Summary
Ontworpen flappen vereisen een geïntegreerd functioneel vasculair netwerk. In dit protocol presenteren we een methode voor het fabriceren van een 3D-geprinte weefselflap met een hiërarchisch vasculair netwerk en de directe microchirurgische anastomosen naar de dijbeenslagader van ratten.
Abstract
Engineering implanteerbare, functionele, dikke weefsels vereist het ontwerpen van een hiërarchisch vasculair netwerk. 3D-bioprinting is een technologie die wordt gebruikt om weefsels te creëren door laag op laag printbare biomaterialen, bioinks en cellen op een ordelijke en automatische manier toe te voegen, waardoor zeer ingewikkelde structuren kunnen worden gecreëerd die traditionele weefselmanipulatietechnieken niet kunnen bereiken. 3D-bioprinting is dus een aantrekkelijke in vitro benadering om de inheemse vasculatuurcomplexstructuur na te bootsen, variërend van millimetrische vaten tot microvasculaire netwerken.
Vooruitgang in 3D-bioprinting in granulaire hydrogels maakte de extrusie met hoge resolutie van extracellulaire matrixgebaseerde bioinks met lage viscositeit mogelijk. Dit werk presenteert een gecombineerde 3D-bioprinting en op offervorm gebaseerde 3D-printbenadering voor het fabriceren van gemanipuleerde gevasculariseerde weefselflappen. 3D-bioprinting van endotheel- en ondersteuningscellen met behulp van recombinant collageen-methacrylaatbioink in een gelatine-ondersteuningsbad wordt gebruikt voor de fabricage van een zelfgeassembleerd capillair netwerk. Deze geprinte microvasculatuur is geassembleerd rond een mesoschaalvatachtige poreuze steiger, vervaardigd met behulp van een opofferende 3D-geprinte mal, en is bezaaid met endotheelcellen.
Deze assemblage induceert het endotheel van het mesoschaalvat tot anastomose met het omliggende capillaire netwerk, waardoor een hiërarchisch vasculair netwerk ontstaat binnen een gemanipuleerde weefselflap. De gemanipuleerde flap wordt vervolgens direct geïmplanteerd door chirurgische anastomose in een heupslagader van een rat met behulp van een manchettechniek. De beschreven methoden kunnen worden uitgebreid voor de fabricage van verschillende gevasculariseerde weefselflappen voor gebruik in reconstructiechirurgie en vascularisatiestudies.
Introduction
Ernstige weefseldefecten worden veroorzaakt door traumatische verwondingen, aangeboren afwijkingen of ziekte, en de huidige gouden standaard voor de behandeling van deze defecten is door het gebruik van autologe transplantaten, gevasculariseerde weefselflappen en microvasculaire vrije flappen als weefselvervangers. Deze opties hebben echter de nadelen van beperkte donorplaatsweefsel en morbiditeit op de donorplaats1. Er is dus een groeiende vraag naar alternatieve weefselvervangers die kunnen worden gebruikt om deze defecten te corrigeren2. De dikte van de gemanipuleerde weefselconstructies wordt beperkt door de diffusie van voedingsstoffen en gassen naar de cellen, en daarom is een goed vasculair netwerk essentieel voor het genereren van grote, dikke en goed gevoede steigers.
Verschillende benaderingen zijn toegepast om de vascularisatie van gemanipuleerde implantaten te bevorderen3, waaronder de in vivo rekrutering van vasculaire ondersteuning van de gastheer, de levering van groeifactoren en cytokines in de steigers, de prevascularisatie van implantaten, het genereren van een perfuseerbaar vertakkend microvesselbed met behulp van micropatterningtechnieken4, het gebruik van opofferingsmaterialen voor vasculaire kanaal- / netwerkvorming5 , evenals het creëren van kanalen binnen 3D bioprinted constructen 5,6. Vascularisatie van dikke weefsels vereist de integratie van een hiërarchisch vasculair netwerk bestaande uit bloedvaten op macroschaal en microcapillaire schaal. De bloedvaten op macroschaal verdelen het bloed effectief door het hele construct en maken microchirurgische anastomosen met de bloedvaten van de gastheer mogelijk, terwijl de bloedvaten op microcapillaire schaal de diffusie van voedingsstoffen mogelijk maken.
Bioprinting heeft de afgelopen jaren veel aandacht gekregen vanwege de voordelen die het biedt ten opzichte van conventionele tissue engineering-methoden. Weefsels en organen zijn complexe en ingewikkelde 3D-objecten met een specifieke architectuur. 3D-bioprinting, met zijn vermogen om lagen biomaterialen in hoge resolutie af te zetten, maakt het mogelijk om complexe weefsel- en orgaanvervangers (bijv. Nier, long, lever) te creëren 7. Verschillende printtechnologieën zijn aangepast voor bioprinting, waaronder extrusie-gebaseerde, inkjet8, laser-assisted deposition 9,10 en stereolithografie-gebaseerde11,12 bioprinting. De op extrusie gebaseerde technologieën zijn afhankelijk van het extruderen van het materiaal door een mondstuk door druk uit te oefenen op het materiaalmassaoppervlak tegenover het mondstuk.
Free-form reversible embedding of suspended hydrogels (FRESH) is een bioprinttechniek13,14 waarbij gebruik wordt gemaakt van een granulair ondersteuningsmateriaal waarin het geëxtrudeerde materiaal wordt afgezet en op zijn plaats wordt gefixeerd door het steunbad. Het steunbad biedt mechanische ondersteuning voor de geëxtrudeerde, vooraf verknoopte bioink tot de crosslinking. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het steunbad het mogelijk maakt om materialen met een lage viscositeit te extruderen die hun vorm niet kunnen behouden na extrusie en vóór crosslinking15. Dit vergroot de pool van beschikbare materialen die als bioinks kunnen worden gebruikt.
Dit artikel presenteert een protocol voor het genereren van een gevasculariseerde flap die vasculatuur op microschaal en mesoschaal combineert. Om dit te bereiken, worden bioprinted, zelfassemblerende, microvasculaire netwerken gegenereerd in recombinant humaan collageenmethacrylaat (rhCollMA) hydrogel, dat vervolgens verbinding maakt met het binnenste van een grotere, implanteerbare, vasculaire steiger, wat resulteert in een volledig gemanipuleerde weefselflap16. Om een snelle en directe perfusie van gemanipuleerde weefsels tot stand te brengen, is een directe microchirurgische anastomose naar gastheervaten vereist. De vasculaire steiger heeft niet voldoende hechtsterkte om te worden geanastomoseerd met behulp van traditionele microchirurgische vaatwand hechting. Daarom beschrijven we een "manchet"17,18,19 methode om een anastomose te bereiken met de gemeenschappelijke dijbeenslagader van een rat. Bij deze methode worden de uiteinden van het vat vastgezet met omtreknaden, zonder dat de vaatwand hoeft te worden geperforeerd.
