Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

3 डी प्रिंटिंग प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके इंजीनियर संवहनी फ्लैप का निर्माण

Published: May 19, 2022 doi: 10.3791/63920
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion-Israel Institute of Technology

Summary

इंजीनियर फ्लैप को एक निगमित कार्यात्मक संवहनी नेटवर्क की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक पदानुक्रमित संवहनी नेटवर्क और चूहे ऊरु धमनी के लिए अपने प्रत्यक्ष माइक्रोसर्जिकल एनास्टोमोस युक्त एक 3 डी मुद्रित ऊतक प्रालंब बनाने की एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

इंजीनियरिंग प्रत्यारोपण योग्य, कार्यात्मक, मोटे ऊतकों को एक पदानुक्रमित संवहनी नेटवर्क डिजाइन करने की आवश्यकता होती है। 3 डी बायोप्रिंटिंग एक ऐसी तकनीक है जिसका उपयोग प्रिंट करने योग्य बायोमटेरियल्स की परत पर परत जोड़कर ऊतकों को बनाने के लिए किया जाता है, जिसे बायोइंक कहा जाता है, और कोशिकाओं को व्यवस्थित और स्वचालित तरीके से, जो अत्यधिक जटिल संरचनाओं को बनाने की अनुमति देता है जो पारंपरिक ऊतक इंजीनियरिंग तकनीक प्राप्त नहीं कर सकते हैं। इस प्रकार, 3 डी बायोप्रिंटिंग मिलीमेट्रिक वाहिकाओं से लेकर माइक्रोवास्कुलर नेटवर्क तक देशी वास्कुलचर जटिल संरचना की नकल करने के लिए एक आकर्षक इन विट्रो दृष्टिकोण है।

दानेदार हाइड्रोगेल में 3 डी बायोप्रिंटिंग में प्रगति ने कम चिपचिपाहट बाह्य मैट्रिक्स-आधारित बायोइंक के उच्च-रिज़ॉल्यूशन एक्सट्रूज़न को सक्षम किया। यह काम इंजीनियर संवहनी ऊतक फ्लैप बनाने के लिए एक संयुक्त 3 डी बायोप्रिंटिंग और बलिदान मोल्ड-आधारित 3 डी प्रिंटिंग दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। जिलेटिन समर्थन स्नान के भीतर पुनः संयोजक कोलेजन-मेथैक्रिलेट बायोइंक का उपयोग करके एंडोथेलियल और समर्थन कोशिकाओं के 3 डी बायोप्रिंटिंग का उपयोग स्व-इकट्ठे केशिका नेटवर्क के निर्माण के लिए किया जाता है। यह मुद्रित माइक्रोवास्कुलचर एक मेसोस्केल पोत जैसे छिद्रपूर्ण मचान के चारों ओर इकट्ठा होता है, जो एक बलिदान 3 डी मुद्रित मोल्ड का उपयोग करके गढ़ा जाता है, और एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त होता है।

यह असेंबली मेसोस्केल पोत के एंडोथेलियम को आसपास के केशिका नेटवर्क के साथ एनास्टोमोस के लिए प्रेरित करती है, एक इंजीनियर ऊतक फ्लैप के भीतर एक पदानुक्रमित संवहनी नेटवर्क स्थापित करती है। इंजीनियर फ्लैप को सीधे सर्जिकल एनास्टोमोसिस द्वारा कफ तकनीक का उपयोग करके चूहे के ऊरु धमनी में प्रत्यारोपित किया जाता है। पुनर्निर्माण सर्जरी और संवहनीकरण अध्ययन में उपयोग के लिए विभिन्न संवहनी ऊतक फ्लैप के निर्माण के लिए वर्णित विधियों का विस्तार किया जा सकता है।

Introduction

गंभीर ऊतक दोष दर्दनाक चोटों, जन्मजात दोषों या बीमारी के कारण होते हैं, और इन दोषों के इलाज के लिए वर्तमान स्वर्ण मानक ऑटोलॉगस ग्राफ्ट, संवहनी ऊतक फ्लैप और ऊतक विकल्प के रूप में माइक्रोवास्कुलर मुक्त फ्लैप का उपयोग करके है। हालांकि, इन विकल्पों में सीमित दाता साइट ऊतक और दाता साइट रुग्णता की कमियां हैं1. इस प्रकार, वैकल्पिक ऊतक विकल्पों की बढ़ती मांग है जिनका उपयोग इन दोषों को ठीक करने के लिए किया जा सकता है2. इंजीनियर ऊतक निर्माणों की मोटाई कोशिकाओं की ओर पोषक तत्वों और गैसों के प्रसार से सीमित होती है, और इसलिए, बड़े, मोटे और ठीक से पोषित मचानों को उत्पन्न करने के लिए एक उचित संवहनी नेटवर्क आवश्यक है।

इंजीनियर प्रत्यारोपण3 के संवहनीकरण को बढ़ावा देने के लिए कई दृष्टिकोण लागू किए गए हैं, जिसमें मेजबान से संवहनी समर्थन की विवो भर्ती, मचानों के भीतर विकास कारकों और साइटोकिन्स की डिलीवरी, प्रत्यारोपण का पूर्वसंवहनीकरण, माइक्रोपैटर्निंग तकनीकों का उपयोग करके एक सुगंधित ब्रांचिंग माइक्रोवेसल बिस्तर की पीढ़ी4, संवहनी चैनल / , साथ ही 3 डी बायोप्रिंटेड निर्माण 5,6 के भीतर चैनलों का निर्माण। मोटे ऊतकों के संवहनीकरण के लिए मैक्रो-स्केल और माइक्रोकेशिका-स्केल वाहिकाओं से युक्त पदानुक्रमित संवहनी नेटवर्क के समावेश की आवश्यकता होती है। मैक्रो-स्केल वाहिकाएं पूरे निर्माण में रक्त को प्रभावी ढंग से वितरित करती हैं और मेजबान रक्त वाहिकाओं के साथ माइक्रोसर्जिकल एनास्टोमोस की अनुमति देती हैं, जबकि माइक्रोकेशिका-पैमाने पर वाहिकाएं पोषक तत्व प्रसार की अनुमति देती हैं।

पारंपरिक ऊतक इंजीनियरिंग विधियों पर प्रदान किए जाने वाले फायदे के कारण बायोप्रिंटिंग ने हाल के वर्षों में मजबूत ध्यान आकर्षित किया है। ऊतक और अंग एक विशिष्ट वास्तुकला के साथ जटिल और जटिल 3 डी वस्तुएं हैं। 3 डी बायोप्रिंटिंग, उच्च रिज़ॉल्यूशन में बायोमैटेरियल्स की परतों को जमा करने की क्षमता के साथ, जटिल ऊतक और अंग विकल्प (जैसे, गुर्दे, फेफड़े, यकृत) बनाने की क्षमता को सक्षम बनाता है। बायोप्रिंटिंग के लिए कई प्रिंटिंग प्रौद्योगिकियों को अनुकूलित किया गया है, जिसमें एक्सट्रूज़न-आधारित, इंकजेट8, लेजर-असिस्टेड डिपोजिशन 9,10 और स्टीरियोलिथोग्राफी-आधारित11,12 बायोप्रिंटिंग शामिल हैं। एक्सट्रूज़न-आधारित प्रौद्योगिकियां नोजल के विपरीत सामग्री थोक सतह पर दबाव डालकर नोजल के माध्यम से सामग्री को बाहर निकालने पर भरोसा करती हैं।

