Summary
דשים מהונדסים דורשים רשת כלי דם פונקציונלית משולבת. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לייצור דש רקמה מודפס בתלת-ממד המכיל רשת כלי דם היררכית ואת האנסטומוזות המיקרו-כירורגיות הישירות שלה לעורק עצם הירך של החולדה.
Abstract
הנדסת רקמות מושתלות, פונקציונליות ועבות דורשת תכנון רשת כלי דם היררכית. הדפסה ביולוגית תלת-ממדית היא טכנולוגיה המשמשת ליצירת רקמות על ידי הוספת שכבה על גבי שכבה של ביו-חומרים הניתנים להדפסה, המכונים ביו-אינקים ותאים באופן מסודר ואוטומטי, המאפשר יצירת מבנים מורכבים ביותר שטכניקות מסורתיות של הנדסת רקמות אינן יכולות להשיג. לפיכך, הדפסה ביולוגית תלת-ממדית היא גישה מושכת במבחנה כדי לחקות את המבנה המורכב הטבעי של כלי הדם, החל מכלי שיט מילימטריים וכלה ברשתות מיקרו-וסקולריות.
ההתקדמות בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית בהידרוג'לים גרגיריים אפשרה שחול ברזולוציה גבוהה של ביו-אינקים מבוססי מטריצה חוץ-תאית בעלי צמיגות נמוכה. עבודה זו מציגה גישת הדפסה תלת-ממדית משולבת של הדפסה ביולוגית בתלת-ממד והדפסה תלת-ממדית מבוססת-הקרבה לייצור כנפי רקמות וסקולריות מהונדסות. הדפסה ביולוגית תלת-ממדית של תאי אנדותל ותאי תמיכה באמצעות ביו-אינק של קולגן-מתקרילט רקומביננטי בתוך אמבט תמיכה בג'לטין מנוצלת לייצור רשת נימית בהרכבה עצמית. מיקרו-וסקולטורה מודפסת זו מורכבת סביב פיגום נקבובי דמוי כלי מזוקלי, המיוצר באמצעות תבנית מודפסת בתלת-ממד של הקורבן, והוא נזרע בתאי אנדותל.
הרכבה זו גורמת לאנדותל של כלי הדם המזוקלי לאנסטומוז עם הרשת הנימית הסובבת, ויוצרת רשת כלי דם היררכית בתוך דש רקמה מהונדס. הדש המהונדס מושתל ישירות על ידי אנסטומוזיס כירורגי לעורק עצם הירך של חולדה בטכניקת השרוול. ניתן להרחיב את השיטות המתוארות לייצור כנפי רקמות וסקולריות שונות לשימוש בניתוחי שחזור ומחקרי כלי דם.
Introduction
מומים חמורים ברקמות נגרמים כתוצאה מפציעות טראומטיות, מומים מולדים או מחלות, ותקן הזהב הנוכחי לטיפול בפגמים אלה הוא באמצעות שתלים אוטולוגיים, דשי רקמות וסקולריות ודשים חופשיים ממיקרו-וסקולריים כתחליפי רקמה. עם זאת, לאפשרויות אלה יש את החסרונות של רקמת אתר תורמים מוגבלת ותחלואה באתר התורם1. לפיכך, יש ביקוש הולך וגובר לתחליפי רקמות חלופיים שניתן להשתמש בהם כדי לתקן פגמים אלה2. עובי מבני הרקמות המהונדסים מוגבל על ידי דיפוזיה של חומרי מזון וגזים לעבר התאים, ולכן רשת כלי דם נכונה חיונית ליצירת פיגומים גדולים, עבים ומזינים כראוי.
מספר גישות יושמו כדי לקדם את הווסקולריזציה של שתלים מהונדסים3, כולל גיוס in vivo של תמיכה וסקולרית מהמארח, אספקת גורמי גדילה וציטוקינים בתוך הפיגומים, פרבסקולריזציה של שתלים, יצירת מיטת מיקרו-ווסל מסתעפת הניתנת להסתעפות מתמדת באמצעות טכניקות מיקרו-פטרנינג4, שימוש בחומרי הקרבה להיווצרות תעלות/רשת כלי דם5 וכן יצירת ערוצים בתוך מבנים מודפסים ביולוגית בתלת-ממד 5,6., וסקולריזציה של רקמות עבות דורשת שילוב של רשת כלי דם היררכית המורכבת מכלי דם בקנה מידה מאקרו ומיקרו-קפילרי. כלי הדם בקנה מידה מאקרו מפיצים את הדם ביעילות לאורך כל המבנה ומאפשרים אנסטומוזות מיקרו-כירורגיות עם כלי הדם המארחים, בעוד שכלי הדם בקנה מידה מיקרו-קפילרי מאפשרים דיפוזיה של חומרים מזינים.
הדפסה ביולוגית זכתה לתשומת לב רבה בשנים האחרונות בשל היתרונות שהיא מציעה על פני שיטות קונבנציונליות של הנדסת רקמות. רקמות ואיברים הם אובייקטים תלת-ממדיים מורכבים ומורכבים עם ארכיטקטורה ספציפית. הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, עם יכולתה להפקיד שכבות של ביו-חומרים ברזולוציה גבוהה, מאפשרת את היכולת ליצור תחליפי רקמות ואיברים מורכבים (למשל, כליות, ריאות, כבד)7. מספר טכנולוגיות הדפסה הותאמו להדפסה ביולוגית, כולל הדפסה מבוססת שחול, הזרקת דיו8, תצהיר בסיוע לייזר 9,10, והדפסה ביולוגית מבוססת סטריאוליתוגרפיהשל 11,12. הטכנולוגיות מבוססות השחול מסתמכות על הבלטת החומר דרך זרבובית על ידי הפעלת לחץ על משטח התפזורת של החומר מול הזרבובית.
הטבעה הפיכה חופשית של הידרוג'לים מרחפים (FRESH) היא טכניקת הדפסה ביולוגית13,14 המשתמשת בחומר תמיכה גרגירי שבו החומר המובלט מופקד ומקובע במקומו על ידי אמבט התמיכה. אמבט התמיכה מעניק תמיכה מכנית לביו-אינק המובלט, המקושר מראש, עד להצלבתו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאמבטיה התומכת מאפשרת הבלטה של חומרים בעלי צמיגות נמוכה שאינם יכולים לשמור על צורתם לאחר שחול ולפני ההצלבה15. זה מרחיב את מאגר החומרים הזמינים שיכולים לשמש כביו-אינקים.
מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת דש כלי דם המשלב כלי דם זעירים ומזוזקליים. כדי להשיג זאת, רשתות מיקרו-וסקולריות מודפסות ביולוגיות, המורכבות מעצמן, נוצרות בהידרוג'ל קולגן מתקרילט אנושי (rhCollMA) רקומביננטי, אשר לאחר מכן מתחבר לפנים של פיגום כלי דם גדול יותר, מושתל, וכתוצאה מכך דש רקמה מהונדס לחלוטין16. כדי ליצור זלוף מהיר וישיר של רקמות מהונדסות, נדרשת אנסטומוזיס מיקרו-כירורגית ישירה לכלי המארח. לפיגום הווסקולרי אין חוזק שימור תפרים מספיק כדי לעבור תפירה באמצעות תפירת דופן כלי דם מיקרו-כירורגית מסורתית. לכן, אנו מתארים שיטה "חפתים"17,18,19 להשגת אנסטומוזיס עם עורק הירך הנפוץ של חולדה. בשיטה זו, קצוות הכלי מאובטחים בתפרים היקפיים, ללא צורך לנקב את דופן הכלי.
