Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы мыши

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63916
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

Summary

Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы является жизнеспособным методом модуляции экспрессии генов без ущерба для сократимости мышц у мышей.

Abstract

Транзиторная модуляция экспрессии генов в мышиных скелетных мышцах путем плазмидной электропорации является полезным инструментом для оценки нормальной и патологической физиологии. Сверхэкспрессия или нокдаун генов-мишеней позволяет исследователям манипулировать отдельными молекулярными событиями и, таким образом, лучше понимать механизмы, которые влияют на мышечную массу, мышечный метаболизм и сократимость. Кроме того, электропорация плазмид ДНК, которые кодируют флуоресцентные метки, позволяет исследователям измерять изменения субклеточной локализации белков в скелетных мышцах in vivo. Ключевая функциональная оценка скелетных мышц включает измерение сократимости мышц. В этом протоколе мы демонстрируем, что исследования сократимости целых мышц все еще возможны после инъекции плазмидной ДНК, электропорации и модуляции экспрессии генов. Целью этой учебной процедуры является демонстрация пошагового метода плазмидной электропорации ДНК в скелетные мышцы мыши для облегчения поглощения и экспрессии в миофибрах передней и разгибательной мышц большеберцовой кости, а также демонстрация того, что сократимость скелетных мышц не нарушается инъекцией и электропорацией.

Introduction

Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы in vivo является важным инструментом для оценки изменений в физиологии скелетных мышц и молекулярной сигнализации путем модуляции экспрессии генов в различных физиологических и патофизиологических условиях 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Экспериментальный перенос генов в скелетные мышцы был продемонстрирован еще в 1990 году Wolff et al., где как РНК, так и ДНК были успешно перенесены без электропорации, а экспрессия люциферазы поддерживалась в течение не менее 2 месяцев10. Относительно низкая эффективность трансфекции только при инъекции проблематична, и Айхара и Миядзаки продемонстрировали повышенный перенос генов с электропорацией в 1998 году путем электропорации конструкции pCAGGS-IL-5 в переднюю мышцу большеберцовой кости (TA) и измерения экспрессии IL-5 сыворотки11. С тех пор во многих исследованиях изучалась эффективность различных концентраций ДНК, объемов и параметров электропорации для обеспечения максимальной эффективности переноса генов. Mir et al. проверили различные параметры электропорации, включая напряжение, число импульсов, продолжительность и частоту импульса, а также концентрацию ДНК, и определили, что большее напряжение, число импульсов и концентрация ДНК способствовали увеличению эффективности электропорации12. Основным предостережением к высокому электропорационному напряжению является то, что, хотя оно способствует увеличению поглощения ДНК миофибрами, оно также вызывает повреждение мышц, что может сбить с толку результаты. Schertzer et al. показали, что электропорация при 200 В вызывала повреждение примерно у 50% миофибров через 3 дня после электропорации, тогда как только 10% миофибров были повреждены при 50 В13. Мы приняли во внимание переменные, влияющие на эффективный перенос ДНК по сравнению с повреждением мышц, и обнаружили, что напряжение 125 В на сантиметр ширины суппорта достаточно для достижения эффективного переноса генов.

Анализ площади поперечного сечения мышечного волокна и сократимости всей мышцы после электропорации является важным аспектом метода измерения изменений размера и функции мышц из-за модуляции генов. Мы и другие ранее продемонстрировали, что электропорация контрольных векторов сама по себе не вызывает уменьшения площади миофибры. Конструкция зеленого флуоресцентного белка (EGFP) была полезным флуоресцентным индикатором трансфекции ДНК в этих исследованиях13,14. Ряд исследований исследовали сократимость ТА in situ после электропорации и обнаружили различные результаты. Одно исследование показало, что электропорация 75 В/см вызвала около 30% снижения тетановой силы через 3 дня после электропорации, а через 7 дней после электропорации тетаническая сила вернулась к контрольному уровню, в то время как электропорация 50 В/см не ставила под угрозу силу13,15. Другое исследование показало, что была 30% потеря тетанической силы через 3 ч после электропорации 180 В / см, которая восстановилась до фиктивных уровней силы через 7 дней16.

В следующей подробной процедуре мы демонстрируем инъекцию и электропорацию плазмиды PCDNA3-EGFP в мышцах ТА и разгибателя digitorum longus (EDL) мышей. Мы также демонстрируем, что этот метод не влияет на сократимость всей мышцы EDL. Цель состоит в том, чтобы продемонстрировать эффективное поглощение плазмид в миофибрах, не вызывая потери функции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты с использованием животных проводились в Медицинском колледже штата Пенсильвания, одобрены Комитетом по институциональным уходу и использованию животных Университета штата Пенсильвания и проводились в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 года и последующих поправках к ней. Для этой процедуры использовались 12-недельные самки мышей C57BL/6. Все хирургические инструменты были автоклавированы для стерильности перед экспериментами.

1. Препарат для инъекций/электропорации ТА и ЭДЛ

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти этапы идентичны для приготовления инъекций/электропорации ТА и ЭДЛ.

  1. Плазмиды очищения экспрессии до концентрации 1 мкг/мкл, разбавленной в стерильном PBS до начала эксперимента. Для этой процедуры использовался коммерчески доступный набор для очистки без эндотоксинов для очистки пустого вектора pcDNA3-EGFP (GFP) или pcDNA3 (контроль).
  2. Рассчитать концентрацию плазмиды для обеспечения адекватного объема инъекции (ТА 50 мкг ДНК в 50 мкл стерильного PBS; EDL 10 мкг ДНК в 10 мкл стерильных PBS) и аликвотные образцы.
  3. Запрограммируйте настройки электропоратора с помощью выбранного колеса и нажатием на колесо для выбора параметров следующим образом: Режим - НН, Напряжение - 12,5 В/мм (регулируется в момент впрыска), длина импульса - 20 мс, количество импульсов - 5, интервал - 200 мс, полярность - униполярная.
  4. Обезболивайте мышей, используя газ изофлуран. Поместите мышей в индукционную коробку с 5% изофлураном. Подтверждают хирургическую плоскость анестезии отсутствием рефлекса защемления пальца ноги с помощью щипцов и снижают изофлуран до 2% поддерживающей дозы. Переведите мышей в соответствующий носовой конус, опирающийся на пластину циркулирующей воды при 37 °C для остальной части процедуры.
  5. Удалите волосы с обеих задних конечностей с помощью небольших машинок для резания волос. Очистите нижние конечности чередованием 70% этанола / бетадина для дезинфекции области инъекции.

2. Впрыск ТА/электропорация

  1. Когда мышь находится в положении лежа, найдите сухожилие TA, видимое через кожу на боковой стороне голени. Используя микрошприц объемом 50 мкл со съемной иглой 30 Г, вставьте иглу на 1-2 мм выше миотендинозного соединения под небольшим углом 5°, пока игла не достигнет верхнего конца мышцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция в середину мышцы является целью.
  2. Медленно нажмите на плунжер, медленно втягивая иглу вдоль пути инъекции, чтобы доставить 50 мкл плазмидного раствора. Мышца должна набухать.
  3. Установите таймер на 1 мин и измерьте толщину ножки на ТА. В зависимости от размера мыши это может быть от 5-10 мм. Установите электроды суппорта на измеряемую толщину и установите напряжение электропоратора на 12,5 В/мм.
  4. Через 1 мин поместите электроды суппорта вокруг нижней конечности. Электроды должны быть плотными, но не чрезмерно плотными. Подайте 5 импульсов квадратной волны с длительностью 20 мс и интервалами 200 мс (мышца должна дергаться с каждым импульсом).
  5. Повторите с альтернативной конечностью, используя контрольный вектор.
  6. Выньте мышь из наркоза и дайте ей восстановиться на грелке, установленной на 37 °C. После выздоровления верните мышь в клетку.

3. Впрыск/электропорация EDL

  1. Когда мышь находится в положении лежа, найдите передний гребень большеберцовой кости визуально и с помощью мягкой пальпации.
    1. С помощью скальпеля делают неглубокий разрез через кожу на боковой стороне переднего гребня большеберцовой кости на 5 мм ниже колена на 2 мм выше миотендинозного соединения ТА.
    2. С помощью небольших ножниц тупое рассечение фасции, обнажая мышцу ТА.
    3. Опять же, используя тупое рассечение ножницами, отделите мышцу ТА от большеберцовой кости осторожно, потянув мышцу сбоку, обнажив EDL. Небольшие, изогнутые щипцы могут быть использованы для поддержания ТА чистым от EDL во время процедуры.
  2. Используя микрошприц объемом 50 мкл со съемной иглой 30 г, вставьте иглу в EDL продольно, пока игла не достигнет верхнего конца мышцы.
  3. Медленно нажмите на плунжер, медленно втягивая иглу вдоль пути инъекции, чтобы ввести 10 мкл плазмидного раствора (мышца должна набухать).
  4. Установите таймер на 1 мин и измерьте толщину ножки на EDL. В зависимости от размера мыши это может быть от 5-10 мм. Установите электроды суппорта на измеряемую толщину и установите напряжение электропоратора на 12,5 В/мм.
  5. Через 1 мин поместите электроды суппорта вокруг нижней конечности. Электроды должны быть плотными, но не чрезмерно плотными. Подайте 5 импульсов квадратной волны с длительностью 20 мс и интервалами 200 мс (мышцы должны дергаться с каждым импульсом).
  6. Закройте разрез одноразовыми нерассасывающимися нейлоновыми швами 4/0.
  7. Повторите с альтернативной конечностью или оставьте конечность нетронутой в качестве абсолютного контроля.
  8. Выньте мышь из наркоза и дайте ей восстановиться на грелке, установленной на 37 °C. Вводят соответствующий подкожный анальгетик сразу после операции и через 12-24 ч после операции. После выздоровления верните мышь в клетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие исследования показали дефицит сократимости мышц в ТА сразу после электропорации и то, что сократительное восстановление происходит в течение 3 дней13,15. По этой причине анализ мышц ТА и ЭДЛ на гистологию, экспрессию белка или сократимость мышц проводится через 3-10 дней после электропорации. Длительная экспрессия EGFP наблюдалась до 3 недель после процедуры13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Электропорация для облегчения переноса генов в скелетных мышцах является полезным методом, используемым для оценки изменений в физиологии мышц. Мы продемонстрировали подробную, пошаговую процедуру для достижения эффективного переноса генов как в мышцах ТА, так и в мышцах EDL. Различия в эффективности трансфекции возникают из-за ряда переменных. Среди этих переменных - параметры электропорации (импульсы, напряжение, длительность импульса и т. Д.), Размер конструкции гена и концентрация / объем вводимой ДНК. Ранее мы показали, что параметры электропорации 5 импульсов при 125 В/см с длительностью 20 мс, разделенной интервалами 200 мс, достаточны для эффективного переноса генов в TA14. Мы также демонстрируем в текущем исследовании, что инъекция / электропорация ДНК не вызывает потерю сократимости мышц в EDL через 3 дня после эксперимента.

Чтобы визуализировать перенос генов, pcDNA3-EGFP или pcDNA3 (контрольную) конструкцию электропорировали в мышцу TA или EDL мыши. Через 3 дня после процедуры TA или EDL тщательно рассекали, помещали в среду с оптимальной температурой резания (OTC) и замораживали в жидком азотоохлаждаемом изопентане (2-метилбутане), как описано ранее 14,17,18,19. 10 мкм мышечных участков были получены с помощью криостата, взятого из середины живота каждой мышцы. Затем секции инкубировали в 1% параформальдегиде в течение 5 мин, с последующим 3-5 мин промывкой в PBS. Затем секции инкубировали в агглютинине зародышей пшеницы, конъюгированном с texas Red, разбавленным 1:100 в PBS в течение 90 мин в темноте. Секции снова промывали в PBS 3 раза по 5 мин каждая. Затем мышечные участки обрезали в водных монтажных средах и визуализировали в длине волны 594 нм (красный) для визуализации отдельных мышечных волокон и в длине волны 480 нм для обнаружения GFP (рисунок 1A). Контрольные мышцы, вводимые pcDNA3, были визуализированы в обоих каналах с одинаковыми настройками экспозиции для контроля потенциальной автофлуоресценции. Мышцы, вводимые /электропорированные EGFP, показали положительные зеленые волокна, демонстрируя поглощение конструкции pcDNA3-EGFP, в то время как мышцы, введенные / электропорированные pcDNA3 (контроль), не показали зеленых положительных волокон. Мы и другие ранее показали, что область поперечного сечения миофибры не компрометируется экспрессией GFP, сравнивая положительные волокна GFP (зеленые) с не-GFP экспрессирующими волокнами (черными) в пределах тех же мышечных участков 4,6,19. При изображении при меньшем увеличении эффективность трансфекции мышц EDL визуализируется через появление зеленых волокон (положительных) по сравнению с черными волокнами (отрицательными) (рисунок 1B). Эффективность трансфекции с использованием этой процедуры составила 56,6% ± 4,7%, что было измерено в 3 мышцах EDL. Эти данные показывают, что инъекция и электропорация мышцы ТА достаточны для эффективного переноса генов. Кроме того, инъекция и электропорация EDL вызывает эффективное поглощение генных конструкций.

Важным инструментом для оценки физиологии скелетных мышц является измерение сократимости мышц. Предыдущие исследователи показали, что сократимость ТА, измеренная in situ, может быть нарушена на ранней стадии после инъекции и электропорации задней конечности13. Чтобы проверить, нарушена ли сократимость EDL после инъекции и электропорации, мы хирургически обнажили EDL, ввели ему pcDNA3-EGFP или конструкцию и электропорировали задний лимб. В качестве контроля альтернативная конечность была оставлена нетронутой для сравнения. Мыши были усыплены через 3 дня, а сократимость всей мышцы EDL была измерена с использованием полевой стимуляции в физиологической ванне, как описано ранее 14,19,20,21. Вкратце, EDL был рассечен, а сухожилия были привязаны шелковым швом 4/0 к крючкам из нержавеющей стали и подвешены между датчиком силы и статическим основанием. Мышцы купали в буфере Тирода, который представляет собой физиологический раствор для ванны (121 мМ NaCl, 5,0 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl2, 0,5 мМ MgCl2, 0,4 мМ2PO4, 24 мМ NaHCO3, 0,1 мМ ЭДТА, 5,5 мМ глюкозы) и пузырили со 100% кислородом на протяжении всей процедуры. Сокращение мышц стимулировали с помощью платиновых электродов для доставки супрамаксимального стимула. Оптимальная длина мышцы (Lo) была скорректирована таким образом, чтобы дать максимальную силу в начале процедуры. Соотношение сила-частота определяли с помощью частот стимуляции между 1-150 Гц (импульсы 0,5 мс при супрамаксимальном напряжении). Мышце давали расслабиться в течение 3 минут между каждой стимуляцией. После того, как процедура стимуляции была завершена, вес и длина мышцы были измерены. Удельная сила рассчитывалась путем нормализации абсолютной силы на всю площадь поперечного сечения мышцы, которая рассчитывается как вес, деленный на длину и использующий ранее определенную константу плотности мышц (1,056 кг/м−3)21. Мы показали, что репрезентативные инъекционные и электропорированные EDL имеют сходные тетанические реакции при 100 Гц по сравнению с контрольными неинъекционными или электропорированными мышцами (рисунок 2A и рисунок 2B). Мы обнаружили, что мышечная тетаническая сила, удельная тетаническая сила, время до пикового напряжения и половинное время релаксации не были скомпрометированы в инъекционном и электропорированном EDL по сравнению с нетронутым контролем (таблица 1). Наши данные показывают, что экспрессия белка, которая влияет на сократимость, может модулироваться с помощью электропорации в EDL, не вызывая побочных эффектов.

Figure 1
Рисунок 1: Электропорация pcDNA3-EGFP достаточна для поглощения ДНК в мышцах ТА и ЭДЛ. A) Репрезентативные поперечные сечения от элементов управления TA и EDL (впрыскиваемые с управляющим вектором и электропорированные 125 В/см) и GFP (инжекционные с pcDNA3-EGFP и электропорированные 125 В/см). Шкала 50 мкм. B) Репрезентативное поперечное сечение от EDL, демонстрирующее эффективность трансфекции. Шкала 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Инъекция и электропорация не ставят под угрозу функцию мышц. Репрезентативные тетанические кривые силы при 100 Гц от A) невпрыскиваемого/электропорированного EDL (контроль) и B) впрыскиваемого/электропорированного EDL (GFP). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Управление (n=3) GFP (n=3) p-значение
ФО (г) 34.13 ± 1.15 35.87 ± 1.55 0.1918
сФО (кН/м2) 691.56 ± 45.80 660.00 ± 33.61 0.3917
ТТП (с) 0.249 ± 0.0203 0.247 ± 0.0197 0.9084
RT1/2 (сек) 0,035 ± 0,0035 0,033 ± .0031 0.6458
Управление - неинъекционное/неэлектропорированное; ГФП-вводят с pcDNA3-EGFP и электропорируют. Значения являются средними ± SD. p=0,05 считается значимым. F0 - Необработанная тетаническая сила при 100 Гц, sF 0-Тетанская удельная сила при 100 Гц, TTP - Время достижения пика при 1 Гц, RT1/2 - Время до половины релаксации при 1 Гц.

Таблица 1: Сократимость всей мышцы от контроля по сравнению с электропорированными EDL. Таблица, показывающая, что различные параметры мышечной силы не скомпрометированы в инъекционных/электропорированных EDL (GFP) по сравнению с неинъекционными/неэлектропорированными контрольными группами. F0 = тетаническая сила при 100 Гц, sF0 = удельная тетаническая сила при 100 Гц, TTP = время до пикового напряжения при 1 Гц, RT1/2 = время полурелаксации. Студенческий t-тест; Значимость при p = 0,05. n = 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Перенос генов in vivo в скелетных мышцах, усиленный электропорацией, является полезным и относительно простым инструментом для модуляции экспрессии белка в мышцах. Мы показали шаги, необходимые для достижения эффективного переноса генов в мышцах EDL и TA, и продемонстрировали, что измерение сократимости EDL является жизнеспособным после процедуры. Этот метод не требует более сложных вирусных векторов и позволяет сравнивать трансфектированную и нетрансфектную область поперечного сечения мышечного волокна в одной мышце. Ограничением этой процедуры является то, что эффективность поглощения конструкции не была полной, и некоторые миофибры оставались нетрансфектированными.

Обсуждаемые процедуры не ограничиваются электропорацией векторов экспрессии. Ранее мы показали, что нокдаун белка может быть достигнут путем выполнения тех же процедур, но с использованием siRNA или shRNA конструирует in vivo14. Кроме того, репортерные конструкции могут быть использованы для измерения транскрипционной активности генов-мишеней 2,4,22. Эти инструменты позволяют манипулировать несколькими белками одновременно в одной скелетной мышце, а также дают исследователю возможность легко измерить транскрипционные изменения. Скелетные мышцы также могут быть котрансфектированы экспрессией или вектором sh/siRNA и флуоресцентным репортером. Исследования показали, что более 95% мышечных волокон, которые занимают один вектор, также будут занимать другой вектор23. Это полезно, когда помеченные конструкции нежизнеспособны. Подобные эксперименты могут быть проведены в различных мышцах, включая камбалу, икроножную крупу, квадрицепсы и сгибатель digitorum brevis, среди прочих24. Процедура не ограничивается мышами. Крысы широко использовались для переноса мышечных генов, но следует учитывать изменения в объеме инъекций, концентрации ДНК и параметрах электропорации. Важно отметить, что эффективность переноса генов снижается, когда электропорация применяется к большим площадям, и более крупные мышцы могут потребовать многократных инъекций24.

Животные постгенного переноса могут быть использованы для изучения различных физиологических и патофизиологических состояний. Основными детерминантами эффективности этой процедуры, которые следует учитывать, являются эффективность трансфекции желаемой конструкции и продолжительность исследования. В то время как повышенная экспрессия белка наблюдалась в течение 270 дней после электропорации12, исследования показали, что со временем наблюдается снижение экспрессии 13,25. Простота и эффективность этой процедуры делают ее весьма применимой для изучения физиологии скелетных мышц.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

B.A.H. и D.L.W не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgments

Никакой

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable) Ethicon 662G Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe Hamilton 80501 microsyringe
C57BLl/6NHsd mice Envigo 044 12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode BTX 45-0102 1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis Aurora Scientific 605A Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System BTX 45-0662 electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors Fine Science Tools 14088-10 Scissors for blunt dissection
Force Transducer Aurora Scientific 407A To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats Fine Science Tools 13010-12 Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector Fisher Scientific V79020 Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid Addgene 13031 Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps Fine Science Tools 11009-13 Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10 Becton Dickinson 37 1210 Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media VWR 25608-930 Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red Thermo-Fisher Scientific W21405 Membrane staining for muscle cross section

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
  2. Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
  3. Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
  4. Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
  5. Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
  6. Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
  7. Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
  8. Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
  9. Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
  10. Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
  11. Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
  12. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  13. Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
  14. Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
  15. Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
  16. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
  17. Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
  18. Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
  19. Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
  20. Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
  21. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732 (2015).
  22. Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
  23. Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
  24. Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  25. Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).

Tags

Биология выпуск 182
Электропорация плазмидной ДНК в скелетные мышцы мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hain, B. A., Waning, D. L.… More

Hain, B. A., Waning, D. L. Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (182), e63916, doi:10.3791/63916 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter