Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Elektroporatie van plasmide-DNA in de skeletspieren van de muis

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63916
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

Summary

Elektroporatie van plasmide-DNA in skeletspieren is een haalbare methode om genexpressie te moduleren zonder de spiercontractiliteit bij muizen in gevaar te brengen.

Abstract

Voorbijgaande genexpressiemodulatie in muizenskeletspieren door plasmide-elektroporatie is een nuttig hulpmiddel voor het beoordelen van normale en pathologische fysiologie. Overexpressie of knockdown van doelgenen stelt onderzoekers in staat om individuele moleculaire gebeurtenissen te manipuleren en zo de mechanismen die van invloed zijn op spiermassa, spiermetabolisme en contractiliteit beter te begrijpen. Bovendien stelt elektroporatie van DNA-plasmiden die fluorescerende tags coderen onderzoekers in staat om veranderingen in subcellulaire lokalisatie van eiwitten in skeletspieren in vivo te meten. Een belangrijke functionele beoordeling van de skeletspieren omvat de meting van spiercontractiliteit. In dit protocol tonen we aan dat hele spiercontractiliteitsstudies nog steeds mogelijk zijn na plasmide-DNA-injectie, elektroporatie en genexpressiemodulatie. Het doel van deze instructieprocedure is om de stapsgewijze methode van DNA-plasmide-elektroporatie in de skeletspieren van muizen te demonstreren om de opname en expressie in de myofiberen van de tibialis anterieure en extensor digitorum longusspieren te vergemakkelijken, evenals om aan te tonen dat de contractiliteit van de skeletspier niet wordt aangetast door injectie en elektroporatie.

Introduction

Plasmide DNA-elektroporatie in skeletspieren in vivo is een belangrijk hulpmiddel voor het beoordelen van veranderingen in de skeletspierfysiologie en moleculaire signalering door genexpressie te moduleren in een verscheidenheid aan fysiologische en pathofysiologische omstandigheden 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Experimentele genoverdracht in de skeletspieren werd al in 1990 aangetoond door Wolff et al., waarbij zowel RNA als DNA met succes werden overgedragen zonder elektroporatie, en luciferase-expressie gedurende ten minste 2 maanden werd gehandhaafd10. De relatief lage transfectie-efficiëntie met alleen injectie is problematisch, en Aihara en Miyazaki toonden in 1998 een verhoogde genoverdracht met elektroporatie door een pCAGGS-IL-5-construct in de tibialis anterieure (TA) spier te elektropoderen en serum IL-5 expressie11 te meten. Sinds die tijd hebben veel studies de werkzaamheid van verschillende DNA-concentraties, volumes en elektroporatieparameters onderzocht om maximale genoverdrachtsefficiëntie te garanderen. Mir et al. testten verschillende elektroporatieparameters, waaronder spanning, pulsgetal, pulsduur en frequentie, evenals DNA-concentratie, en stelden vast dat een grotere spanning, pulsgetal en DNA-concentratie allemaal bijdroegen aan een verhoogde elektroporatie-efficiëntie12. Een belangrijk voorbehoud bij een hoge elektroporatiespanning is dat, hoewel het een verhoogde DNA-opname in myofiberen vergemakkelijkt, het ook spierschade veroorzaakt, wat de resultaten kan verstoren. Schertzer et al. toonden aan dat elektroporatie bij 200 V schade veroorzaakte in ongeveer 50% van de myofiberen 3 dagen na elektroporatie, terwijl slechts 10% van de myofiberen beschadigd was bij 50 V13. We hebben rekening gehouden met de variabelen die van invloed zijn op efficiënte DNA-overdracht versus spierschade en ontdekten dat een spanning van 125 V per centimeter remklauwbreedte voldoende is om effectieve genoverdracht te bereiken.