निलंबित हाइड्रोगेल (फ्रेश) का फ्री-फॉर्म रिवर्सिबल एम्बेडिंग एक बायोप्रिंटिंग तकनीक13,14 है जो एक दानेदार समर्थन सामग्री का उपयोग करता है जिसमें एक्सट्रूडेड सामग्री जमा की जाती है और समर्थन स्नान द्वारा जगह में तय की जाती है। समर्थन स्नान एक्सट्रूडेड, प्री-क्रॉसलिंक्ड बायोइंक के लिए यांत्रिक समर्थन देता है जब तक कि इसकी क्रॉसलिंकिंग न हो। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि समर्थन स्नान कम चिपचिपाहट सामग्री को बाहर निकालने की अनुमति देता है जो एक्सट्रूज़न के बाद औरक्रॉसलिंकिंग 15 से पहले अपने आकार को बनाए नहीं रख सकता है। यह उपलब्ध सामग्रियों के पूल का विस्तार करता है जिसे बायोइंक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

यह पेपर एक संवहनी फ्लैप की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो माइक्रोस्केल और मेसोस्केल वास्कुलचर को जोड़ती है। इसे प्राप्त करने के लिए, बायोप्रिंटेड, सेल्फ-असेंबलिंग, माइक्रोवास्कुलर नेटवर्क पुनः संयोजक मानव कोलेजन मेथैक्रिलेट (आरएचकोल्मा) हाइड्रोगेल में उत्पन्न होते हैं, जो तब एक बड़े, प्रत्यारोपण योग्य, संवहनी मचान के इंटीरियर से जुड़ता है, जिसके परिणामस्वरूप पूरी तरह से इंजीनियर ऊतक फ्लैप16 होता है। इंजीनियर ऊतकों के तेजी से और प्रत्यक्ष छिड़काव को स्थापित करने के लिए, मेजबान जहाजों के लिए एक प्रत्यक्ष माइक्रोसर्जिकल एनास्टोमोसिस की आवश्यकता होती है। संवहनी मचान में पारंपरिक माइक्रोसर्जिकल पोत दीवार टांका लगाने का उपयोग करके एनास्टोमोज़ करने के लिए पर्याप्त सिवनी प्रतिधारण शक्ति नहीं है। इसलिए, हम चूहे की सामान्य ऊरु धमनी के साथ एनास्टोमोसिस प्राप्त करने के लिए "कफ" 17,18,19 विधि का वर्णन करते हैं। इस विधि में, पोत की दीवार को छिद्रित करने की आवश्यकता के बिना, पोत के सिरों को परिधीय टांके के साथ सुरक्षित किया जाता है।

यद्यपि प्रस्तावित प्रोटोकॉल को आरएचकोल्मा पर्यावरण में पदानुक्रमित वास्कुलचर का अध्ययन करने के लिए तैयार किया गया है, इस दृष्टिकोण का विस्तार किया जा सकता है और विभिन्न प्रकार के नए अनुप्रयोगों पर लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल विभिन्न बायोइंक में विभिन्न ऊतक-विशिष्ट कोशिकाओं को बायोप्रिंट करने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, संरचनाओं की ज्यामिति और आकार को विशिष्ट आवश्यकताओं, जैसे कि बड़े ऊतक पुनर्निर्माण या जैविक अध्ययन ों को फिट करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है।

Protocol

टेक्नियन प्री-क्लिनिकल रिसर्च अथॉरिटी (पीसीआरए टेक्नियन, नैतिकता अनुमोदन संख्या 058-05-20) की देखरेख में सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई और आयोजित की गई। इन अध्ययनों के लिए नर स्प्रैग-डॉली चूहों (275-350 ग्राम) का उपयोग किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, उपकरणों और सॉफ़्टवेयर से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. संवहनी पाड़ निर्माण

  1. कंप्यूटर एडेड डिज़ाइन (सीएडी) सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके वांछित संवहनी मचान आकार का 3 डी कंप्यूटर मॉडल बनाएं या ऑनलाइन रिपॉजिटरी से वांछित संवहनी संरचना की 3 डी फ़ाइल डाउनलोड करें।
    1. 0.9 मिमी के आंतरिक व्यास, 2 मिमी के बाहरी व्यास और 18 मिमी की ऊंचाई के साथ एक सिलेंडर बनाएं। सिलेंडर की दीवार के साथ 0.22 मिमी के व्यास के साथ रेडियल फेनेस्ट्रेशन जोड़ें।
  2. 3 डी डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मचान के लिए एक मोल्ड बनाएँ और इसे एक के रूप में निर्यात करें। एसटीएल फ़ाइल। अगला, बाद में मोल्ड को भरने को आसान बनाने के लिए डिज़ाइन में एक फ़नल जोड़ें।
  3. आयात करें. फ्यूज्ड डिपोजिशन मॉडलिंग (एफडीएम) 3 डी प्रिंटर के लिए स्लाइसिंग सॉफ्टवेयर में एसटीएल फ़ाइल। 0.1 मिमी की परत ऊंचाई के साथ मॉडल स्लाइस करें, और इसे .gcode के रूप में निर्यात करें या इसे सीधे 3 डी प्रिंटर पर भेजें।
  4. 3 डी पानी में घुलनशील ब्यूटेन-डायोल विनाइल अल्कोहल कॉपोलीमर (बीवीओएच) फिलामेंट का उपयोग करके 0.25 मिमी नोजल से लैस एफडीएम 3 डी प्रिंटर पर मोल्ड प्रिंट करें। उपयोग होने तक मुद्रित मोल्डों को वैक्यूम चैंबर में स्टोर करें।
    सावधानी: नंगे हाथों से बीवीओएच फिलामेंट को संभालने से बचें क्योंकि यह नमी-संवेदनशील है। इसके अलावा, नमी के संपर्क से बचने के लिए फिलामेंट को वैक्यूम चैंबर में स्टोर करने की सिफारिश की जाती है।
  5. 1,4-डाइऑक्सेन में पॉली-एल-लैक्टिक-एसिड (पीएलएलए) और पॉलीलैक्टिक-सह-ग्लाइकोलिक-एसिड (पीएलजीए) के 1: 1 मिश्रण का बहुलक समाधान तैयार करें।
    1. 350 मिलीग्राम पीएलएलए और 350 मिलीग्राम पीएलजीए का वजन करें और 20 मिलीलीटर ग्लास शीशी में स्थानांतरित करें।
    2. 1,4-डाइऑक्सेन के 10 एमएल को मापें और ग्लास पिपेट का उपयोग करके ग्लास शीशी में स्थानांतरित करें। कांच की शीशी में एक छोटा चुंबकीय हलचल बार जोड़ें।
      सावधानी: 1,4-डाइऑक्सेन एक खतरनाक कार्बनिक विलायक है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करें और एक धूआं हुड के अंदर काम करें।
    3. कांच की शीशी को 70 डिग्री सेल्सियस तक गर्म गर्म पानी के स्नान के अंदर रखें और रात भर सामग्री को मिलाएं जब तक कि सभी पॉलिमर पूरी तरह से भंग न हो जाएं। उपयोग होने तक समाधान को एयरटाइट ग्लास कंटेनर में स्टोर करें।
  6. पीएलएलए: पीएलजीए समाधान के साथ बीवीओएच मोल्ड्स भरें।
    1. एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके, बहुलक समाधान के 30 μL को मापें और मोल्ड में भरें।
      नोट: मोल्ड को भरने के लिए आवश्यक मात्रा डिज़ाइन किए गए पोत की मात्रा के अनुसार बदल जाएगी। मोल्ड का फ़नल पूरी तरह से भरजाने तक बहुलक समाधान जोड़ते रहें।
    2. 2 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर मोल्ड अपकेंद्रित्र। पूर्ण भरने को सुनिश्चित करने के लिए बहुलक समाधान के एक और 20 μL के साथ मोल्ड को ऊपर उठाएं।
  7. सभी बहुलक समाधान फ्रीज सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर भरे हुए मोल्डों को फ्रीज करें। रात भर लियोफिलाइज करके मोल्ड्स से विलायक निकालें।
    नोट: मोल्ड में बहुलक का रंग फ्रीज-सुखाने की प्रक्रिया के बाद स्पष्ट से सफेद होना चाहिए।
  8. बलिदान मोल्ड सामग्री को हटाने के लिए, कोमल सरगर्मी के तहत 5 एल विआयनीकृत पानी के स्नान के लिए फ्रीज-सुखाने की प्रक्रिया के बाद मोल्डों को स्थानांतरित करें। बादल छाने पर नहाने में पानी को बदल दें। जब सभी बीवीओएच घुल जाते हैं, तो मचानों को हवा से सुखाएं और उपयोग होने तक उन्हें वैक्यूम कक्ष में स्टोर करें।