למרות שהפרוטוקול המוצע הוכן כדי לחקור כלי דם היררכיים בסביבת rhCollMA, ניתן להרחיב גישה זו וליישם אותה במגוון יישומים חדשים. ניתן ליישם את הפרוטוקול על הדפסה ביולוגית של תאים ספציפיים לרקמות שונות בביו-אינקים שונים. יתר על כן, ניתן לשנות בקלות את הגיאומטריה והגודל של המבנים כך שיתאימו לדרישות ספציפיות, כגון שחזור רקמות גדולות או מחקרים ביולוגיים.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים אושרו ונערכו בהנחיית הרשות למחקר פרה-קליני בטכניון (PCRA Technion, אישור אתיקה מס' 058-05-20). זכרי חולדות ספראג-דאולי (275-350 גרם) שימשו למחקרים אלה. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. ייצור פיגום כלי דם
- צור מודל ממוחשב תלת-ממדי של צורת פיגום כלי הדם הרצויה באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD) או הורד קובץ תלת-ממדי של מבנה כלי דם רצוי ממאגרים מקוונים.
- צור גליל עם קוטר פנימי של 0.9 מ"מ, קוטר חיצוני של 2 מ"מ, וגובה של 18 מ"מ. הוסיפו פנסטרציות רדיאליות בקוטר של 0.22 מ"מ לצד דופן הצילינדר.
- צור תבנית עבור הפיגום באמצעות תוכנת העיצוב התלת-ממדית וייצא אותה כ- . קובץ STL. לאחר מכן, הוסף משפך לעיצוב כדי להקל על מילוי התבנית מאוחר יותר.
- ייבא את . קובץ STL לתוכנת החיתוך עבור מדפסת התלת-ממד של מידול תצהיר מתמזג (FDM). פרוס את הדגם עם גובה שכבה של 0.1 מ"מ, וייצא אותו כ- .gcode או שלח אותו ישירות למדפסת התלת-ממד.
- הדפסה תלת-ממדית של התבנית במדפסת FDM 3D המצוידת בזרבובית 0.25 מ"מ, תוך שימוש בקופולימר אלכוהול ויניל ויניל (BVOH) מסיס במים. אחסנו את התבניות המודפסות בתא ואקום עד לשימוש.
אזהרה: הימנעו מטיפול בחוט ה-BVOH בידיים חשופות מכיוון שהוא רגיש ללחות. בנוסף, מומלץ לאחסן את החוט בתא ואקום כדי למנוע חשיפה ללחות. - הכינו תמיסת פולימר של תערובת 1:1 של חומצה פולי-L-לקטית (PLLA) וחומצה פולילקטית-קו-גליקולית (PLGA) ב-1,4-דיוקסן.
- שוקלים 350 מ"ג PLLA ו-350 מ"ג PLGA ומעבירים לבקבוקון זכוכית של 20 מ"ל.
- מדידת 10 מ"ל של 1,4-דיוקסן והעברה לבקבוקון הזכוכית באמצעות פיפטה מזכוכית. הוסיפו מוט ערבוב מגנטי קטן לבקבוקון הזכוכית.
אזהרה: 1,4-דיוקסן הוא ממס אורגני מסוכן. השתמשו בציוד בטיחות אישי מתאים ועבדו בתוך מכסה אדים. - מניחים את בקבוקון הזכוכית בתוך אמבט מים חמים המחומם ל-70 מעלות צלזיוס ומערבבים את התכולה למשך הלילה עד שכל הפולימרים מתמוססים במלואם. אחסנו את התמיסה במיכל זכוכית אטום עד לשימוש.
- מלאו את תבניות ה-BVOH בתמיסת PLLA:PLGA.
- באמצעות פיפטה תזוזה חיובית, למדוד 30 μL של תמיסת הפולימר ולמלא את התבנית.
הערה: הנפח הדרוש למילוי התבנית ישתנה בהתאם לנפח הכלי המתוכנן. יש להמשיך להוסיף את תמיסת הפולימר עד שהמשפך של התבנית יתמלא במלואו. - צנטריפוגה את התבנית ב 100 × גרם במשך 2 דקות. מלאו את התבנית ב-20 μL נוספים של תמיסת הפולימר כדי להבטיח מילוי מלא.
- באמצעות פיפטה תזוזה חיובית, למדוד 30 μL של תמיסת הפולימר ולמלא את התבנית.
- הקפא את התבניות המלאות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות כדי להבטיח שכל תמיסת הפולימרים תקפא. הסר את הממס מן התבניות על ידי lyophilizing אותם לילה.
הערה: צבע הפולימר בתבנית צריך להפוך משחיר ללבן לאחר תהליך ייבוש ההקפאה. - כדי להסיר את חומר התבנית המקריב, העבירו את התבניות לאחר תהליך הייבוש בהקפאה לאמבטיית מים שעברה דה-יוניזציה של 5 ליטר תחת ערבוב עדין. החליפו את המים באמבטיה כשהם מתעננים. כאשר כל ה-BVOH מתמוסס, מייבשים את הפיגומים באוויר ומאחסנים אותם בתא ואקום עד לשימוש.
2. ציפוי פיגום כלי הדם בפיברונקטין
- יש לחטא את פיגומי כלי הדם PLLA:PLGA על ידי טבילתם ב-70% אתנול למשך 30 דקות.
- לשטוף את הפיגומים 3x 5 דקות עם PBS.
- הכינו דילול של 50 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין אנושי ב-PBS וציפו את הפיגומים.
- יש לערבב 500 μL של תמיסת פיברונקטין (1 מ"ג/מ"ל) עם 9.5 מ"ל של PBS.
- טבלו את פיגומי כלי הדם המחוטאים בתמיסת פיברונקטין זו ודגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות כדי לאפשר ספיגת חלבונים.
- לאחר הדגירה, לשטוף את הפיגומים עם PBS כדי להסיר את fibronectin unbound. אחסן את הפיגומים המצופים האלה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
3. הכנת ביואינק rhCollMA
- הכינו מאגר פוספטים לנטרול מלאי הביואינק החומצי rhCollMA.
- הכינו מלאי של פי 10 של מאגר פוספטים על ידי המסת 5.495 גרם של Na2HPO4, 1.55 גרם של NaH2PO4, ו-30 מ"ג של NaCl ב-50 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה.
- הכינו דילול של פי 10 ממאגר הפוספטים המלאי פי 10 על ידי שילוב של חלק אחד של חיץ פוספט פי 10 עם 9 חלקים של מים שעברו דה-יוניזציה.
- שלב 900 μL של תמיסת rhCollMA במלאי עם 100 μL של חיץ פוספט 10x כדי לנטרל את תמיסת rhCollMA החומצית.
- דיללו את תמיסת ה-rhCollMA המנוטרלת לריכוז הרצוי של 10 מ"ג/מ"ל על ידי ערבובה עם הכמות הנדרשת של מאגר פוספט אחד.
הערה: ריכוז המניות של rhCollMA משתנה בין מגרשים. לכן, נפח של 1x 1x 1 כרית פוספט הדרוש כדי להגיע לריכוז הרצוי ישתנה. - הכן את תמיסת הפורוגן-פוטו-יניטיטור (PEO-LAP) כך שתשולב עם ה-rhCollMA הנייטרלי המדולל.
- הכן תמיסה של 1.6% (w/v) של פולי(אתילן אוקסיד) (PEO) ב- DMEM ללא פנול ללא אדום על ידי המסת 160 מ"ג של PEO ב-10 מ"ל של DMEM.
- הוסף 20 מ"ג של ליתיום פניל-2,4,6-טרימתילבנזוילפוספינאט (LAP) לתמיסה זו כדי לקבל 0.2% (w/v) LAP בתמיסה. מנקודה זו, לכסות את הפתרון עם רדיד אלומיניום או לשמור אותו במקום חשוך כדי להגן עליו מפני אור.
- לעקר את תמיסת PEO-LAP על ידי העברתו דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. אחסן פתרון זה בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) למשך שבוע אחד עד שבוע.
- לפני ההדפסה הביולוגית, ערבבו את תמיסת ה-rhCollMA הנייטרלית המדוללת עם תמיסת PEO-LAP ביחס של 1:1 כדי לקבל את פתרון הביו-אינק הסופי. השתמשו בצנרת, ולא במערבולת, כדי לערבב את התמיסות תוך הימנעות מבועות אוויר.
- אם הרבה בועות מוכנסות לפתרון, צנטריפוגה ב-2,000 × גרם למשך 30 שניות. לאחר צנטריפוגה, ערבבו שוב את תמיסת הביו-אינק כדי להבטיח הומוגניות.
4. הכנת אמבטיית תמיכה גרעינית
- מכינים חומר תמיכה גרגירי ג'לטין.
- בארון בטיחות ביולוגי, מחלקים את התכולה של צינור אחד של 2 גרם של חומר תמיכה ליופילי לשני צינורות חרוטיים סטריליים של 50 מ"ל, שכל אחד מהם מכיל כ-1 גרם.
- הוסיפו 40 מ"ל של DMEM נטול פנול-אדום קר (4 מעלות צלזיוס) לכל צינור, והתפתלו במרץ עד שכל חומר התמיכה הלופילי מתמוסס.
- תן ל- slurry שנוצר לשבת על 4 ° C כדי לאפשר לחומר התומך להתייבש מחדש.
- דגה את חומר התמיכה בתא ואקום למשך 30 דקות כדי להפחית בועות.
- צנטריפוגה את חומר התמיכה ב 2,000 × g במשך 5 דקות. ודא שהחומר נמצא בתחתית הצינור והסופרנט ברור.
- לשאוף את supernatant, תוך הקפדה לא לשאוף את חומר התמיכה בתחתית.
הערה: החומר התומך לא צריך לזרום בעת הטיית הצינור לאחר הסרת הסופרנאטנט. אם החומר זורם, צנטריפוגה שוב באמצעות אותן הגדרות אך מבלי להוסיף סופרנטנט חדש.
- מעבירים כ-4 מ"ל של חומר התמיכה המוכן והדחוס לכל באר של צלחת בעלת 12 בארות באמצעות פיפטת תזוזה חיובית. הקש על צלחת הבאר על משטח קשה כדי לאלץ את חומר התמיכה להתפשט באופן שווה בבאר.
הערה: הנפח המינימלי המומלץ של חומר התמיכה הוא פי 3 מנפח המבנה שיודפס בו. - מניחים את צלחת הבאר עם חומר התמיכה על במת ביו-פרינטר מקורר, או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, עד לשימוש בה כדי למנוע מהחלקיקים הג'לטיניים להתמוסס.
5. שילוב תאי אנדותל ותאי תמיכה עם הביו-אינק
- יש להכין את מדיום תאי האנדותל בהתאם להוראות היצרן על ידי ערבוב המדיום הבסיסי עם רכיב הקיט הבינוני המתאים לו, כולל תמיסה אנטיביוטית, סרום בקר עוברי ותוספי גדילת תאי אנדותל.
- הכינו את מדיום תאי הגזע של עיסת השיניים על ידי שילוב של 500 מ"ל של DMEM דל גלוקוז, 58 מ"ל של סרום בקר עוברי, 5.8 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 5.8 מ"ל של תחליף גלוטמין, 5.8 מ"ל של 1 M HEPES ו-5.8 מ"ל של תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-ניסטטין.
- הכינו תרחיף המכיל 2 × 106 תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של שומן אנושי (HAMEC-ZsGreen1) ו-6 × 106 תאי גזע של עיסת שיניים (DPSCs) ב-10 מ"ל של מדיום תאי אנדותל.
- צנטריפוגה של תרחיף התא ב-200 × גרם למשך 4 דקות כדי לקבל כדור תא. לשאוף לתווך העל-טבעי.
- בצעו שימוש חוזר בכדור התא ב-1 מ"ל של ביואינק rhCollMA שהוכן בעבר (המכיל PEO-LAP) כדי להשיג ביואינק עם ריכוז תאים כולל של 8 × 106 תאים לכל 1 מ"ל של ביואינק.
אזהרה: לאחר שילוב הביואינק עם התאים, המשך מיד לשלב הבא. אם התאים יישארו בתרחיף במשך זמן רב, התאים ישקעו לתחתית הצינור, וכדאיותם תידרדר. לניסויים שאינם מערבים תאים, יש לדלג על שלבים 5.1-5.5, או לשלב חרוזים פלואורסצנטיים עם הביואינק במקום תאים להדמיה מיקרוסקופית משופרת של המבנים המודפסים. - מעבירים את תערובת התאים-ביו-אינק למחסניות הדפסה.
- התאם מחט בקוטר פנימי של 0.22 מ"מ למחסנית הדפסת ענבר של 3 מ"ל והנח את המחסנית בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
- העבר 1 מ"ל של תערובת התאים-ביואינק למחסנית ההדפסה על ידי מילויה מלמעלה, באמצעות פיפטת תזוזה חיובית להפחתת בועות.
- התקן את מחסנית ההדפסה בכלי המתאים בביו-פרינטר.
6. הדפסה ביולוגית של רשתות מיקרו-וסקולריות באמצעות ביו-אינק rhCollMA
- צור תכנון CAD תלת-ממדי עבור הרשת המיקרו-וסקולרית המודפסת ביולוגית.
- שרטטו תבנית דו-ממדית של ריבוע 4 מ"מ המכיל במרכזו תעלה מעגלית בקוטר 2 מ"מ. הוציאו את הסקיצה ב-4 מ"מ כדי לקבל קוביית 4 מ"מ x 4 מ"מ x 4 מ"מ עם ערוץ מרכזי. ייצא אובייקט זה כאובייקט . קובץ STL.
- ייבאו צלחת של 12 בארות. תבנית STL לתוך לשונית המידול המוצק בתוכנת החיתוך של הביו-פרינטר וממקמת אותה באזור המיועד של מיטת ההדפסה הווירטואלית.
- ייבא את . קובץ STL של צורת הקובייה לתוך לשונית המידול המוצק בתוכנת החיתוך של bioprinter. לחץ על תיבת הסימון השתמש בחותך חיצוני | קביעת תצורה של slicer תחת המקטע מאפייני אובייקט . בחלון הקופץ, בחר תבנית rectilinear עבור תבנית המילוי והקלד 30% בצפיפות המילוי. לחץ על קבל.
- הניחו עותק של צורת הקובייה בכל באר וירטואלית רצויה על ידי לחיצה על הקובייה והזזתה באמצעות העכבר.
- צור הגדרות חומר חדשות עבור rhCollMA bioink בכרטיסיית החומרים של תוכנת חיתוך הביו-פרינטר על-ידי לחיצה על לחצן הוסף חומר . בחר את הגדרות החומר להדפסה. עבור לחץ, סוג 2 psi בתיבה המתאימה. עבור מהירות, הקלד 20 מ"מ לשנייה בתיבה המתאימה.