Analyse van het dwarsdoorsnedegebied van spiervezels en de contractiliteit van de hele spier na elektroporatie zijn belangrijke aspecten van de methode voor het meten van veranderingen in spiergrootte en -functie als gevolg van genmodulatie. Wij en anderen hebben eerder aangetoond dat elektroporatie van controlevectoren alleen geen afname van het myofibergebied veroorzaakt. Het groene fluorescerende eiwit (EGFP) construct was een nuttige fluorescerende indicator van DNA-transfectie in deze studies13,14. Een aantal studies hebben de in situ contractiliteit van de TA na elektroporatie onderzocht en vonden wisselende resultaten. Eén studie toonde aan dat 75 V /cm elektroporatie ongeveer 30% vermindering van de tetanische kracht veroorzaakte 3 dagen na elektroporatie, en 7 dagen na elektroporatie was de tetanische kracht terug op het controleniveau, terwijl 50 V / cm elektroporatie kracht13,15 niet in gevaar bracht. Een andere studie toonde aan dat er een verlies van 30% van tetanische kracht was 3 uur na 180 V / cm elektroporatie, die na 7 dagen herstelde tot de schijnkrachtniveaus16.

In de volgende gedetailleerde procedure demonstreren we injectie en elektroporatie van een pcDNA3-EGFP plasmide in de TA- en extensor digitorum longus (EDL) spieren van muizen. We tonen ook aan dat deze methode geen invloed heeft op de contractiliteit van de hele spieren van EDL. Het doel is om een efficiënte opname van plasmide in myofiberen aan te tonen zonder functieverlies te veroorzaken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten met dieren werden uitgevoerd aan het Penn State College of Medicine, goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Penn State University, en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen die zijn vastgelegd in de Verklaring van Helsinki van 1964 en de latere wijzigingen ervan. Voor deze procedure werden 12 weken oude vrouwelijke C57BL/6-muizen gebruikt. Alle chirurgische hulpmiddelen werden geautoclaveerd voor steriliteit voorafgaand aan experimenten.

1. TA en EDL injectie/elektroporatie voorbereiding

OPMERKING: Deze stappen zijn identiek voor TA- en EDL-injectie/ elektroporatievoorbereiding.

  1. Purify expressie plasmide constructen tot een concentratie van 1 μg/μL verdund in steriele PBS voorafgaand aan het experiment. Voor deze procedure werd een in de handel verkrijgbare endotoxinevrije zuiveringskit gebruikt om pcDNA3-EGFP (GFP) of pcDNA3 lege vector (controle) te zuiveren.
  2. Bereken de plasmideconcentratie om te zorgen voor een adequaat injectievolume (TA 50 μg DNA in 50 μL steriel PBS; EDL 10 μg DNA in 10 μL steriele PBS) en aliquot monsters.
  3. Programmeer de elektroporatorinstellingen door het keuzewiel te gebruiken en het wiel in te drukken om de parameters als volgt te kiezen: Modus - LV, Spanning - 12,5 V / mm (aan te passen op het moment van injectie), pulslengte - 20 ms, aantal pulsen - 5, interval - 200 ms, polariteit - unipolair.
  4. Verdoof de muizen met isofluraangas. Plaats de muizen in een inductiedoos met 5% isofluraan. Bevestig het chirurgische vlak van anesthesie door de afwezigheid van de teenknijpenreflex met behulp van een tang en verlaag isofluraan tot 2% onderhoudsdosis. Breng muizen over naar een geschikte neuskegel die rust op een circulerende waterplaat bij 37 °C voor de rest van de procedure.
  5. Verwijder het haar van beide achterpoten met behulp van kleine tondeuses. Schrob de onderste ledematen met afwisselend 70% ethanol/betadine om het injectiegebied te ontsmetten.

2. TA-injectie/elektroporatie

  1. Met de muis in rugligging, lokaliseer de TA-pees zichtbaar door de huid aan de zijkant van het onderbeen. Gebruik een microspuit van 50 μL met een afneembare naald van 30 G en steek de naald 1-2 mm superieur aan de myotendineuze overgang in een ondiepe hoek van 5° totdat de naald het superieure uiteinde van de spier bereikt.
    OPMERKING: Injectie in het midden van de spier is het doel.
  2. Druk de zuiger langzaam in terwijl u de naald langzaam langs het injectiepad intrekt om 50 μL plasmide-oplossing af te leveren. De spier moet opzwellen.
  3. Stel de timer in op 1 min en meet de dikte van het been bij de TA. Afhankelijk van de grootte van de muis kan dit van 5-10 mm zijn. Stel de remklauwelektroden in op de gemeten dikte en stel de elektroporatorspanning in op 12,5 V/mm.
  4. Plaats na 1 minuut de remklauwelektroden rond de onderste ledemaat. De elektroden moeten goed zitten, maar niet te strak. Lever 5 blokgolfpulsen, met intervallen van 20 ms en 200 ms (de spier moet bij elke puls trillen).
  5. Herhaal dit met de alternatieve ledemaat met behulp van de controlevector.
  6. Haal de muis uit de narcose en laat hem herstellen op een verwarmingskussen dat is ingesteld op 37 °C. Eenmaal hersteld, brengt u de muis terug naar zijn kooi.

