Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

אלקטרופורציה של דנ"א פלסמיד לשריר השלד של העכבר

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63916
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

Summary

אלקטרופורציה של דנ"א פלסמידי לתוך שרירי השלד היא שיטה בת קיימא לווסת ביטוי גנים מבלי להתפשר על התכווצות השרירים בעכברים.

Abstract

אפנון ביטוי גנים חולף בשריר השלד של מורין על ידי אלקטרופורציה של פלסמיד הוא כלי שימושי להערכת פיזיולוגיה נורמלית ופתולוגית. ביטוי יתר או הפלה של גני מטרה מאפשר לחוקרים לתמרן אירועים מולקולריים בודדים, ובכך להבין טוב יותר את המנגנונים המשפיעים על מסת השריר, על חילוף החומרים של השריר ועל התכווצותו. בנוסף, אלקטרופורציה של פלסמידי דנ"א המקודדים תגים פלואורסצנטיים מאפשרת לחוקרים למדוד שינויים בלוקליזציה תת-תאית של חלבונים בשרירי השלד in vivo. הערכה תפקודית מרכזית של שרירי השלד כוללת מדידה של התכווצות השרירים. בפרוטוקול זה אנו מראים כי מחקרי התכווצות שרירים שלמים עדיין אפשריים לאחר הזרקת דנ"א פלסמידית, אלקטרופורציה ומודולציה של ביטוי גנים. מטרתו של הליך הדרכה זה היא להדגים את השיטה שלב אחר שלב של אלקטרופורציה של פלסמיד דנ"א לתוך שרירי השלד של העכבר כדי להקל על קליטה וביטוי במיופיבר של שרירי הטיביאליס הקדמיים והיציבים של שרירי ה- ditensor digitorum longus, כמו גם כדי להראות כי התכווצות שרירי השלד אינה נפגעת על ידי הזרקה ואלקטרופורציה.

Introduction

אלקטרופורציה של DNA פלסמיד לשרירי השלד in vivo היא כלי חשוב להערכת שינויים בפיזיולוגיה של שרירי השלד ובאיתות מולקולרי על ידי אפנון ביטוי גנים במגוון מצבים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . העברת גנים ניסיונית לשריר השלד הודגמה כבר בשנת 1990 על ידי Wolff et al., שם גם רנ"א וגם דנ"א הועברו בהצלחה ללא אלקטרופורציה, וביטוי לוציפראז נשמר במשך חודשיים לפחות10. יעילות הטרנספקציה הנמוכה יחסית עם הזרקה בלבד היא בעייתית, ואיהארה ומיאזאקי הדגימו העברת גנים מוגברת עם אלקטרופורציה בשנת 1998 על ידי אלקטרופורציה של מבנה pCAGGS-IL-5 לשריר הקדמי של טיביאליס (TA) ומדידת סרום IL-5 ביטוי11. מאז, מחקרים רבים חקרו את היעילות של ריכוזי DNA שונים, נפחים ופרמטרים של אלקטרופורציה כדי להבטיח יעילות מקסימלית של העברת גנים. Mir et al. בחנו פרמטרים שונים של אלקטרופורציה, כולל מתח, מספר פולס, משך פולס ותדירות, כמו גם ריכוז DNA, וקבעו כי מתח גדול יותר, מספר פולס וריכוז DNA תרמו כולם ליעילות אלקטרופורציה מוגברת12. אזהרה מרכזית למתח אלקטרופורציה גבוה היא שבעוד שהוא מאפשר קליטה מוגברת של דנ"א למיופיברים, הוא גם גורם לנזק לשרירים, מה שעלול לבלבל את התוצאות. Schertzer et al. הראו כי אלקטרופורציה ב-200 V גרמה לנזק בכ-50% מהמיופיברים 3 ימים לאחר האלקטרופורציה, בעוד שרק 10% מהמיופיברים ניזוקו ב-50 V13. לקחנו בחשבון את המשתנים המשפיעים על העברת דנ"א יעילה לעומת נזק לשרירים ומצאנו שמתח של 125 וולט לסנטימטר של רוחב קליפר מספיק כדי להשיג העברת גנים יעילה.

