समाधान: 200 एनएम एडीएफ /कोफिलिन (तालिका 1), 100 एनएम फासीन, 0.15 μM 10% एलेक्सा -488 लेबल जी-एक्टिन।
  3. ट्यूब 1 से 3 (धारा 7) बदलें। 3-4 मिनट के लिए उच्च प्रवाह सभी पूर्व निर्धारित का उपयोग कर इंजेक्ट करें।
  4. फिलामेंट पोलीमराइजेशन: ~ 10 मिनट के लिए मिड फ्लो 1 पर दबाव सेटिंग सेट करें। पोलीमराइजेशन को टीआईआरएफ के साथ चित्रित किया जा सकता है।
  5. फिलामेंट बंडलिंग (चित्रा 4 सी): छवि अधिग्रहण शुरू करें (1 फ्रेम / 1-2 फ्रेम के बाद, दबाव सेटिंग को मिड फ्लो 2 पर सेट करें और फिलामेंट बंडलिंग का निरीक्षण करें।
  6. बंडल विखंडन: छवि अधिग्रहण शुरू करें (1 फ्रेम / 1-2 फ्रेम के बाद, दबाव सेटिंग को मिड फ्लो 3 पर सेट करें और एकल फिलामेंट्स और बंडलों दोनों के कोफिलिन-प्रेरित विघटन का निरीक्षण करें।

11. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस सफाई प्रक्रिया

नोट: एक प्रयोग से दूसरे में किसी भी संदूषण से बचने के लिए, प्रत्येक प्रयोग के बाद सभी ट्यूबिंग और प्रवाह मीटर को बड़े पैमाने पर साफ और पूरी तरह से सूखना महत्वपूर्ण है।

  1. पीडीएमएस कक्ष से सभी ट्यूबिंग डिस्कनेक्ट करें और कक्ष को त्याग दें।
  2. पीक ट्यूबिंग और प्रवाह मीटर को साफ करने के लिए, ट्यूबिंग को खाली 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में टेप करें और जलाशय लगभग खाली होने तक अधिकतम दबाव पर निम्नलिखित समाधान इंजेक्ट करें:
    एफ-बफर के 400 μL।
    0.5 एम एनएओएच के 400 μL।
    शुद्ध पानी के 400 μL.
    आइसोप्रोपेनॉल के 200 μL।
  3. एक खाली जलाशय के साथ बदलें और हवा उड़ा जब तक ट्यूबिंग पूरी तरह से सूखी (~ 2-4 मिनट, अधिकतम दबाव) कर रहे हैं।

12. छवि विश्लेषण

नोट: जबकि यह पांडुलिपि माइक्रोफ्लुइडिक्स में एकल एक्टिन फिलामेंट्स को इकट्ठा करने, हेरफेर करने और कल्पना करने की विधि पर केंद्रित है, अधिग्रहित फिल्मों का विश्लेषण करने के लिए एक संक्षिप्त विधि यहां प्रदान की गई है। विश्लेषण 16-बिट छवियों पर किया जाता है, इमेजजे का उपयोग करके, अनुभाग 8 का पालन करता है।