3. EDL-injectie/elektroporatie

  1. Met de muis in rugligging, lokaliseer het scheenbeen voorste kam visueel en door zachte palpatie.
    1. Maak met behulp van een scalpel een ondiepe incisie door de huid aan de laterale kant van de voorste kuif van het scheenbeen 5 mm inferieur aan de knie tot 2 mm superieur aan de TA myotendineuze overgang.
    2. Gebruik een kleine schaar om de fascia stomp te ontleden, waardoor de TA-spier wordt blootgesteld.
    3. Nogmaals, met behulp van stompe dissectie met een schaar, scheidt u de TA-spier voorzichtig van het scheenbeen door de spier zijdelings te trekken, waardoor de EDL wordt blootgesteld. Kleine, gebogen tangen kunnen worden gebruikt om de TA tijdens de procedure vrij te houden van de EDL.
  2. Gebruik een microspuit van 50 μL met een afneembare naald van 30 G en steek de naald in de lengterichting in de EDL totdat de naald het superieure uiteinde van de spier bereikt.
  3. Druk de zuiger langzaam in terwijl u de naald langzaam langs het injectiepad intrekt om 10 μL van de plasmide-oplossing te injecteren (spier moet opzwellen).
  4. Stel een timer in voor 1 min en meet de dikte van het been bij de EDL. Afhankelijk van de grootte van de muis kan dit van 5-10 mm zijn. Stel de remklauwelektroden in op de gemeten dikte en stel de elektroporatorspanning in op 12,5 V/mm.
  5. Plaats na 1 minuut de remklauwelektroden rond de onderste ledemaat. De elektroden moeten goed zitten, maar niet te strak. Lever 5 blokgolfpulsen, met intervallen van 20 ms en 200 ms (spier moet bij elke puls trillen).
  6. Sluit de incisie met behulp van wegwerp 4/0 niet-absorbeerbare nylon hechtingen.
  7. Herhaal dit met de alternatieve ledemaat of laat de ledemaat onaangeroerd als absolute controle.
  8. Haal de muis uit de narcose en laat hem herstellen op een verwarmingskussen dat is ingesteld op 37 °C. Dien een geschikt subcutaan analgeticum toe onmiddellijk na de operatie en 12-24 uur na de operatie. Eenmaal hersteld, brengt u de muis terug naar zijn kooi.
    OPMERKING: Eerdere studies hebben een spiercontractiliteitstekort in de TA aangetoond onmiddellijk na elektroporatie en dat contractiel herstel optreedt in de loop van 3 dagen13,15. Om deze reden wordt de analyse van zowel de TA- als de EDL-spieren voor histologie, eiwitexpressie of spiercontractiliteit 3-10 dagen na elektroporatie uitgevoerd. Langdurige expressie van EGFP is waargenomen tot 3 weken na de procedure13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Elektroporatie om genoverdracht in skeletspieren te vergemakkelijken is een nuttige techniek die wordt gebruikt om veranderingen in de spierfysiologie te evalueren. We hebben een gedetailleerde, stapsgewijze procedure gedemonstreerd om efficiënte genoverdracht in zowel de TA- als de EDL-spieren te bereiken. Verschillen in transfectie-efficiëntie treden op als gevolg van een aantal variabelen. Onder deze variabelen zijn elektroporatieparameters (pulsen, spanning, pulsduur, enz.), genconstructgrootte en concentratie / volume van geïnjecteerd DNA. We hebben eerder aangetoond dat elektroporatieparameters van 5 pulsen bij 125 V/cm, met een duur van 20 ms gescheiden door intervallen van 200 ms, voldoende zijn om een efficiënte genoverdracht in de TA14 te bereiken. We tonen in de huidige studie ook aan dat injectie/elektroporatie van DNA geen verlies van spiercontractiliteit veroorzaakt in de EDL 3 dagen na het experimenteren.