2. फाइब्रोनेक्टिन के साथ संवहनी मचान कोटिंग

  1. पीएलएलए कीटाणुरहित: पीएलजीए संवहनी मचान उन्हें 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में विसर्जित करके।
  2. पीबीएस के साथ मचान 3x 5 मिनट धो लें।
  3. पीबीएस में 50 μg / एमएल मानव फाइब्रोनेक्टिन का कमजोर पड़ना तैयार करें और मचानों को कोट करें।
    1. पीबीएस के 9.5 एमएल के साथ स्टॉक फाइब्रोनेक्टिन समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) के 500 μL मिलाएं।
    2. इस फाइब्रोनेक्टिन समाधान में कीटाणुरहित संवहनी मचान विसर्जित और प्रोटीन सोखना के लिए अनुमति देने के लिए 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं।
  4. इनक्यूबेशन बाद, अनबाउंड फाइब्रोनेक्टिन को हटाने के लिए पीबीएस के साथ मचान कुल्ला। इन लेपित मचानों को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. आरएचकोल्मा बायोइंक तैयारी

  1. अम्लीय आरएचकोल्मा बायोइंक स्टॉक को बेअसर करने के लिए एक फॉस्फेट बफर तैयार करें।
    1. ना 2एचपीओ 4 के 5.495 ग्राम,एनएएच2पीओ 4 के 1.55 ग्राम, और 50 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 30 मिलीग्राम एनएसीएल को भंग करके फॉस्फेट बफर का 10 एक्स स्टॉक तैयार करें।
    2. विआयनीकृत पानी के 9 भागों के साथ 10x फॉस्फेट बफर के 1 भाग के संयोजन से 10x स्टॉक फॉस्फेट बफर का 10 गुना कमजोर पड़ने तैयार करें।
  2. अम्लीय आरएचकोल्मा समाधान को बेअसर करने के लिए 10x फॉस्फेट बफर के 100 μL के साथ स्टॉक RhCollMA समाधान के 900 μL गठबंधन।
  3. एमएल की वांछित एकाग्रता के लिए बेअसर आरएचकोल्मा समाधान को 1x फॉस्फेट बफर की आवश्यक मात्रा के साथ मिश्रण करके पतला करें।
    नोट: आरएचकोल्मा की स्टॉक एकाग्रता बहुत सारे के बीच भिन्न होती है। इसलिए, वांछित एकाग्रता तक पहुंचने के लिए आवश्यक 1x फॉस्फेट बफर की मात्रा अलग-अलग होगी।
  4. पतला तटस्थ आरएचकोल्मा के साथ संयुक्त होने के लिए पोरोजन-फोटोइनिशिएटर समाधान (पीईओ-एलएपी) तैयार करें।
    1. डीएमईएम के 10 मिलीलीटर में 160 मिलीग्राम पीईओ को भंग करके फिनोल रेड-फ्री डीएमईएम में पॉली (एथिलीन ऑक्साइड) (पीईओ) का 1.6% (डब्ल्यू /
    2. समाधान में 0.2% (डब्ल्यू / वी) एलएपी प्राप्त करने के लिए इस समाधान में 20 मिलीग्राम लिथियम फिनाइल -2,4,6-ट्राइमेथिलबेंज़ोइलफॉस्फिनेट (एलएपी) जोड़ें। इस बिंदु से, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ समाधान को कवर करें या इसे प्रकाश से बचाने के लिए इसे अंधेरी जगह पर रखें।
    3. 0.22 μm फिल्टर के माध्यम से इसे पारित करके पीईओ-एलएपी समाधान को निष्फल करें। इस समाधान को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. बायोप्रिंटिंग से पहले, अंतिम बायोइंक समाधान प्राप्त करने के लिए पीईओ-एलएपी समाधान के साथ पतला तटस्थ आरएचकोल्मा समाधान को 1: 1 अनुपात में मिलाएं। हवा के बुलबुले से परहेज करते हुए समाधान मिश्रण करने के लिए, भंवर के बजाय पाइपिंग का उपयोग करें।
  6. यदि समाधान में बहुत सारे बुलबुले पेश किए जाते हैं, तो इसे 30 एस के लिए 2,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए बायोइंक समाधान को फिर से मिलाएं।

4. दानेदार समर्थन स्नान की तैयारी

  1. जिलेटिन दानेदार समर्थन सामग्री तैयार करें।
    1. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, लियोफिलाइज्ड समर्थन सामग्री की एक 2 ग्राम ट्यूब की सामग्री को दो बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में विभाजित करें, जिनमें से प्रत्येक में लगभग 1 ग्राम होता है।
    2. प्रत्येक ट्यूब में 40 मिलीलीटर ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) फिनोल-लाल मुक्त डीएमईएम जोड़ें, और सभी लियोफिलाइज्ड समर्थन सामग्री के घुलने तक सख्ती से भंवर।
    3. परिणामी घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर बैठने दें ताकि समर्थन सामग्री को पुनर्जलीकरण करने की अनुमति मिल सके।
    4. बुलबुले को कम करने के लिए 30 मिनट के लिए एक वैक्यूम कक्ष में समर्थन सामग्री को डिगास करें।
    5. 5 मिनट के लिए 2,000 × ग्राम पर समर्थन सामग्री अपकेंद्रित्र। सुनिश्चित करें कि सामग्री ट्यूब के नीचे है और सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है।
    6. सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें, जबकि सावधान रहें कि नीचे समर्थन सामग्री की आकांक्षा न करें।
      नोट: सतह पर तैरनेवाला को हटाने के बाद ट्यूब को तिरछा करते समय समर्थन सामग्री प्रवाहित नहीं होनी चाहिए। यदि सामग्री बहती है, तो इसे फिर से उसी सेटिंग्स का उपयोग करके अपकेंद्रित्र करें लेकिन नए सतह पर तैरनेवाला जोड़ने के बिना।
  2. एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग कर एक 12 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में तैयार, कॉम्पैक्ट समर्थन सामग्री के लगभग 4 एमएल स्थानांतरण। समर्थन सामग्री को कुएं में समान रूप से फैलाने के लिए मजबूर करने के लिए एक कठिन सतह पर अच्छी तरह से प्लेट टैप करें।
    नोट: समर्थन सामग्री की न्यूनतम अनुशंसित मात्रा 3x निर्माण की मात्रा है जो इसमें मुद्रित की जाएगी।
  3. जिलेटिन कणों को पिघलने से रोकने के लिए इसके उपयोग तक, एक ठंडा बायोप्रिंटर चरण, या 4 डिग्री सेल्सियस पर समर्थन सामग्री के साथ अच्छी तरह से प्लेट रखें।

5. बायोइंक के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं और समर्थन कोशिकाओं का समावेश

  1. एंटीबायोटिक समाधान, भ्रूण गोजातीय सीरम और एंडोथेलियल सेल विकास की खुराक सहित बेसल माध्यम को इसके संबंधित मध्यम किट घटक के साथ मिलाकर निर्माता के निर्देशों के अनुसार एंडोथेलियल सेल माध्यम तैयार करें।
  2. कम ग्लूकोज डीएमईएम के 500 मिलीलीटर, भ्रूण गोजातीय सीरम के 58 एमएल, गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए) के 5.8 एमएल, ग्लूटामाइन विकल्प के 5.8 एमएल, 1 एम एचईपीईएस के 5.8 एमएल और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-निस्टैटिन समाधान के 5.8 एमएल के संयोजन से दंत लुगदी स्टेम सेल माध्यम तैयार करें।
  3. एंडोथेलियल सेल माध्यम के 10 एमएल में 2 × 106 जेडएसग्रीन 1-एक्सप्रेसिंग मानव वसा माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल सेल (एचएएमईसी-जेडएसग्रीन 1) और 6 × 106 डेंटल पल्प स्टेम सेल (डीपीएससी) युक्त एक निलंबन तैयार करें।
  4. एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए 4 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला माध्यम की आकांक्षा करें।
  5. बायोइंक के प्रति 1 एमएल 8 × 106 कोशिकाओं की कुल सेल एकाग्रता के साथ बायोइंक प्राप्त करने के लिए पहले से तैयार आरएचकोल्मा बायोइंक के 1 एमएल (पीईओ-एलएपी युक्त) में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    सावधानी: कोशिकाओं के साथ बायोइंक के संयोजन के बाद, तुरंत अगले चरण पर आगे बढ़ें। यदि कोशिकाओं को लंबे समय तक निलंबन में छोड़ दिया जाता है, तो कोशिकाएं ट्यूब के नीचे डूब जाएंगी, और उनकी व्यवहार्यता बिगड़ जाएगी। कोशिकाओं को शामिल नहीं करने वाले प्रयोगों के लिए, या तो चरण 5.1-5.5 छोड़ें, या मुद्रित निर्माणों के बढ़े हुए सूक्ष्म दृश्य के लिए कोशिकाओं के बजाय बायोइंक के साथ फ्लोरोसेंट मोती शामिल करें।
  6. मुद्रण कारतूस में कोशिकाओं-बायोइंक मिश्रण को स्थानांतरित करें।
    1. 3 एमएल एम्बर प्रिंटिंग कारतूस में 0.22 मिमी आंतरिक व्यास सुई फिट करें और कारतूस को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
    2. बुलबुले को कम करने के लिए एक सकारात्मक विस्थापन विंदुक का उपयोग करके, शीर्ष से भरकर मुद्रण कारतूस के लिए कोशिकाओं-बायोइंक मिश्रण के 1 एमएल स्थानांतरण।
  7. बायोप्रिंटर पर उपयुक्त उपकरण में मुद्रण कारतूस स्थापित करें।

6. आरएचकोल्मा बायोइंक का उपयोग करके बायोप्रिंटिंग माइक्रोवास्कुलर नेटवर्क

  1. बायोप्रिंटेड माइक्रोवास्कुलर नेटवर्क के लिए एक 3 डी सीएडी डिज़ाइन बनाएं।
    1. 4 मिमी वर्ग के 2 डी पैटर्न को स्केच करें जिसके केंद्र में 2 मिमी व्यास परिपत्र चैनल है। एक केंद्रीय चैनल के साथ 4 मिमी x 4 मिमी x 4 मिमी घन प्राप्त करने के लिए स्केच को 4 मिमी तक निकालें। इस ऑब्जेक्ट को एक के रूप में निर्यात करें. एसटीएल फ़ाइल।
  2. एक 12 अच्छी तरह से प्लेट आयात करें। बायोप्रिंटर स्लाइसिंग सॉफ्टवेयर में ठोस मॉडलिंग टैब में एसटीएल टेम्पलेट और इसे वर्चुअल प्रिंट बेड के निर्दिष्ट क्षेत्र में रखें।
  3. आयात करें. बायोप्रिंटर स्लाइसिंग सॉफ्टवेयर में ठोस मॉडलिंग टैब में घन आकार की एसटीएल फ़ाइल। बाहरी स्लाइसर का उपयोग करें चेकबॉक्स पर क्लिक करें | ऑब्जेक्ट गुण अनुभाग के अंतर्गत स्लाइसर कॉन्फ़िगर करें। पॉपअप विंडो में, भरण पैटर्न के लिए एक रेक्टिलिनियर पैटर्न चुनें, और भरण घनत्व में 30% टाइप करें। स्वीकार करें क्लिक करें.
  4. क्यूब पर क्लिक करके और माउस का उपयोग करके इसे स्थानांतरित करके प्रत्येक वांछित आभासी अच्छी तरह से क्यूब आकार की एक प्रति रखें।
  5. सामग्री जोड़ें बटन पर क्लिक करके बायोप्रिंटर स्लाइसिंग सॉफ़्टवेयर के सामग्री टैब में RhCollMA बायोइंक के लिए नई सामग्री सेटिंग्स बनाएं। मुद्रण के लिए सामग्री की सेटिंग्स चुनें। दबाव के लिए, संबंधित बॉक्स में 2 पीएसआई टाइप करें। गति के लिए, संबंधित बॉक्स में 20 मिमी /
    नोट: प्रत्येक बायोइंक सामग्री की अपनी अलग-अलग मुद्रण सेटिंग्स होती हैं जिन्हें एप्लिकेशन में सामग्री सूची में सहेजा जा सकता है।
  6. लाइन चौड़ाई और रेखा ऊंचाई मानों को 0.24 मिमी और त्वरण मान को 400 मिमी /
  7. ठोस मॉडलिंग टैब में, क्यूब ऑब्जेक्ट पर क्लिक करें, और फिर क्यूब आकार को असाइन करने के लिए सामग्री अनुभाग से आरएचकोल्मा सामग्री पर क्लिक करें। बायोअसेंबली टैब में, बायोप्रिंटर को प्रिंट जॉब भेजने के लिए सेंड प्रिंट जॉब बटन पर क्लिक करें।
  8. सेलुलर बायोइंक के साथ लोड मुद्रण कारतूस को 3 डी एक्सट्रूज़न-आधारित बायोप्रिंटर के 3 एमएल परिवेश वायवीय वितरण उपकरण में लोड करें।
  9. बायोप्रिंटर इंटरफ़ेस स्क्रीन में कंट्रोल-हीटिंग/कूलिंग टैब के तहत शांत बटन पर क्लिक करके प्रिंट बिस्तर के तापमान को 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। प्रिंटर बिस्तर पर समर्थन स्नान के साथ प्लेट लोड करें।
    नोट: परिवेश के तापमान या बायोइंक बैच परिवर्तनशीलता में अंतर के कारण प्रिंट दबाव और गति के लिए सामग्री की सेटिंग्स बदल सकती हैं। उदाहरण के लिए, ठंडे दिनों में, समान मात्रा में सामग्री को बाहर निकालने के लिए उच्च दबाव या धीमी गति की आवश्यकता होती है।
  10. बायोप्रिंटर इंटरफ़ेस स्क्रीन पर प्रिंट टैब में, चरण 6.7 में भेजे गए प्रिंट जॉब पर क्लिक करें। और प्रारंभ करें क्लिक करें | मुद्रण कार्य प्रारंभ करने के लिए जाएँ.
  11. मुद्रण के बाद, आरएचकोल्मा बायोइंक की क्रॉसलिंकिंग शुरू करने के लिए 30 एस के लिए 3 मेगावाट / सेमी2 की तीव्रता के साथ 405 एनएम प्रकाश स्रोत के लिए अच्छी तरह से प्लेट को उजागर करें।
  12. क्रॉसलिंकिंग के बाद, सभी समर्थन स्नान पिघलने तक कम से कम20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर अच्छी तरह से प्लेट सेते हैं।
  13. धीरे-धीरे तरलीकृत समर्थन स्नान की आकांक्षा करें और इसे एंडोथेलियल सेल माध्यम से बदलें। आगे के चरणों में उपयोग होने तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर निर्माणों सेते हैं।
    नोट: मुद्रण के बाद निर्माण के संकुचन के कारण, चरण 6 के रूप में एक ही दिन असेंबली चरण 7 करने की सिफारिश की जाती है।

7. इंजीनियर संवहनी फ्लैप प्राप्त करने के लिए संवहनी मचान के साथ बायोप्रिंटेड माइक्रोवास्कुलर नेटवर्क को इकट्ठा करना

  1. बायोप्रिंटेड माइक्रोवास्कुलर नेटवर्क के समर्थन सामग्री को हटाने के तुरंत बाद, बायोप्रिंटेड संरचना के मुख्य चैनल में एक फाइब्रोनेक्टिन-लेपित पीएलएलए: पीएलजीए संवहनी मचान रखें।
  2. 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इकट्ठे निर्माणों सेते हैं।
  3. एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ संवहनी मचान के लुमेन को लाइन करें।
    1. एमएल की एकाग्रता पर टीडीटोमैटो-व्यक्त मानव वसा माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएएमईसी-टीडीटोमैटो) ×एक सेल निलंबन तैयार करें।
    2. एक हाइड्रोफोबिक सतह पर इस सेल निलंबन की 20 μL छोटी बूंद रखें (यानी, एक गैर-ऊतक संस्कृति [गैर-टीसी] 10 सेमी पकवान)।
    3. धीरे-धीरे संवहनी मचानों को छोटी बूंद के शीर्ष पर रखें, जैसे कि एक छोर पर मचान का लुमेन सेल बूंद के साथ संपर्क बनाता है।
    4. मचान के विरोधी छोर से छोटी बूंद की आकांक्षा करें (यानी, वह अंत जो छोटी बूंद से संपर्क नहीं कर रहा है), सेल निलंबन के साथ अपने लुमेन को भरना।
    5. एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में वरीयता प्राप्त मचान रखें और इसे 60 मिनट के लिए एक आर्द्र इनक्यूबेटर में अंदर एक रोटेटर में रखें। अगला, मचान को 12-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें और एंडोथेलियल सेल माध्यम के 2 एमएल जोड़ें।
  4. ताजा एंडोथेलियल सेल माध्यम के साथ हर 2 दिनों में माध्यम को प्रतिस्थापित करते हुए, 7 दिनों के लिए इंजीनियर फ्लैप को संस्कृति दें।

8. इंजीनियर फ्लैप के कन्फोकल माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना

  1. संस्कृति के 4 दिनों और 7 दिनों के बाद, एक कॉन्फोकल लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इकट्ठे मचानों की लाइव-सेल इमेजिंग करें।
    1. माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर जेडएसग्रीन 1 और टीडीटोमैटो फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए प्रतिदीप्ति चैनलों को परिभाषित करें।
    2. 0.5x ज़ूम (पिक्सेल आकार 5 μm) के साथ एक 5x/ 0.16 उद्देश्य लेंस चुनें, और 41 μm प्रत्येक की मोटाई के साथ 22 स्लाइस के साथ एक Z-स्टैक को परिभाषित करें।
    3. छवि के लिए 3 x 2 टाइल स्कैन को परिभाषित करें और पूरे निर्माण को कैप्चर करें।
  2. लेजर तीव्रता को समायोजित करें और कोई संतृप्ति और न्यूनतम पृष्ठभूमि के साथ एक स्पष्ट फ्लोरोसेंट संकेत प्राप्त करने और छवियों को प्राप्त करने के लिए मूल्यों को प्राप्त करें।
  3. माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर या इसी तरह की छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक एकल 2 डी छवि प्राप्त करने के लिए अधिग्रहित जेड-स्टैक का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण करें।
  4. ब्याज के एक क्षेत्र की उच्च आवर्धन इमेजिंग प्रदर्शन करें।
    1. 0.5 ज़ूम (पिक्सेल आकार 1.25 μm) के साथ 10x/0.3 उद्देश्य लेंस पर स्विच करें और 41 μm की मोटाई के 9 स्लाइस के साथ एक Z-स्टैक को परिभाषित करें।
    2. चरण 8.2.-8.3 निष्पादित करें।
  5. संस्कृति के 7 दिनों के बाद, इंजीनियर फ्लैप को 20 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में डुबोकर ठीक करें।
  6. पीबीएस के साथ 3x 5 मिनट निर्माण धो लें।
  7. निर्माणों के लिए पीबीएस में 0.3% (वी / वी) ट्राइटन-एक्स जोड़ें और कोशिकाओं को पारगम्य बनाने के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  8. पीबीएस के साथ 3x 5 मिनट निर्माण धो लें।
  9. पीबीएस में 5% (डब्ल्यू / वी) गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) को भंग करके एक अवरुद्ध समाधान तैयार करें। इंजीनियर फ्लैप में अवरुद्ध समाधान जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  10. एसएमए-व्यक्त समर्थन कोशिकाओं को दागने के लिए पहले तैयार 5% बीएसए समाधान में माउस विरोधी चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एंटी-एसएमए) 1:50 एंटीबॉडी को पतला करके प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में मचान सेते हैं।
  12. पीबीएस के साथ 3x 5 मिनट धो लें।
  13. पीबीएस में सीवाई 3-संयुग्मित बकरी एंटी-माउस आईजीजी 1: 400 एंटीबॉडी और 4 ', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई, 2.5 μg /
  14. मचान के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान लागू करें और कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए सेते हैं।
  15. पीबीएस के साथ 3x 5 मिनट धो लें।
  16. 1 महीने तक पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्माणों को स्टोर करें।
  17. एक कॉन्फोकल लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दाग मचानों की छवि।
    1. माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर तीन प्रतिदीप्ति चैनलों (डीएपीआई, जेडएसग्रीन और सीवाई 3) को परिभाषित करें।
    2. 50 μm की कुल मोटाई फैले 2 μm की एक खंड मोटाई के साथ एक Z-स्टैक को परिभाषित करें। अगला, निर्माण के बड़े क्षेत्रों की छवि के लिए एक टाइल स्कैन को परिभाषित करें।
    3. कोई संतृप्ति और न्यूनतम पृष्ठभूमि के साथ एक स्पष्ट फ्लोरोसेंट संकेत प्राप्त करने के लिए अधिग्रहण मापदंडों को समायोजित करें।
    4. 1.0x ज़ूम (पिक्सेल आकार 0.31 μm) के साथ 20x/0.8 उद्देश्य का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण करें।
  18. माइक्रोस्कोप छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर या इसी तरह की छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक एकल 2 डी छवि प्राप्त करने के लिए अधिग्रहित जेड-स्टैक का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण करें।

9. एक कफ तकनीक का उपयोग करके एक चूहे की ऊरु धमनी के लिए सीधे इंजीनियर फ्लैप को एनास्टोमोस करना

  1. निम्नलिखित सर्जिकल टूल तैयार करें और निष्फल करें (आटोक्लेव): नंबर 15 स्केलपेल, ठीक दांतेदार संदंश की एक जोड़ी, और अंगूठी-संभाली कैंची की एक छोटी जोड़ी। इसके अलावा, निम्नलिखित माइक्रोसर्जिकल टूल तैयार करें और निष्फल करें: एक सीधा ठीक-नुकीला नंबर 3 जौहरी का संदंश, एक कोण वाले जौहरी के संदंश, घुमावदार जबड़े के साथ एक गोल-संभाल सुई धारक, पोत फैलाव की एक जोड़ी, विदारक कैंची, एडवेंटिटिया कैंची, साथ ही साथ उनके आवेदक के साथ पोत क्लैंप।
  2. 195 मिलीलीटर खारा के साथ स्टॉक हेपरिन समाधान के 5 मिलीलीटर पतला करके 100 आईयू / एमएल हेपरिनाइज्ड खारा का समाधान तैयार करें।
  3. पॉलीमाइड कफ को काटें और निष्फल करें।
    1. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक पॉलीमाइड ट्यूब के 2.5 मिमी वर्गों में कटौती करें।
    2. प्रत्येक खंड के एक छोर पर, कफ हैंडल प्राप्त करने के लिए ट्यूब की दीवार में 1.25 मिमी लंबाई में चीरा लगाएं। पोत विचलन को कम करने के लिए ट्यूब के दूसरे छोर पर एक कोण कट बनाएं।
    3. 70% इथेनॉल में कफ को डुबोएं, इसके बाद हेपरिनाइज्ड खारा के साथ दो वॉश करें।
  4. सर्जरी के लिए एक पुरुष स्प्रैग-डॉली चूहा (275-350 ग्राम) तैयार करें।
    1. सर्जरी से सात दिन पहले, प्रतिरक्षा दमन प्राप्त करने के लिए साइक्लोस्पोरिन (10 मिलीग्राम किग्रा -1) की चमड़े के नीचे की दैनिक खुराक का प्रशासन शुरू करें।
    2. सर्जरी से पहले, प्रेरण कक्ष का उपयोग करके संस्थागत एसओपी के अनुसार 3% आइसोफ्लूरेन साँस लेना का उपयोग करके जानवर को संवेदनाहारी करें। दोनों पैरों को चुटकी और सजगता की जांच करके गहरी संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
    3. एनाल्जेसिक ब्यूप्रेनोर्फिन (0.03 मिलीग्राम किग्रा -1) और थक्कारोधी हेपरिन (200 आईयू किग्रा -1) की चमड़े के नीचे की खुराक का प्रशासन करें।
    4. निर्जलीकरण को रोकने के लिए जानवर की आंखों पर एक चिकनाई आंख मरहम लागू करें।
    5. चूहे के सर्जिकल क्षेत्र दाढ़ी और आयोडीन और फिर 70% इथेनॉल के साथ साइट कीटाणुरहित। चिपकने वाला टेप का उपयोग करके जानवर के अंगों को मेज पर सुरक्षित करें।
  5. आम ऊरु धमनी को उजागर और अलग करें।
    1. पैर और पेट के बीच की संकुचन के साथ त्वचा के माध्यम से 2 सेमी लंबा, तिरछा चीरा बनाएं।
    2. संदंश और कुंद समाप्त कैंची का उपयोग करके, वंक्षण वसा पैड की कल्पना करने के लिए अंतर्निहित ऊतक से त्वचा को छोड़ दें।
    3. कैंची और संदंश का उपयोग करके, ऊपरी, औसत दर्जे का और निचले मार्जिन के चारों ओर वसा पैड के माध्यम से सही कटौती करें। वसा पैड के नीचे बड़े जहाजों को न काटने पर ध्यान दें।
    4. वसा पैड को पार्श्व रूप से प्रतिबिंबित करें, जिससे एपिगैस्ट्रिक वाहिकाओं को बरकरार रखा जा सके। सुखाने को रोकने और इसे ठीक करने के लिए प्रतिबिंबित वसा पैड पर एक गीला धुंध रखें। सुनिश्चित करें कि सामान्य ऊरु वाहिकाएं दिखाई दे रही हैं।
      नोट: वसा पैड का उपयोग बाद में एनास्टोमोस पर नरम दबाव लागू करने के लिए किया जाएगा।
    5. वंक्षण स्नायुबंधन से ऊरु धमनी को समीपस्थ रूप से एपिगैस्ट्रिक धमनी ब्रांचिंग पॉइंट तक अपने म्यान से निकालकर उजागर करें।
      चेतावनी: आमतौर पर इसके नीचे ऊरु धमनी की एक शाखा चल ती है, जिसे आमतौर पर मर्फी की शाखा कहा जाता है। ध्यान दें कि इस कठिन-से-देखने वाली शाखा को नुकसान न पहुंचाएं।
    6. मर्फी की शाखा को लिगेट करके विभाजित करें, और फिर धमनी के बीच में दो संयुक्ताक्षरों के साथ ऊरु धमनी को लिगेट करें जो 1 मिमी अलग है। कफ के माध्यम से पोत के अंत को खींचने के लिए बाद में उपयोग करने के लिए संयुक्ताक्षर सिवनी के एक छोर को लंबा रखें।
  6. एडवेंटिटिया कैंची का उपयोग करके दो संयुक्ताक्षरों के बीच धमनी को काटें।
    सावधानी: इस कटौती को करते समय कोई रक्तस्राव नहीं होना चाहिए। यदि धमनी अंत खून बहता है, तो धमनी को दबाएं और एक संयुक्ताक्षर को फिर से लागू करें।
  7. संयुक्ताक्षर सिवनी के लंबे छोर का उपयोग करके, प्रत्येक पोत के अंत को एक पॉलीमाइड कफ में डालें, जैसा कि पिछले चरण में तैयार किया गया था, जैसे कि दो कफ के हैंडल एक दूसरे से दूर की ओर इशारा कर रहे हैं।
  8. सम्मिलन के बाद, कफ हैंडल और पोत पर एक साथ एक क्लैंप लागू करें, जगह में कफ को सुरक्षित करें।
  9. 27 जी सुई से लैस सिरिंज में एक हेपरिनाइज्ड खारा समाधान तैयार करें।
  10. लिगेटेड पोत के अंत पर खींचें और इसे संयुक्ताक्षर के करीब काट लें। पोत के अंत को हेपरिनाइज्ड खारा के साथ तुरंत धो लें जब तक कि लुमेन में कोई रक्त दिखाई न दे।