ניתוח של אזור חתך סיבי שריר והתכווצות שריר שלם לאחר אלקטרופורציה הם היבטים חשובים של השיטה למדידת שינויים בגודל השריר ובתפקוד עקב אפנון הגנים. אנו ואחרים הוכחנו בעבר כי אלקטרופורציה של וקטורים לבקרה לבדה אינה גורמת לירידה באזור המיופייבר. מבנה החלבון הפלואורסצנטי הירוק (EGFP) היה אינדיקטור פלואורסצנטי שימושי לטרנספקציה של דנ"א במחקרים אלה13,14. מספר מחקרים בחנו את התכווצות ה-TA באתרה לאחר אלקטרופורציה ומצאו תוצאות שונות. מחקר אחד הראה כי אלקטרופורציה של 75 V/cm גרמה לירידה של כ-30% בכוח הטטאני 3 ימים לאחר האלקטרופורציה, וב-7 ימים לאחר האלקטרופורציה, הכוח הטטאני חזר לרמת הבקרה, בעוד אלקטרופורציה של 50 V/cm לא פגעה בכוח13,15. מחקר אחר הראה כי היה אובדן של 30% של כוח טטאני 3 שעות לאחר אלקטרופורציה של 180 V/cm, אשר התאושש לרמות כוח הבושה לאחר 7 ימים16.

בהליך המפורט הבא, אנו מדגימים הזרקה ואלקטרופורציה של פלסמיד pcDNA3-EGFP בשרירי TA ו- extensor digitorum longus (EDL) של עכברים. אנו גם מראים כי שיטה זו אינה משפיעה על התכווצות השרירים השלמים של EDL. המטרה היא להדגים ספיגת פלסמיד יעילה במיופיברים מבלי לגרום לאובדן תפקוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בבית הספר לרפואה של פן סטייט, שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פן סטייט, ובוצעו בהתאם לסטנדרטים האתיים שנקבעו בהצהרת הלסינקי משנת 1964 ובתיקוניה המאוחרים יותר. נקבת עכברי C57BL/6 בת 12 שבועות שימשה להליך זה. כל הכלים הכירורגיים עברו אוטוקלאבים לעקרות לפני הניסויים.

1. הכנת הזרקת ת"א ו-EDL/אלקטרופורציה

הערה: שלבים אלה זהים להכנה להזרקה/אלקטרופורציה של TA ו-EDL.

  1. טהרו את מבני הפלסמיד של הביטוי לריכוז של 1 מיקרוגרם/מיקרול שדוללו ב-PBS סטרילי לפני הניסוי. עבור הליך זה, ערכת טיהור ללא אנדוטוקסין זמינה מסחרית שימשה לטיהור pcDNA3-EGFP (GFP) או pcDNA3 וקטור ריק (בקרה).
  2. חישוב ריכוז הפלסמיד כדי להבטיח נפח הזרקה הולם (TA 50 מיקרוגרם של דנ"א ב-50 μL של PBS סטרילי; EDL 10 מיקרוגרם דנ"א ב-10 מיקרול של PBS סטרילי) ודגימות אליקוט.
  3. תכנת את הגדרות האלקטרופורטור על ידי שימוש בגלגל הנבחר ודיכוי הגלגל כדי לבחור את הפרמטרים כדלקמן: מצב - LV, מתח - 12.5 V / מ"מ (שיותאם בזמן ההזרקה), אורך הדופק - 20 אלפיות השנייה, מספר הפולסים - 5, מרווח - 200 אלפיות השנייה, קוטביות - חד קוטבית.
  4. להרדים את העכברים באמצעות גז איזופלורן. מניחים את העכברים בקופסת אינדוקציה עם איזופלורן של 5%. אשרו את המישור הכירורגי של ההרדמה על ידי היעדר רפלקס צביטה בבוהן באמצעות מלקחיים והפחיתו את מינון האיזופלורן ל-2% תחזוקה. מעבירים עכברים לחרוט אף מתאים שנח על צלחת מים במחזור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס להמשך ההליך.
  5. הסירו את השיער משני החלקים האחוריים באמצעות קוצצי שיער קטנים. קרצפו את הגפיים התחתונות עם 70% אתנול/בטאדין לסירוגין כדי לחטא את אזור ההזרקה.

2. הזרקת ת"א/אלקטרופורציה

  1. כאשר העכבר נמצא בתנוחת שכיבה, אתרו את גיד ה-TA הנראה דרך העור בצד הצדדי של הרגל התחתונה. באמצעות מיקרו-מזרק 50 μL עם מחט 30 G ניתנת להסרה, הכנס את המחט 1-2 מ"מ עדיפה על הצומת המיוטננדי בזווית רדודה של 5° עד שהמחט מגיעה לקצה העליון של השריר.
    הערה: הזרקה לאמצע השריר היא המטרה.
  2. לדכא באיטיות את הבוכנה תוך כדי נסיגה איטית של המחט לאורך נתיב ההזרקה כדי לספק 50 μL של תמיסת פלסמיד. השריר צריך להתנפח.
  3. הגדר את הטיימר למשך דקה אחת ומדוד את עובי הרגל ב- TA. בהתאם לגודל העכבר, זה יכול להיות מ 5-10 מ"מ. הגדר את אלקטרודות הקליפר לעובי הנמדד והגדר את מתח האלקטרופורטור ל-12.5 וולט/מ"מ.
  4. לאחר דקה אחת, הניחו את אלקטרודות הקליפר סביב הגפה התחתונה. האלקטרודות צריכות להיות צמודות אך לא הדוקות מדי. ספקו 5 פולסים של גלים רבועים, עם משך של 20 אלפיות השנייה ומרווחים של 200 אלפיות השנייה (השריר צריך להתעוות עם כל פעימה).
  5. חזור על הפעולה עם הגפה החלופית באמצעות וקטור הבקרה.
  6. הסר את העכבר מהרדמה ואפשר לו להתאושש על משטח חימום שנקבע ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר שהתאושש, החזירו את העכבר לכלוב שלו.

3. הזרקת EDL/אלקטרופורציה

  1. כאשר העכבר במצב שכיבה, אתרו את הפסגה הקדמית של עצם השוקה באופן חזותי ובאמצעות מישוש עדין.
    1. באמצעות אזמל, בצע חתך רדוד דרך העור בצד הצדדי של הפסגה הקדמית של השוקה 5 מ"מ נחות מהברך עד 2 מ"מ עדיף על צומת TA myotendinous.
    2. באמצעות מספריים קטנים, מנתחים בוטה את החיתולית, וחושפים את שריר ה- TA.
    3. שוב, באמצעות דיסקציה קהה עם מספריים, להפריד את שריר TA מן השוקה בעדינות על ידי משיכת השריר לרוחב, חשיפת EDL. ניתן להשתמש במלקחיים קטנים ומעוקלים כדי לשמור על ה- TA נקי מה- EDL במהלך ההליך.
  2. באמצעות מיקרו-מזרק 50 μL עם מחט 30 G ניתנת להסרה, הכנס את המחט לתוך EDL לאורך עד שהמחט מגיעה לקצה העליון של השריר.
  3. לאט לאט לדכא את הבוכנה תוך כדי נסיגה איטית של המחט לאורך נתיב ההזרקה כדי להזריק 10 μL של תמיסת הפלסמיד (השריר צריך להתנפח).
  4. קבעו טיימר למשך דקה אחת ומדדו את עובי הרגל ב-EDL. בהתאם לגודל העכבר, זה יכול להיות מ 5-10 מ"מ. הגדר את אלקטרודות הקליפר לעובי הנמדד והגדר את מתח האלקטרופורטור ל-12.5 וולט/מ"מ.
  5. לאחר דקה אחת, הניחו את אלקטרודות הקליפר סביב הגפה התחתונה. האלקטרודות צריכות להיות צמודות אך לא הדוקות מדי. ספקו 5 פולסים של גלים רבועים, עם משך של 20 אלפיות השנייה ומרווחים של 200 אלפיות השנייה (השריר צריך להתעוות עם כל דופק).
  6. סגור את החתך באמצעות תפרים חד פעמיים 4/0 שאינם נספגים מניילון.
  7. חזרו על הפעולה עם הגפה החלופית או השאירו את האיבר ללא מגע כשליטה מוחלטת.
  8. הסר את העכבר מהרדמה ואפשר לו להתאושש על משטח חימום שנקבע ל -37 מעלות צלזיוס. מתן משכך כאבים תת עורי מתאים מיד לאחר הניתוח ו 12-24 שעות לאחר הניתוח. לאחר שהתאושש, החזירו את העכבר לכלוב שלו.
    הערה: מחקרים קודמים הראו גירעון בהתכווצות שרירים בת"א מיד לאחר האלקטרופורציה וכי התאוששות התכווצות מתרחשת במשך 3 ימים 13,15. מסיבה זו, הניתוח של שרירי TA ו- EDL הן להיסטולוגיה, ביטוי חלבונים או התכווצות שרירים מתבצע 3-10 ימים לאחר אלקטרופורציה. ביטוי ממושך של EGFP נצפה עד 3 שבועות לאחר ההליך13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אלקטרופורציה כדי להקל על העברת גנים בשרירי השלד היא טכניקה שימושית המשמשת להערכת שינויים בפיזיולוגיה של השריר. הדגמנו הליך מפורט, שלב אחר שלב, להשגת העברת גנים יעילה הן בשרירי TA והן בשרירי EDL. הבדלים ביעילות הטרנספקציה מתרחשים עקב מספר משתנים. בין המשתנים הללו ניתן למנות פרמטרים של אלקטרופורציה (פולסים, מתח, משך פולס וכו'), גודל מבנה גנים וריכוז/נפח של דנ"א מוזרק. הראינו בעבר שפרמטרים של אלקטרופורציה של 5 פולסים ב-125 וולט/ס"מ, עם משך של 20 אלפיות השנייה המופרד במרווחים של 200 אלפיות השנייה, מספיקים כדי להשיג העברת גנים יעילה ב-TA14. אנו גם מדגימים במחקר הנוכחי כי הזרקה/אלקטרופורציה של דנ"א אינה גורמת לאובדן התכווצות השרירים ב-EDL 3 ימים לאחר הניסוי.

על מנת לדמיין העברת גנים, מבנה pcDNA3-EGFP או pcDNA3 (בקרה) התחשמלו לשריר TA או EDL של עכברים. 3 ימים לאחר ההליך, ה-TA או ה-EDL נותחו בקפידה, הונחו במדיית טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OTC) והוקפאו באופן הצמד באיזופנטן מקורר חנקן נוזלי (2-מתילבוטאן), כפי שתואר קודם לכן 14,17,18,19. נתחי שריר של 10 מיקרומטר הושגו באמצעות קריוסטאט שנלקח מאמצע הבטן של כל שריר. לאחר מכן הודגמו המקטעים בפרפורמלדהיד של 1% במשך 5 דקות, ולאחר מכן שטיפות של 3-5 דקות ב-PBS. לאחר מכן הודגמו קטעים באגלוטינין של נבט חיטה שהוצמד לטקסס רד מדולל 1:100 ב-PBS במשך 90 דקות בחושך. קטעים נשטפו שוב ב- PBS 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד. לאחר מכן, מקטעי השרירים כוסו במדיית הרכבה מימית והצטלמו באורך הגל של 594 ננומטר (אדום) כדי לדמיין את סיבי השריר הבודדים ובאורך גל של 480 ננומטר כדי לזהות GFP (איור 1A). שרירי הבקרה שהוזרקו עם pcDNA3 צולמו בשני הערוצים עם אותן הגדרות חשיפה כדי לשלוט על פלואורסצנציה אוטומטית פוטנציאלית. שרירים שהוזרקו/הוזרקו עם EGFP הראו סיבים ירוקים חיוביים, והדגימו ספיגה של מבנה ה-pcDNA3-EGFP, בעוד ששרירים שהוזרקו/הוזרקו עם pcDNA3 (בקרה) לא הראו סיבים חיוביים ירוקים. אנו ואחרים הראינו בעבר כי אזור חתך מיופייבר אינו נפגע על ידי ביטוי GFP על ידי השוואת סיבים חיוביים של GFP (ירוק) ללא GFP המבטאים סיבים (שחורים) בתוך אותם חתכי שרירים 4,6,19. כאשר מדמיינים אותם בהגדלה נמוכה יותר, ניתן לדמיין את יעילות ההעברה של שרירי ה-EDL באמצעות הופעתם של סיבים ירוקים (חיוביים) לעומת סיבים שחורים (שליליים) (איור 1B). יעילות הטרנספקציה באמצעות הליך זה הייתה 56.6% ± 4.7%, כפי שנמדד ב-3 שרירי EDL. נתונים אלה מראים כי הזרקה ואלקטרופורציה של שריר ה- TA מספיקים להעברת גנים יעילה. בנוסף, הזרקה ואלקטרופורציה של ה-EDL מעוררות ספיגה יעילה של מבני גנים.

כלי חשוב להערכת הפיזיולוגיה של שרירי השלד הוא מדידת התכווצות השרירים. חוקרים קודמים הראו כי התכווצות ה-TA הנמדדת באתרה עלולה להיפגע בשלב מוקדם לאחר הזרקה ואלקטרופורציה של הגפה האחורית13. על מנת לבחון אם התכווצות ה-EDL נפגעת לאחר הזרקה ואלקטרופורציה, חשפנו בניתוח את ה-EDL, הזרקנו לו pcDNA3-EGFP או מבנה, ועשינו אלקטרופורמציה לאחור. כבקרה, הגפה החלופית נותרה ללא מגע לצורך השוואה. העכברים הומתו 3 ימים לאחר מכן, והתכווצות השרירים השלמים של EDL נמדדה באמצעות גירוי שדה באמבטיה פיזיולוגית, כפי שתואר קודם לכן 14,19,20,21. בקצרה, ה-EDL נותח, והגידים נקשרו באמצעות תפר משי 4/0 לקרסים מפלדת אל-חלד ונתלו בין מתמר כוח לבסיס סטטי. השרירים התרחצו ב-Tyrode buffer, שהוא תמיסת אמבטיה פיזיולוגית (121 mM NaCl, 5.0 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.4 mM NaH2PO4, 24 mM NaHCO3, 0.1 mM EDTA, 5.5 mM גלוקוז) ובועות עם 100% חמצן לאורך כל ההליך. התכווצות השרירים הייתה מגורה באמצעות אלקטרודות פלטינה כדי לספק גירוי סופרמקימלי. האורך האופטימלי של השריר (Lo) הותאם כדי להניב את הכוח המרבי בתחילת ההליך. הקשר בין כוח לתדר נקבע באמצעות תדרי גירוי בין 1-150 הרץ (0.5 אלפיות השנייה פולסים במתח סופרמקימלי). השריר הורשה להירגע במשך 3 דקות בין כל גירוי. לאחר השלמת הליך הגירוי נמדדו משקלו ואורכו של השריר. הכוח הספציפי חושב על ידי נרמול הכוח המוחלט לכל אזור חתך השרירים, המחושב כמשקל חלקי האורך ובאמצעות קבוע צפיפות השריר שנקבע קודם לכן (1.056 ק"ג/מ"ק−3)21. הראינו של-EDLs בהזרקה ואלקטרו-פוסע מייצגים יש תגובות טטניות דומות ב-100 הרץ בהשוואה לשרירים שאינם מוזרקים או אלקטרופורים (איור 2A ואיור 2B). מצאנו שכוח טטאני של שרירים, כוח טטאני ספציפי, זמן עד שיא המתח ומחצית זמן ההרפיה לא נפגעו ב-EDL המוזרק והאלקטרופורציה בהשוואה לבקרה שלא נגעו בה (טבלה 1). הנתונים שלנו מראים כי ביטוי חלבונים המשפיע על התכווצות עשוי להיות מווסת באמצעות אלקטרופורציה ב-EDL מבלי לגרום לתופעות לוואי.

Figure 1
איור 1: אלקטרופורציה של pcDNA3-EGFP מספיקה לקליטת דנ"א בשרירי TA ו-EDL. A) חתכי רוחב מייצגים מפקדי TA ו- EDL (מוזרקים עם וקטור בקרה ואלקטרופורציה 125 V /cm) ו- GFP (מוזרק עם pcDNA3-EGFP ואלקטרופורציה 125 V / cm). סרגל קנה מידה 50 μm. B) חתך מייצג מה- EDL המדגים יעילות טרנספקציה. סרגל קנה מידה 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הזרקה ואלקטרופורציה אינן פוגעות בתפקוד השרירים. עקומות כוח טטניות מייצגות ב-100 הרץ מ-A) EDL לא מוזרק/אלקטרופורדי (בקרה) ו-B) EDL מוזרק/אלקטרופוזי (GFP). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שליטה (n=3) GFP (n=3) ערך p
FO (g) 34.13 ± 1.15 35.87 ± 1.55 0.1918
sFO (kN/m2) 691.56 ± 45.80 660.00 ± 33.61 0.3917
TTP (שניה) 0.249 ± 0.0203 0.247 ± 0.0197 0.9084
RT1/2 (שניות) 0.035 ± 0.0035 0.033 ± .0031 0.6458
בקרה -לא מוזרקת/לא אלקטרופורציה; GFP-מוזרק עם pcDNA3-EGFP ואלקטרופורד. ערכים הם ממוצעים ± SD. p=0.05 נחשב משמעותי. F0- כוח טטאני גולמי ב-100 הרץ, sF0-כוח ספציפי טטאני ב-100 הרץ, TTP- זמן לשיא ב-1Hz, RT1/2- זמן לחצי הרפיה ב-1Hz.

טבלה 1: התכווצות שריר שלם משליטה לעומת EDLs אלקטרופוגרים. טבלה המציגה כי פרמטרים שונים של כוח שריר אינם נפגעים ב-EDLs מוזרקים/אלקטרופורים (GFP) בהשוואה לבקרות שאינן מוזרקות/לא אלקטרופוריות. F0 = כוח טטאני ב 100 הרץ, sF0 = כוח טטני ספציפי ב 100 הרץ, TTP = זמן למתח שיא ב 1 הרץ, RT1/2 = חצי זמן הרפיה. מבחן t של התלמיד; משמעות ב p = 0.05. n = 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

העברת גנים In vivo בשרירי השלד המשופרת על ידי אלקטרופורציה היא כלי שימושי ופשוט יחסית לאפנות ביטוי חלבונים בשריר. הראינו את הצעדים הנדרשים להשגת העברת גנים יעילה בשרירי ה-EDL וה-TA והוכחנו שמדידת התכווצות של ה-EDL היא בת קיימא לאחר ההליך. טכניקה זו אינה דורשת וקטורים ויראליים מסובכים יותר ומאפשרת השוואה של אזור חתך סיבי שריר שעבר טרנספקציה ולא טרנספקציה בשריר יחיד. מגבלה להליך זה היא שיעילות קליטת המבנה לא הושלמה וחלק מהמיופיברים נותרו ללא טרנספורמציה.

ההליכים הנדונים אינם מוגבלים לאלקטרופורציה של וקטורי ביטוי. הראינו בעבר כי ניתן להשיג הפלת חלבונים על ידי ביצוע אותם נהלים, אך שימוש ב-siRNA או ב-shRNA מבנים in vivo14. בנוסף, ניתן להשתמש במבני כתבים כדי למדוד את פעילות השעתוק של גני מטרה 2,4,22. כלים אלה מאפשרים מניפולציה של חלבונים מרובים בו זמנית בשריר שלד יחיד, תוך מתן אפשרות לחוקר למדוד בקלות שינויים שעתוק. ניתן גם לבצע טרנספקציה משותפת של שרירי השלד עם ביטוי או וקטור sh/siRNA וכתב פלואורסצנטי. מחקרים הראו כי למעלה מ-95% מסיבי השריר שתופסים וקטור אחד יתפסו גם וקטור אחר23. זה שימושי כאשר מבנים מתויגים אינם בני קיימא. ניסויים דומים יכולים להתבצע בשרירים שונים, כולל הסולאוס, הגסטרוקנמיוס, quadriceps, ו flexor digitorum brevis, בין היתר24. ההליך אינו מוגבל לעכברים. חולדות שימשו באופן נרחב להעברת גנים של שרירים, אך יש לקחת בחשבון שינויים בנפח ההזרקה, בריכוז הדנ"א ובפרמטרים של אלקטרופורציה. חשוב לציין, יעילות העברת הגנים פוחתת כאשר משתמשים באלקטרופורציה על אזורים גדולים, ושרירים גדולים יותר עשויים לדרוש זריקות מרובות24.

ניתן להשתמש בבעלי חיים לאחר העברת גנים כדי לחקור מגוון מצבים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. הגורמים העיקריים הקובעים את היעילות של הליך זה שיש לקחת בחשבון הם יעילות הטרנספקציה של המבנה הרצוי ומשך המחקר. בעוד שביטוי חלבון מוגבר נצפה כבר 270 יום לאחר אלקטרופורציה12, מחקרים הראו כי יש ירידה בביטוי לאורך זמן13,25. הפשטות והיעילות של הליך זה הופכות אותו לישים מאוד לחקר הפיזיולוגיה של שרירי השלד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

B.A.H. ו- D.L.W טוענים לניגוד עניינים.

Acknowledgments

ללא

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable) Ethicon 662G Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe Hamilton 80501 microsyringe
C57BLl/6NHsd mice Envigo 044 12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode BTX 45-0102 1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis Aurora Scientific 605A Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System BTX 45-0662 electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors Fine Science Tools 14088-10 Scissors for blunt dissection
Force Transducer Aurora Scientific 407A To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats Fine Science Tools 13010-12 Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector Fisher Scientific V79020 Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid Addgene 13031 Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps Fine Science Tools 11009-13 Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10 Becton Dickinson 37 1210 Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media VWR 25608-930 Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red Thermo-Fisher Scientific W21405 Membrane staining for muscle cross section

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
  2. Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
  3. Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
  4. Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
  5. Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
  6. Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
  7. Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
  8. Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
  9. Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
  10. Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
  11. Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
  12. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  13. Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
  14. Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
  15. Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
  16. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
  17. Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
  18. Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
  19. Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
  20. Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
  21. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732 (2015).
  22. Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
  23. Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
  24. Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  25. Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).

Tags

ביולוגיה גיליון 182
אלקטרופורציה של דנ"א פלסמיד לשריר השלד של העכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hain, B. A., Waning, D. L.… More

Hain, B. A., Waning, D. L. Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (182), e63916, doi:10.3791/63916 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter