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Biology

माउस कंकाल की मांसपेशी में प्लास्मिड डीएनए का इलेक्ट्रोपोरेशन

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63916
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

Summary

कंकाल की मांसपेशियों में प्लास्मिड डीएनए का इलेक्ट्रोपोरेशन चूहों में मांसपेशियों के संकुचन से समझौता किए बिना जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने का एक व्यवहार्य तरीका है।

Abstract

प्लास्मिड इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा म्यूरिन कंकाल की मांसपेशियों में क्षणिक जीन अभिव्यक्ति मॉडुलन सामान्य और पैथोलॉजिकल फिजियोलॉजी का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। लक्ष्य जीन की ओवरएक्सप्रेशन या नॉकडाउन जांचकर्ताओं को व्यक्तिगत आणविक घटनाओं में हेरफेर करने में सक्षम बनाता है और इस प्रकार, मांसपेशियों, मांसपेशियों के चयापचय और सिकुड़न को प्रभावित करने वाले तंत्र को बेहतर ढंग से समझता है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट टैग को एन्कोड करने वाले डीएनए प्लास्मिड का इलेक्ट्रोपोरेशन जांचकर्ताओं को विवो में कंकाल की मांसपेशियों में प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण में परिवर्तन को मापने की अनुमति देता है। कंकाल की मांसपेशियों के एक प्रमुख कार्यात्मक मूल्यांकन में मांसपेशियों की सिकुड़न का माप शामिल है। इस प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शित करते हैं कि प्लास्मिड डीएनए इंजेक्शन, इलेक्ट्रोपोरेशन और जीन अभिव्यक्ति मॉडुलन के बाद पूरे मांसपेशी संकुचन अध्ययन अभी भी संभव हैं। इस अनुदेशात्मक प्रक्रिया का लक्ष्य माउस कंकाल की मांसपेशियों में डीएनए प्लास्मिड इलेक्ट्रोपोरेशन की चरण-दर-चरण विधि का प्रदर्शन करना है ताकि टिबियलिस पूर्वकाल और एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस मांसपेशियों के मायोफाइबर में तेज और अभिव्यक्ति की सुविधा मिल सके, साथ ही यह प्रदर्शित किया जा सके कि कंकाल की मांसपेशी संकुचन इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा समझौता नहीं किया जाता है।

Introduction

विवो में कंकाल की मांसपेशियों में प्लास्मिड डीएनए इलेक्ट्रोपोरेशन विभिन्न प्रकार की शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों में जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करके कंकाल की मांसपेशी शरीर विज्ञान और आणविक सिग्नलिंग में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . कंकाल की मांसपेशियों में प्रायोगिक जीन हस्तांतरण वोल्फ एट अल द्वारा 1990 की शुरुआत में प्रदर्शित किया गया था, जहां आरएनए और डीएनए दोनों को इलेक्ट्रोपोरेशन के बिना सफलतापूर्वक स्थानांतरित किया गया था, और ल्यूसिफेरेज़ अभिव्यक्ति को कम से कम 2 महीने10 तक बनाए रखा गया था। इंजेक्शन के साथ अपेक्षाकृत कम अभिकर्मक दक्षता केवल समस्याग्रस्त है, और ऐहारा और मियाज़ाकी ने 1998 में पीसीएजीजीएस-आईएल -5 निर्माण को टिबियलिस पूर्वकाल (टीए) मांसपेशियों में इलेक्ट्रोपोरेट करके और सीरम आईएल -5 अभिव्यक्ति11 को मापकर इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ जीन हस्तांतरण में वृद्धि का प्रदर्शन किया। उस समय से, कई अध्ययनों ने अधिकतम जीन हस्तांतरण दक्षता सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न डीएनए सांद्रता, वॉल्यूम और इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों की प्रभावकारिता की जांच की है। वोल्टेज, पल्स नंबर, पल्स अवधि और आवृत्ति, साथ ही डीएनए एकाग्रता सहित विभिन्न इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों का परीक्षण किया, और यह निर्धारित किया कि अधिक वोल्टेज, पल्स संख्या और डीएनए एकाग्रता सभी ने इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता में वृद्धि में योगदान दिया12. उच्च इलेक्ट्रोपोरेशन वोल्टेज के लिए एक प्रमुख चेतावनी यह है कि, जबकि यह मायोफाइबर में डीएनए तेज में वृद्धि की सुविधा प्रदान करता है, यह मांसपेशियों को नुकसान भी पहुंचाता है, जो परिणामों को भ्रमित कर सकता है। शर्टज़र एट अल ने दिखाया कि 200 वी पर इलेक्ट्रोपोरेशन ने इलेक्ट्रोपोरेशन के 3 दिनों बाद लगभग 50% मायोफाइबर में नुकसान पहुंचाया, जबकि 50 वी13 पर केवल 10% मायोफाइबर क्षतिग्रस्त हो गए। हमने कुशल डीएनए हस्तांतरण बनाम मांसपेशियों की क्षति को प्रभावित करने वाले चर को ध्यान में रखा है और पाया है कि कैलिपर चौड़ाई के 125 वी प्रति सेंटीमीटर का वोल्टेज प्रभावी जीन हस्तांतरण को पूरा करने के लिए पर्याप्त है।

मांसपेशी फाइबर क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र का विश्लेषण और इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद पूरे मांसपेशी संकुचन जीन मॉडुलन के कारण मांसपेशियों के आकार और कार्य में परिवर्तन को मापने के लिए विधि के महत्वपूर्ण पहलू हैं। हमने और अन्य लोगों ने पहले प्रदर्शित किया है कि अकेले नियंत्रण वैक्टर के इलेक्ट्रोपोरेशन से मायोफाइबर क्षेत्र में कमी नहीं होती है। ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) निर्माण इन अध्ययनों13,14 में डीएनए अभिकर्मक का एक उपयोगी फ्लोरोसेंट संकेतक था। कई अध्ययनों ने इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद टीए की सीटू सिकुड़न में जांच की है और अलग-अलग परिणाम पाए हैं। एक अध्ययन से पता चला है कि 75 वी / सेमी इलेक्ट्रोपोरेशन ने इलेक्ट्रोपोरेशन के 3 दिनों के बाद टेटैनिक बल में लगभग 30% की कमी का कारण बना, और 7 दिनों के बाद इलेक्ट्रोपोरेशन तक, टेटैनिक बल नियंत्रण स्तर पर वापस आ गया, जबकि 50 वी / सेमी इलेक्ट्रोपोरेशन ने बल13,15 से समझौता नहीं किया। एक अन्य अध्ययन से पता चला है कि 180 वी / सेमी इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद टेटैनिक बल 3 घंटे का 30% नुकसान हुआ था, जो 7 दिनों16 दिनों के बाद शम बल के स्तर पर ठीक हो गया था।

निम्नलिखित विस्तृत प्रक्रिया में, हम चूहों के टीए और एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल) मांसपेशियों में पीसीडीएनए 3-ईजीएफपी प्लास्मिड के इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन का प्रदर्शन करते हैं। हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि यह विधि ईडीएल पूरे मांसपेशियों के संकुचन को प्रभावित नहीं करती है। इसका उद्देश्य फ़ंक्शन के नुकसान के बिना मायोफाइबर में कुशल प्लास्मिड अपटेक का प्रदर्शन करना है।

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Protocol

जानवरों का उपयोग करने वाले सभी प्रयोग पेन स्टेट कॉलेज ऑफ मेडिसिन में किए गए थे, जिसे पेन स्टेट यूनिवर्सिटी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और हेलसिंकी की 1964 की घोषणा और इसके बाद के संशोधनों में निर्धारित नैतिक मानकों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था। इस प्रक्रिया के लिए 12 सप्ताह की मादा सी 57 बीएल / 6 चूहों का उपयोग किया गया था। प्रयोग से पहले बाँझपन के लिए सभी सर्जिकल उपकरणों को आटोक्लेव किया गया था।

1. टीए और ईडीएल इंजेक्शन /

नोट: ये चरण टीए और ईडीएल इंजेक्शन / इलेक्ट्रोपोरेशन तैयारी के लिए समान हैं।

  1. प्रयोग से पहले बाँझ पीबीएस में पतला 1 μg/μL की एकाग्रता के लिए अभिव्यक्ति प्लास्मिड निर्माणों शुद्ध। इस प्रक्रिया के लिए, पीसीडीएनए 3-ईजीएफपी (जीएफपी) या पीसीडीएनए 3 खाली वेक्टर (नियंत्रण) को शुद्ध करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंडोटॉक्सिन मुक्त शुद्धि किट का उपयोग किया गया था।
  2. पर्याप्त इंजेक्शन मात्रा सुनिश्चित करने के लिए प्लास्मिड एकाग्रता की गणना करें (बाँझ पीबीएस के 50 μL में डीएनए के टीए 50 μg; बाँझ पीबीएस के 10 μL में डीएनए के ईडीएल 10 μg) और विभाज्य नमूने।
  3. चयनित पहिया का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेटर सेटिंग्स को प्रोग्राम करें और निम्नानुसार मापदंडों का चयन करने के लिए पहिया को निराश करें: मोड - एलवी, वोल्टेज - 12.5 वी / मिमी (इंजेक्शन के समय समायोजित किया जाना है), पल्स लंबाई - 20 एमएस, दालों की संख्या - 5, अंतराल - 200 एमएस, ध्रुवीयता - एकध्रुवीय।
  4. आइसोफ्लूरेन गैस का उपयोग करके चूहों को संवेदनाहारी करें। 5% आइसोफ्लूरेन के साथ एक प्रेरण बॉक्स में चूहों प्लेस। संदंश का उपयोग कर पैर की अंगुली चुटकी पलटा की अनुपस्थिति से संज्ञाहरण के सर्जिकल विमान की पुष्टि करें और आइसोफ्लूरेन को 2% रखरखाव खुराक तक कम करें। प्रक्रिया के बाकी के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक परिसंचारी पानी की प्लेट पर आराम एक उपयुक्त नाक शंकु के लिए चूहों स्थानांतरण।
  5. छोटे हेयर क्लिपर्स का उपयोग करके दोनों हिंडलिंब से बाल निकालें। इंजेक्शन क्षेत्र को साफ करने के लिए 70% इथेनॉल / बीटाडीन के साथ निचले अंगों को स्क्रब करें।

2. टीए इंजेक्शन/

  1. एक लापरवाह स्थिति में माउस के साथ, निचले पैर के पार्श्व पक्ष पर त्वचा के माध्यम से दिखाई देने वाले टीए कण्डरा का पता लगाएं। एक वियोज्य 30 जी सुई के साथ एक 50 μL माइक्रो-सिरिंज का उपयोग करके, सुई को उथले 5 ° कोण पर मायोटेंडिनस जंक्शन से 1-2 मिमी बेहतर डालें जब तक कि सुई मांसपेशियों के बेहतर छोर तक नहीं पहुंच जाती।
    नोट: मांसपेशियों के बीच में इंजेक्शन लक्ष्य है।
  2. प्लास्मिड समाधान के 50 μL देने के लिए इंजेक्शन पथ के साथ सुई को धीरे-धीरे वापस लेते हुए धीरे-धीरे सवार को दबाएं। मांसपेशियों में सूजन आनी चाहिए।
  3. 1 मिनट के लिए टाइमर सेट करें और टीए पर पैर की मोटाई को मापें। माउस के आकार के आधार पर, यह 5-10 मिमी से हो सकता है। कैलिपर इलेक्ट्रोड को मापा मोटाई पर सेट करें और इलेक्ट्रोपोरेटर वोल्टेज को 12.5 वी /
  4. 1 मिनट के बाद, निचले अंग के चारों ओर कैलिपर इलेक्ट्रोड रखें। इलेक्ट्रोड स्नग होना चाहिए लेकिन अत्यधिक तंग नहीं होना चाहिए। 20 एमएस अवधि और 200 एमएस अंतराल के साथ 5 वर्ग-तरंग दालों को वितरित करें (मांसपेशियों को प्रत्येक नाड़ी के साथ चिकोटी चाहिए)।
  5. नियंत्रण वेक्टर का उपयोग करके वैकल्पिक अंग के साथ दोहराएं।
  6. संज्ञाहरण से माउस निकालें और यह 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक हीटिंग पैड पर ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं। एक बार बरामद होने के बाद, माउस को उसके पिंजरे में वापस कर दें।

3. ईडीएल इंजेक्शन /

  1. एक लापरवाह स्थिति में माउस के साथ, टिबिया हड्डी पूर्वकाल शिखा नेत्रहीन और कोमल तालमेल के माध्यम से पता लगाने।
    1. स्केलपेल का उपयोग करके, टिबिया पूर्वकाल शिखा के पार्श्व पक्ष पर त्वचा के माध्यम से एक उथला चीरा बनाएं 5 मिमी घुटने से 2 मिमी से 2 मिमी बेहतर टीए मायोटेंडिनस जंक्शन से बेहतर।
    2. छोटी कैंची का उपयोग करके, टीए मांसपेशियों को उजागर करते हुए, प्रावरणी को कुंद विच्छेदन करें।
    3. फिर, कैंची के साथ कुंद विच्छेदन का उपयोग करके, टीए मांसपेशियों को धीरे-धीरे टिबिया से अलग करें, ईडीएल को उजागर करते हुए, मांसपेशियों को धीरे-धीरे खींचकर। प्रक्रिया के दौरान ईडीएल से टीए को स्पष्ट रखने के लिए छोटे, घुमावदार संदंश का उपयोग किया जा सकता है।
  2. एक वियोज्य 30 जी सुई के साथ एक 50 μL माइक्रो-सिरिंज का उपयोग करके, सुई को अनुदैर्ध्य रूप से ईडीएल में डालें जब तक कि सुई मांसपेशियों के बेहतर छोर तक न पहुंच जाए।
  3. प्लास्मिड समाधान के 10 μL इंजेक्शन लगाने के लिए इंजेक्शन पथ के साथ सुई को धीरे-धीरे वापस लेते हुए धीरे-धीरे सवार को दबाएं (मांसपेशियों को सूजन चाहिए)।
  4. 1 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करें और ईडीएल में पैर की मोटाई को मापें। माउस के आकार के आधार पर, यह 5-10 मिमी से हो सकता है। कैलिपर इलेक्ट्रोड को मापा मोटाई पर सेट करें और इलेक्ट्रोपोरेटर वोल्टेज को 12.5 वी /
  5. 1 मिनट के बाद, निचले अंग के चारों ओर कैलिपर इलेक्ट्रोड रखें। इलेक्ट्रोड स्नग होना चाहिए लेकिन अत्यधिक तंग नहीं होना चाहिए। 20 एमएस अवधि और 200 एमएस अंतराल (मांसपेशियों को प्रत्येक नाड़ी के साथ चिकोटी चाहिए) के साथ 5 वर्ग-तरंग दालों को वितरित करें।
  6. डिस्पोजेबल 4/0 गैर-अवशोषित नायलॉन टांके का उपयोग करके चीरा बंद करें।
  7. वैकल्पिक अंग के साथ दोहराएं या अंग को पूर्ण नियंत्रण के रूप में अछूता छोड़ दें।
  8. संज्ञाहरण से माउस निकालें और यह 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक हीटिंग पैड पर ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं। सर्जरी के तुरंत बाद एक उपयुक्त चमड़े के नीचे एनाल्जेसिक और सर्जरी के बाद 12-24 घंटे का प्रशासन करें। एक बार बरामद होने के बाद, माउस को उसके पिंजरे में वापस कर दें।
    नोट: पिछले अध्ययनों ने इलेक्ट्रोपोरेशन के तुरंत बाद टीए में मांसपेशियों के संकुचन की कमी दिखाई है और यह सिकुड़ा हुआ वसूली 3 दिनों13,15 के दौरान होती है। इस कारण से, ऊतक विज्ञान, प्रोटीन अभिव्यक्ति, या मांसपेशियों के संकुचन के लिए टीए और ईडीएल मांसपेशियों दोनों का विश्लेषण इलेक्ट्रोपोरेशन के 3-10 दिनों के बाद किया जाता है। ईजीएफपी की लंबे समय तक अभिव्यक्ति प्रक्रिया13 के बाद 3 सप्ताह तक देखी गई है।

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Representative Results

कंकाल की मांसपेशियों में जीन हस्तांतरण की सुविधा के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन एक उपयोगी तकनीक है जिसका उपयोग मांसपेशियों के शरीर विज्ञान में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। हमने टीए और ईडीएल दोनों मांसपेशियों में कुशल जीन हस्तांतरण को पूरा करने के लिए एक विस्तृत, चरण-दर-चरण प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है। अभिकर्मक दक्षता में अंतर कई चर के कारण होता है। इन चरों में इलेक्ट्रोपोरेशन पैरामीटर (दालों, वोल्टेज, पल्स अवधि, आदि), जीन निर्माण आकार और डीएनए इंजेक्शन की एकाग्रता / सेमी पर 5 दालों के इलेक्ट्रोपोरेशन पैरामीटर, 200 एमएस अंतराल से अलग 20 एमएस अवधि के साथ, टीए14 में कुशल जीन हस्तांतरण को पूरा करने के लिए पर्याप्त हैं। हम वर्तमान अध्ययन में यह भी प्रदर्शित करते हैं कि डीएनए के इंजेक्शन / इलेक्ट्रोपोरेशन से ईडीएल 3-दिन के बाद प्रयोग में मांसपेशियों की सिकुड़न का नुकसान नहीं होता है।

जीन स्थानांतरण की कल्पना करने के लिए, एक पीसीडीएनए 3-ईजीएफपी या पीसीडीएनए 3 (नियंत्रण) निर्माण माउस टीए या ईडीएल मांसपेशियों में इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था। प्रक्रिया के 3 दिन बाद, टीए या ईडीएल को सावधानीपूर्वक विच्छेदित किया गया था, इष्टतम काटने के तापमान (ओटीसी) मीडिया में रखा गया था, और तरल नाइट्रोजन-ठंडा आइसोपेंटेन (2-मिथाइलब्यूटेन) में स्नैप-जमे हुए, जैसा कि पहले 14,17,18,19 वर्णित है। प्रत्येक मांसपेशी के मध्य पेट से लिए गए क्रायोस्टैट का उपयोग करके 10 μm मांसपेशी वर्गों को प्राप्त किया गया था। वर्गों तो 5 मिनट के लिए 1% पैराफॉर्मलडिहाइड में ऊष्मायन किया गया, पीबीएस में 3-5 मिनट धोने के द्वारा पीछा किया। वर्गों को तब गेहूं-रोगाणु एग्लूटिनिन में ऊष्मायन किया गया था टेक्सास रेड अंधेरे में 90 मिनट के लिए पीबीएस में 1:100 पतला। अनुभागों को फिर से 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार पीबीएस में धोया गया था। मांसपेशियों के वर्गों को तब जलीय बढ़ते मीडिया में कवर किया गया था और व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबर की कल्पना करने के लिए 594 एनएम तरंग दैर्ध्य (लाल) में और जीएफपी (चित्रा 1 ए) का पता लगाने के लिए 480 एनएम तरंग दैर्ध्य में चित्रित किया गया था। पीसीडीएनए 3 के साथ इंजेक्शन नियंत्रण मांसपेशियों को संभावित ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए नियंत्रित करने के लिए एक ही एक्सपोजर सेटिंग्स के साथ दोनों चैनलों में चित्रित किया गया था। ईजीएफपी के साथ इंजेक्शन / इलेक्ट्रोपोरेटेड मांसपेशियों ने सकारात्मक हरे फाइबर दिखाए, पीसीडीएनए 3-ईजीएफपी निर्माण के उत्थान का प्रदर्शन किया, जबकि पीसीडीएनए 3 (नियंत्रण) के साथ इंजेक्शन / इलेक्ट्रोपोरेटेड मांसपेशियों ने कोई हरा सकारात्मक फाइबर नहीं दिखाया। हमने और अन्य लोगों ने पहले दिखाया है कि मायोफाइबर क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र जीएफपी सकारात्मक फाइबर (हरा) की तुलना गैर-जीएफपी व्यक्त फाइबर (काला) से एक ही मांसपेशी वर्गों 4,6,19 के भीतर जीएफपी अभिव्यक्ति से समझौता नहीं किया जाता है। जब कम आवर्धन पर चित्रित किया जाता है, तो ईडीएल मांसपेशी अभिकर्मक दक्षता को हरे फाइबर (सकारात्मक) बनाम काले फाइबर (नकारात्मक) (चित्रा 1 बी) की उपस्थिति के माध्यम से कल्पना की जाती है। इस प्रक्रिया का उपयोग करके अभिकर्मक दक्षता 56.6% ± 4.7% थी, जैसा कि 3 ईडीएल मांसपेशियों में मापा गया था। इस डेटा से पता चलता है कि टीए मांसपेशियों का इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन कुशल जीन हस्तांतरण के लिए पर्याप्त है। इसके अतिरिक्त, ईडीएल का इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन जीन निर्माणों के कुशल उत्थान को प्राप्त करता है।

कंकाल की मांसपेशी शरीर विज्ञान के मूल्यांकन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण मांसपेशियों के संकुचन का माप है। पिछले जांचकर्ताओं ने दिखाया है कि सीटू में मापा गया टीए की सिकुड़न को हिंद अंग13 के इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद जल्दी समझौता किया जा सकता है। यह जांचने के लिए कि इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद ईडीएल सिकुड़न से समझौता किया जाता है या नहीं, हमने शल्य चिकित्सा से ईडीएल को उजागर किया, इसे पीसीडीएनए 3-ईजीएफपी या निर्माण के साथ इंजेक्ट किया, और हिंडलिंब को इलेक्ट्रोपोरेट किया। एक नियंत्रण के रूप में, वैकल्पिक अंग को तुलना के लिए अछूता छोड़ दिया गया था। चूहों को 3 दिन बाद इच्छामृत्यु दी गई थी, और ईडीएल पूरी मांसपेशी संकुचन को शारीरिक स्नान में क्षेत्र उत्तेजना का उपयोग करके मापा गया था, जैसा कि पहले 14,19,20,21 वर्णित किया गया था। संक्षेप में, ईडीएल को विच्छेदित किया गया था, और टेंडन को स्टेनलेस स्टील के हुक में 4/0 रेशम सिवनी के माध्यम से बांधा गया था और एक बल ट्रांसड्यूसर और स्थिर आधार के बीच निलंबित कर दिया गया था। मांसपेशियों को टायरोड बफर में स्नान किया गया था, जो एक शारीरिक स्नान समाधान (121 एमएम एनएसीएल, 5.0 एमएम केसीएल, 1.8 एमएम सीएसीएल2, 0.5 एमएम एमजीसीएल2, 0.4 एमएम एनएएच2पीओ4, 24 एमएम एनएएचसीओ3, 0.1 एमएम ईडीटीए, 5.5 एमएम ग्लूकोज) है और पूरी प्रक्रिया में 100% ऑक्सीजन के साथ बुलबुला है। मांसपेशियों के संकुचन को प्लैटिनम इलेक्ट्रोड का उपयोग करके एक सुपरमैक्सिमल उत्तेजना देने के लिए उत्तेजित किया गया था। प्रक्रिया की शुरुआत में अधिकतम बल उत्पन्न करने के लिए मांसपेशियों की इष्टतम लंबाई (एलओ) को समायोजित किया गया था। बल-आवृत्ति संबंध 1-150 हर्ट्ज (सुपरमैक्सिमल वोल्टेज पर 0.5 एमएस दालों) के बीच उत्तेजना आवृत्तियों का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। मांसपेशियों को प्रत्येक उत्तेजना के बीच 3 मिनट के लिए आराम करने की अनुमति दी गई थी। उत्तेजना प्रक्रिया पूरी होने के बाद, मांसपेशियों के वजन और लंबाई को मापा गया। विशिष्ट बल की गणना पूरे मांसपेशी क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र में पूर्ण बल को सामान्य करके की गई थी, जिसकी गणना लंबाई से विभाजित वजन के रूप में की जाती है और पहले से निर्धारित मांसपेशी घनत्व स्थिरांक (1.056 किग्रा / हमने दिखाया है कि प्रतिनिधि इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेटेड ईडीएल में गैर-इंजेक्शन या इलेक्ट्रोपोरेटेड मांसपेशियों (चित्रा 2 ए और चित्रा 2 बी) को नियंत्रित करने की तुलना में 100 हर्ट्ज पर समान टेटेनिक प्रतिक्रियाएं हैं। हमने पाया कि मांसपेशी टेटैनिक बल, विशिष्ट टेटैनिक बल, चोटी के तनाव का समय, और अछूता नियंत्रण (तालिका 1) की तुलना में इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेटेड ईडीएल में आधा विश्राम समय समझौता नहीं किया गया था। हमारे डेटा से पता चलता है कि प्रोटीन अभिव्यक्ति जो संकुचन को प्रभावित करती है, प्रतिकूल प्रभाव पैदा किए बिना ईडीएल में इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके संशोधित की जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: पीसीडीएनए 3-ईजीएफपी का इलेक्ट्रोपोरेशन टीए और ईडीएल मांसपेशियों में डीएनए तेज के लिए पर्याप्त है। ए) टीए और ईडीएल नियंत्रण (नियंत्रण वेक्टर और इलेक्ट्रोपोरेटेड 125 वी / सेमी के साथ इंजेक्ट किया गया) और जीएफपी (पीसीडीएनए 3-ईजीएफपी और इलेक्ट्रोपोरेटेड 125 वी / सेमी के साथ इंजेक्ट किया गया) से प्रतिनिधि क्रॉस-सेक्शन। बी) अभिकर्मक दक्षता का प्रदर्शन ईडीएल से प्रतिनिधि क्रॉस-सेक्शन। स्केल पट्टी 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन मांसपेशियों के कार्य से समझौता नहीं करता है। ए से 100 हर्ट्ज पर प्रतिनिधि टेटैनिक बल घटता है) गैर-इंजेक्शन / इलेक्ट्रोपोरेटेड ईडीएल (नियंत्रण) और बी) इंजेक्शन / इलेक्ट्रोपोरेटेड ईडीएल (जीएफपी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नियंत्रण (एन = 3) जीएफपी (एन = 3) पी-वैल्यू
एफओ (जी) 34.13 ± 1.15 35.87 ± 1.55 0.1918
एसएफओ (केएन / 691.56 ± 45.80 660.00 ± 33.61 0.3917
टीटीपी (सेकंड) 0.249 ± 0.0203 0.247 ± 0.0197 0.9084
आरटी 1/2 (सेकंड) 0.035 ± 0.0035 0.033 ±.0031 0.6458
नियंत्रण -गैर-इंजेक्शन/गैर-इलेक्ट्रोपोरेटेड; जीएफपी-पीसीडीएनए 3-ईजीएफपी के साथ इंजेक्ट किया गया और इलेक्ट्रोपोरेटेड। मान एसडी ± माध्य हैं पी = 0.05 महत्वपूर्ण माना जाता है। एफ0- 100 हर्ट्ज पर रॉ टेटैनिक फोर्स, 100 हर्ट्ज पर एसएफ 0-टेटैनिक स्पेसिफिक फोर्स, 1 हर्ट्ज पर टीटीपी- पीक का समय, आरटी 1/2- 1 हर्ट्ज पर आधा विश्राम का समय।

तालिका 1: इलेक्ट्रोपोरेटेड ईडीएल बनाम नियंत्रण से पूरी मांसपेशी संकुचन। तालिका से पता चलता है कि गैर-इंजेक्शन / गैर-इलेक्ट्रोपोरेटेड नियंत्रणों की तुलना में इंजेक्शन / इलेक्ट्रोपोरेटेड ईडीएल (जीएफपी) में विभिन्न मांसपेशी बल मापदंडों से समझौता नहीं किया जाता है। एफ0 = 100 हर्ट्ज पर टेटैनिक बल, एसएफ0 = 100 हर्ट्ज पर विशिष्ट टेटैनिक बल, टीटीपी = 1 हर्ट्ज पर चरम तनाव का समय, आरटी1/2 = आधा विश्राम समय। छात्र का टी-टेस्ट; पी = 0.05 पर महत्व। एन = 3।

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Discussion

इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा बढ़ाए गए कंकाल की मांसपेशियों में विवो जीन हस्तांतरण मांसपेशियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए एक उपयोगी और अपेक्षाकृत सरल उपकरण है। हमने ईडीएल और टीए मांसपेशियों में कुशल जीन हस्तांतरण प्राप्त करने के लिए आवश्यक कदम दिखाए हैं और दिखाया है कि ईडीएल की सिकुड़न माप प्रक्रिया के बाद व्यवहार्य है। इस तकनीक को अधिक जटिल वायरल वैक्टर की आवश्यकता नहीं होती है और एक ही मांसपेशी में ट्रांसफेक्टेड और गैर-ट्रांसफेक्टेड मांसपेशी फाइबर क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र की तुलना की अनुमति देता है। इस प्रक्रिया की एक सीमा यह है कि निर्माण तेज दक्षता पूरी नहीं हुई थी और कुछ मायोफाइबर गैर-ट्रांसफेक्टेड रहे।

चर्चा की गई प्रक्रियाएं अभिव्यक्ति वैक्टर के इलेक्ट्रोपोरेशन तक सीमित नहीं हैं। हमने पहले दिखाया है कि प्रोटीन नॉकडाउन को समान प्रक्रियाओं का पालन करके प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन विवो14 में एसआईआरएनए या एसएचआरएनए निर्माणों का उपयोग करके। इसके अतिरिक्त, रिपोर्टर निर्माणों का उपयोग लक्ष्य जीन 2,4,22 की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को मापने के लिए किया जा सकता है। ये उपकरण एक कंकाल की मांसपेशी में समवर्ती रूप से कई प्रोटीनों के हेरफेर की अनुमति देते हैं, जबकि अन्वेषक को ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों को आसानी से मापने का विकल्प भी देते हैं। कंकाल की मांसपेशियों को एक अभिव्यक्ति या श / सीआरएनए वेक्टर और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ सह-संक्रमित भी किया जा सकता है। अध्ययनों से पता चला है कि 95% मांसपेशी फाइबर जो एक वेक्टर लेते हैं, वे एक और वेक्टर23 भी लेंगे। यह तब उपयोगी होता है जब टैग किए गए निर्माण व्यवहार्य नहीं होते हैं। इसी तरह के प्रयोग विभिन्न मांसपेशियों में आयोजित किए जा सकते हैं, जिनमें सोलस, गैस्ट्रोनेमियस, क्वाड्रिसेप्स और फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस शामिल हैं, दूसरोंके बीच 24. प्रक्रिया चूहों तक सीमित नहीं है। मांसपेशियों के जीन हस्तांतरण के लिए चूहों का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है, लेकिन इंजेक्शन की मात्रा, डीएनए एकाग्रता और इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों में परिवर्तन पर विचार किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण बात यह है कि जीन स्थानांतरण दक्षता कम हो जाती है जब इलेक्ट्रोपोरेशन बड़े क्षेत्रों में लागू होता है, और बड़ी मांसपेशियों को कई इंजेक्शन की आवश्यकता हो सकती है24.

पोस्ट-जीन ट्रांसफर जानवरों का उपयोग विभिन्न प्रकार की शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। ध्यान में रखने के लिए इस प्रक्रिया की प्रभावकारिता के मुख्य निर्धारक वांछित निर्माण की अभिकर्मक दक्षता और अध्ययन की अवधि हैं। जबकि इलेक्ट्रोपोरेशन12 के 270 दिनों के बाद प्रोटीन अभिव्यक्ति में वृद्धि देखी गई है, अध्ययनों से पता चला है कि समय के साथ अभिव्यक्ति में कमी13,25 है। इस प्रक्रिया की सादगी और प्रभावकारिता इसे कंकाल की मांसपेशी शरीर विज्ञान के अध्ययन पर अत्यधिक लागू करती है।

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Disclosures

बीएएच और डीएलडब्ल्यू का दावा है कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

कोई नहीं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable) Ethicon 662G Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe Hamilton 80501 microsyringe
C57BLl/6NHsd mice Envigo 044 12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode BTX 45-0102 1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis Aurora Scientific 605A Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System BTX 45-0662 electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors Fine Science Tools 14088-10 Scissors for blunt dissection
Force Transducer Aurora Scientific 407A To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats Fine Science Tools 13010-12 Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector Fisher Scientific V79020 Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid Addgene 13031 Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps Fine Science Tools 11009-13 Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10 Becton Dickinson 37 1210 Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media VWR 25608-930 Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red Thermo-Fisher Scientific W21405 Membrane staining for muscle cross section

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References

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जीव विज्ञान अंक 182
माउस कंकाल की मांसपेशी में प्लास्मिड डीएनए का इलेक्ट्रोपोरेशन
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Hain, B. A., Waning, D. L.… More

Hain, B. A., Waning, D. L. Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (182), e63916, doi:10.3791/63916 (2022).

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