    सावधानी: सुनिश्चित करें कि पोत के अंत को अच्छी तरह से धोया जाता है क्योंकि अंदर छोड़ा गया कोई भी रक्त एक थक्का बनाएगा, जिसे प्रक्रिया पूरी करने पर रक्तप्रवाह में पेश किया जाएगा। इससे पोत का रोड़ा और पैर में छिड़काव का नुकसान हो सकता है।
  11. पोत के लुमेन को एक हाथ से उसके म्यान से पकड़कर और दूसरे हाथ से बर्तन फैलाने वाले से उसके लुमेन को फैलाकर फैलाएं।
  12. कफ शरीर के चारों ओर एक ढीला 6-0 पॉलीप्रोपाइलीन परिधीय सिवनी रखें। कफ शरीर पर दो पोत फैलाव का उपयोग करके पोत समाप्त हो जाता है और परिधीय सिवनी को कसकर इसे सुरक्षित करता है।
    नोट: यदि जोड़तोड़ के दौरान क्लैंप किए गए पोत के माध्यम से कोई रक्त लीक होता है, तो लुमेन को हेपरिनाइज्ड खारा के साथ अच्छी तरह से धो लें।
  13. हेपरिनाइज्ड खारा के साथ इंजीनियर फ्लैप को कुल्ला, और फिर संवहनी मचान के लुमेन में पोत-पंक्तिबद्ध कफ डालें। मचान और कफ शरीर के चारों ओर एक परिधीय 6-0 पॉलीप्रोपाइलीन सिवनी रखकर मचान को ठीक करें। संवहनी मचान के दोनों किनारों के लिए यह कदम उठाएं।
  14. आसपास के ऊतक से इंजीनियर फ्लैप को अलग करने के लिए एनास्टोमोस साइट के चारों ओर एक 0.2 μm पॉलीस्टाइनिन झिल्ली फ़िल्टर लपेटें।
  15. पहले डिस्टल क्लैंप जारी करें; फिर, पोत के माध्यम से रक्त प्रवाह को फिर से स्थापित करने के लिए समीपस्थ क्लैंप जारी करें।
  16. एनास्टोमोस के माध्यम से किसी भी रक्तस्राव को रोकने के लिए, ऊरु वाहिकाओं पर वसा पैड को वापस प्रतिबिंबित करें और 3 मिनट के लिए बाँझ धुंध का उपयोग करके कोमल दबाव लागू करें।
  17. 6-0 पॉलीप्रोपाइलीन का उपयोग करके वसा पैड को वापस सीवन करें; फिर, 5-0 पीजीए अवशोषित टांके का उपयोग करके त्वचा को सीवन करें।
  18. खारा के साथ घाव क्षेत्र को साफ करें और आयोडीन समाधान लागू करें।
  19. पश्चात दर्द और पशु प्रबंधन के लिए, पीने के पानी में ट्रामाडोल का 0.1% (वी / इसके अलावा, हेपरिन (200 आईयू किग्रा -1) और साइक्लोस्पोरिन (10 मिलीग्राम किग्रा -1) की दैनिक खुराक का प्रशासन करें।
  20. एक हीटिंग लैंप के नीचे रखे गए जानवर को एक साफ पिंजरे में रखें। जानवर की निगरानी करना जारी रखें जब तक कि वह स्टर्नल रिकंबेंसी बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न करे।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल एक संवहनी मचान (चित्रा 1 एआई) और एक बायोप्रिंटेड माइक्रोवास्कुलचर (चित्रा 1 एआईआई) से बना एक इंजीनियर फ्लैप के निर्माण का वर्णन करता है, जिसे मेसोस्केल और माइक्रोस्केल वास्कुलचर (चित्रा 1 एआईआईआई) प्राप्त करने के लिए इकट्ठा किया गया था। प्रोटोकॉल के बाद, संवहनी पाड़ के बीवीओएच मोल्ड डिजाइन किए गए थे और 3 डी मुद्रित (चित्रा 1 बी, सी)। प्राप्त मुद्रित संरचनाओं को बीवीओएच के छोटे किस्में के लिए नेत्रहीन निरीक्षण किया गया था, जो मोल्ड्स (चित्रा 1 डी) के खाली स्थानों में पाया जा सकता है। ये किस्में आमतौर पर गलत सामग्री सेटिंग्स का संकेत देती हैं या बीवीओएच ने नमी को अवशोषित कर लिया है। इन किस्में को हटा दिया जाना चाहिए क्योंकि वे परिणामस्वरूप संवहनी मचान में मोल्ड और संरचनात्मक दोषों के अधूरे भरने का कारण बन सकते हैं। अगला, मोल्डपीएलएलए: पीएलजीए समाधान से भरे हुए थे, इसके बाद फ्रीज-सुखाने की प्रक्रिया और धोने के चरण, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है। प्राप्त पीएलएलए: पीएलजीए संवहनी मचान पोत दीवार अखंडता और लुमेन पैटेंसी (चित्रा 1 ई) को सत्यापित करने के लिए नेत्रहीन निरीक्षण किया गया था।

एमएल की एकाग्रता पर एक बेअसर आरएचकोल्मा बायोइंक तैयार किया गया था और पीईओ: एलएपी समाधान के साथ 1: 1 अनुपात में संयुक्त किया गया था। जेड-ग्रीन 1 और दंत लुगदी स्टेम कोशिकाओं के साथ लेबल किए गए मानव वसा माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को आरएचकोल्मा बायोइंक के साथ फिर से निलंबित कर दिया गया था, और समाधान को प्रिंटिंग कारतूस और प्रिंटर पर लोड किया गया था। एक रेक्टिलिनियर पैटर्न (चित्रा 1 डी) के साथ एक केंद्रीय चैनल के साथ बॉक्स आकार जिलेटिन समर्थन स्नान के अंदर बायोप्रिंट किए गए थे। मुद्रण के बाद, निर्माणों को क्रॉसलिंक किया गया था, और समर्थन स्नान को भंग कर दिया गया था और धोया गया था। संस्कृति के 4 दिनों के बाद, माइक्रोवास्कुलर नेटवर्क स्व-असेंबली की जांच के लिए निर्माणों को लाइव-इमेज किया गया था। चित्रा 1 डी बायोप्रिंटेड निर्माण में एक अत्यधिक विकसित एचएएमईसी-जेडएसग्रीन 1 माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क का एक उदाहरण दिखाता है।