הערה: לכל חומר ביואינק יש הגדרות הדפסה שונות משלו שניתן לשמור ברשימת החומרים ביישום. - הקצה את ערכי רוחב השורה וגובה הקו ל- 0.24 מ"מ ואת ערך ההאצה ל- 400 מ"מ לשנייה2, על-ידי הקלדת ערכים אלה בתיבות המתאימות.
- בכרטיסייה מידול מוצק , לחץ על אובייקט הקובייה ולאחר מכן לחץ על חומר rhCollMA ממקטע החומרים כדי להקצות אותו לצורת הקובייה. בכרטיסייה bioassembly , לחץ על לחצן שלח משימת הדפסה כדי לשלוח את משימת ההדפסה לפרינטר הביולוגי.
- טען את מחסנית ההדפסה העמוסה בביו-אינק התאי לכלי ההפצה הפנאומטי הסביבתי 3 מ"ל של הביו-פרינט מבוסס האקסטרוזיה התלת-ממדית.
- הגדר את טמפרטורת מיטת ההדפסה ל- 4 °C (74 °F) על-ידי לחיצה על הכפתור הקריר מתחת לכרטיסייה Control-חימום/קירור במסך ממשק bioprinter. טען את הצלחת עם אמבט התמיכה על מיטת המדפסת.
הערה: ההגדרות של החומר עבור לחץ הדפסה ומהירות עשויות להשתנות עקב הבדלים בטמפרטורת הסביבה או בהשתנות אצווה ביו-אינק. לדוגמה, בימים קרים יותר, יש צורך בלחץ גבוה יותר או במהירות איטית יותר כדי להוציא את אותה כמות של חומר. - בכרטיסיית ההדפסה במסך ממשק הביו-פרינטר, לחץ על משימת ההדפסה שנשלחה בשלב 6.7. ולחץ על התחל | עבור כדי להתחיל את עבודת ההדפסה.
- לאחר ההדפסה, חשוף את לוח הבאר למקור אור של 405 ננומטר בעוצמה של 3 mW/cm2 במשך 30 שניות כדי ליזום את הקישור ההצלבה של הביו-אינק rhCollMA.
- לאחר קישור צולב, דגירה של צלחת הבאר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 20 דקות לפחות עד שכל אמבט התמיכה נמס.
- לשאוף בעדינות את אמבט התמיכה החריף ולהחליף אותו עם מדיום תאי אנדותל. דגירה של המבנים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד לשימוש בשלבים נוספים.
הערה: בשל התכווצות המבנה לאחר ההדפסה, מומלץ לבצע את ההרכבה שלב 7 באותו יום כמו שלב 6.
7. הרכבת הרשת המיקרו-וסקולרית המודפסת ביולוגית עם פיגום כלי הדם כדי לקבל את הדש הווסקולרי המהונדס
- מיד לאחר הסרת חומר התמיכה של הרשת המיקרו-וסקולרית המודפסת ביולוגית, הניחו פיגום כלי דם PLLA:PLGA מצופה פיברונקטין בערוץ הראשי של המבנה המודפס ביולוגית.
- דגירה של המבנים המורכבים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך יומיים.
- מרפדים את הלומן של פיגום כלי הדם בתאי אנדותל.
- הכינו תרחיף תאי של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של שומן אנושי (HAMEC-tdTomato) המבטאים tdTomato בריכוז של 1 × 107 תאים/מ"ל.
- מניחים טיפה של 20 μL של תרחיף תא זה על משטח הידרופובי (כלומר, צלחת שאינה תרבית רקמה [nonTC] בקוטר 10 ס"מ).
- מניחים בעדינות את פיגומי כלי הדם על גבי הטיפה, כך שהלומן של הפיגום בקצה אחד יוצר מגע עם טיפת התא.
- שאפו את הטיפה מהקצה הנגדי של הפיגום (כלומר, הקצה שאינו בא במגע עם הטיפה), ומלאו את לומן שלה בתרחיף התא.
- מניחים את הפיגום הזורע בצינור מיקרו-צנטריפוגה ומכניסים אותו לרוטציה בפנים באינקובטור לח למשך 60 דקות. לאחר מכן, מעבירים את הפיגום לצלחת של 12 בארות ומוסיפים 2 מ"ל של מדיום תאי אנדותל.
- תרבית את הדשים המהונדסים במשך 7 ימים, תוך החלפת המדיום כל יומיים במדיום תאי אנדותל טריים.
8. מיקרוסקופיה קונפוקלית וכתם אימונופלואורסצנטי של הדשים המהונדסים
- לאחר 4 ימים ו-7 ימים של תרבית, בצע הדמיה של תאים חיים של הפיגומים המורכבים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.
- הגדר את תעלות הפלואורסצנציה עבור חלבונים פלואורסצנטיים ZsGreen1 ו- tdTomato בתוכנת רכישת התמונה של מיקרוסקופ.
- בחרו בעדשה אובייקטיבית של 5x/0.16 עם זום של 0.5x (גודל פיקסל 5 מיקרומטר), והגדירו ערימת Z עם 22 פרוסות בעובי של 41 מיקרומטר כל אחת.
- הגדר סריקת אריחים בגודל 3 x 2 כדי לצלם וללכוד את המבנה כולו.
- התאם את עוצמת הלייזר וצבר ערכים כדי לקבל אות פלואורסצנטי ברור ללא רוויה ורקע מינימלי ולרכוש את התמונות.
- בצע הקרנה בעוצמה מרבית של מחסנית Z שנרכשה כדי להשיג תמונה דו-ממדית אחת באמצעות תוכנת רכישת התמונה במיקרוסקופ או בתוכנת ניתוח תמונות דומה.
- בצע הדמיית הגדלה גבוהה יותר של אזור עניין.
- עבור לעדשת מטרה של 10x/0.3 עם זום של 0.5 (גודל פיקסל 1.25 μm) והגדר ערימת Z בעובי של 9 פרוסות של 41 מיקרומטר.
- בצע שלבים 8.2.-8.3.
- לאחר 7 ימים של תרבות, לתקן את הדשים המהונדסים על ידי טבילתם ב 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות.
- לשטוף את המבנים 3x 5 דקות עם PBS.
- הוסף 0.3% (v/v) Triton-X ב- PBS למבנים ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחלחל לתאים.
- לשטוף את המבנים 3x 5 דקות עם PBS.
- הכינו תמיסת חסימה על ידי המסת 5% (w/v) אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS. הוסיפו את תמיסת החסימה לדשים המהונדסים ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- הכן את תמיסת הנוגדן העיקרית על ידי דילול של נוגדן אקטין שריר אנטי-חלק (anti-SMA) של עכבר 1:50 בתמיסת BSA של 5% שהוכנה בעבר כדי להכתים את תאי התמיכה המבטאים SMA.
- דגירה של הפיגומים בתמיסת הנוגדנים העיקרית בן לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף 3x 5 דקות עם PBS.
- הכן את תמיסת הנוגדן המשני על ידי דילול נוגדן IgG 1:400 של עז מצומדת Cy3 ונוגדן 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל) ב-PBS.
- יש למרוח את תמיסת הנוגדנים המשנית על הפיגומים ולדגום במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף 3x 5 דקות עם PBS.
- אחסן את המבנים בטמפרטורה של 4 °C ב- PBS למשך עד חודש אחד.
- דמיינו את הפיגומים המוכתמים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר.
- הגדר את שלושת הערוצים הפלואורסצנטיים (DAPI, ZsGreen ו- Cy3) בתוכנת רכישת התמונות של המיקרוסקופ.
- הגדר ערימת Z עם עובי מקטע של 2 מיקרומטר המשתרע על פני עובי כולל של 50 מיקרומטר. לאחר מכן, הגדר סריקת אריחים כדי לצלם אזורים גדולים יותר של המבנה.
- התאם את פרמטרי הרכישה כדי לקבל אות פלואורסצנטי ברור ללא רוויה ורקע מינימלי.
- קבל את התמונות באמצעות המטרה 20x/0.8 עם זום של 1.0x (גודל פיקסל 0.31 מיקרומטר).
- בצע הקרנה בעוצמה מרבית של מחסנית Z שנרכשה כדי להשיג תמונה דו-ממדית אחת באמצעות תוכנת רכישת התמונה במיקרוסקופ או בתוכנת ניתוח תמונות דומה.
9. אנסטומוס הדש המהונדס ישירות לעורק הירך של חולדה באמצעות טכניקת חפתים
- מכינים ומעקרים (אוטוקלאב) את הכלים הכירורגיים הבאים: אזמל מס' 15, זוג מלקחיים בעלי שיניים עדינות וזוג קטן של מספריים עם טיפול בטבעת. בנוסף, הכינו ועקרו את הכלים המיקרו-כירורגיים הבאים: מלקחיים ישרים ומחודדים מס' 3 של תכשיטן מס', מלקחיים של תכשיטן זוויתי, מחזיק מחט בעל ידית עגולה עם לסתות מעוקלות, זוג מרחיבי כלי, מספריים מנתחים, מספריים אדוונטיטיים, וכן מהדקי כלי עם המוליך שלהם.
- הכינו תמיסה של 100 IU/mL מלוחים הפריניים על ידי דילול 5 מ"ל של תמיסת הפרין במלאי עם 195 מ"ל של מי מלח.
- חותכים ומעקרים את אזיקי הפולימיד.
- חותכים מקטעים של 2.5 מ"מ של שפופרת פולימיד מתחת למיקרוסקופ ניתוח.
- בקצה אחד של כל חתך, בצע חתך באורך 1.25 מ"מ בקיר הצינור כדי לקבל ידית חפתים. בצע חיתוך זוויתי בקצה השני של הצינור כדי להקל על תפיחת כלי השיט.
- הטביעו את האזיקים ב-70% אתנול ולאחר מכן שתי שטיפות עם מי מלח הפריניים.
- הכינו חולדה ספראג-דאולי זכרית (275-350 גרם) לניתוח.
- שבעה ימים לפני הניתוח, התחילו לתת מינון יומי תת עורי של ציקלוספורין (10 מ"ג ק"ג-1) כדי להשיג דיכוי חיסוני.
- לפני הניתוח, מרדימים את החיה באמצעות שאיפת איזופלורן של 3% על פי SOP מוסדי באמצעות תא אינדוקציה. אמתו הרדמה עמוקה על ידי צביטה בשתי כפות הרגליים ובדיקת רפלקסים.
- מתן מינון תת עורי של בופרנורפין משכך כאבים (0.03 מ"ג ק"ג-1) והפרין נוגד קרישה (200 יחב"ל ק"ג-1).
- יש למרוח משחת סיכה לעיניים על עיני החיה כדי למנוע התייבשות.
- לגלח את האזור הכירורגי של החולדה ולחטא את האתר עם יוד ולאחר מכן 70% אתנול. הצמידו את גפי החיה לשולחן באמצעות סרט דבק.
- לחשוף ולבודד את עורק הירך המשותף.
- בצע חתך אלכסוני באורך 2 ס"מ דרך העור, לאורך הקעורה בין הרגל לבטן.
- באמצעות מלקחיים ומספריים בעלי קצה קהה, שחררו את העור מהרקמה שמתחת כדי לדמיין את כרית השומן המפשעתית.
- באמצעות מספריים ומלקחיים, חותכים ישר דרך כרית השומן סביב השוליים העליונים, המדיאליים והתחתונים. שימו לב לא לחתוך כלים גדולים מתחת למשטח השומן.
- לשקף את כרית השומן לרוחב, משאיר את כלי העיכול epigastric שלם. מניחים גזה רטובה על כרית השומן המוחזרת כדי למנוע ייבוש ולקבע אותה במקומה. ודא שכלי הירך הנפוצים גלויים לעין.
הערה: כרית השומן תשמש מאוחר יותר להפעלת לחץ רך על האנסטומוזות. - חשוף את עורק הירך מהרצועה המפשעתית באופן פרוקסימלי לנקודת ההסתעפות של העורק האפיגסטרי באופן דיסטלי על ידי חילוץו מהנדן שלו.
אזהרה: בדרך כלל יש ענף של עורק הירך העובר מתחתיו, המכונה בדרך כלל הענף של מרפי. שימו לב לא לפגוע בענף הקשה הזה. - מחלקים את הענף של מרפי על ידי קשירתו, ולאחר מכן מפרידים את עורק הירך עם שתי ליגטורות במרכז העורק במרווח של 1 מ"מ זו מזו. יש לשמור על קצה אחד של תפר הליגטורה זמן רב כדי להשתמש בו מאוחר יותר כדי למשוך את קצה הכלי דרך השרוול.
- חותכים את העורק בין שתי הליגטורות באמצעות מספריים של אדוונטיטיה.
אזהרה: לא צריך להיות כל דימום בעת ביצוע חתך זה. אם קצה העורק מדמם, הידקו את העורק והחלו מחדש ליגטורה. - באמצעות הקצה הארוך של תפר הליגטורה, יש להכניס כל קצה כלי לתוך שרוול פולימיד, כפי שהוכן בשלב הקודם, כך שידיות שני האזיקים מצביעות זו על זו.
- לאחר ההחדרה, יש למרוח מהדק בו-זמנית על ידית השרוול ועל הכלי, תוך אבטחת השרוול במקום.
- מכינים תמיסת מלח הפרינית במזרק המצויד במחט 27 גרם.
- משכו את קצה הכלי הקשור וחתכו אותו קרוב לליגטורה. מיד לשטוף את הכלי מסתיים ביסודיות עם מלוחים heparinized עד לא נראה דם בלומן.
אזהרה: יש לוודא כי קצה כלי הדם נשטף היטב מכיוון שכל דם שיישאר בפנים ייצור קריש דם, אשר יוכנס לזרם הדם עם השלמת ההליך. זה עלול להוביל לחסימה של כלי השיט ולאובדן זלוף ברגל. - הרחב את לומן הכלי על ידי החזקתו בנדן שלו ביד אחת והרחבת לומן שלו עם מרחיב הכלי ביד השנייה.
- מניחים תפר היקפי פוליפרופילן 6-0 רופף סביב גוף השרוול. אוורט את קצה הכלי באמצעות שני מרחיבים כלי על גוף השרוול ומהדק אותו במקומו על ידי הידוק התפר ההיקפי.
הערה: אם דם כלשהו דולף דרך כלי הדם המהודק במהלך המניפולציות, שטפו את הלומן ביסודיות עם מלח הפריניזציה. - יש לשטוף את הדש המהונדס במי מלח, ולאחר מכן להחדיר את השרוול המרופד בכלי לתוך לומן של פיגום כלי הדם. תקן את הפיגום במקומו על ידי הנחת תפר פוליפרופילן 6-0 היקפי סביב הפיגום וגוף השרוול. בצע שלב זה עבור שני צידי פיגום כלי הדם.
- עוטפים מסנן קרום פוליסטירן של 0.2 מיקרומטר סביב אתר האנסטומוזות כדי לבודד את הדש המהונדס מהרקמה הסובבת.
- שחררו תחילה את המהדק הדיסטלי; לאחר מכן, שחררו את המהדק הפרוקסימלי כדי להקים מחדש את זרימת הדם דרך כלי הדם.
- כדי לעצור כל דימום דרך האנסטומוזות, יש לשקף את כרית השומן בחזרה מעל כלי הירך ולהפעיל לחץ עדין באמצעות גזה סטרילית למשך 3 דקות.
- לתפור את כרית השומן בחזרה למקומה באמצעות פוליפרופילן 6-0; לאחר מכן, לתפור את העור באמצעות 5-0 תפרים נספגים PGA.
- מנקים את אזור הפצע עם מי מלח ומורחים תמיסת יוד.
- לכאבים לאחר הניתוח ולניהול בעלי חיים, הכינו 0.1% (v/v) של טרמדול במי השתייה. יתר על כן, לתת מינון יומי של הפרין (200 IU ק"ג-1) ו cyclosporine (10 מ"ג ק"ג-1).
- מניחים את החיה בכלוב נקי בפני עצמו ומונחים מתחת למנורת חימום. ממשיכים לעקוב אחר החיה עד שהיא חוזרת להכרה מספקת כדי לשמור על התאוששות החזה.
Representative Results
פרוטוקול זה מתאר ייצור של דש מהונדס המורכב מפיגום כלי דם (איור 1Ai) ומיקרו-וסקולטורה מודפסת ביולוגית (איור 1Aii), אשר הורכבו כדי להשיג כלי דם מזוקליים ומיקרו-ממדיים (איור 1Aiii). בעקבות הפרוטוקול, תבניות BVOH של פיגום כלי הדם תוכננו והודפסו בתלת-ממד (איור 1B,C). המבנים המודפסים שהתקבלו נבדקו חזותית לאיתור גדילים קטנים של BVOH, שניתן למצוא בחללים הריקים של התבניות (איור 1D). גדילים אלה בדרך כלל מצביעים על הגדרות חומרים שגויות או שה-BVOH ספג לחות. יש להסיר גדילים אלה מכיוון שהם עלולים להוביל למילוי לא שלם של העובש ולפגמים מבניים בפיגום כלי הדם שנוצר. לאחר מכן, התבניות מולאו בתמיסת PLLA:PLGA, ואחריה תהליך ייבוש ההקפאה ושלבי הכביסה, כמתואר בפרוטוקול. פיגום כלי הדם PLLA:PLGA שהתקבל נבדק באופן חזותי כדי לאמת את שלמות דופן כלי השיט ואת טפיחות לומן (איור 1E).
ביואינק rhCollMA מנוטרל בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל הוכן ושולב ביחס של 1:1 עם תמיסת PEO:LAP. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של השומן האנושי המסומנים ב-Zs-Green1 ובתאי גזע של עיסת דנטלית הוכנסו לשימוש חוזר עם הביואינק rhCollMA, והתמיסה הועמסה לתוך מחסנית הדפסה ועל המדפסת. צורות קופסה עם ערוץ מרכזי עם תבנית רקטלינארית (איור 1D) הודפסו ביולוגית בתוך אמבט התמיכה בג'לטין. לאחר ההדפסה, המבנים הוצלבו, ואמבט התמיכה הומס ונשטף. לאחר 4 ימים של תרבות, המבנים צולמו בשידור חי כדי לבדוק הרכבה עצמית של רשת מיקרו-וסקולרית. איור 1D מציג דוגמה לרשת מיקרו-וסקולרית מפותחת מאוד של HAMEC-ZsGreen1 במבנה המודפס ביולוגית.
לאחר מכן, פיגום כלי דם מצופה פיברונקטין הוכנס לערוץ המרכזי של המבנה המודפס (איור 2A). המבנים המורכבים היו בתרבית במשך יומיים, שבמהלכם התאים נדבקים בג'ל, ומחברים אותו בחוזקה לפיגום הווסקולרי. לאחר מכן, פיגום כלי הדם היה מרופד ב- HAMECs המבטאים tdTomato, על פי הפרוטוקול. לאחר 7 ימי תרבות, המבנים תוקנו וצולמו. איור 2B מראה מבט צדדי על המבנים המורכבים שבהם תאי האנדותל במיקרו-וסקולטורה המודפסת ביולוגית מתוארים בירוק, בעוד שהרירית האנדותלית של פיגום כלי הדם מתוארת באדום. התמונה מראה הרכבה עצמית מיקרו-וסקולרית ירוקה בג'ל המודפס ביולוגית, בעוד שפיגום כלי הדם מרופד בתאי אנדותל אדומים. עם הגדלה גבוהה יותר, נבטים שמקורם בציפוי האנדותל האדום נראים נובטים ומרדימים עם הרשת המיקרו-וסקולרית המודפסת ביולוגית (איור 2C). לאחר מכן, המבנים הוכתמו עבור אקטין שרירי חלק α (SMA) כסמן לתאי הגזע הדנטליים של עיסת השיניים. לאחר ההדבקה החיסונית, המבנים צולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר (איור 2D).
לבסוף, לאחר 7 ימים של תרבית, הדשים המהונדסים הוכנסו באופן מיקרו-כירורגי לעורק הירך של חולדה, כפי שמתואר בפרוטוקול. ניתן לראות סרטון של הליך מייצג בסרטון משלים S1. איור 2E מציג תמונה מייצגת של אנסטומוזות שהושלמו לפני הסרת המהדק, ואיור 2F מציג תמונה מייצגת של אתר האנסטומוזות לאחר הסרת מהדקים והמוסטזיס. לא אמור להיות דימום גלוי לפני סגירת הפצע.
איור 1: תמונות מייצגות של כלי הדם המפוברקים של מזו והמיקרו-קנה מידה. (א) סקירה סכמטית של שלבי הפרוטוקול. הועתק עם הרשאה16. (B) תכנון CAD לתבנית הקורבן של פיגום כלי הדם. (C) מבט מהצד של תבנית הקרבה מייצגת מודפסת בתלת-ממד (סרגל קנה מידה = 0.5 מ"מ). (D) תצוגה עליונה של תבנית קורבן (סרגל קנה מידה = 0.5 מ"מ) (E) פיגום כלי דם מייצג המיוצר באמצעות פרוטוקול התיאור (סרגל קנה מידה = 5 מ"מ). (F) תכנון CAD עבור הרשת המיקרו-וסקולרית rhCollMA המודפסת ביולוגית בתלת-ממד. קווי רשת = 1 מ"מ. (G) תמונה מייצגת של רשת כלי דם מודפסת ביולוגית מפותחת מאוד המציגה את HAMEC-ZsGreen1 בירוק. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצורים: CAD = תכנון בעזרת מחשב; rhCollMA = רקומביננטי מתקרילט קולגן אנושי; HAMEC = תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של שומן אנושי; PLLA = חומצה פולי-L-לקטית; PLGA = חומצה פולילקטית-קו-גליקולית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תמונות מייצגות של הדש הווסקולרי המורכב . (A) תצלום של הרכבה מייצגת של מיקרו-וסקולטורה מודפסת ביולוגית ופיגום כלי הדם. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (B) מבט מהצד של דש מהונדס מייצג שצולם 4 ימים לאחר רירית האנדותל של פיגום כלי הדם. המיקרו-וסקולטורה המודפסת ביולוגית מוצגת בירוק (HAMEC-ZsGreen1), ואילו רירית האנדותל מוצגת באדום (HAMEC-tdTomato). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (C) תמונה מייצגת של אנסטומוזות בין כלי הדם המודפסים ביולוגית בירוק לבין רירית האנדותל באדום. סרגל קנה מידה = 200 μm. (D) תמונה מייצגת של חיסון עבור אקטין שריר חלק (אדום), גרעינים (כחול) ותאי אנדותל (ירוק) לאחר 7 ימים של דגירה. סרגל קנה מידה = 0.1 מ"מ. (E) תמונה מייצגת של אנסטומוזות שהושלמו של הדש המהונדס עם עורק הירך של חולדה לפני הסרת המהדק ו-(F) לאחר הסרת המהדק. קיצורים: HAMEC = תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של השומן האנושי; SMA = אקטין שריר חלק; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
וידאו משלים S1: הליך מיקרו-כירורגי מייצג להרדמה של פיגום כלי הדם לעורק הירך של חולדה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.
Discussion
הנדסת רקמות כלי דם היא אחד האתגרים העיקריים של הנדסת רקמות20. השיטות הנוכחיות ליצירת רקמת כלי דם מהונדסת מתמקדות ביצירת מיקרו-וסקולטורהבהרכבה עצמית 21,22,23 או בייצור פיגומי כלי דם מזוקליים 24,25 ולא בשחזור מערכת של כלי דם היררכיים, שניתן לחדור אליה באופן מיידי וישיר עם השתלה26 . בעבודה זו אנו מתארים פרוטוקול העושה שימוש בשתי שיטות הדפסה תלת-ממדיות כדי ליצור רשת כלי שיט היררכית המורכבת מכלי דם זעירים ומזוקליים. הפרוטוקול משלב רשת מיקרו-וסקולרית תלת-ממדית בהדפסה ביולוגית ובהרכבה עצמית עם פיגום כלי דם מזוקלי, ומשיג דש מושתל וסקולרי. יתר על כן, מאמר זה מציג פרוטוקול להסטה ישירה של דש זה לעורק הירך של חולדה.
הדפסה ביולוגית בתלת-ממד צברה עניין בשנים האחרונות בשל הרבגוניות שלה על פני טכניקות מסורתיות של הנדסת רקמות. בעוד שפרוטוקול זה מתאר את יצירתה של רשת מיקרו-וסקולרית בביו-אינק rhCollMA, ניתן ליישם את השיטות בהן נעשה שימוש עם שינויים מעטים בביו-אינקים רבים אחרים משפע הביו-אינקים הנחקרים והחדשניים ואמבטיות תמיכה27,28. בחרנו להשתמש ב-rhCollMA כביואינק בשל שפע הקולגן מסוג I ב-ECM האנושי, המספק סביבה מתאימה לחיבור תאים. יתר על כן, הוא מיוצר באופן רקומביננטי בצמחים ושונה עוד יותר עם קבוצות מתקרילט, המאפשרות פוטופולימריזציה והיווצרות הידרוג'לים תלת-ממדיים יציבים29,30. פוטו-קרוסלינקינג הושג על ידי הוספת הפוטוניטיטור LAP, שהוכח כלא רעיל ומופעל על ידי חשיפה לאור כחול של 405 ננומטר, מה שמפחית את הפוטוטוקסיות האפשרית של אור UV. עם זאת, השימוש בביו-אינקים רגישים לאור מחייב שימוש במדיום תרבית ללא אדום פנול להכנת הביואינק והחומר התומך. יתר על כן, הפרוטוקול מתאר את השימוש בחומר תומך בג'לטין, המאפשר שחול בנאמנות גבוהה של ביואינקים כגון rhCollMA. לכן, זה קריטי כדי להבטיח את השימוש במדיום קר במהלך הכנתו ואת הקירור של מיטת המדפסת. חימום מוגזם עלול להתרחש עקב מקור האור המשמש לקישור צולב או מטמפרטורות סביבה גבוהות.
ביו-פרינטר מבוסס שחול שימש כאן ליצירת הרשת המיקרו-וסקולרית המודפסת ביולוגית, וכיום ישנם מדפיסים ביולוגיים רבים הזמינים מסחרית שיכולים ליצור מבנים דומים. יתר על כן, ניתן לשנות את השיטות המוצעות בקלות וליישם אותן כדי לחקור גיאומטריות, גדלים ודפוסי מילוי שונים. בעבודה זו נבחרה תבנית מילוי רקטלינארית כדי ליצור נקבוביות מחוברות, וניתן להדפיס אותה במהירות יחסית בנאמנות גבוהה.
בועות אוויר מציבות אתגר משמעותי בהדפסת ביולוגיה של שחול, במיוחד בתוך חומרים תומכים. לכן, חיוני למזער את הנוכחות וההיווצרות של בועות אלה על ידי שימוש בפיפטות תזוזה חיוביות להעברת חומר התמיכה, הכנת תרחיף תאי הביו-אינק והעברתן למחסניות ההדפסה.
בעבודה זו, תאי אנדותל שמקורם בשומן אנושי ותאי גזע של עיסת דנטלית שימשו כתאים תומכים בשל בידודם הקל יחסית מהחולים. יתר על כן, ריכוז תאים כולל של 8 x 106 תאים /מ"ל נבחר מכיוון שהוכח כי ריכוז זה קובע את רשתות כלי הדם המפותחות ביותר16. בעוד שניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי ליצור מיקרו-וסקולטורה באמצעות סוגי תאים ומקורות שונים, כמו גם ביו-אינקים שונים, יש לבצע כיול של ריכוז התאים כדי לקבוע את התנאים הטובים ביותר להתפתחות הרשת המיקרו-וסקולרית. יתר על כן, תאים ספציפיים לרקמות (כלומר, מיובלסטים או אוסטאובלסטים) יכולים להיות משולבים בתוך הביואינק כדי להשיג דשים וסקולריים ספציפיים לרקמות.
התבנית של פיגום כלי הדם הנקבוביים יוצרה באמצעות חומר מסיס במים מודפס בתלת-ממד שהודפס בתלת-ממד במדפסת תלת-ממד של שחול הזמינה באופן מסחרי. התוצאה היא טכניקה חסכונית המבוססת על פלטפורמות אב-טיפוס מהירות, כך שניתן לחקור ולסנן במהירות31 גיאומטריות וגדלים רבים ושונים של פיגומי כלי דם. עם זאת, מגבלה של שיטה זו היא מגבלת הרזולוציה של רוב מדפסות התלת-ממד32. עם זאת, עם התעשייה המתפתחת במהירות סביב ייצור תוספים, מגבלות אלה צפויות להשתפר עם הזמן. השימוש בממסים אורגניים לתהליך הייצור הוא מגבלה נוספת של הפרוטוקול, שכן רוב הממסים האורגניים רעילים לתאים, ומונעים את היכולת לשלב את הליך ההדפסה הביולוגית עם תהליך ייצור פיגומי כלי הדם.
לשיטה המתוארת של זריעת הלומן של הפיגום באמצעות שאיפה בניגוד לדחיפת תרחיף התאים יש השפעות משמעותיות על לוקליזציה של התאים הזורעים. שימוש בלחץ שלילי מאפשר אנדותליזציה של הלומן הפנימי של הפיגום תוך מזעור כל שפיכה של תרחיף התא דרך הנקבים שעל דופן הפיגום16.
שיטת "השרוול" המתוארת לאנסטומוזות מיקרו-כירורגיות ניתנת לשינוי בקלות ולהסתגל לחומרים או גדלים שונים של פיגומי כלי דם, כמו גם לעורקים וורידים שונים בקנה מידה רחב של מודלים של בעלי חיים. ההתאמות לפרוטוקול יכללו גדלים שונים של שפופרות פולימיד וגדלי תפרים שונים. שיטה זו אינה דורשת ניקוב של דופן הפיגום, מה שעלול להוביל להתפתחות פגמים. עבודה זו מציגה פרוטוקול שניתן להרחיב ליישומים רבים. ההיבטים הקריטיים של פרוטוקול זה, הכוללים ייצור של כלי דם מזו ומיקרו-בקנה מידה ואת ההרכבה וההשתלה שלהם, מייצגים היבטים קריטיים של דשים מהונדסים הן עבור יישומים משחזרים, והן עבור מחקרים בהנדסת כלי דם ורקמות אחרות.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
פרויקט זה קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק מס' 818808). rhCollMA סופק בנדיבות על ידי CollPlant (רחובות, ישראל). המחברים מודים לרשות למחקר פרה-קליני בטכניון על הסיוע בטיפול בבעלי חיים, וכן לג'נט זבין, גליה בן דוד ועידן רדנסקי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dioxane | Biosolve Chemical | 42405 | |
| 27 G x 0.5" blunt tip dispensing needles | CML supply | 901-27-050 | |
| 3cc amber syringe barrel & piston set | Nordson EFD | 7012085 | Amber syringes used to block light and prevent premature crosslinking |
| 5-0 AssuCryl PGA absorbale suture | Assut Sutures | Absorbable sutures used for skin wound closure | |
| 6-0 polypropelene sutures | Assut Sutures | 9351 | |
| Acland clamps | S&T | B-1V | |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-15 | |
| Angled no.3 jeweler's forceps | S&T | JFAL-3-18 | |
| BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter | Advanced Solutions | a 6-axis 3D bioprinter | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Buprenorphine | vetmarket | B15100 | |
| BVOH filament | Verbatim | 55903 | a water-soluble 1.75 mm diameter filament |
| Clamp applying forceps | S&T | CAF-4 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| Dietrich bulldog clamps | Fine Science Tools (FST) | 18039-45 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carlo Erba Reagents | 480141 | |
| Dissection scissors | S&T | 18039-45 | |
| DMEM, High Glucose, No Phenol Red | Sartorius | 01-053-1A | |
| Duratears | Alcon | DJ03 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | glutamine substitute |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Heparin Sodium 5,000 I.U./mL | Panpharma | - | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | A stock concentration of 1 mg/mL |
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal Critical Care | NDC 66794-011-25 | |
| LifeSupport | Advanced Biomatrix | 5244 | a gelatin support slurry for FRESH 3D bioprinting |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| MICROMAN E M1000E, 100-1,000 µL | Gilson | FD10006 | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Poly(ethylene oxide), M.W. 250,000 to 400,000 | Acros Organics | 178602500 | |
| Poly(L-lactic acid), IV 5.0 dl/g (PLLA) | Polysciencse, Inc. | 18582-10 | |
| Polyimide tubing, ID: 0.0249", OD: 0.0273" | Cole-Parmer | 95820-05 | A thin-walled tube used to fabricate cuffs for microsurgical anastomoses |
| Prusa I3 MK2.5 3D Printer | Prusa Research | http://www.prusa3d.com/ | a popular commercial 3D printer |
| Resomer RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Evonik Industries | 719870 | |
| rhCollMA | CollPlant | https://collplant.com/ | generously provided by CollPlant (Rehovot, Israel) |
| round-handled needle holder | S&T | B-15-8 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
| Sodium Chloride | Biosolve Chemical | 19030591 | |
| Sodium Phosphate dibasic (NaH2PO4) | Riedel-de Haen | 4276 | |
| Solidworks | Dassault Systems | CAD software | |
| Straight no.3 jeweler's forceps | S&T | JF-3-18 | |
| Straight serrated forceps | Fine Science Tools (FST) | 11050-10 | |
| Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton Limited | 305 | |
| Triton-X 100 | BioLab LTD | 57836 | |
| TSIM | Advanced Solutions | 3D slicing and design software for the BioAssembly Bot | |
| Vessel dilator | S&T | D-5a.1 | |
| Zeiss Tivato 700 surgical microscope | Zeiss |
References
- Wallace, C. G., Wei, F. -C. C. The current status, evolution and future of facial reconstruction. Chang Gung Medical Journal. 31 (5), 441-449 (2008).
- Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G.
- Duan, B. State-of-the-art review of 3D bioprinting for cardiovascular tissue engineering. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 195-209 (2017).
- Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
- Ouyang, L., Armstrong, J. P. K., Chen, Q., Lin, Y., Stevens, M. M. Void-free 3D bioprinting for in situ endothelialization and microfluidic perfusion. Advanced Functional Materials. 30 (1), 1908349 (2020).
- Baltazar, T., et al. Three dimensional bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes, fibroblasts, pericytes, and endothelial cells. Tissue Engineering - Part A. 26 (5-6), 227-238 (2020).
- Chia, H. N., Wu, B. M. Recent advances in 3D printing of biomaterials. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 4 (2015).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
- Guillotin, B., et al. Laser assisted bioprinting of engineered tissue with high cell density and microscale organization. Biomaterials. 31 (28), 7250-7256 (2010).
- Catros, S., et al. Laser-assisted bioprinting for creating on-demand patterns of human osteoprogenitor cells and nano-hydroxyapatite. Biofabrication. 3 (2), (2011).
- Ronca, A., Ambrosio, L., Grijpma, D. W. Preparation of designed poly(d,l-lactide)/nanosized hydroxyapatite composite structures by stereolithography. Acta Biomaterialia. 9 (4), 5989-5996 (2013).
- Lan, P. X., Lee, J. W., Seol, Y. J., Cho, D. W. Development of 3D PPF/DEF scaffolds using micro-stereolithography and surface modification. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 20 (1), 271-279 (2009).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- Bhattacharjee, T., et al.
- Szklanny, A. A., et al. 3D bioprinting of engineered tissue flaps with hierarchical vessel networks (VesselNet) for direct host-to-implant perfusion. Advanced Materials. 33 (42), 2102661 (2021).
- Schleimer, K., et al. Training a sophisticated microsurgical technique: interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats. Journal of Visualized Experiments JoVE. (69), (2012).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: A new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
- Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), (2014).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
- Szklanny, A. A., et al. High-throughput scaffold system for studying the effect of local geometry and topology on the development and orientation of sprouting blood vessels. Advanced Functional Materials. 1901335, 1-13 (2019).
- Song, W., et al. Engineering transferrable microvascular meshes for subcutaneous islet transplantation. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).
- Ying, G. L., et al. Aqueous two-phase emulsion bioink-enabled 3D bioprinting of porous hydrogels. Advanced Materials. 30 (50), 1-9 (2018).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Jang, J., Park, J. Y., Gao, G., Cho, D. W. Biomaterials-based 3D cell printing for next-generation therapeutics and diagnostics. Biomaterials. 156, 88-106 (2018).
- Suntornnond, R., An, J., Chua, C. K. Roles of support materials in 3D bioprinting - present and future. International Journal of Bioprinting. 3 (1), 83-86 (2017).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human recombinant type I collagen produced in plants. Tissue Engineering - Part A. 19 (13-14), 1527-1533 (2013).
- Stein, H., et al. Production of bioactive, post-translationally modified, heterotrimeric, human recombinant type-I collagen in transgenic tobacco. Biomacromolecules. 10 (9), 2640-2645 (2009).
- Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of precision polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , 120062 (2020).
- Karakurt, I., Lin, L. 3D printing technologies: techniques, materials, and post-processing. Current Opinion in Chemical Engineering. 28, 134-143 (2020).