Om genoverdracht te visualiseren, werd een pcDNA3-EGFP of pcDNA3 (controle) construct geëlektropoeerd in muis TA of EDL spier. 3 dagen na de procedure werd de TA of EDL zorgvuldig ontleed, in optimale snijtemperatuur (OTC) media geplaatst en vastgevroren in vloeibaar stikstofgekoeld isopentaan (2-methylbutaan), zoals eerder beschreven 14,17,18,19. 10 μm spiersecties werden verkregen met behulp van een cryostaat uit de middenbuik van elke spier. Secties werden vervolgens geïncubeerd in 1% paraformaldehyde gedurende 5 minuten, gevolgd door 3-5 minuten wasbeurten in PBS. Secties werden vervolgens geïncubeerd in tarwekiem agglutinine geconjugeerd aan Texas Red verdund 1:100 in PBS gedurende 90 minuten in het donker. Secties werden opnieuw 3 keer gewassen in PBS gedurende 5 minuten elk. Spiersecties werden vervolgens bedekt met waterige montagemedia en afgebeeld in de golflengte van 594 nm (rood) om de individuele spiervezels te visualiseren en in een golflengte van 480 nm om GFP te detecteren (figuur 1A). De controlespieren geïnjecteerd met pcDNA3 werden in beide kanalen in beeld gebracht met dezelfde belichtingsinstellingen om te controleren op potentiële autofluorescentie. Spieren geïnjecteerd / geëlektropoeerd met EGFP vertoonden positieve groene vezels, wat de opname van het pcDNA3-EGFP-construct aantoont, terwijl spieren geïnjecteerd / geëlektropoteerd met pcDNA3 (controle) geen groene positieve vezels vertoonden. Wij en anderen hebben eerder aangetoond dat het myofiber-transsectiegebied niet wordt aangetast door GFP-expressie door GFP-positieve vezels (groen) te vergelijken met niet-GFP-expressievezels (zwart) binnen dezelfde spiersecties 4,6,19. Wanneer de EDL-spiertransfectie-efficiëntie wordt afgebeeld met een lagere vergroting, wordt de efficiëntie van de EDL-spiertransfectie gevisualiseerd door het verschijnen van groene vezels (positief) versus zwarte vezels (negatief) (figuur 1B). Transfectie-efficiëntie met behulp van deze procedure was 56,6% ± 4,7%, zoals gemeten in 3 EDL-spieren. Deze gegevens tonen aan dat de injectie en elektroporatie van de TA-spier voldoende is voor een efficiënte genoverdracht. Bovendien leidt injectie en elektroporatie van de EDL tot een efficiënte opname van genconstructen.

Een belangrijk hulpmiddel voor de evaluatie van de skeletspierfysiologie is het meten van spiercontractiliteit. Eerdere onderzoekers hebben aangetoond dat de contractiliteit van de in situ gemeten TA vroeg na injectie en elektroporatie van de achterpoot kan worden aangetast13. Om te testen of de EDL-contractiliteit na injectie en elektroporatie wordt aangetast, hebben we de EDL chirurgisch blootgelegd, geïnjecteerd met pcDNA3-EGFP of construct en de achterste elektrolytiseerd. Als controle werd de alternatieve ledemaat onaangeroerd gelaten voor vergelijking. De muizen werden 3 dagen later geëuthanaseerd en de EDL-contractiliteit van de hele spier werd gemeten met behulp van veldstimulatie in een fysiologisch bad, zoals eerder beschreven 14,19,20,21. Kortom, de EDL werd ontleed en de pezen werden via 4/0 zijden hechtdraad aan roestvrijstalen haken gebonden en opgehangen tussen een krachtopnemer en statische basis. De spieren werden gebaad in Tyrode-buffer, een fysiologische badoplossing (121 mM NaCl, 5,0 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 24 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA, 5,5 mM glucose) en borrelden met 100% zuurstof gedurende de hele procedure. Spiercontractie werd gestimuleerd met behulp van platina-elektroden om een supramaximale stimulus te geven. Spieroptimale lengte (Lo) werd aangepast om de maximale kracht aan het begin van de procedure te leveren. De kracht-frequentierelatie werd bepaald met behulp van stimulatiefrequenties tussen 1-150 Hz (0,5 ms pulsen bij supramaximale spanning). De spier mocht tussen elke stimulatie 3 minuten ontspannen. Nadat de stimulatieprocedure was voltooid, werden het gewicht en de lengte van de spier gemeten. De specifieke kracht werd berekend door de absolute kracht te normaliseren naar het hele spierdoorsnedegebied, dat wordt berekend als het gewicht gedeeld door de lengte en met behulp van de eerder bepaalde spierdichtheidsconstante (1,056 kg / m−3) 21. We hebben aangetoond dat representatieve geïnjecteerde en geëlektropoeerde EDLs vergelijkbare tetanische reacties hebben bij 100 Hz in vergelijking met controle niet-geïnjecteerde of geëlektropoeerde spieren (figuur 2A en figuur 2B). We vonden spiertetanische kracht, specifieke tetanische kracht, tijd tot piekspanning en halve ontspanningstijd werden niet aangetast in de geïnjecteerde en geëlektropoeerde EDL in vergelijking met de onaangeroerde controle (tabel 1). Onze gegevens tonen aan dat eiwitexpressie die de contractiliteit beïnvloedt, kan worden gemoduleerd met behulp van elektroporatie in de EDL zonder nadelige effecten te veroorzaken.

Figure 1
Figuur 1: Elektroporatie van pcDNA3-EGFP is voldoende voor DNA-opname in TA en EDL-spieren. A) Representatieve doorsneden van TA- en EDL-controles (geïnjecteerd met controlevector en geëlektropoeerd 125 V/cm) en GFP (geïnjecteerd met pcDNA3-EGFP en geëlektroporated 125 V/cm). Schaalbalk 50 μm. B) Representatieve doorsnede van de EDL die transfectie-efficiëntie aantoont. Schaalbalk 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Injectie en elektroporatie brengen de spierfunctie niet in gevaar. Representatieve tetanische krachtcurven bij 100 Hz van A) niet-geïnjecteerde/geëlektropoleerde EDL (controle) en B) geïnjecteerde/elektroporated EDL (GFP). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Controle (n=3) GFP (n=3) p-waarde
FO (g) 34,13 ± 1,15 35,87 ± 1,55 0.1918
sFO (kN/m2) 691,56 ± 45,80 660,00 ± 33,61 0.3917
TTP (sec) 0,249 ± 0,0203 0,247 ± 0,0197 0.9084
RT1/2 (sec) 0,035 ± 0,0035 0.033 ± .0031 0.6458
Controle -niet-geïnjecteerd/niet-elektroporated; GFP-geïnjecteerd met pcDNA3-EGFP en geëlektropoeerd. Waarden zijn gemiddeld ± SD. p= 0,05 als significant beschouwd. F0- Raw Tetanic Force bij 100Hz, sF 0-Tetanic Specific Force bij 100Hz, TTP- Time to Peak bij 1Hz, RT1/2- Time to half relaxation bij 1Hz.

Tabel 1: Volledige spiercontractiliteit van controle versus geëlektroporated EDLs. Tabel waaruit blijkt dat verschillende spierkrachtparameters niet worden aangetast in geïnjecteerde/elektroporated EDLs (GFP) in vergelijking met niet-geïnjecteerde/niet-elektroporated controles. F0 = tetanische kracht bij 100 Hz, sF0 = specifieke tetanische kracht bij 100 Hz, TTP = tijd tot piekspanning bij 1 Hz, RT1/2 = halve ontspanningstijd. Student's t-test; Significantie bij p = 0,05. n = 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vivo genoverdracht in skeletspieren versterkt door elektroporatie is een nuttig en relatief eenvoudig hulpmiddel voor het moduleren van eiwitexpressie in spieren. We hebben de stappen getoond die nodig zijn om een efficiënte genoverdracht in de EDL- en TA-spieren te bereiken en hebben aangetoond dat contractiliteitsmeting van de EDL levensvatbaar is na de procedure. Deze techniek vereist geen meer gecompliceerde virale vectoren en maakt de vergelijking mogelijk van getransfecteerde en niet-getransfecteerde spiervezel dwarsdoorsnedegebied in een enkele spier. Een beperking van deze procedure is dat de constructopname-efficiëntie niet volledig was en dat sommige myofibers niet-getransfecteerd bleven.

De besproken procedures zijn niet beperkt tot de elektroporatie van expressievectoren. We hebben eerder aangetoond dat eiwit knockdown kan worden bereikt door dezelfde procedures te volgen, maar met behulp van siRNA- of shRNA-constructies in vivo14. Bovendien kunnen reporterconstructies worden gebruikt om de transcriptionele activiteit van doelgenen 2,4,22 te meten. Deze hulpmiddelen maken de manipulatie van meerdere eiwitten tegelijkertijd in een enkele skeletspier mogelijk, terwijl de onderzoeker ook de mogelijkheid heeft om eenvoudig transcriptionele veranderingen te meten. Skeletspieren kunnen ook worden getransfecteerd met een expressie- of sh / siRNA-vector en fluorescerende reporter. Studies hebben aangetoond dat meer dan 95% van de spiervezels die de ene vector innemen, ook een andere vector zullen innemen23. Dit is handig wanneer gelabelde constructies niet levensvatbaar zijn. Soortgelijke experimenten kunnen worden uitgevoerd in verschillende spieren, waaronder de soleus, gastrocnemius, quadriceps en flexor digitorum brevis, onder andere24. De procedure is niet beperkt tot muizen. Ratten zijn op grote schaal gebruikt voor spiergenoverdracht, maar veranderingen in injectievolume, DNA-concentratie en elektroporatieparameters moeten worden overwogen. Belangrijk is dat de efficiëntie van de genoverdracht afneemt wanneer elektroporatie wordt toegepast op grote gebieden, en grotere spieren kunnen meerdere injecties vereisen24.

Post-gen transfer dieren kunnen worden gebruikt om een verscheidenheid aan fysiologische en pathofysiologische aandoeningen te bestuderen. De belangrijkste determinanten van de werkzaamheid van deze procedure waarmee rekening moet worden gehouden, zijn de transfectie-efficiëntie van het gewenste construct en de duur van het onderzoek. Hoewel verhoogde eiwitexpressie is waargenomen tot 270 dagen na elektroporatie12, hebben studies aangetoond dat er een vermindering van expressie is in de loop van de tijd13,25. De eenvoud en werkzaamheid van deze procedure maken het zeer toepasbaar op de studie van de skeletspierfysiologie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

B.A.H. en D.L.W. claimen geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Geen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable) Ethicon 662G Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe Hamilton 80501 microsyringe
C57BLl/6NHsd mice Envigo 044 12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode BTX 45-0102 1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis Aurora Scientific 605A Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System BTX 45-0662 electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors Fine Science Tools 14088-10 Scissors for blunt dissection
Force Transducer Aurora Scientific 407A To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats Fine Science Tools 13010-12 Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector Fisher Scientific V79020 Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid Addgene 13031 Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps Fine Science Tools 11009-13 Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10 Becton Dickinson 37 1210 Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media VWR 25608-930 Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red Thermo-Fisher Scientific W21405 Membrane staining for muscle cross section

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
  2. Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
  3. Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
  4. Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
  5. Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
  6. Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
  7. Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
  8. Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
  9. Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
  10. Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
  11. Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
  12. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  13. Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
  14. Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
  15. Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
  16. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
  17. Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
  18. Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
  19. Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
  20. Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
  21. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732 (2015).
  22. Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
  23. Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
  24. Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  25. Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).

Tags

Biologie Nummer 182
Elektroporatie van plasmide-DNA in de skeletspieren van de muis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hain, B. A., Waning, D. L.… More

Hain, B. A., Waning, D. L. Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (182), e63916, doi:10.3791/63916 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter