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Biology

Elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63916
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

Summary

L'elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico è un metodo praticabile per modulare l'espressione genica senza compromettere la contrattilità muscolare nei topi.

Abstract

La modulazione transitoria dell'espressione genica nel muscolo scheletrico murino mediante elettroporazione plasmidica è uno strumento utile per valutare la fisiologia normale e patologica. La sovraespressione o l'abbattimento dei geni bersaglio consente ai ricercatori di manipolare singoli eventi molecolari e, quindi, comprendere meglio i meccanismi che influenzano la massa muscolare, il metabolismo muscolare e la contrattilità. Inoltre, l'elettroporazione dei plasmidi del DNA che codificano i tag fluorescenti consente ai ricercatori di misurare i cambiamenti nella localizzazione subcellulare delle proteine nel muscolo scheletrico in vivo. Una valutazione funzionale chiave del muscolo scheletrico include la misurazione della contrattilità muscolare. In questo protocollo, dimostriamo che gli studi di contrattilità dell'intero muscolo sono ancora possibili dopo l'iniezione di DNA plasmidico, l'elettroporazione e la modulazione dell'espressione genica. L'obiettivo di questa procedura didattica è dimostrare il metodo passo-passo dell'elettroporazione del plasmide del DNA nel muscolo scheletrico del topo per facilitare l'assorbimento e l'espressione nelle miofibre dei muscoli tibiale anteriore ed estensore digitorum longus, nonché dimostrare che la contrattilità del muscolo scheletrico non è compromessa dall'iniezione e dall'elettroporazione.

Introduction

L'elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico in vivo è uno strumento importante per valutare i cambiamenti nella fisiologia del muscolo scheletrico e nella segnalazione molecolare modulando l'espressione genica in una varietà di condizioni fisiologiche e fisiopatologiche 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Il trasferimento genico sperimentale nel muscolo scheletrico è stato dimostrato già nel 1990 da Wolff et al., dove sia l'RNA che il DNA sono stati trasferiti con successo senza elettroporazione e l'espressione della luciferasi è stata mantenuta per almeno 2 mesi10. L'efficienza di trasfezione relativamente bassa con la sola iniezione è problematica, e Aihara e Miyazaki hanno dimostrato un aumento del trasferimento genico con l'elettroporazione nel 1998 elettroporando un costrutto pCAGGS-IL-5 nel muscolo tibiale anteriore (TA) e misurando l'espressione sierica di IL-511. Da quel momento, molti studi hanno studiato l'efficacia di diverse concentrazioni di DNA, volumi e parametri di elettroporazione per garantire la massima efficienza di trasferimento genico. Mir et al. hanno testato diversi parametri di elettroporazione, tra cui tensione, numero di impulsi, durata e frequenza dell'impulso, nonché concentrazione di DNA, e hanno determinato che una maggiore tensione, numero di impulsi e concentrazione di DNA hanno contribuito ad aumentare l'efficienza dell'elettroporazione12. Un avvertimento importante per l'alta tensione di elettroporazione è che, mentre facilita l'aumento dell'assorbimento del DNA nelle miofibre, provoca anche danni muscolari, che possono confondere i risultati. Schertzer et al. hanno dimostrato che l'elettroporazione a 200 V ha causato danni in circa il 50% delle miofibre 3 giorni dopo l'elettroporazione, mentre solo il 10% delle miofibre è stato danneggiato a 50 V13. Abbiamo preso in considerazione le variabili che influenzano il trasferimento efficiente del DNA rispetto al danno muscolare e abbiamo scoperto che una tensione di 125 V per centimetro di larghezza della pinza è sufficiente per realizzare un efficace trasferimento genico.

L'analisi dell'area della sezione trasversale delle fibre muscolari e la contrattilità dell'intero muscolo dopo l'elettroporazione sono aspetti importanti del metodo per misurare i cambiamenti nelle dimensioni e nella funzione muscolare dovuti alla modulazione genica. Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che l'elettroporazione dei vettori di controllo da sola non causa una diminuzione dell'area della miofibra. Il costrutto della proteina fluorescente verde (EGFP) è stato un utile indicatore fluorescente della trasfezione del DNA in questi studi13,14. Numerosi studi hanno studiato la contrattilità in situ del TA dopo elettroporazione e hanno trovato risultati variabili. Uno studio ha dimostrato che l'elettroporazione a 75 V / cm ha causato una riduzione di circa il 30% della forza tetanica 3 giorni dopo l'elettroporazione, e da 7 giorni dopo l'elettroporazione, la forza tetanica è tornata al livello di controllo, mentre l'elettroporazione a 50 V / cm non ha compromesso la forza13,15. Un altro studio ha dimostrato che c'è stata una perdita del 30% di forza tetanica 3 ore dopo 180 V / cm di elettroporazione, che è tornata ai livelli di forza fittizia dopo 7 giorni16.

Nella seguente procedura dettagliata, dimostriamo l'iniezione e l'elettroporazione di un plasmide pcDNA3-EGFP nei muscoli TA ed estensore digitorum longus (EDL) dei topi. Dimostriamo anche che questo metodo non influisce sulla contrattilità del muscolo intero EDL. L'obiettivo è dimostrare un efficace assorbimento del plasmide nelle miofibre senza causare perdita di funzione.

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Protocol

Tutti gli esperimenti che utilizzano animali sono stati eseguiti presso il Penn State College of Medicine, approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Penn State University, ed eseguiti in conformità con gli standard etici stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e nei suoi successivi emendamenti. Per questa procedura sono stati utilizzati topi C57BL/6 di 12 settimane. Tutti gli strumenti chirurgici sono stati autoclavati per la sterilità prima della sperimentazione.

1. Preparazione per iniezione/elettroporazione TA ed EDL

NOTA: questi passaggi sono identici per la preparazione all'iniezione/elettroporazione TA ed EDL.

  1. Purificare i costrutti plasmidici di espressione ad una concentrazione di 1 μg/μL diluito in PBS sterile prima dell'esperimento. Per questa procedura, è stato utilizzato un kit di purificazione privo di endotossine disponibile in commercio per purificare il vettore vuoto pcDNA3-EGFP (GFP) o pcDNA3 (controllo).
  2. Calcolare la concentrazione del plasmide per garantire un adeguato volume di iniezione (TA 50 μg di DNA in 50 μL di PBS sterile; EDL 10 μg di DNA in 10 μL di PBS sterile) e campioni di aliquota.
  3. Programmare le impostazioni dell'elettroporatore utilizzando la ruota di selezione e premendo la ruota per scegliere i parametri come segue: Modalità - LV, Tensione - 12,5 V / mm (da regolare al momento dell'iniezione), lunghezza dell'impulso - 20 ms, numero di impulsi - 5, intervallo - 200 ms, polarità - unipolare.
  4. Anestetizzare i topi usando gas isoflurano. Posizionare i topi in una scatola di induzione con il 5% di isoflurano. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia con l'assenza del riflesso del pizzico della punta usando una pinza e ridurre l'isoflurano alla dose di mantenimento del 2%. Trasferire i topi in un cono nasale appropriato appoggiato su una piastra d'acqua circolante a 37 °C per il resto della procedura.
  5. Rimuovere i peli da entrambi gli arti posteriori usando piccoli tagliacapelli. Strofinare gli arti inferiori con alternanza 70% etanolo/betadina per sanificare l'area di iniezione.

2. Iniezione/elettroporazione TA

  1. Con il mouse in posizione supina, individuare il tendine TA visibile attraverso la pelle sul lato laterale della parte inferiore della gamba. Utilizzando una microsiringa da 50 μL con un ago staccabile da 30 G, inserire l'ago 1-2 mm superiore alla giunzione miotendinea con un angolo di 5° poco profondo fino a quando l'ago raggiunge l'estremità superiore del muscolo.
    NOTA: l'iniezione nel mezzo del muscolo è l'obiettivo.
  2. Premere lentamente lo stantuffo mentre si ritrae lentamente l'ago lungo il percorso di iniezione per erogare 50 μL di soluzione plasmidica. Il muscolo dovrebbe gonfiarsi.
  3. Impostare il timer per 1 minuto e misurare lo spessore della gamba al TA. A seconda delle dimensioni del mouse, questo può essere da 5-10 mm. Impostare gli elettrodi della pinza sullo spessore misurato e impostare la tensione dell'elettroporatore su 12,5 V/mm.
  4. Dopo 1 minuto, posizionare gli elettrodi della pinza attorno all'arto inferiore. Gli elettrodi devono essere aderenti ma non eccessivamente stretti. Erogare 5 impulsi a onda quadra, con una durata di 20 ms e intervalli di 200 ms (il muscolo dovrebbe contrarsi ad ogni impulso).
  5. Ripetete con l'arto alternativo utilizzando il vettore di controllo.
  6. Rimuovere il mouse dall'anestesia e lasciarlo recuperare su una piastra riscaldante impostata a 37 °C. Una volta recuperato, riporta il mouse nella sua gabbia.

3. Iniezione/elettroporazione EDL

  1. Con il mouse in posizione supina, individuare la cresta anteriore dell'osso della tibia visivamente e attraverso una delicata palpazione.
    1. Usando un bisturi, fare un'incisione superficiale attraverso la pelle sul lato laterale della cresta anteriore della tibia 5 mm inferiore al ginocchio a 2 mm superiore alla giunzione miotendinea TA.
    2. Usando piccole forbici, smussare la fascia, esponendo il muscolo TA.
    3. Ancora una volta, usando la dissezione smussata con le forbici, separare delicatamente il muscolo TA dalla tibia tirando il muscolo lateralmente, esponendo l'EDL. Piccole pinze curve possono essere utilizzate per mantenere l'AT libero dall'EDL durante la procedura.
  2. Utilizzando una microsiringa da 50 μL con un ago staccabile da 30 G, inserire l'ago nell'EDL longitudinalmente fino a quando l'ago raggiunge l'estremità superiore del muscolo.
  3. Premere lentamente lo stantuffo mentre si ritrae lentamente l'ago lungo il percorso di iniezione per iniettare 10 μL della soluzione plasmidica (il muscolo dovrebbe gonfiarsi).
  4. Impostare un timer per 1 minuto e misurare lo spessore della gamba all'EDL. A seconda delle dimensioni del mouse, questo può essere da 5-10 mm. Impostare gli elettrodi della pinza sullo spessore misurato e impostare la tensione dell'elettroporatore su 12,5 V/mm.
  5. Dopo 1 minuto, posizionare gli elettrodi della pinza attorno all'arto inferiore. Gli elettrodi devono essere aderenti ma non eccessivamente stretti. Erogare 5 impulsi a onda quadra, con una durata di 20 ms e intervalli di 200 ms (il muscolo dovrebbe contrarsi ad ogni impulso).
  6. Chiudere l'incisione utilizzando suture di nylon monouso 4/0 non assorbibili.
  7. Ripeti con l'arto alternativo o lascia l'arto intatto come controllo assoluto.
  8. Rimuovere il mouse dall'anestesia e lasciarlo recuperare su una piastra riscaldante impostata a 37 °C. Somministrare un analgesico sottocutaneo appropriato immediatamente dopo l'intervento chirurgico e 12-24 ore dopo l'intervento chirurgico. Una volta recuperato, riporta il mouse nella sua gabbia.
    NOTA: Studi precedenti hanno dimostrato un deficit di contrattilità muscolare nel TA immediatamente dopo l'elettroporazione e che il recupero contrattile avviene nel corso di 3 giorni13,15. Per questo motivo, l'analisi dei muscoli TA ed EDL per l'istologia, l'espressione proteica o la contrattilità muscolare viene condotta 3-10 giorni dopo l'elettroporazione. L'espressione prolungata di EGFP è stata osservata fino a 3 settimane dopo la procedura13.

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Representative Results

L'elettroporazione per facilitare il trasferimento genico nel muscolo scheletrico è una tecnica utile utilizzata per valutare i cambiamenti nella fisiologia muscolare. Abbiamo dimostrato una procedura dettagliata e passo-passo per realizzare un trasferimento genico efficiente sia nei muscoli TA che EDL. Le differenze nell'efficienza di trasfezione si verificano a causa di una serie di variabili. Tra queste variabili ci sono i parametri di elettroporazione (impulsi, tensione, durata dell'impulso, ecc.), La dimensione del costrutto genico e la concentrazione / volume di DNA iniettato. Abbiamo precedentemente dimostrato che i parametri di elettroporazione di 5 impulsi a 125 V / cm, con una durata di 20 ms separati da intervalli di 200 ms, sono sufficienti per realizzare un efficiente trasferimento genico nel TA14. Dimostriamo anche nel presente studio che l'iniezione / elettroporazione del DNA non causa la perdita di contrattilità muscolare nell'EDL 3 giorni dopo la sperimentazione.

Per visualizzare il trasferimento genico, un costrutto pcDNA3-EGFP o pcDNA3 (controllo) è stato elettroporato nel muscolo TA o EDL del topo. 3 giorni dopo la procedura, l'TA o l'EDL sono stati accuratamente sezionati, posti in mezzi a temperatura di taglio ottimale (OTC) e congelati a scatto in isopenttano raffreddato con azoto liquido (2-metilbutano), come precedentemente descritto 14,17,18,19. Sezioni muscolari da 10 μm sono state ottenute utilizzando un criostato prelevato dalla pancia centrale di ciascun muscolo. Le sezioni sono state poi incubate in paraformaldeide all'1% per 5 minuti, seguite da lavaggi di 3-5 minuti in PBS. Le sezioni sono state poi incubate in agglutinina di germe di grano coniugata a Texas Red diluita 1:100 in PBS per 90 minuti al buio. Le sezioni sono state nuovamente lavate in PBS 3 volte per 5 minuti ciascuna. Le sezioni muscolari sono state quindi coperte in supporti di montaggio acquosi e fotografate nella lunghezza d'onda di 594 nm (rossa) per visualizzare le singole fibre muscolari e nella lunghezza d'onda di 480 nm per rilevare la GFP (Figura 1A). I muscoli di controllo iniettati con pcDNA3 sono stati ripresi in entrambi i canali con le stesse impostazioni di esposizione per controllare la potenziale autofluorescenza. I muscoli iniettati/elettroporati con EGFP hanno mostrato fibre verdi positive, dimostrando l'assorbimento del costrutto pcDNA3-EGFP, mentre i muscoli iniettati/elettroporati con pcDNA3 (controllo) non hanno mostrato fibre verdi positive. Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che l'area della sezione trasversale della miofibra non è compromessa dall'espressione della GFP confrontando le fibre GFP positive (verde) con le fibre che esprimono la GFP (nero) all'interno delle stesse sezioni muscolari 4,6,19. Quando viene ripreso con un ingrandimento inferiore, l'efficienza di trasfezione muscolare EDL viene visualizzata attraverso la comparsa di fibre verdi (positive) rispetto alle fibre nere (negative) (Figura 1B). L'efficienza di trasfezione con questa procedura è stata del 56,6% ± del 4,7%, misurata in 3 muscoli EDL. Questi dati mostrano che l'iniezione e l'elettroporazione del muscolo TA è sufficiente per un efficiente trasferimento genico. Inoltre, l'iniezione e l'elettroporazione dell'EDL provocano un assorbimento efficiente dei costrutti genici.

Uno strumento importante per la valutazione della fisiologia del muscolo scheletrico è la misurazione della contrattilità muscolare. Precedenti ricercatori hanno dimostrato che la contrattilità dell'AT misurata in situ può essere compromessa precocemente dopo l'iniezione e l'elettroporazione dell'arto posteriore13. Per verificare se la contrattilità EDL è compromessa dopo l'iniezione e l'elettroporazione, abbiamo esposto chirurgicamente l'EDL, iniettato con pcDNA3-EGFP o costrutto ed elettroporato l'arto posteriore. Come controllo, l'arto alternativo è stato lasciato intatto per il confronto. I topi sono stati sottoposti a eutanasia 3 giorni dopo e la contrattilità muscolare intera dell'EDL è stata misurata utilizzando la stimolazione del campo in un bagno fisiologico, come descritto in precedenza 14,19,20,21. In breve, l'EDL è stato sezionato e i tendini sono stati legati tramite sutura di seta 4/0 a ganci in acciaio inossidabile e sospesi tra un trasduttore di forza e una base statica. I muscoli sono stati immersi nel tampone Tyrode, che è una soluzione fisiologica da bagno (121 mM NaCl, 5,0 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 24 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA, 5,5 mM glucosio) e bollati con ossigeno al 100% durante la procedura. La contrazione muscolare è stata stimolata utilizzando elettrodi di platino per fornire uno stimolo sopramassimale. La lunghezza ottimale del muscolo (Lo) è stata regolata per ottenere la massima forza all'inizio della procedura. La relazione forza-frequenza è stata determinata utilizzando frequenze di stimolazione comprese tra 1-150 Hz (impulsi di 0,5 ms a tensione sovramassimale). Al muscolo è stato permesso di rilassarsi per 3 minuti tra ogni stimolazione. Dopo che la procedura di stimolazione è stata completata, sono stati misurati il peso e la lunghezza del muscolo. La forza specifica è stata calcolata normalizzando la forza assoluta all'intera area della sezione trasversale muscolare, che viene calcolata come il peso diviso per la lunghezza e utilizzando la costante di densità muscolare precedentemente determinata (1,056 kg / m-3) 21. Abbiamo dimostrato che gli EDL rappresentativi iniettati ed elettroporati hanno risposte tetaniche simili a 100 Hz rispetto ai muscoli di controllo non iniettati o elettroporati (Figura 2A e Figura 2B). Abbiamo scoperto che la forza tetanica muscolare, la forza tetanica specifica, il tempo di massima tensione e il tempo di rilassamento di metà non erano compromessi nell'EDL iniettato ed elettroporato rispetto al controllo intatto (Tabella 1). I nostri dati dimostrano che l'espressione proteica che influenza la contrattilità può essere modulata utilizzando l'elettroporazione nell'EDL senza causare effetti avversi.

Figure 1
Figura 1: L'elettroporazione di pcDNA3-EGFP è sufficiente per l'assorbimento del DNA nei muscoli TA ed EDL. A) Sezioni trasversali rappresentative da controlli TA ed EDL (iniettate con vettore di controllo ed elettroporate 125 V/cm) e GFP (iniettate con pcDNA3-EGFP ed elettroporate 125 V/cm). Scala bar 50 μm. B) Sezione trasversale rappresentativa dell'EDL che dimostra l'efficienza della trasfezione. Barra della scala 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: L'iniezione e l'elettroporazione non compromettono la funzione muscolare. Curve di forza tetaniche rappresentative a 100 Hz da A) EDL non iniettato/elettroporato (controllo) e B) EDL iniettato/elettroporato (GFP). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Controllo (n=3) GFP (n=3) valore p
FO (g) 34.13 ± 1.15 35,87 ± 1,55 0.1918
sFO (kN/m2) 691,56 ± 45,80 660,00 ± 33,61 0.3917
TTP (sec) 0,249 ± 0,0203 0,247 ± 0,0197 0.9084
RT1/2 (sec) 0,035 ± 0,0035 0,033 ± .0031 0.6458
Controllo -non iniettato/non elettroporato; GFP-iniettato con pcDNA3-EGFP ed elettroporato. I valori sono medi ± SD. p=0,05 considerati significativi. F0- Raw Tetanic Force a 100Hz, sF 0-Tetanic Specific Force a 100Hz, TTP- Time to Peak a 1Hz, RT1/2- Tempo a metà rilassamento a 1Hz.

Tabella 1: Contrattilità muscolare intera da controllo rispetto a EDL elettroporati. Tabella che mostra che diversi parametri di forza muscolare non sono compromessi negli EDL iniettati / elettroporati (GFP) rispetto ai controlli non iniettati / non elettroporati. F0 = forza tetanica a 100 Hz, sF0 = forza tetanica specifica a 100 Hz, TTP = tempo di tensione di picco a 1 Hz, RT1/2 = tempo di rilassamento a metà. T-test dello studente; Significatività a p = 0,05. n = 3.

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Discussion

Il trasferimento genico in vivo nel muscolo scheletrico potenziato dall'elettroporazione è uno strumento utile e relativamente semplice per modulare l'espressione proteica nel muscolo. Abbiamo mostrato i passaggi necessari per ottenere un trasferimento genico efficiente nei muscoli EDL e TA e dimostrato che la misurazione della contrattilità dell'EDL è praticabile seguendo la procedura. Questa tecnica non richiede vettori virali più complicati e consente il confronto trasfettato e non trasfettato dell'area della sezione trasversale della fibra muscolare in un singolo muscolo. Una limitazione a questa procedura è che l'efficienza di assorbimento del costrutto non era completa e alcune miofibre rimanevano non trasfettate.

Le procedure discusse non si limitano all'elettroporazione dei vettori di espressione. Abbiamo precedentemente dimostrato che il knockdown delle proteine può essere ottenuto seguendo le stesse procedure, ma utilizzando costrutti di siRNA o shRNA in vivo14. Inoltre, i costrutti reporter possono essere utilizzati per misurare l'attività trascrizionale dei geni bersaglio 2,4,22. Questi strumenti consentono la manipolazione di più proteine contemporaneamente in un singolo muscolo scheletrico, dando anche allo sperimentatore la possibilità di misurare facilmente i cambiamenti trascrizionali. Il muscolo scheletrico può anche essere co-trasfettato con un vettore di espressione o sh / siRNA e un reporter fluorescente. Gli studi hanno dimostrato che oltre il 95% delle fibre muscolari che occupano un vettore occuperanno anche un altro vettore23. Ciò è utile quando i costrutti con tag non sono validi. Esperimenti simili possono essere condotti in vari muscoli, tra cui il soleo, il gastrocnemio, il quadricipite e il flessore digitorum brevis, tra gli altri24. La procedura non è limitata ai topi. I ratti sono stati ampiamente utilizzati per il trasferimento genico muscolare, ma dovrebbero essere considerati cambiamenti nel volume di iniezione, nella concentrazione di DNA e nei parametri di elettroporazione. È importante sottolineare che l'efficienza del trasferimento genico diminuisce quando l'elettroporazione viene applicata a grandi aree e i muscoli più grandi possono richiedere iniezioni multiple24.

Gli animali post-trasferimento genico possono essere utilizzati per studiare una varietà di condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. I principali determinanti dell'efficacia di questa procedura da prendere in considerazione sono l'efficienza di trasfezione del costrutto desiderato e la durata dello studio. Mentre l'aumento dell'espressione proteica è stato osservato fino a 270 giorni dopo l'elettroporazione12, gli studi hanno dimostrato che c'è una riduzione dell'espressione nel tempo13,25. La semplicità e l'efficacia di questa procedura la rendono altamente applicabile allo studio della fisiologia del muscolo scheletrico.

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Disclosures

B.A.H. e D.L.W non rivendicano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Nessuno

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable) Ethicon 662G Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe Hamilton 80501 microsyringe
C57BLl/6NHsd mice Envigo 044 12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode BTX 45-0102 1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis Aurora Scientific 605A Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System BTX 45-0662 electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors Fine Science Tools 14088-10 Scissors for blunt dissection
Force Transducer Aurora Scientific 407A To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats Fine Science Tools 13010-12 Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector Fisher Scientific V79020 Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid Addgene 13031 Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps Fine Science Tools 11009-13 Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10 Becton Dickinson 37 1210 Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media VWR 25608-930 Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red Thermo-Fisher Scientific W21405 Membrane staining for muscle cross section

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Biologia Numero 182
Elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo
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Hain, B. A., Waning, D. L.… More

Hain, B. A., Waning, D. L. Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (182), e63916, doi:10.3791/63916 (2022).

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