Hoewel het voorgestelde protocol is voorbereid om hiërarchische vasculatuur in de rhCollMA-omgeving te bestuderen, kan deze aanpak worden uitgebreid en toegepast op een verscheidenheid aan nieuwe toepassingen. Het protocol kan worden toegepast op het bioprinten van verschillende weefselspecifieke cellen in verschillende bioinks. Bovendien kunnen de geometrie en grootte van de constructies eenvoudig worden aangepast aan specifieke vereisten, zoals grote weefselreconstructie of biologische studies.
Protocol
Alle dierprocedures werden goedgekeurd en uitgevoerd onder toezicht van de Technion Pre-Clinical Research Authority (PCRA Technion, ethische goedkeuring nr. 058-05-20). Mannelijke Sprague-Dawley ratten (275-350 g) werden gebruikt voor deze studies. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Vasculaire steiger fabricage
- Maak een 3D-computermodel van de gewenste vasculaire steigervorm met behulp van CAD-software (computer-aided design) of download een 3D-bestand van een gewenste vasculaire structuur uit online repositories.
- Maak een cilinder met een binnendiameter van 0,9 mm, een buitendiameter van 2 mm en een hoogte van 18 mm. Voeg radiale fenestraties met een diameter van 0,22 mm toe naast de cilinderwand.
- Maak een mal voor de steiger met behulp van de 3D-ontwerpsoftware en exporteer deze als een . STL-bestand. Voeg vervolgens een trechter toe aan het ontwerp om het vullen van de mal later te vergemakkelijken.
- Importeer de . STL-bestand in de slicing-software voor de fused deposition modeling (FDM) 3D-printer. Snijd het model met een laaghoogte van 0,1 mm en exporteer het als .gcode of stuur het rechtstreeks naar de 3D-printer.
- 3D-print de mal op een FDM 3D-printer uitgerust met een 0,25 mm mondstuk, met behulp van in water oplosbaar buteen-diol vinylalcohol copolymeer (BVOH) filament. Bewaar de bedrukte mallen in een vacuümkamer tot gebruik.
LET OP: Vermijd het BVOH-filament met blote handen te hanteren, omdat het vochtgevoelig is. Bovendien wordt aanbevolen om het filament in een vacuümkamer op te slaan om blootstelling aan vocht te voorkomen. - Bereid een polymeeroplossing van een 1:1 mengsel van poly-L-melkzuur (PLLA) en polymelk-co-glycolzuur (PLGA) in 1,4-dioxaan.
- Weeg 350 mg PLLA en 350 mg PLGA af en breng over op een glazen injectieflacon van 20 ml.
- Meet 10 ml 1,4-dioxaan en breng over in de glazen injectieflacon met behulp van een glazen pipet. Voeg een kleine magnetische roerstaaf toe aan de glazen injectieflacon.
LET OP: 1,4-Dioxaan is een gevaarlijk organisch oplosmiddel. Gebruik geschikte persoonlijke veiligheidsuitrusting en werk in een zuurkast. - Plaats de glazen injectieflacon in een tot 70 °C verwarmd warmwaterbad en meng de inhoud een nacht totdat alle polymeren volledig zijn opgelost. Bewaar de oplossing in een luchtdichte glazen container tot gebruik.
- Vul de BVOH mallen met de PLLA:PLGA oplossing.
- Meet met behulp van een verdringerpipet 30 μL van de polymeeroplossing en vul de mal in.
OPMERKING: Het volume dat nodig is om de mal te vullen, verandert afhankelijk van het volume van het ontworpen vat. Blijf de polymeeroplossing toevoegen totdat de trechter van de mal volledig is gevuld. - Centrifugeer de mal op 100 × g gedurende 2 min. Vul de mal aan met nog eens 20 μL van de polymeeroplossing om een volledige vulling te garanderen.
- Meet met behulp van een verdringerpipet 30 μL van de polymeeroplossing en vul de mal in.
- Vries de gevulde mallen minstens 30 minuten in bij -80 °C om ervoor te zorgen dat alle polymeeroplossing bevriest. Verwijder het oplosmiddel uit de mallen door ze een nacht te lyofiliseren.
OPMERKING: De kleur van het polymeer in de mal moet na het vriesdroogproces van helder naar wit veranderen. - Om het opofferingsvormmateriaal te verwijderen, brengt u de mallen na het vriesdroogproces over naar een 5 L gedeïoniseerd waterbad onder zacht roeren. Vervang het water in het bad als het troebel wordt. Wanneer alle BVOH is opgelost, droogt u de steigers aan de lucht en bewaart u ze in een vacuümkamer tot gebruik.
2. De vasculaire steiger bedekken met fibronectine
- Desinfecteer de PLLA:PLGA vasculaire steigers door ze gedurende 30 minuten onder te dompelen in 70% ethanol.
- Was de steigers 3x 5 min met PBS.
- Bereid een verdunning van 50 μg/ml humaan fibronectine in PBS en bedek de steigers.
- Meng 500 μL fibronectineoplossing (1 mg/ml) met 9,5 ml PBS.
- Dompel de gedesinfecteerde vasculaire steigers onder in deze fibronectine-oplossing en incubeer ze bij 37 °C gedurende 60 minuten om eiwitadsorptie mogelijk te maken.
- Spoel na incubatie de steigers af met PBS om de ongebonden fibronectine te verwijderen. Bewaar deze gecoate steigers maximaal 1 week bij 4 °C.
3. rhCollMA bioink voorbereiding
- Bereid een fosfaatbuffer voor om de zure rhCollMA bioinkvoorraad te neutraliseren.
- Bereid een 10x voorraad fosfaatbuffer voor door 5,495 g Na2HPO4, 1,55 g NaH2PO4 en 30 mg NaCl op te lossen in 50 ml gedeïoniseerd water.
- Bereid een 10-voudige verdunning van de 10x voorraadfosfaatbuffer door 1 deel van 10x fosfaatbuffer te combineren met 9 delen gedeïoniseerd water.
- Combineer 900 μL stock rhCollMA-oplossing met 100 μL 10x fosfaatbuffer om de zure rhCollMA-oplossing te neutraliseren.
- Verdun de geneutraliseerde rhCollMA-oplossing tot de gewenste concentratie van 10 mg / ml door deze te mengen met de vereiste hoeveelheid 1x fosfaatbuffer.
OPMERKING: De voorraadconcentratie van rhCollMA varieert tussen partijen. Daarom zal het volume van 1x fosfaatbuffer dat nodig is om de gewenste concentratie te bereiken variëren. - Bereid de porogene-foto-initiatoroplossing (PEO-LAP) in combinatie met de verdunde neutrale rhCollMA.
- Bereid een 1,6% (g/v) oplossing van poly(ethyleenoxide) (PEO) in fenol roodvrije DMEM door 160 mg PEO op te lossen in 10 ml DMEM.
- Voeg 20 mg lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP) toe aan deze oplossing om 0,2% (g/v) LAP in de oplossing te verkrijgen. Bedek vanaf dit punt de oplossing met aluminiumfolie of bewaar het op een donkere plaats om het tegen licht te beschermen.
- Steriliseer de PEO-LAP-oplossing door deze door een filter van 0,22 μm te laten lopen. Bewaar deze oplossing maximaal 1 week bij 4 °C.
- Meng voorafgaand aan het bioprinten de verdunde neutrale rhCollMA-oplossing met de PEO-LAP-oplossing in een verhouding van 1:1 om de uiteindelijke bioinkoplossing te verkrijgen. Gebruik pipetteren, in plaats van een vortex, om de oplossingen te mengen en tegelijkertijd luchtbellen te vermijden.
- Als er veel bubbels in de oplossing worden geïntroduceerd, centrifugeer het dan op 2.000 × g gedurende 30 s. Meng na centrifugeren de bioinkoplossing opnieuw om homogeniteit te garanderen.
4. Granulaire ondersteuning badvoorbereiding
- Bereid gelatinekorrelig dragermateriaal.
- Verdeel in een biologische veiligheidskast de inhoud van een buis van 2 g gelyofiliseerd steunmateriaal in twee steriele conische buizen van 50 ml, die elk ongeveer 1 g bevatten.
- Voeg 40 ml koud (4 °C) fenolroodvrij DMEM toe aan elke buis en vortex krachtig totdat al het gelyofiliseerde steunmateriaal is opgelost.
- Laat de resulterende drijfmest op 4 °C zitten om het steunmateriaal te laten rehydrateren.
- Ontgas het steunmateriaal in een vacuümkamer gedurende 30 minuten om bellen te verminderen.
- Centrifugeer het steunmateriaal op 2.000 × g gedurende 5 minuten. Zorg ervoor dat het materiaal zich aan de onderkant van de buis bevindt en dat het supernatant helder is.
- Aspirateer het supernatant, terwijl je voorzichtig bent om het ondersteunende materiaal aan de onderkant niet te aspirateren.
OPMERKING: Het ondersteuningsmateriaal mag niet stromen terwijl de buis schuin staat na het verwijderen van het supernatant. Als het materiaal stroomt, centrifugeer het dan opnieuw met dezelfde instellingen, maar zonder nieuw supernatant toe te voegen.
- Breng ongeveer 4 ml van het voorbereide, verdichte steunmateriaal over in elke put van een 12-wellsplaat met behulp van een pipet met positieve verplaatsing. Tik op de putplaat op een hard oppervlak om het steunmateriaal gelijkmatig in de put te verspreiden.
OPMERKING: Het minimaal aanbevolen volume aan ondersteuningsmateriaal is 3x het volume van het construct dat erin wordt afgedrukt. - Plaats de putplaat met het steunmateriaal op een afgekoeld bioprinterstadium of bij 4 °C tot het gebruik ervan om te voorkomen dat de gelatinedeeltjes smelten.
5. Opname van endotheelcellen en ondersteunende cellen met de bioink
- Bereid endotheelcelmedium volgens de instructies van de fabrikant door het basale medium te mengen met de overeenkomstige mediumkitcomponent, inclusief een antibioticumoplossing, foetaal runderserum en endotheelcelgroeisupplementen.
- Bereid tandpulp stamcelmedium door 500 ml dmem met een laag glucosegehalte, 58 ml foetaal runderserum, 5,8 ml niet-essentiële aminozuren (NEAA), 5,8 ml glutaminevervanger, 5,8 ml 1 M HEPES en 5,8 ml penicilline-streptomycine-nystatine-oplossing te combineren.
- Bereid een suspensie met 2 × 106 ZsGreen1-expressing human adipose microvasculaire endotheelcellen (HAMEC-ZsGreen1) en 6 × 106 tandpulpstamcellen (DPSC's) in 10 ml endotheelcelmedium.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 200 × g gedurende 4 minuten om een celpellet te verkrijgen. Aspirateer het supernatant medium.
- Resuspendeer de celpellet in 1 ml rhCollMA bioink die eerder is bereid (met PEO-LAP) om een bioink te verkrijgen met een totale celconcentratie van 8 × 106 cellen per 1 ml bioink.
LET OP: Nadat u de bioink met de cellen hebt gecombineerd, gaat u onmiddellijk verder met de volgende stap. Als cellen lange tijd in de suspensie worden achtergelaten, zullen de cellen naar de bodem van de buis zinken en zal hun levensvatbaarheid verslechteren. Voor experimenten waarbij geen cellen betrokken zijn, slaat u stap 5.1-5.5 over of neemt u fluorescerende kralen op met de bioink in plaats van cellen voor verbeterde microscopische visualisatie van de afgedrukte constructies. - Breng het cellen-bioink mengsel over in printcartridges.
- Plaats een naald met een inwendige diameter van 0,22 mm op een amberkleurige printcartridge van 3 ml en plaats de cartridge in een conische buis van 50 ml.
- Breng 1 ml van het cellen-bioinkmengsel over naar de printcartridge door deze vanaf de bovenkant te vullen met behulp van een pipet met positieve verplaatsing om bubbels te verminderen.
- Installeer de printcartridge in het juiste gereedschap bij de bioprinter.
6. Bioprinten van microvasculaire netwerken met rhCollMA bioink
- Maak een 3D CAD-ontwerp voor het biogeprinte microvasculaire netwerk.
- Schets een 2D-patroon van een vierkant van 4 mm met een cirkelvormig kanaal met een diameter van 2 mm in het midden. Extrudeer de schets met 4 mm om een kubus van 4 mm x 4 mm x 4 mm met een centraal kanaal te verkrijgen. Exporteer dit object als een . STL-bestand.
- Importeer een 12-well plaat. STL-sjabloon in het solide modelleringstabblad in de bioprinter-snijsoftware en plaats deze in het aangewezen gebied van het virtuele printbed.
- Importeer de . STL-bestand van de kubusvorm in het solide modelleringstabblad in de bioprinter-snijsoftware. Klik op het selectievakje Externe slicer gebruiken | slicer configureren in de sectie objecteigenschappen . Kies in het pop-upvenster een rechtlijnig patroon voor het vulpatroon en typ 30% in de vuldichtheid. Klik op accepteren.
- Plaats een kopie van de kubusvorm in elk gewenst virtueel putje door op de kubus te klikken en deze met de muis te verplaatsen.
- Maak nieuwe materiaalinstellingen voor rhCollMA bioink in het tabblad materialen van de bioprinter snijsoftware door op de knop Materiaal toevoegen te klikken. Kies de afdrukinstellingen van het materiaal. Typ voor druk 2 psi in het overeenkomstige vak. Typ voor snelheid 20 mm/s in het overeenkomstige vak.
OPMERKING: Elk bioinkmateriaal heeft zijn eigen verschillende afdrukinstellingen die kunnen worden opgeslagen in de materialenlijst in de toepassing. - Wijs de waarden voor de lijnbreedte en lijnhoogte toe aan 0,24 mm en de versnellingswaarde aan 400 mm/s2 door deze waarden in de overeenkomstige vakken te typen.
- Klik op het tabblad effen modellering op het kubusobject en klik vervolgens op het rhCollMA-materiaal in de sectie materialen om het toe te wijzen aan de kubusvorm. Klik op het tabblad bioassemblage op de knop Afdruktaak verzenden om de afdruktaak naar de bioprinter te verzenden.
- Plaats de printcartridge geladen met de cellulaire bioink in het 3 ml ambient pneumatische doseergereedschap van de 3D extrusie-gebaseerde bioprinter.
- Stel de temperatuur van het printbed in op 4 °C door op de koelknop te klikken onder het tabblad Controle-verwarming/koeling in het interfacescherm van de bioprinter. Plaats de plaat met het steunbad op het printerbed.
OPMERKING: De instellingen van het materiaal voor de afdrukdruk en -snelheid kunnen veranderen als gevolg van verschillen in omgevingstemperatuur of variabiliteit van bioinkbatches. Op koudere dagen is bijvoorbeeld een hogere druk of lagere snelheid nodig om dezelfde hoeveelheid materiaal te extruderen. - Klik op het tabblad Afdrukken op het interfacescherm van de bioprinter op de afdruktaak die in stap 6.7 is verzonden. en klik op start | ga om de afdruktaak te starten.
- Stel na het printen de putplaat gedurende 30 s bloot aan een lichtbron van 405 nm met een intensiteit van 3 mW/cm2 om de crosslinking van de rhCollMA bioink te initiëren.
- Incubeer na het crosslinken de putplaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende ten minste 20 minuten totdat al het steunbad smelt.
- Adem het vloeibare steunbad voorzichtig aan en vervang het door endotheelcelmedium. Incubeer de constructen bij 37 °C en 5% CO2 tot gebruik in verdere stappen.
OPMERKING: Vanwege de samentrekking van de constructie na het afdrukken, wordt aanbevolen om de assemblage stap 7 op dezelfde dag uit te voeren als stap 6.
7. Het samenstellen van het bioprinted microvasculaire netwerk met de vasculaire scaffold om de gemanipuleerde gevasculariseerde flap te verkrijgen
- Plaats onmiddellijk na het verwijderen van het biogeprinte microvasculaire netwerk een met fibronectine gecoate PLLA:PLGA vasculaire steiger in het hoofdkanaal van de biogeprinte structuur.
- Incubeer de geassembleerde constructies bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 2 dagen.
- Bekleed het lumen van de vasculaire steiger met endotheelcellen.
- Bereid een celsuspensie van tdTomato-tot expressie brengende menselijke vetweefselmicrovasculaire endotheelcellen (HAMEC-tdTomato) in een concentratie van 1 × 107 cellen / ml.
- Plaats een druppeltje van 20 μL van deze celsuspensie op een hydrofoob oppervlak (d.w.z. een niet-weefselkweek [nonTC] schaal van 10 cm).
- Plaats de vasculaire steigers voorzichtig bovenop de druppel, zodat het lumen van de steiger aan het ene uiteinde contact maakt met de celdruppel.
- Aspirateer de druppel van het tegenovergestelde uiteinde van de steiger (d.w.z. het uiteinde dat geen contact maakt met de druppel) en vul het lumen met de celsuspensie.
- Plaats de gezaaide steiger in een microcentrifugebuis en plaats deze gedurende 60 minuten in een rotator in een bevochtigde incubator. Breng vervolgens de steiger over in een 12-well plaat en voeg 2 ml endotheelcelmedium toe.
- Kweek de ontworpen flappen gedurende 7 dagen, terwijl het medium om de 2 dagen wordt vervangen door vers endotheelcelmedium.
8. Confocale microscopie en immunofluorescentiekleuring van de gemanipuleerde flappen
- Na 4 dagen en 7 dagen cultuur, voer live-cell imaging van de geassembleerde steigers uit met behulp van een confocale laserscanmicroscoop.
- Definieer de fluorescentiekanalen voor ZsGreen1 en tdTomato fluorescerende eiwitten op de microscoop beeldacquisitiesoftware.
- Kies een 5x/0.16 objectieflens met 0,5x zoom (pixelgrootte 5 μm) en definieer een Z-stack met 22 plakjes met een dikte van elk 41 μm.
- Definieer een scan van 3 x 2 tegels naar afbeelding en leg de hele constructie vast.
- Pas de laserintensiteit en versterkingswaarden aan om een duidelijk fluorescerend signaal te verkrijgen zonder verzadiging en minimale achtergrond en de beelden te verkrijgen.
- Voer een projectie met maximale intensiteit uit van de verworven Z-stack om een enkel 2D-beeld te verkrijgen met behulp van de microscoopbeeldacquisitiesoftware of vergelijkbare beeldanalysesoftware.
- Voer een hogere vergrotingsafbeelding uit van een interessant gebied.
- Schakel over naar een 10x/0.3 objectieflens met 0,5 zoom (pixelgrootte 1,25 μm) en definieer een Z-stack met 9 plakjes diktes van 41 μm.
- Voer stappen 8.2.-8.3 uit.
- Na 7 dagen kweken, bevestig de ontworpen flappen door ze gedurende 20 minuten onder te dompelen in 4% paraformaldehyde.
- Was de constructen 3x 5 min met PBS.
- Voeg 0,3% (v/v) Triton-X in PBS toe aan de constructen en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te permeabiliseren.
- Was de constructen 3x 5 min met PBS.
- Bereid een blokkerende oplossing door 5% (w/v) runderserumalbumine (BSA) in PBS op te lossen. Voeg de blokkeeroplossing toe aan de ontworpen flappen en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Bereid de primaire antilichaamoplossing door het anti-gladde spieractine (anti-SMA) 1:50-antilichaam van muizen te verdunnen in de 5% BSA-oplossing die eerder is bereid om de SMA-tot expressie brengende ondersteuningscellen te kleuren.
- Incubeer de steigers in de primaire antilichaamoplossing 's nachts bij 4 °C.
- Wassen 3x 5 min met PBS.
- Bereid de secundaire antilichaamoplossing door Cy3-geconjugeerde geitenantimuis IgG 1:400-antilichaam en 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 2,5 μg/ml) in PBS te verdunnen.
- Breng de secundaire antilichaamoplossing aan op de steigers en incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur.
- Wassen 3x 5 min met PBS.
- Bewaar de constructies bij 4 °C in PBS gedurende maximaal 1 maand.
- Beeld de bevlekte steigers in met behulp van een confocale laserscanmicroscoop.
- Definieer de drie fluorescentiekanalen (DAPI, ZsGreen en Cy3) op de microscoopbeeldacquisitiesoftware.
- Definieer een Z-stack met een sectiedikte van 2 μm met een totale dikte van 50 μm. Definieer vervolgens een tegelscan om grotere delen van de constructie af te beelden.
- Pas de acquisitieparameters aan om een helder fluorescerend signaal te verkrijgen zonder verzadiging en minimale achtergrond.
- Verkrijg de beelden met een objectief van 20x/0,8 met 1,0x zoom (pixelgrootte 0,31 μm).
- Voer een projectie met maximale intensiteit uit van de verworven Z-stack om een enkel 2D-beeld te verkrijgen met behulp van de microscoopbeeldacquisitiesoftware of vergelijkbare beeldanalysesoftware.
9. Anastomosing van de ontworpen flap rechtstreeks naar de dijbeenslagader van een rat met behulp van een manchettechniek
- Bereid en steriliseer (autoclaaf) de volgende chirurgische hulpmiddelen: nr. 15 scalpel, een paar fijntandige tangen en een klein paar ringvormige scharen. Bereid en steriliseer bovendien de volgende microchirurgische gereedschappen: een rechte fijngepunte juwelierstang nr. 3, een schuine juwelierstang, een naaldhouder met ronde handgreep met gebogen kaken, een paar vaatverwijders, ontleedschaar, adventitia-schaar en vatklemmen met hun applicator.
- Bereid een oplossing van 100 IE/ml gehepariniseerde zoutoplossing door 5 ml voorraadheparineoplossing te verdunnen met 195 ml zoutoplossing.
- Snijd en steriliseer polyimide manchetten.
- Snijd 2,5 mm secties van een polyimide buis onder een ontleedmicroscoop.
- Maak aan het ene uiteinde van elke sectie een incisie van 1,25 mm in de lengterichting in de wand van de buis om een manchethandgreep te verkrijgen. Maak een schuine snede aan het andere uiteinde van de buis om de eversie van het vat te vergemakkelijken.
- Dompel de manchetten onder in 70% ethanol gevolgd door twee wasbeurten met heparinized zoutoplossing.
- Bereid een mannelijke Sprague-Dawley-rat (275-350 g) voor op een operatie.
- Zeven dagen voorafgaand aan de operatie, begin met het toedienen van een subcutane dagelijkse dosis ciclosporine (10 mg kg-1) om immuunsuppressie te bereiken.
- Verdoof het dier voorafgaand aan de operatie met behulp van 3% isofluraaninhalatie volgens institutionele SOP met behulp van een inductiekamer. Controleer diepe anesthesie door beide voeten te knijpen en te controleren op reflexen.
- Dien een subcutane dosis pijnstillende buprenorfine (0,03 mg kg-1) en anticoagulerende heparine (200 IE kg-1) toe.
- Breng een bevochtigende oogzalf aan op de ogen van het dier om uitdroging te voorkomen.
- Scheer het chirurgische gebied van de rat en desinfecteer de site met jodium en vervolgens 70% ethanol. Bevestig de ledematen van het dier aan de tafel met plakband.
- Blootstellen en isoleren van de gemeenschappelijke femorale slagader.
- Maak een 2 cm lange, schuine incisie door de huid, langs de holte tussen het been en de buik.
- Gebruik een tang en een botte schaar om de huid los te maken van het onderliggende weefsel om het inguinale vetkussen te visualiseren.
- Knip met een schaar en tang dwars door het vetkussen rond de bovenste, mediale en onderste marges. Let op dat je geen grote vaten onder het vetkussen snijdt.
- Reflecteer het vetkussen zijdelings en laat de epigastrische vaten intact. Plaats een nat gaasje op het gereflecteerde vetkussen om uitdroging te voorkomen en bevestig het op zijn plaats. Zorg ervoor dat de gemeenschappelijke femorale vaten zichtbaar zijn.
OPMERKING: Het vetkussen zal later worden gebruikt om zachte druk uit te oefenen op de anastomosen. - Stel de dijbeenslagader van het inguinale ligament proximaal bloot aan het vertakkingspunt van de epigastrische slagader distaal door het uit de schede te halen.
LET OP: Er loopt meestal een tak van de dijbeenslagader onderdoor, gewoonlijk Murphy's tak genoemd. Let op dat je deze moeilijk te zien tak niet beschadigt. - Verdeel de tak van de Murphy door deze te bruinen en lireer vervolgens de dijbeenslagader met twee ligaturen in het midden van de slagader op 1 mm afstand van elkaar. Houd het ene uiteinde van de ligatuur hechting lang om later te gebruiken om het uiteinde van het vat door de manchet te trekken.
- Knip de slagader tussen de twee ligaturen met een adventitia-schaar.
LET OP: Er mag geen bloeding zijn bij het uitvoeren van deze snee. Als het arteriële uiteinde afloopt, klemt u de slagader vast en brengt u opnieuw een ligatuur aan. - Gebruik het lange uiteinde van de ligatuurnatuurverbinding en plaats elk uiteinde van het vat in een polyimidemanchet, zoals voorbereid in de vorige stap, zodat de handgrepen van de twee manchetten van elkaar weg wijzen.
- Breng na het inbrengen tegelijkertijd een klem aan op de handgreep van de manchet en het vat en bevestig de manchet op zijn plaats.
- Bereid een heparinized zoutoplossing in een spuit met een naald van 27 G.
- Trek aan het geligeerde vatuiteinde en snijd het dicht bij de ligatuur. Was het uiteinde van het vat onmiddellijk grondig met de gehepariniseerde zoutoplossing totdat er geen bloed zichtbaar is in het lumen.
LET OP: Zorg ervoor dat het uiteinde van het vat goed wordt gewassen, omdat al het bloed dat erin achterblijft een stolsel vormt, dat na het voltooien van de procedure in de bloedbaan wordt geïntroduceerd. Dit kan leiden tot occlusie van het vat en verlies van perfusie aan het been. - Vergroot het lumen van het vat door het met één hand bij de schede te houden en met de andere hand het lumen te verwijden met de vaatverwijderaar.
- Plaats een losse 6-0 polypropyleen omtrek hechting rond het manchetlichaam. Het vat eindigt met behulp van twee vaatverwijders over het manchetlichaam en zet het op zijn plaats door de omtreknaad aan te spannen.
OPMERKING: Als er tijdens de manipulaties bloed door het geklemde vat lekt, was het lumen dan grondig met een gehepariniseerde zoutoplossing. - Spoel de ontworpen flap met heparinized zoutoplossing en plaats vervolgens de met vaat beklede manchet in het lumen van de vasculaire steiger. Bevestig de steiger op zijn plaats door een omtrek van 6-0 polypropyleen hechting rond de steiger en het manchetlichaam te plaatsen. Doe deze stap voor beide zijden van de vasculaire steiger.
- Wikkel een polystyreenmembraanfilter van 0,2 μm rond de anastomosenplaats om de gemanipuleerde flap van het omliggende weefsel te isoleren.
- Laat eerst de distale klem los; laat vervolgens de proximale klem los om de bloedstroom door het vat te herstellen.
- Om eventuele bloedingen door de anastomosen te stoppen, reflecteert u het vetkussen terug over de femorale vaten en oefent u gedurende 3 minuten zachte druk uit met een steriel gaasje.
- Hecht het vetkussen terug op zijn plaats met behulp van 6-0 polypropyleen; hecht vervolgens de huid met behulp van 5-0 PGA absorbeerbare hechtingen.
- Reinig het wondgebied met zoutoplossing en breng jodiumoplossing aan.
- Bereid voor postoperatieve pijn en diermanagement een 0,1% (v/v) tramadol in drinkwater. Dien bovendien een dagelijkse dosis heparine (200 IE kg-1) en ciclosporine (10 mg kg-1) toe.
- Plaats het dier in een schone kooi zelf geplaatst onder een verwarmingslamp. Blijf het dier in de gaten houden totdat het weer voldoende bij bewustzijn is om de sternale lighouding te behouden.
Representative Results
Dit protocol beschrijft de fabricage van een gemanipuleerde flap bestaande uit een vasculaire steiger (figuur 1Ai) en een bioprint microvasculatuur (figuur 1Aii), die werden geassembleerd om mesoschaal- en microschaalvaculaturen te bereiken (figuur 1Aiii). Volgens het protocol werden BVOH-mallen van de vasculaire steiger ontworpen en 3D-geprint (figuur 1B, C). De verkregen geprinte structuren werden visueel geïnspecteerd op kleine strengen BVOH, die kunnen worden gevonden in de lege ruimtes van de mallen (figuur 1D). Deze strengen geven meestal onjuiste materiaalinstellingen aan of dat de BVOH vocht heeft opgenomen. Deze strengen moeten worden verwijderd omdat ze kunnen leiden tot onvolledige vulling van de mal en structurele defecten in de resulterende vasculaire steiger. Vervolgens werden de mallen gevuld met PLLA:PLGA-oplossing, gevolgd door het vriesdroogproces en de wasstappen, zoals beschreven in het protocol. De verkregen PLLA:PLGA vasculaire steiger werd visueel geïnspecteerd om de integriteit van de vaatwand en de doorgankelijkheid van het lumen te verifiëren (figuur 1E).
Een geneutraliseerde rhCollMA bioink in een concentratie van 10 mg/ml werd bereid en gecombineerd in een verhouding van 1:1 met de PEO:LAP oplossing. Menselijke vetweefselmicrovasculaire endotheelcellen gelabeld met Zs-Green1 en tandpulpstamcellen werden geresuspendeerd met de rhCollMA-bioink en de oplossing werd in een printcartridge en op de printer geladen. Doosvormen met een centraal kanaal met een rechtlijnig patroon (figuur 1D) werden gebioprint in het gelatine-steunbad. Na het printen werden de constructies verknoopt en werd het steunbad opgelost en gewassen. Na 4 dagen cultuur werden de constructies live in beeld gebracht om te controleren op microvasculaire netwerkzelfassemblage. Figuur 1D toont een voorbeeld van een hoog ontwikkeld HAMEC-ZsGreen1 microvasculair netwerk in het bioprinted construct.
Vervolgens werd een met fibronectine gecoate vasculaire steiger in het centrale kanaal van het geprinte construct ingebracht (figuur 2A). De geassembleerde constructies werden gedurende 2 dagen gekweekt, waarbij de cellen de gel samentrekken en stevig aan de vasculaire steiger hechtten. Vervolgens werd de vasculaire steiger bekleed met HAMEC's die tdTomato tot expressie brachten, volgens het protocol. Na 7 dagen cultuur werden de constructies gefixeerd en in beeld gebracht. Figuur 2B toont een zijaanzicht van de geassembleerde constructies waar de endotheelcellen in de biogeprinte microvasculatuur in het groen zijn afgebeeld, terwijl de endotheelbekleding van de vasculaire steiger in rood is afgebeeld. De afbeelding toont een groene microvasculaire zelfassemblage in de bioprinted gel, terwijl de vasculaire steiger is bekleed met rode endotheelcellen. Bij een hogere vergroting worden spruiten afkomstig van de rode endotheelbekleding gezien die ontkiemen en anastomoseren met het biogeprinte microvasculaire netwerk (figuur 2C). Vervolgens werden de constructen gekleurd voor α-smooth muscle actin (SMA) als marker voor de stamcellen van de tandpulp. Na de immunostaining werden de constructen in beeld gebracht met behulp van een laserscanende confocale microscoop (figuur 2D).
Ten slotte werden de gemanipuleerde flappen na 7 dagen kweken microchirurgisch anastomosueel geanomoseerd naar de dijbeenslagader van een rat, zoals beschreven in het protocol. Een video van een representatieve procedure is te zien in Aanvullende Video S1. Figuur 2E toont een representatief beeld van een voltooid anastomos voorafgaand aan het verwijderen van de klem, en figuur 2F toont een representatief beeld van de anastomosenplaats na het verwijderen van de klem en hemostase. Er mag geen bloeding zichtbaar zijn voorafgaand aan de wondsluiting.
Figuur 1: Representatieve beelden van de gefabriceerde meso- en microschaalvaten. (A) Schematisch overzicht van de stappen van het protocol. Gereproduceerd met toestemming16. (B) CAD-ontwerp voor de offerschimmel van de vasculaire steiger. (C) Zijaanzicht van een representatieve 3D-geprinte offermal (schaalbalk = 0,5 mm). (D) Bovenaanzicht van offerschimmel (schaalbalk = 0,5 mm) (E) Representatieve vasculaire steiger vervaardigd met behulp van het beschreven protocol (schaalbalk = 5 mm). (F) CAD-ontwerp voor het 3D-bioprinted rhCollMA microvasculaire netwerk. Rasterlijnen = 1 mm. (G) Representatieve afbeelding van een hoog ontwikkeld biogeprint vasculair netwerk met HAMEC-ZsGreen1 in het groen. Schaalbalk = 200 μm. Afkortingen: CAD = computer-aided design; rhCollMA = recombinant humaan collageenmethacrylaat; HAMEC = humane vet microvasculaire endotheelcellen; PLLA = poly-L-melkzuur; PLGA = polymelk-co-glycolzuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve beelden van de geassembleerde gevasculariseerde flap. (A) Een foto van een representatieve assemblage van bioprinted microvasculatuur en de vasculaire scaffold. Schaalbalk = 1 mm. (B) Zijaanzicht van een representatieve ontworpen flap afgebeeld 4 dagen na de endotheelbekleding van de vasculaire steiger. De bioprinte microvasculatuur wordt weergegeven in het groen (HAMEC-ZsGreen1), terwijl de endotheelvoering in het rood wordt weergegeven (HAMEC-tdTomato). Schaalbalk = 1 mm. (C) Representatief beeld van anastomosen tussen de biogeprinte vasculatuur in groen en de endotheelvoering in rood. Schaalbalk = 200 μm. (D) Representatief beeld van immunostaining voor gladde spieractine (rood), kernen (blauw) en endotheelcellen (groen) na 7 dagen incubatie. Schaalbalk = 0,1 mm. (E) Representatief beeld van een voltooid anastomos van de ontworpen flap met de dijbeenslagader van een rat vóór het verwijderen van de klem en (F) na het verwijderen van de klem. Afkortingen: HAMEC = human adipose microvasculaire endotheelcellen; SMA = gladde spier actine; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende video S1: Representatieve microchirurgische procedure voor het anastomoseren van de vasculaire steiger naar de dijbeenslagader van een rat. Klik hier om deze video te downloaden.
Discussion
Engineering gevasculariseerde weefsels is een van de belangrijkste uitdagingen van tissue engineering20. De huidige methoden voor het creëren van gemanipuleerd vasculair weefsel richten zich op het creëren van zelfgeassembleerde microvasculatuur 21,22,23 of het fabriceren van mesoschaal vasculaire steigers 24,25 en niet op het opnieuw creëren van een systeem van hiërarchische vasculatuur, dat onmiddellijk en direct na implantatie kan worden doordrenkt26 . In dit werk beschrijven we een protocol dat gebruik maakt van twee 3D-printmodaliteiten om een hiërarchisch vatnetwerk te fabriceren dat bestaat uit vasculaturen op microschaal en mesoschaal. Het protocol combineert een 3D-bioprinted, zelfgeassembleerd microvasculair netwerk met een mesoschaal vasculaire steiger, waardoor een implanteerbare, gevasculariseerde flap wordt bereikt. Verder presenteert dit artikel een protocol voor het direct anastomeren van deze flap naar de dijbeenslagader van een rat.
3D-bioprinting heeft de afgelopen jaren aan interesse gewonnen vanwege de veelzijdigheid ten opzichte van traditionele tissue engineering-technieken. Hoewel dit protocol de generatie van een microvasculair netwerk in rhCollMA-bioink beschrijft, kunnen de gebruikte methoden met weinig aanpassingen worden toegepast op vele andere bioinks uit de overvloed aan bestudeerde en nieuwe bioinks en ondersteunende baden27,28. We kozen ervoor om rhCollMA als biobaan te gebruiken vanwege de overvloed aan type I collageen in de menselijke ECU, waardoor een geschikte omgeving voor celaanhechting wordt geboden. Bovendien wordt het recombinant geproduceerd in planten en verder gemodificeerd met methacrylaatgroepen, wat fotopolymerisatie en de vorming van stabiele 3D-hydrogelsmogelijk maakt 29,30. Photocrosslinking werd bereikt door de toevoeging van de foto-initiator LAP, waarvan is aangetoond dat deze niet-toxisch is en wordt geactiveerd door blootstelling aan 405 nm blauw licht, waardoor de mogelijke fototoxiciteit van UV-licht wordt verminderd. Het gebruik van lichtgevoelige bioinks vereist echter het gebruik van een fenolroodvrij kweekmedium voor de bereiding van de bioink en het dragermateriaal. Verder beschrijft het protocol het gebruik van gelatine-ondersteuningsmateriaal, dat de high-fidelity extrusie van bioinks zoals rhCollMA mogelijk maakt. Het is dus van cruciaal belang om het gebruik van koud medium te garanderen tijdens de bereiding en de koeling van het printerbed. Overmatige verwarming kan optreden als gevolg van de lichtbron die wordt gebruikt voor crosslinking of van verhoogde omgevingstemperaturen.
Een op extrusie gebaseerde bioprinter is hier gebruikt om het bioprinted microvasculaire netwerk te creëren, en er zijn momenteel veel commercieel verkrijgbare bioprinters die vergelijkbare constructies kunnen genereren. Bovendien kunnen de voorgestelde methoden eenvoudig worden gewijzigd en toegepast om verschillende geometrieën, maten en invulpatronen te bestuderen. In dit werk is gekozen voor een rechtlijnig invulpatroon om onderling verbonden poriën te creëren, en dit kan relatief snel met hoge getrouwheid worden afgedrukt.
Luchtbellen vormen een aanzienlijke uitdaging bij het afdrukken van extrusiebioprinting, vooral in ondersteunende materialen. Daarom is het van cruciaal belang om de aanwezigheid en vorming van deze bellen te minimaliseren door pipetten met positieve verplaatsing te gebruiken voor de overdracht van het ondersteuningsmateriaal, de voorbereiding van de bioink-celsuspensie en hun overdracht naar de printcartridges.
In dit werk werden menselijke vetweefsel-afgeleide endotheelcellen en tandpulpstamcellen gebruikt als ondersteunende cellen vanwege hun relatief eenvoudige isolatie van patiënten. Bovendien werd gekozen voor een totale celconcentratie van 8 x 106 cellen/ml, omdat is aangetoond dat deze concentratie de meest ontwikkelde vasculaire netwerken tot stand brengt16. Hoewel dit protocol kan worden gebruikt om microvasculatuur te genereren met behulp van verschillende celtypen en bronnen, evenals verschillende bioinks, moet een kalibratie van de celconcentratie worden uitgevoerd om de beste omstandigheden voor de ontwikkeling van het microvasculaire netwerk vast te stellen. Bovendien kunnen weefselspecifieke cellen (d.w.z. myoblasten of osteoblasten) in de bioink worden opgenomen om weefselspecifieke gevasculariseerde flappen te bereiken.
De mal voor de poreuze vasculaire steiger werd vervaardigd met behulp van 3D-geprint wateroplosbaar materiaal op een in de handel verkrijgbare extrusie 3D-printer. Dit resulteert in een kosteneffectieve techniek op basis van rapid prototyping-platforms, zodat veel verschillende geometrieën en maten van vasculaire steigers snel kunnen worden bestudeerd en gescreend31. Niettemin is een beperking van deze methode de resolutielimiet van de meeste 3D-printers32. Met de snel evoluerende industrie rond additieve productie, wordt echter verwacht dat deze limieten in de loop van de tijd zullen verbeteren. Het gebruik van organische oplosmiddelen voor het fabricageproces is een andere beperking van het protocol, omdat de meeste organische oplosmiddelen giftig zijn voor cellen, waardoor het niet mogelijk is om de bioprintingprocedure te combineren met het vasculaire steigerfabricageproces.
De beschreven methode om het lumen van de steiger te zaaien met behulp van aspiratie in tegenstelling tot het duwen van de celsuspensie heeft grote effecten op de lokalisatie van de gezaaide cellen. Het gebruik van negatieve druk maakt endotheelisatie van het binnenste lumen van de steiger mogelijk, terwijl het morsen van de celsuspensie door de perforaties op de wand van de steiger wordt geminimaliseerd16.
De beschreven "manchet" -methode voor microchirurgische anastomosen kan eenvoudig worden gewijzigd en aangepast aan verschillende vasculaire steigermaterialen of -maten, evenals aan verschillende slagaders en aderen in een breed scala van diermodellen. De aanpassingen aan het protocol zouden verschillende polyimide buismaten en hechtingsgroottes omvatten. Deze methode vereist geen perforatie van de steigerwand, wat kan leiden tot de ontwikkeling van defecten. Dit werk presenteert een protocol dat kan worden uitgebreid naar vele toepassingen. De kritieke aspecten van dit protocol, waaronder de fabricage van meso- en microschaal vasculatuur en hun assemblage en implantatie, vertegenwoordigen kritieke aspecten van gemanipuleerde flappen, zowel voor reconstructieve toepassingen als voor vasculaire en andere tissue engineering studies.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit project ontving financiering van de European Research Council (ERC) in het kader van het Horizon 2020 Research and Innovation Programme van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 818808). rhCollMA werd genereus verstrekt door CollPlant (Rehovot, Israël). De auteurs bedanken de Pre-clinical Research Authority van Technion voor de hulp bij dierenverzorging, evenals Janette Zavin, Galia Ben David en Idan Redenski.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dioxane | Biosolve Chemical | 42405 | |
| 27 G x 0.5" blunt tip dispensing needles | CML supply | 901-27-050 | |
| 3cc amber syringe barrel & piston set | Nordson EFD | 7012085 | Amber syringes used to block light and prevent premature crosslinking |
| 5-0 AssuCryl PGA absorbale suture | Assut Sutures | Absorbable sutures used for skin wound closure | |
| 6-0 polypropelene sutures | Assut Sutures | 9351 | |
| Acland clamps | S&T | B-1V | |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-15 | |
| Angled no.3 jeweler's forceps | S&T | JFAL-3-18 | |
| BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter | Advanced Solutions | a 6-axis 3D bioprinter | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Buprenorphine | vetmarket | B15100 | |
| BVOH filament | Verbatim | 55903 | a water-soluble 1.75 mm diameter filament |
| Clamp applying forceps | S&T | CAF-4 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| Dietrich bulldog clamps | Fine Science Tools (FST) | 18039-45 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carlo Erba Reagents | 480141 | |
| Dissection scissors | S&T | 18039-45 | |
| DMEM, High Glucose, No Phenol Red | Sartorius | 01-053-1A | |
| Duratears | Alcon | DJ03 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | glutamine substitute |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Heparin Sodium 5,000 I.U./mL | Panpharma | - | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | A stock concentration of 1 mg/mL |
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal Critical Care | NDC 66794-011-25 | |
| LifeSupport | Advanced Biomatrix | 5244 | a gelatin support slurry for FRESH 3D bioprinting |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| MICROMAN E M1000E, 100-1,000 µL | Gilson | FD10006 | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Poly(ethylene oxide), M.W. 250,000 to 400,000 | Acros Organics | 178602500 | |
| Poly(L-lactic acid), IV 5.0 dl/g (PLLA) | Polysciencse, Inc. | 18582-10 | |
| Polyimide tubing, ID: 0.0249", OD: 0.0273" | Cole-Parmer | 95820-05 | A thin-walled tube used to fabricate cuffs for microsurgical anastomoses |
| Prusa I3 MK2.5 3D Printer | Prusa Research | http://www.prusa3d.com/ | a popular commercial 3D printer |
| Resomer RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Evonik Industries | 719870 | |
| rhCollMA | CollPlant | https://collplant.com/ | generously provided by CollPlant (Rehovot, Israel) |
| round-handled needle holder | S&T | B-15-8 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
| Sodium Chloride | Biosolve Chemical | 19030591 | |
| Sodium Phosphate dibasic (NaH2PO4) | Riedel-de Haen | 4276 | |
| Solidworks | Dassault Systems | CAD software | |
| Straight no.3 jeweler's forceps | S&T | JF-3-18 | |
| Straight serrated forceps | Fine Science Tools (FST) | 11050-10 | |
| Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton Limited | 305 | |
| Triton-X 100 | BioLab LTD | 57836 | |
| TSIM | Advanced Solutions | 3D slicing and design software for the BioAssembly Bot | |
| Vessel dilator | S&T | D-5a.1 | |
| Zeiss Tivato 700 surgical microscope | Zeiss |
References
- Wallace, C. G., Wei, F. -C. C. The current status, evolution and future of facial reconstruction. Chang Gung Medical Journal. 31 (5), 441-449 (2008).
- Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering complex tissues. Science Translational Medicine. 4 (160), 12 (2012).
- Duan, B. State-of-the-art review of 3D bioprinting for cardiovascular tissue engineering. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 195-209 (2017).
- Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
- Ouyang, L., Armstrong, J. P. K., Chen, Q., Lin, Y., Stevens, M. M. Void-free 3D bioprinting for in situ endothelialization and microfluidic perfusion. Advanced Functional Materials. 30 (1), 1908349 (2020).
- Baltazar, T., et al. Three dimensional bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes, fibroblasts, pericytes, and endothelial cells. Tissue Engineering - Part A. 26 (5-6), 227-238 (2020).
- Chia, H. N., Wu, B. M. Recent advances in 3D printing of biomaterials. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 4 (2015).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
- Guillotin, B., et al. Laser assisted bioprinting of engineered tissue with high cell density and microscale organization. Biomaterials. 31 (28), 7250-7256 (2010).
- Catros, S., et al. Laser-assisted bioprinting for creating on-demand patterns of human osteoprogenitor cells and nano-hydroxyapatite. Biofabrication. 3 (2), (2011).
- Ronca, A., Ambrosio, L., Grijpma, D. W. Preparation of designed poly(d,l-lactide)/nanosized hydroxyapatite composite structures by stereolithography. Acta Biomaterialia. 9 (4), 5989-5996 (2013).
- Lan, P. X., Lee, J. W., Seol, Y. J., Cho, D. W. Development of 3D PPF/DEF scaffolds using micro-stereolithography and surface modification. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 20 (1), 271-279 (2009).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).
- Szklanny, A. A., et al. 3D bioprinting of engineered tissue flaps with hierarchical vessel networks (VesselNet) for direct host-to-implant perfusion. Advanced Materials. 33 (42), 2102661 (2021).
- Schleimer, K., et al. Training a sophisticated microsurgical technique: interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats. Journal of Visualized Experiments JoVE. (69), (2012).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: A new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
- Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), (2014).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
- Szklanny, A. A., et al. High-throughput scaffold system for studying the effect of local geometry and topology on the development and orientation of sprouting blood vessels. Advanced Functional Materials. 1901335, 1-13 (2019).
- Song, W., et al. Engineering transferrable microvascular meshes for subcutaneous islet transplantation. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).
- Ying, G. L., et al. Aqueous two-phase emulsion bioink-enabled 3D bioprinting of porous hydrogels. Advanced Materials. 30 (50), 1-9 (2018).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Jang, J., Park, J. Y., Gao, G., Cho, D. W. Biomaterials-based 3D cell printing for next-generation therapeutics and diagnostics. Biomaterials. 156, 88-106 (2018).
- Suntornnond, R., An, J., Chua, C. K. Roles of support materials in 3D bioprinting - present and future. International Journal of Bioprinting. 3 (1), 83-86 (2017).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human recombinant type I collagen produced in plants. Tissue Engineering - Part A. 19 (13-14), 1527-1533 (2013).
- Stein, H., et al. Production of bioactive, post-translationally modified, heterotrimeric, human recombinant type-I collagen in transgenic tobacco. Biomacromolecules. 10 (9), 2640-2645 (2009).
- Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of precision polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , 120062 (2020).
- Karakurt, I., Lin, L. 3D printing technologies: techniques, materials, and post-processing. Current Opinion in Chemical Engineering. 28, 134-143 (2020).
