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Biology

Électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique de la souris

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63916
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

Summary

L’électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique est une méthode viable pour moduler l’expression des gènes sans compromettre la contractilité musculaire chez la souris.

Abstract

La modulation transitoire de l’expression génique dans le muscle squelettique murin par électroporation plasmidique est un outil utile pour évaluer la physiologie normale et pathologique. La surexpression ou l’élimination des gènes cibles permet aux chercheurs de manipuler des événements moléculaires individuels et, par conséquent, de mieux comprendre les mécanismes qui ont un impact sur la masse musculaire, le métabolisme musculaire et la contractilité. De plus, l’électroporation des plasmides d’ADN qui codent des étiquettes fluorescentes permet aux chercheurs de mesurer les changements dans la localisation subcellulaire des protéines dans le muscle squelettique in vivo. Une évaluation fonctionnelle clé du muscle squelettique comprend la mesure de la contractilité musculaire. Dans ce protocole, nous démontrons que les études de contractilité musculaire entière sont encore possibles après l’injection d’ADN plasmidique, l’électroporation et la modulation de l’expression génique. L’objectif de cette procédure pédagogique est de démontrer la méthode étape par étape de l’électroporation du plasmide d’ADN dans le muscle squelettique de la souris pour faciliter l’absorption et l’expression dans les myofibres des muscles tibialis antérieur et extenseur digitorum longus, ainsi que de démontrer que la contractilité des muscles squelettiques n’est pas compromise par l’injection et l’électroporation.

Introduction

L’électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique in vivo est un outil important pour évaluer les changements dans la physiologie des muscles squelettiques et la signalisation moléculaire en modulant l’expression des gènes dans diverses conditions physiologiques et physiopathologiques 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Le transfert expérimental de gènes dans le muscle squelettique a été démontré dès 1990 par Wolff et al., où l’ARN et l’ADN ont été transférés avec succès sans électroporation, et l’expression de la luciférase a été maintenue pendant au moins 2 mois10. L’efficacité de transfection relativement faible avec injection seulement est problématique, et Aihara et Miyazaki ont démontré une augmentation du transfert de gènes avec l’électroporation en 1998 en électroporatant une construction pCAGGS-IL-5 dans le muscle tibialis antérieur (TA) et en mesurant l’expression sérique de l’IL-511. Depuis lors, de nombreuses études ont étudié l’efficacité de différentes concentrations d’ADN, volumes et paramètres d’électroporation pour assurer une efficacité maximale du transfert de gènes. Mir et al. ont testé différents paramètres d’électroporation, y compris la tension, le nombre d’impulsions, la durée et la fréquence des impulsions, ainsi que la concentration d’ADN, et ont déterminé qu’une tension, un nombre d’impulsions et une concentration d’ADN plus élevés contribuaient tous à une efficacité accrue de l’électroporation12. Une mise en garde majeure à la tension d’électroporation élevée est que, bien qu’elle facilite l’absorption accrue de l’ADN dans les myofibres, elle provoque également des dommages musculaires, ce qui peut confondre les résultats. Schertzer et al. ont montré que l’électroporation à 200 V causait des dommages dans environ 50% des myofibres 3 jours après l’électroporation, alors que seulement 10% des myofibres étaient endommagés à 50 V13. Nous avons pris en considération les variables affectant le transfert efficace de l’ADN par rapport aux dommages musculaires et avons constaté qu’une tension de 125 V par centimètre de largeur d’étrier est suffisante pour réaliser un transfert de gène efficace.

L’analyse de la section transversale des fibres musculaires et de la contractilité musculaire entière après électroporation sont des aspects importants de la méthode de mesure des changements de taille et de fonction musculaires dus à la modulation des gènes. Nous et d’autres avons déjà démontré que l’électroporation des vecteurs de contrôle seule ne provoque pas une diminution de la zone myofibre. La construction de la protéine fluorescente verte (EGFP) était un indicateur fluorescent utile de la transfection de l’ADN dans ces études13,14. Un certain nombre d’études ont étudié la contractilité in situ de l’AT après électroporation et ont trouvé des résultats variables. Une étude a montré que l’électroporation de 75 V / cm entraînait une réduction d’environ 30% de la force tétanique 3 jours après l’électroporation, et 7 jours après l’électroporation, la force tétanique était revenue au niveau de contrôle, tandis que l’électroporation de 50 V / cm ne compromettait pas la force13,15. Une autre étude a montré qu’il y avait une perte de 30% de la force tétanique 3 h après une électroporation de 180 V / cm, qui a retrouvé les niveaux de force simulée après 7 jours16.

Dans la procédure détaillée suivante, nous démontrons l’injection et l’électroporation d’un plasmide pcDNA3-EGFP dans les muscles TA et extenseur digitorum longus (EDL) de souris. Nous démontrons également que cette méthode n’affecte pas la contractilité musculaire entière de l’EDL. L’objectif est de démontrer une absorption efficace des plasmides dans les myofibres sans entraîner de perte de fonction.

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Protocol

Toutes les expériences utilisant des animaux ont été réalisées au Penn State College of Medicine, approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de Pennsylvanie, et réalisées conformément aux normes éthiques établies dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs. Des souris femelles C57BL/6 âgées de 12 semaines ont été utilisées pour cette procédure. Tous les outils chirurgicaux ont été autoclavés pour la stérilité avant l’expérimentation.

1. Préparation d’injection/électroporation TA et EDL

REMARQUE: Ces étapes sont identiques pour la préparation d’injection / électroporation TA et EDL.

  1. Purifier les constructions plasmidiques d’expression à une concentration de 1 μg/μL diluée dans du PBS stérile avant l’expérience. Pour cette procédure, un kit de purification sans endotoxine disponible dans le commerce a été utilisé pour purifier le vecteur vide pcDNA3-EGFP (GFP) ou pcDNA3 (témoin).
  2. Calculer la concentration en plasmides pour assurer un volume d’injection adéquat (TA 50 μg d’ADN dans 50 μL de PBS stérile; EDL 10 μg d’ADN dans 10 μL de PBS stérile) et des échantillons aliquotes.
  3. Programmez les réglages de l’électroporateur en utilisant la roue de sélection et en appuyant sur la roue pour choisir les paramètres comme suit: Mode - BT, Tension - 12,5 V / mm (à ajuster au moment de l’injection), longueur d’impulsion - 20 ms, nombre d’impulsions - 5, intervalle - 200 ms, polarité - unipolaire.
  4. Anesthésier les souris à l’aide de gaz isoflurane. Placez les souris dans une boîte à induction contenant 5% d’isoflurane. Confirmer le plan chirurgical de l’anesthésie par l’absence du réflexe de pincement de l’orteil à l’aide de pinces et réduire l’isoflurane à 2% de dose d’entretien. Transférer les souris dans un cône de nez approprié reposant sur une plaque d’eau circulante à 37 ° C pour le reste de la procédure.
  5. Enlevez les poils des deux membres postérieurs à l’aide de petites tondeuses à cheveux. Frottez les membres inférieurs avec une alternance de 70% d’éthanol / bétadine pour assainir la zone d’injection.

2. Injection/électroporation d’AT

  1. Avec la souris en position couchée, localisez le tendon TA visible à travers la peau sur le côté latéral de la jambe. À l’aide d’une micro-seringue de 50 μL avec une aiguille détachable de 30 G, insérez l’aiguille de 1 à 2 mm au-dessus de la jonction myoténdineuse à un angle peu profond de 5 ° jusqu’à ce que l’aiguille atteigne l’extrémité supérieure du muscle.
    REMARQUE: L’injection au milieu du muscle est l’objectif.
  2. Appuyez lentement sur le piston tout en rétractant lentement l’aiguille le long du chemin d’injection pour délivrer 50 μL de solution plasmidique. Le muscle devrait gonfler.
  3. Réglez la minuterie pendant 1 min et mesurez l’épaisseur de la jambe au niveau de l’AT. Selon la taille de la souris, cela peut aller de 5 à 10 mm. Réglez les électrodes de l’étrier sur l’épaisseur mesurée et réglez la tension de l’électroporateur sur 12,5 V/mm.
  4. Après 1 min, placez les électrodes de l’étrier autour du membre inférieur. Les électrodes doivent être bien ajustées mais pas trop serrées. Délivrer 5 impulsions d’ondes carrées, avec une durée de 20 ms et des intervalles de 200 ms (le muscle doit se contracter à chaque impulsion).
  5. Répétez l’opération avec l’autre membre à l’aide du vecteur témoin.
  6. Retirez la souris de l’anesthésie et laissez-la récupérer sur un coussin chauffant réglé à 37 °C. Une fois récupérée, retournez la souris dans sa cage.

3. Injection/électroporation EDL

  1. Avec la souris en décubitus dorsal, localisez la crête antérieure de l’os du tibia visuellement et par palpation douce.
    1. À l’aide d’un scalpel, faites une incision peu profonde à travers la peau du côté latéral de la crête antérieure du tibia de 5 mm inférieure au genou à 2 mm supérieure à la jonction myoténdineuse TA.
    2. À l’aide de petits ciseaux, disséquez le fascia émoussé, exposant le muscle TA.
    3. Encore une fois, en utilisant une dissection émoussée avec des ciseaux, séparez doucement le muscle TA du tibia en tirant le muscle latéralement, exposant l’EDL. De petites pinces incurvées peuvent être utilisées pour garder l’AT à l’écart de l’EDL pendant la procédure.
  2. À l’aide d’une micro-seringue de 50 μL avec une aiguille détachable de 30 G, insérez l’aiguille dans l’EDL longitudinalement jusqu’à ce que l’aiguille atteigne l’extrémité supérieure du muscle.
  3. Appuyez lentement sur le piston tout en rétractant lentement l’aiguille le long du chemin d’injection pour injecter 10 μL de la solution plasmidique (le muscle doit gonfler).
  4. Réglez une minuterie pendant 1 min et mesurez l’épaisseur de la jambe à l’EDL. Selon la taille de la souris, cela peut aller de 5 à 10 mm. Réglez les électrodes de l’étrier sur l’épaisseur mesurée et réglez la tension de l’électroporateur sur 12,5 V/mm.
  5. Après 1 min, placez les électrodes de l’étrier autour du membre inférieur. Les électrodes doivent être bien ajustées mais pas trop serrées. Délivrer 5 impulsions d’ondes carrées, d’une durée de 20 ms et d’intervalles de 200 ms (le muscle doit se contracter à chaque impulsion).
  6. Fermez l’incision à l’aide de sutures en nylon jetables 4/0 non résorbables.
  7. Répétez avec le membre alternatif ou laissez le membre intact comme contrôle absolu.
  8. Retirez la souris de l’anesthésie et laissez-la récupérer sur un coussin chauffant réglé à 37 °C. Administrer un analgésique sous-cutané approprié immédiatement après la chirurgie et 12-24 h après la chirurgie. Une fois récupérée, retournez la souris dans sa cage.
    NOTE: Des études antérieures ont montré un déficit de contractilité musculaire dans l’AT immédiatement après l’électroporation et que la récupération contractile se produit au cours de 3 jours13,15. Pour cette raison, l’analyse des muscles TA et EDL pour l’histologie, l’expression des protéines ou la contractilité musculaire est effectuée 3 à 10 jours après l’électroporation. Une expression prolongée de l’EGFP a été observée jusqu’à 3 semaines après la procédure13.

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Representative Results

L’électroporation pour faciliter le transfert de gènes dans le muscle squelettique est une technique utile utilisée pour évaluer les changements dans la physiologie musculaire. Nous avons démontré une procédure détaillée, étape par étape, pour réaliser un transfert efficace de gènes dans les muscles TA et EDL. Les différences dans l’efficacité de la transfection se produisent en raison d’un certain nombre de variables. Parmi ces variables figurent les paramètres d’électroporation (impulsions, tension, durée de l’impulsion, etc.), la taille de la construction du gène et la concentration / volume d’ADN injecté. Nous avons déjà montré que les paramètres d’électroporation de 5 impulsions à 125 V/cm, avec une durée de 20 ms séparée par des intervalles de 200 ms, sont suffisants pour réaliser un transfert de gène efficace dans le TA14. Nous démontrons également dans la présente étude que l’injection / électroporation de l’ADN ne provoque pas de perte de contractilité musculaire dans l’EDL 3 jours après l’expérimentation.

Afin de visualiser le transfert de gènes, une construction pcDNA3-EGFP ou pcDNA3 (contrôle) a été électroporée dans le muscle TA ou EDL de souris. 3 jours après la procédure, l’AT ou l’EDL a été soigneusement disséqué, placé dans un milieu à température de coupe optimale (OTC) et congelé dans de l’isopentane (2-méthylbutane) refroidi à l’azote liquide, comme décrit précédemment 14,17,18,19. Des sections musculaires de 10 μm ont été obtenues à l’aide d’un cryostat prélevé au milieu du ventre de chaque muscle. Les sections ont ensuite été incubées dans du paraformaldéhyde à 1% pendant 5 min, suivies de lavages de 3 à 5 minutes dans du PBS. Des sections ont ensuite été incubées dans de l’agglutinine de germe de blé conjuguée à Texas Red diluée 1:100 dans du PBS pendant 90 min dans l’obscurité. Les sections ont de nouveau été lavées dans PBS 3 fois pendant 5 minutes chacune. Les sections musculaires ont ensuite été recouvertes dans des supports de montage aqueux et imagées dans la longueur d’onde de 594 nm (rouge) pour visualiser les fibres musculaires individuelles et dans une longueur d’onde de 480 nm pour détecter la GFP (Figure 1A). Les muscles témoins injectés avec de l’ADCp3 ont été imagés dans les deux canaux avec les mêmes paramètres d’exposition pour contrôler l’autofluorescence potentielle. Les muscles injectés / électroporés avec de l’EGFP ont montré des fibres vertes positives, démontrant l’absorption de la construction pcDNA3-EGFP, tandis que les muscles injectés / électroporés avec pcDNA3 (contrôle) n’ont montré aucune fibre verte positive. Nous et d’autres avons déjà montré que la section transversale du myofiber n’est pas compromise par l’expression de GFP en comparant les fibres positives GFP (vert) aux fibres exprimant non GFP (noir) dans les mêmes sections musculaires 4,6,19. Lorsqu’elle est imagée à un grossissement inférieur, l’efficacité de la transfection musculaire EDL est visualisée par l’apparition de fibres vertes (positives) par rapport à des fibres noires (négatives) (Figure 1B). L’efficacité de la transfection à l’aide de cette procédure était de 56,6% ± 4,7%, mesurée dans 3 muscles EDL. Ces données montrent que l’injection et l’électroporation du muscle TA sont suffisantes pour un transfert efficace des gènes. De plus, l’injection et l’électroporation de l’EDL permettent une absorption efficace des constructions génétiques.

Un outil important pour l’évaluation de la physiologie des muscles squelettiques est la mesure de la contractilité musculaire. Des chercheurs antérieurs ont montré que la contractilité de l’AT mesurée in situ peut être compromise tôt après l’injection et l’électroporation du membre postérieur13. Afin de tester si la contractilité de l’EDL est compromise après l’injection et l’électroporation, nous avons exposé chirurgicalement l’EDL, lui avons injecté de l’ADNLa3-EGFP ou de la construction, et électroporé le membre postérieur. En tant que contrôle, le membre alternatif a été laissé intact à des fins de comparaison. Les souris ont été euthanasiées 3 jours plus tard, et la contractilité musculaire entière de l’EDL a été mesurée en utilisant la stimulation du champ dans un bain physiologique, comme décrit précédemment 14,19,20,21. Brièvement, l’EDL a été disséqué et les tendons ont été attachés via une suture de soie 4/0 à des crochets en acier inoxydable et suspendus entre un transducteur de force et une base statique. Les muscles ont été baignés dans un tampon Tyrode, qui est une solution de bain physiologique (121 mM NaCl, 5,0 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 24 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA, 5,5 mM de glucose) et bouillonnés avec 100% d’oxygène tout au long de la procédure. La contraction musculaire a été stimulée à l’aide d’électrodes en platine pour délivrer un stimulus supramaximal. La longueur optimale musculaire (Lo) a été ajustée pour produire la force maximale au début de la procédure. La relation force-fréquence a été déterminée en utilisant des fréquences de stimulation comprises entre 1 et 150 Hz (impulsions de 0,5 ms à une tension supramaximale). Le muscle a été autorisé à se détendre pendant 3 minutes entre chaque stimulation. Une fois la procédure de stimulation terminée, le poids et la longueur du muscle ont été mesurés. La force spécifique a été calculée en normalisant la force absolue sur l’ensemble de la section transversale musculaire, qui est calculée comme le poids divisé par la longueur et en utilisant la constante de densité musculaire précédemment déterminée (1,056 kg / m −3)21. Nous avons montré que les EDL injectés et électroporés représentatifs ont des réponses tétaniques similaires à 100 Hz par rapport aux muscles témoins non injectés ou électroporés (Figure 2A et Figure 2B). Nous avons constaté que la force tétanique musculaire, la force tétanique spécifique, le temps nécessaire pour atteindre le pic de tension et la moitié du temps de relaxation n’étaient pas compromis dans l’EDL injecté et électroporé par rapport au témoin intact (tableau 1). Nos données démontrent que l’expression des protéines qui affecte la contractilité peut être modulée par électroporation dans l’EDL sans causer d’effets indésirables.

Figure 1
Figure 1 : L’électroporation de l’ADNPi3-EGFP est suffisante pour l’absorption de l’ADN dans les muscles TA et EDL. A) Sections transversales représentatives des contrôles TA et EDL (injectés avec vecteur témoin et électroporés 125 V/cm) et GFP (injectés avec pcDNA3-EGFP et électroporés 125 V/cm). Barre d’échelle 50 μm. B) Section transversale représentative de l’EDL démontrant l’efficacité de la transfection. Barre d’échelle 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : L’injection et l’électroporation ne compromettent pas la fonction musculaire. Courbes de force tétanique représentatives à 100 Hz à partir de A) EDL non injecté/électroporé (contrôle) et B) EDL injecté/électroporé (GFP). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Contrôle (n=3) GFP (n=3) valeur de p
FO (g) 34.13 ± 1.15 35,87 ± 1,55 0.1918
sFO (kN/m2) 691,56 ± 45,80 660,00 ± 33,61 0.3917
TTP (sec) 0,249 ± 0,0203 0,247 ± 0,0197 0.9084
RT1/2 (sec) 0,035 ± 0,0035 0,033 ±,0031 0.6458
Contrôle -non injecté/non électroporé; GFP injecté avec pcDNA3-EGFP et électroporé. Les valeurs sont moyennes ± ET. p = 0,05 considéré comme significatif. F0- Force tétanique brute à 100Hz, sF0-Force spécifique tétanique à 100Hz, TTP- Temps de crête à 1Hz, RT1/2- Temps de demi-relaxation à 1Hz.

Tableau 1 : Contractilité musculaire entière du contrôle par rapport aux EDL électroporés. Tableau montrant que différents paramètres de force musculaire ne sont pas compromis dans les EDL injectés/électroporés (GFP) par rapport aux témoins non injectés/non électroporés. F0 = force tétanique à 100 Hz, sF0 = force tétanique spécifique à 100 Hz, TTP = temps de tension maximale à 1 Hz, RT1/2 = demi-temps de relaxation. Test t de l’élève; Signification à p = 0,05. n = 3.

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Discussion

Le transfert de gènes in vivo dans le muscle squelettique amélioré par électroporation est un outil utile et relativement simple pour moduler l’expression des protéines dans le muscle. Nous avons montré les étapes nécessaires pour obtenir un transfert efficace de gènes dans les muscles EDL et TA et démontré que la mesure de la contractilité de l’EDL est viable après la procédure. Cette technique ne nécessite pas de vecteurs viraux plus compliqués et permet de comparer la section transversale des fibres musculaires transfectées et non transfectées dans un seul muscle. Une limite à cette procédure est que l’efficacité d’absorption de la construction n’était pas complète et que certains myofibres restaient non transfectés.

Les procédures discutées ne se limitent pas à l’électroporation des vecteurs d’expression. Nous avons déjà montré que l’élimination des protéines peut être obtenue en suivant les mêmes procédures, mais en utilisant des constructions siRNA ou shRNA in vivo14. De plus, les constructions rapporteures peuvent être utilisées pour mesurer l’activité transcriptionnelle des gènes cibles 2,4,22. Ces outils permettent la manipulation simultanée de plusieurs protéines dans un seul muscle squelettique, tout en donnant à l’investigateur la possibilité de mesurer facilement les changements transcriptionnels. Le muscle squelettique peut également être co-transfecté avec un vecteur d’expression ou sh/siRNA et un rapporteur fluorescent. Des études ont montré que plus de 95% des fibres musculaires qui absorbent un vecteur absorberont également un autre vecteur23. Ceci est utile lorsque les constructions balisées ne sont pas viables. Des expériences similaires peuvent être menées dans divers muscles, y compris le soléaire, le gastrocnémien, le quadriceps et le fléchisseur digitorum brevis, entre autres24. La procédure ne se limite pas aux souris. Les rats ont été largement utilisés pour le transfert de gènes musculaires, mais des changements dans le volume d’injection, la concentration d’ADN et les paramètres d’électroporation doivent être pris en compte. Il est important de noter que l’efficacité du transfert de gènes diminue lorsque l’électroporation est appliquée sur de grandes surfaces, et les muscles plus gros peuvent nécessiter plusieurs injections24.

Les animaux post-transfert de gènes peuvent être utilisés pour étudier une variété de conditions physiologiques et physiopathologiques. Les principaux déterminants de l’efficacité de cette procédure à prendre en considération sont l’efficacité de transfection de la construction souhaitée et la durée de l’étude. Bien qu’une augmentation de l’expression protéique ait été observée jusqu’à 270 jours après l’électroporation12, des études ont montré qu’il y avait une réduction de l’expression au fil du temps13,25. La simplicité et l’efficacité de cette procédure la rendent très applicable à l’étude de la physiologie des muscles squelettiques.

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Disclosures

B.A.H. et D.L.W. ne revendiquent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Aucun

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable) Ethicon 662G Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe Hamilton 80501 microsyringe
C57BLl/6NHsd mice Envigo 044 12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode BTX 45-0102 1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis Aurora Scientific 605A Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System BTX 45-0662 electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors Fine Science Tools 14088-10 Scissors for blunt dissection
Force Transducer Aurora Scientific 407A To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats Fine Science Tools 13010-12 Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector Fisher Scientific V79020 Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid Addgene 13031 Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps Fine Science Tools 11009-13 Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10 Becton Dickinson 37 1210 Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media VWR 25608-930 Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red Thermo-Fisher Scientific W21405 Membrane staining for muscle cross section

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biologie numéro 182
Électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique de la souris
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Hain, B. A., Waning, D. L.… More

Hain, B. A., Waning, D. L. Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (182), e63916, doi:10.3791/63916 (2022).

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