  1. छवि उपचार न्यूनतम है:
    1. पोलीमराइजेशन या डीपोलिमराइजेशन छवि स्टैक आयात करें।
    2. [वैकल्पिक] फ़ंक्शन घटाएँ पृष्ठभूमि (डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स (यानी 'रोलिंग बॉल त्रिज्या' = 50 पिक्सेल)) के साथ छवि तीव्रता को समरूप करें)। यह विशेष रूप से उपयोगी है यदि पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति एक फिल्म के दौरान बदलती है या यदि प्रतिदीप्ति रोशनी देखने के क्षेत्र पर सजातीय नहीं है।
    3. चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें (शून्य के पास पृष्ठभूमि, अधिकतम के पास फिलामेंट्स)।
  2. फिलामेंट काइमोग्राफ बनाएं:
    1. एक फिलामेंट का चयन करें जो विराम, टूट या अलग नहीं होता है। अन्यथा व्यवहार के आधार पर चयन न करें। ऊपर 1-2 पिक्सेल की रेखा खींचें (सीधी रेखा उपकरण)। फिलामेंट नंबर सहेजें (आरओआई प्रबंधक में जोड़ें)।
    2. फ़ंक्शन स्लाइस लागू करें (स्लाइस गिनती: 5 पिक्सेल)। अधिकतम तीव्रता (फ़ंक्शन जेडप्रोजेक्शन) की गणना करें।
  3. पोलीमराइजेशन/डिपोलिमराइजेशन दर को मापें:
    1. काइमोग्राफ पर, फिलामेंट कांटेदार अंत (सीधी रेखा उपकरण, चित्रा 4 ए) के साथ एक रेखा खींचें। लाइन चौड़ाई और ऊंचाई (फ़ंक्शन माप) को मापें।
  4. एकाधिक फिलामेंट्स पर चरण 12.2-12.3 दोहराएँ। पोलीमराइजेशन/डिपोलिमराइजेशन दरों की गणना करें (चित्रा 4 ए):
    Equation 1, जहां वी दर (उप /एस में), डब्ल्यू लाइन चौड़ाई (पिक्सेल), पिक्सेल आकार (एनएम), एच लाइन ऊंचाई (फ्रेम ), और डीटी फ्रेम (सेकंड में) के बीच का समय है। यहां, 2.7 एनएम फिलामेंट लंबाई में एक एक्टिन सबयूनिट के प्रभावी योगदान से मेल खाती है।

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Representative Results

ऊपर वर्णित सभी प्रयोगों के लिए, फ्लोरोसेंटली लेबल एक्टिन फिलामेंट्स स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए, अच्छे विपरीत के साथ, सतह से कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का संकेत (चित्रा 4, सामान्य मुद्दों के समस्या निवारण के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें)। एक्टिन फिलामेंट्स को भी सतह से चिपकना नहीं चाहिए: जब प्रमुख प्रवाह दर कम होती है, तो एक्टिन फिलामेंट्स के पार्श्व उतार-चढ़ाव को लाइव देखते समय बोधगम्य होना चाहिए और किसी को स्पष्ट रूप से यह निर्धारित करने की अनुमति देनी चाहिए कि वे केवल उनके सिरों में से एक द्वारा लंगर डाले हुए हैं। इसी तरह, टीआईआरएफ इमेजिंग का उपयोग करते समय, उनके ऊर्ध्वाधर उतार-चढ़ाव उनकी लंबाई और समय के साथ तीव्रता में परिवर्तन से दिखाई देने चाहिए। लागू प्रवाह दरों के आधार पर, टीआईआरएफ द्वारा अधिग्रहित एक्टिन फिलामेंट्स की छवि गुणवत्ता को अनुकूलित करने के लिए टीआईआरएफ प्रवेश गहराई को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

फिलामेंट्स को पोलीमराइजेशन स्थितियों में उजागर करते समय (धारा 8 देखें), फिलामेंट बढ़ाव नियमित होना चाहिए (यानी, फिलामेंट के अंत में बढ़ाव सतह की बातचीत या स्थायी चिपकने से बाधित नहीं होता है)। इसके अलावा, मापा फिलामेंट कांटेदार अंत बढ़ाव दर ट्यूब 1,20 में एक्टिन एकाग्रता के अनुसार अपेक्षित मूल्य से मेल खाना चाहिए, यह दर्शाता है कि ट्यूब समाधान सही ढंग से माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर (चित्रा 4 ए) तक प्रवाहित किया गया है। इसी तरह, जब एक बफर समाधान के संपर्क में, फिलामेंट्स को एक दर पर लगातार डीपोलिमराइज करना चाहिए जो उनके एडीपी-सामग्री4 (चित्रा 4 ए) को दर्शाता है। फ्लोरोसेंटली लेबल वाले कोफिलिन के समाधान के लिए पहले से ही उगाए गए एक्टिन फिलामेंट्स को उजागर करते समय, कोफिलिन क्लस्टर न्यूक्लिएटेड होंगे और कोफिलिन एकाग्रता पर निर्भर दर पर नुकीले और कांटेदार सिरों (चित्रा 4 बी) दोनों की ओर बढ़ेंगे। एक एबीपी की संभावित क्रॉस-लिंकिंग गतिविधि का आकलन करते समय, जैसे कि फासीन (चित्रा 4 सी), बंडलबनाने वाले क्लोज-बाय एक्टिन फिलामेंट्स को आसानी से उनकी उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता और उनके पार्श्व उतार-चढ़ाव में बदलाव से पता लगाया जाएगा।

तरल का प्रवाह एक्टिन फिलामेंट्स पर एक चिपचिपा घर्षण बल लागू करता है जो माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष की सतह पर लंगर डाले होते हैं। एफ-एक्टिन पर घर्षण बल गुणांक η = 6.10-4 पीएन / μm 2 है, जो प्रति फिलामेंट माइक्रोन लंबाई14 व्यक्त किया गया है। मध्यवर्ती प्रवाह दरों पर, जैसा कि फिलामेंट ऊंचाई सतह से ऊपर 250 एनएम के निरंतर औसत के आसपास उतार-चढ़ाव करती है, फ्री-फ्लोटिंग एंड से फिलामेंट एंकरिंग पॉइंट तक एक बल ढाल मौजूद है। इसलिए कोई भी फिलामेंट के साथ किसी भी बिंदु पर लागू तनाव की गणना कर सकता है, एफ = 6πएलवी का उपयोग करके, जहां वी सतह से ऊपर स्थानीय प्रवाह वेग 250 एनएम है (चित्रा 1 बी) और एल डाउनस्ट्रीम फिलामेंट सेगमेंट लंबाई है (यानी, माना जाता बिंदु से मुक्त अंत तक)। उच्च प्रवाह दरों के लिए, फिलामेंट औसत ऊंचाई स्थिर नहीं है, लेकिन एंकरिंग बिंदु से मुक्त अंत तक रैखिक रूप से बढ़ जाती है, औसतन 250 एनएम से नीचे रहती है, और प्रवाह दरों के आधार पर भिन्न होगी, इस प्रकार फिलामेंट21 के साथ अधिक जटिल तनाव बल प्रोफ़ाइल होती है।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि परिणाम। विशिष्ट प्रयोग जिसमें एक्टिन फिलामेंट्स को स्पेक्ट्रिन-एक्टिन बीज से बहुलकीकृत किया जाता है और विभिन्न एबीपी के संपर्क में लाया जाता है। स्पष्टता के लिए, दृश्य क्षेत्र का केवल एक अंश दिखाया गया है। (ए) बुनियादी पोलीमराइजेशन-डिपोलीमराइजेशन प्रयोग (धारा 8) से परिणाम। फिलामेंट्स को 0.8 μM 10% एलेक्सा -488 लेबल जी-एक्टिन के समाधान के साथ बहुलकीकृत किया जाता है, जो सभी सबयूनिट्स को एडीपी-एक्टिन (नहीं दिखाया गया है) में परिवर्तित करने के लिए 15 मिनट के लिए वृद्ध होता है, और केवल एफ-बफर के संपर्क में आने पर डिपोलिमराइज्ड होता है। नीचे: पोलीमराइजेशन और डिपोलिमराइजेशन दरों को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले काइमोग्राफ। 1 फ्रेम/5 एस, 200 एमएस एक्सपोजर समय, 9% शक्ति पर 150 मेगावाट 488 एनएम लेजर, टीआईआरएफ (लेजर प्रवेश गहराई 250 एनएम) पर अधिग्रहित। (बी) 500 एनएम एमचेरी-कोफिलिन -1 द्वारा एकल एक्टिन फिलामेंट्स का विखंडन। एक्टिन को एटीपी-एटीटीओ 48822 (पीला) के साथ लेबल किया गया है और कोफिलिन -1 को एमचेरी (नीला) से जोड़ा गया है। शीर्ष: दृश्य क्षेत्र का अंश। नोट: सतह पर प्रोटीन समुच्चय। नीचे: एक फिलामेंट के लिए कोफिलिन -1 के बंधन को दिखाते हुए काइमोग्राफ (एरोहेड्स कोफिलिन -1 डोमेन न्यूक्लिएशन इवेंट दिखाते हैं), जिससे एक विखंडन घटना (बिजली का प्रतीक) होता है। 1 फ्रेम/4 एस, 200 एमएस एक्सपोजर, 16% पर 150 मेगावाट 488 एनएम लेजर और 12% पावर पर 100 मेगावाट 561 एनएम लेजर, एपिफ्लोरेसेंस पर अधिग्रहित। (सी) फासीन द्वारा एक्टिन फिलामेंट्स की बंडलिंग (धारा 10.5)। फिलामेंट्स को पहले 0.8 μM 5% एलेक्सा -488 लेबल जी-एक्टिन के साथ बहुलकीकृत किया गया था और 200 एनएम फासिन के साथ बंडल किया गया था। एकल फिलामेंट्स की तुलना में, फिलामेंट बंडल दो से तीन गुना उज्ज्वल दिखाई देते हैं और प्रवाह के साथ पूरी तरह से संरेखित नहीं होते हैं। 10 एस, 200 एमएस एक्सपोजर, 20% 200 डब्ल्यू बुध दीपक तीव्रता, एपिफ्लोरेसेंस पर अधिग्रहित। (ए-सी) पृष्ठभूमि को इमेजजे के तदर्थ फ़ंक्शन के साथ घटाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रोटीन का नाम प्रजातियां यूनिप्रोट रेफरी (अनुक्रम) मूल शुद्धि प्रोटोकॉल रेफरी। टिप्पणियाँ
एक्टिन खरगोश पी 68135 (पूर्ण लंबाई) 23 फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए, रेफरी 24 देखें
प्रोफिलिन 1 मानवीय P07737 (पूर्ण लंबाई) 25 यह भी देखें रेफरी 11
स्पेक्ट्रिन-एक्टिन बीज मानवीय एन/ए 26, 27 यह भी देखें रेफरी 11
कोफिलिन 1 चूहा पी 18760 (पूर्ण लंबाई) 28
जेलसोलिन मानवीय P06396 (पूर्ण लंबाई) 29
एमडीआईए 1 फॉर्मिन चूहा ओ08808 (एए 552-1255) 13 रेफरी 24 में अधिक विस्तृत प्रोटोकॉल
फासिन 1 मानवीय Q16658 (पूर्ण लंबाई) 30

तालिका 1: एक्टिन और एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन 23,24,25,26,27,28,29,30

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) एकाग्रता
ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.4 5 एमएम
केसीएल 50 एमएम
एमजीसीएल 2 1 एमएम
ईजीटीए 0.2 एमएम
एटीपी 0.2 एमएम
डीटीटी डा. 10 एमएम
डीएबीसीओ 1 एमएम

तालिका 2: एफ-बफर संरचना। डीएबीसीओ और डीटीटी की अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता का उपयोग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के दौरान प्रकाश जोखिम के कारण फिलामेंट्स को फोटो-प्रेरित क्षति को सीमित करने के लिए किया जाता है।

नाम सेट करना दबाव (एमबार) प्रवाह दर (एनएल /
अधिकतम दबाव 300 ~ 30 000 (प्रमुख चैनल में)
हाई प्रेशर 150 ~ 15 000 (प्रमुख चैनल में)
मिड प्रेशर 12 ~ 1500 (प्रमुख चैनल में)
'परिवर्तन' दबाव सभी इनलेट्स के लिए 12,
आउटलेट के लिए 5		 ~ 500 (प्रत्येक इनलेट में)

तालिका 3: लागू दबाव और मापा प्रवाह दरों के बीच पत्राचार। परिणामी प्रवाह दर अत्यधिक प्रयोगात्मक सेटअप पर निर्भर करती है। क्रॉस-सेक्शन 20 μm x 800 μm (ऊंचाई x चौड़ाई) के 1 सेमी लंबे मुख्य चैनल के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर के लिए मान दिए जाते हैं, जो 80 सेमी लंबी पीक ट्यूबिंग के साथ प्रत्येक जलाशय से जुड़ा होता है।

अनुपूरक फ़ाइल 1: शास्त्रीय मुद्दे, कारण और समाधान। या एकल एक्टिन फिलामेंट्स के साथ काम करते समय उन्हें आमतौर पर मुद्दों का सामना करना पड़ता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मानक एकल-फिलामेंट विधियों की तुलना में जहां एक्टिन फिलामेंट्स को उनकी लंबाई के साथ कई बिंदुओं द्वारा सतह पर लंगर डाला जाता है या मिथाइलसेल्यूलोज जैसे भीड़ एजेंट द्वारा इसके करीब बनाए रखा जाता है, माइक्रोफ्लुइडिक्स कई फायदे प्रदान करता है। चूंकि सतह के साथ बातचीत न्यूनतम होती है, कृत्रिम विराम ये इंटरैक्शन बढ़ाव और डीपोलीमराइजेशन दोनों के दौरान प्रेरित कर सकते हैं। फिलामेंट्स प्रवाह द्वारा संरेखित होते हैं, एक दूसरे के समानांतर, उनकी निगरानी और उनकी लंबाई के माप को आसान बनाते हैं। फिलामेंट्स के चारों ओर समाधान को लगातार नवीनीकृत किया जाता है, जिससे उन्हें निरंतर प्रोटीन सांद्रता में उजागर किया जाता है। विभिन्न प्रोटीन समाधानों के बीच तेजी से (<1 एस, चित्रा 3 डी, ई) स्विच करने में सक्षम होने के नाते, जिसमें फिलामेंट्स उजागर होते हैं, समय-नियंत्रित अनुक्रमिक प्रयोग करने की अनुमति देता है, जो अक्सर गतिज अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण होते हैं। अंत में, फिलामेंट्स पर बहने वाले समाधान द्वारा लगाए गए चिपचिपा खींचें फिलामेंट्स (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग) पर नियंत्रित यांत्रिक तनाव लागू करने के लिए शोषण किया जा सकता है। किसी को ध्यान देना चाहिए कि मध्यम द्रव प्रवाह (मध्य प्रवाह दबाव सेटिंग्स) फिलामेंट्स को सतह (~ 250 एनएम) के करीब लाता है ताकि न्यूनतम तनाव (<1 पीएन) 14 उत्पन्न करते हुए उन्हें कुशलतापूर्वक टीआईआरएफ के साथ छवि दी जा सके।

शास्त्रीय एकल-फिलामेंट परख की तुलना में, हालांकि, माइक्रोफ्लुइडिक्स को प्रोटीन समाधानों की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होगी: आमतौर पर कुछ 100 μL, जब एक मानक प्रयोग 10 μL से कम के साथ किया जा सकता है। कीमती प्रोटीन का उपयोग करते समय यह एक सीमा हो सकती है। शास्त्रीय प्रयोगों का उपयोग माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोगों की एक श्रृंखला शुरू करने से पहले प्रासंगिक प्रयोगात्मक स्थितियों (जैसे, विभिन्न प्रोटीनों की पूर्ण या सापेक्ष सांद्रता) को स्थापित करने में मदद करने के लिए किया जा सकता है। एक और सीमा, इन विट्रो में किसी भी अन्य एकल-फिलामेंट तकनीकों के लिए, कवरस्लिप सतह के अपूर्ण निष्क्रियता से आती है। कवरस्लिप सफाई और निष्क्रियता परत (बीएसए, पीईजी, आदि) के बंधन में प्रजनन क्षमता को नियंत्रित करना हमेशा कठिन होता है। खूंटी-सिलेन सतह उपचार पर आधारित एक-चरण निष्क्रियता तकनीक कई प्रयोगशालाओं 7,15 में पसंद की तकनीक बन गई है। इस प्रकार, फिलामेंट बीजों का प्रभावी घनत्व प्रयोगों के बीच लगभग दोगुना भिन्न हो सकता है, भले ही जितना संभव हो उतना सटीक रूप से दोहराया जाए। फिलामेंट सतह घनत्व की एक संतोषजनक सीमा के लिए लक्ष्य रखना चाहिए और यदि आवश्यक हो तो प्रयोग को दोहराने के लिए तैयार रहना चाहिए। या एकल एक्टिन फिलामेंट्स के साथ काम करते समय आमतौर पर सामना किए जाने वाले मुद्दों पर पूरक फ़ाइल 1 में चर्चा की जाती है।

यहां प्रस्तुत बुनियादी प्रोटोकॉल के लिए, किसी को ध्यान देना चाहिए कि स्पेक्ट्रिन-एक्टिन बीज, जिसे छोटे स्थिर फिलामेंट्स के रूप में देखा जा सकता है, बेतरतीब ढंग से उन्मुख होते हैं क्योंकि वे सतह से चिपके रहते हैं। नतीजतन, जैसा कि इन बीजों से उगाए गए फिलामेंट्स प्रवाह के साथ संरेखित होते हैं, बीज के निकटतम उनका हिस्सा तेजी से मुड़ा होगा, प्रत्येक का अपना कोण होगा। जिस लंबाई पर फिलामेंट्स मुड़े होते हैं, वह आमतौर पर बहुत छोटा होता है जब फिलामेंट्स मध्य या उच्च प्रवाह के संपर्क में आते हैं। वास्तव में, यह लंबाई आम तौर पर विवर्तन सीमा (~ 200 एनएम) से छोटी होगी और इस प्रकार आसानी से पता नहीं लगाया जाएगा। महत्वपूर्ण बात यह है कि फिलामेंट वक्रता के प्रति संवेदनशील एबीपी इस अत्यधिक तुला क्षेत्र में अलग तरह से बांधेंगे और कार्य करेंगे। पक्षपातपूर्ण परिणामों से बचने के लिए, सबसे सरल विश्लेषण21 से इस क्षेत्र को बाहर करना है।

इससे पहले कि हमने एकल एक्टिन फिलामेंट्स में हेरफेर और कल्पना करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग करना शुरू कर दिया, इसका उपयोग पहले से ही एकल डीएनए फिलामेंट्स3 का अध्ययन करने के लिए किया गया था, जो कहीं अधिक लचीले हैं। यह उल्लेखनीय मतभेदों को जन्म दे सकता है, क्योंकि प्रवाह नाटकीय रूप से डीएनए को खोल सकता है और नाटकीय रूप से इसकी स्पष्ट लंबाई को बदल सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग सूक्ष्मनलिकाएं का अध्ययन करने के लिए यहां प्रस्तुत विधि के समान किया जा सकता है; ये बहुत कठोर हैं लेकिन फिर भी उनके बढ़ाव और डिपोलिमराइजेशन को मापने के लिए प्रवाह के साथ संरेखित करने के लिए बनाया जा सकता है,शर्तों 31,32 के तेजी से स्विच का लाभ उठाते हुए, या सूक्ष्मनलिका प्लास्टिसिटी7 को मापने के लिए एक लंबवत प्रवाह द्वारा झुकाया जा सकता है।

हमने यहां मूल प्रयोग के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है, जहां फिलामेंट्स केवल एक छोर से लंगर डाले हुए हैं और जहां देखने के क्षेत्र में प्रवाह दिशा पूरे प्रयोग में समान है। ये दो विशेषताएं विविध हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, फिलामेंट के साथ एक अलग बल प्रोफ़ाइल उत्पन्न करने के लिए फिलामेंट्स को कई बिंदुओं द्वारा लंगर डाला जा सकता है। इसी तरह, प्रवाह की दिशा स्थानीय रूप से फिलामेंट्स को मोड़ने के लिए (प्रवेश चैनलों के बीच जंक्शन के आसपास के क्षेत्र में, प्रवाह कक्ष में) भिन्न हो सकती है, क्योंकि अनियंत्रित हिस्सा लंगर वाले फिलामेंट सेगमेंट21 की तुलना में एक अलग दिशा में इंगित करेगा। बेतरतीब ढंग से लंगर डाले गए स्पेक्ट्रिन-एक्टिन बीजों से लम्बी फिलामेंट्स को बंडल33 बनाने के लिए क्रॉस-लिंकिंग प्रोटीन के संपर्क में भी लाया जा सकता है (अनुभाग 10 देखें)। अन्य तकनीकों (माइक्रोपैटर्निंग, ऑप्टिकल चिमटी, आदि) के साथ माइक्रोफ्लुइडिक्स के संयोजन या प्रवाह लाइनों को संशोधित करने के लिए डिब्बों के साथ माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों को डिजाइन करके, एकल फिलामेंट्स पर विशिष्ट एबीपी गतिविधि का अध्ययन करने या छोटे एक्टिन नेटवर्क बनानेके लिए कई कॉन्फ़िगरेशन बनाए जा सकते हैं। संयोजनों की संख्या, माइक्रोफ्लुइडिक्स के लाभ और बहुमुखी प्रतिभा के साथ, आणविक पैमाने पर एक्टिन नेटवर्क के स्थानिक-अस्थायी विनियमन को समझने के लिए शोधकर्ताओं को कई उपकरण प्रदान करती है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम बी लाडौक्स और आर-एम के आभारी हैं। उनके यूवी-क्लीनर उपकरणों के उपयोग के लिए मेज प्रयोगशाला, और जे। प्रारंभिक प्रशिक्षण के लिए हम सिलिकॉन वेफर्स पर मोल्ड तैयार करने और माइक्रोफ्लुइडिक्स पर सुझाव प्रदान करने पर प्राप्त हुए। हम यूरोपीय अनुसंधान परिषद ग्रांट एसटीजी -679116 (एजे के लिए) और एजेंस नेशनेल डी ला रेचेर्चे अनुदान मस्कैक्टिन और कंफॉर्मिन (जीआर-एल के लिए) से वित्त पोषण स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-Casein Merck C6905 Used at 8 mg/mL
Biopsy punch (with plunger) Ted Pella 15115-2 ID 0.75 mm, OD 1.07 mm
Biotin-BSA Merck A8549 Used at 1 mg/mL
BSA Merck A8022 Used at 50 mg/mL
Coverslip Mini-Rack
Teflon holder		 Invitrogen C14784 for 8 coverslips
Coverslips 22x40mm
Thickness #1.5		 Menzel Gläser 631-1370
DABCO Merck D27802 component in f-buffer
DTT Euromedex EU0006-D component in f-buffer
Ester NHS Alexa Fluor 488 Invitrogen A20000 Fluorophore for actin labeling on Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific 21338 To biotinylate actin on Lys328
Hellmanex III Hellma 9-307-011-4-507 Glass cleaning detergent
ImageJ NIH N/A open source software
Laboport KNF 811kn.18 vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)
Magic invisible tape Scotch 7100024666 standard transparent office tape
Micrewtube Simport T341-6T 2 mL microfluidic reservoir tubes
Microfluidic device Part 1: Flow Unit S Fluigent FLU-S-D-PCKB Flowmeter
Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL Fluigent 14002001PCK Reservoir holder
Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ Fluigent EZ-11000001
EZ-00345001		 Pressure controller
Model 42 - UVO-Cleaner Jelight Inc. 42-220 Ultraviolet cleaner
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488 Jena Bioscience NU-805-488 ATP-ATTO used to label actin
neutravidin Thermo Scientific 31000
PLL-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) Use at 1 mg/mL in PBS.
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer Dow Corning 1673921 Contains PDMS base and curing agent
Polyetheretherketone (PEEK) tubing Merck Z226661 “Blue” : I.D. = 0.25 mm
Safety blow gun Coilhose Pneumatics 700-S filtered air
Silicon tubing VWR 228-0701P connect PEEK to coupler
Stainless steel catheter coupler Prime Bioscience SC22/15 Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing
Thermoplastic film Sigma Aldrich PM996 Standard "parafilm"
Ultrapure ethanol VWR 64-17-5
Ultrasonic cleaning bath VWR USC200TH To accomodate 1 L beakers
Vacuum dessicator SP Bel-Art F42022-0000 to degas the PDMS or solutions

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References

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एकल एक्टिन फिलामेंट्स और बंडलों की असेंबली गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना
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Wioland, H., Ghasemi, F.,… More

Wioland, H., Ghasemi, F., Chikireddy, J., Romet-Lemonne, G., Jégou, A. Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63891, doi:10.3791/63891 (2022).

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