अगला, एक फाइब्रोनेक्टिन लेपित संवहनी मचान मुद्रित निर्माण (चित्रा 2 ए) के केंद्रीय चैनल में डाला गया था। इकट्ठे निर्माणों को 2 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था, जिसके दौरान कोशिकाएं जेल को अनुबंधित करती हैं, इसे संवहनी मचान से दृढ़ता से संलग्न करती हैं। फिर, संवहनी मचान प्रोटोकॉल के अनुसार, टीडीटोमैटो व्यक्त करने वाले एचएएमईसी के साथ पंक्तिबद्ध था। संस्कृति के 7 दिनों के बाद, निर्माणों को तय किया गया और चित्रित किया गया। चित्रा 2 बी इकट्ठे निर्माणों का एक साइड व्यू दिखाता है जहां बायोप्रिंटेड माइक्रोवास्कुलचर में एंडोथेलियल कोशिकाओं को हरे रंग में दर्शाया गया है, जबकि संवहनी मचान के एंडोथेलियल अस्तर को लाल रंग में दर्शाया गया है। छवि बायोप्रिंटेड जेल में एक हरे रंग की माइक्रोवास्कुलर स्व-असेंबली दिखाती है, जबकि संवहनी मचान लाल एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ पंक्तिबद्ध है। उच्च आवर्धन के साथ, लाल एंडोथेलियल अस्तर से उत्पन्न स्प्राउट्स को बायोप्रिंटेड माइक्रोवास्कुलर नेटवर्क (चित्रा 2 सी) के साथ अंकुरित और एनास्टोमोसिंग देखा जाता है। अगला, निर्माणों को दंत लुगदी स्टेम कोशिकाओं के लिए एक मार्कर के रूप में α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए) के लिए दाग दिया गया था। इम्यूनोस्टेनिंग के बाद, निर्माणों को लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 डी) का उपयोग करके चित्रित किया गया था।

अंत में, संस्कृति के 7 दिनों के बाद, इंजीनियर फ्लैप को प्रोटोकॉल में वर्णित चूहे की ऊरु धमनी के लिए माइक्रोसर्जिक रूप से एनास्टोमोज़ किया गया था। एक प्रतिनिधि प्रक्रिया का एक वीडियो पूरक वीडियो एस 1 में देखा जा सकता है। चित्रा 2 ई क्लैंप हटाने से पहले एक पूर्ण एनास्टोमोस की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है, और चित्रा 2 एफ क्लैंप हटाने और हेमोस्टेसिस के बाद एनास्टोमोस साइट की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है। घाव बंद होने से पहले कोई रक्तस्राव दिखाई नहीं देना चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: गढ़े हुए मेसो- और माइक्रोस्केल जहाजों की प्रतिनिधि छवियां। (ए) प्रोटोकॉल के चरणों का योजनाबद्ध अवलोकन। अनुमति के साथ पुन: पेश कियागया 16. (बी) संवहनी मचान के बलिदान मोल्ड के लिए सीएडी डिजाइन। (सी) एक प्रतिनिधि 3 डी मुद्रित बलिदान मोल्ड (स्केल बार = 0.5 मिमी) का साइड व्यू। (डी) बलिदान मोल्ड का शीर्ष दृश्य (स्केल बार = 0.5 मिमी) (ई) प्रतिनिधि संवहनी पाड़ वर्णन प्रोटोकॉल (स्केल बार = 5 मिमी) का उपयोग करके गढ़ा गया है। (एफ) 3 डी बायोप्रिंटेड आरएचकोल्मा माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क के लिए सीएडी डिजाइन। ग्रिड लाइनें = 1 मिमी (जी) एक अत्यधिक विकसित बायोप्रिंटेड संवहनी नेटवर्क की प्रतिनिधि छवि हरे रंग में एचएएमईसी-जेडएसग्रीन 1 दिखा रही है। स्केल बार = 200 μm। संक्षिप्त नाम: सीएडी = कंप्यूटर एडेड डिज़ाइन; आरएचकोल्मा = पुनः संयोजक मानव कोलेजन मेथैक्रिलेट; एचएएमईसी = मानव वसा माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं; पीएलएलए = पॉली-एल-लैक्टिक एसिड; पीएलजीए = पॉलीलैक्टिक-सह-ग्लाइकोलिक एसिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: इकट्ठे संवहनी फ्लैप की प्रतिनिधि छवियां (ए) बायोप्रिंटेड माइक्रोवास्कुलचर और संवहनी मचान की प्रतिनिधि असेंबली की एक तस्वीर। स्केल बार = 1 मिमी (बी) संवहनी मचान के एंडोथेलियल अस्तर के 4 दिन बाद इमेज किए गए प्रतिनिधि इंजीनियर फ्लैप का साइड व्यू। बायोप्रिंटेड माइक्रोवास्कुलचर को हरे रंग (एचएएमईसी-जेडएसग्रीन 1) में दिखाया गया है, जबकि एंडोथेलियल अस्तर को लाल (एचएएमईसी-टीडीटोमैटो) में दिखाया गया है। स्केल बार = 1 मिमी (सी) हरे रंग में बायोप्रिंटेड वास्कुलचर और लाल रंग में एंडोथेलियल अस्तर के बीच एनास्टोमोस की प्रतिनिधि छवि। स्केल बार = 200 μm. (डी) इनक्यूबेशन के 7 दिनों के बाद चिकनी मांसपेशी एक्टिन (लाल), नाभिक (नीला), और एंडोथेलियल कोशिकाओं (हरा) के लिए इम्यूनोस्टेनिंग की प्रतिनिधि छवि। स्केल बार = 0.1 मिमी (ई) क्लैंप हटाने से पहले चूहे की ऊरु धमनी के साथ इंजीनियर फ्लैप के पूर्ण एनास्टोमोस की प्रतिनिधि छवि और क्लैंप हटाने के बाद (एफ)। संक्षिप्त नाम: एचएएमईसी = मानव वसा माइक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं; एसएमए = चिकनी मांसपेशी एक्टिन; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 1: चूहे की ऊरु धमनी के लिए संवहनी मचान को एनास्टोमोस करने के लिए प्रतिनिधि माइक्रोसर्जिकल प्रक्रिया। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इंजीनियरिंग संवहनी ऊतक ऊतक इंजीनियरिंग20 की मुख्य चुनौतियों में से एक है। इंजीनियर संवहनी ऊतक बनाने के लिए वर्तमान तरीके स्व-इकट्ठे माइक्रोवास्कुलचर21,22,23 बनाने या मेसोस्केल संवहनी मचान24,25 बनाने पर ध्यान केंद्रित करते हैं और पदानुक्रमित वास्कुलचर की एक प्रणाली को फिर से बनाने पर नहीं, जिसे तुरंत और सीधे प्रत्यारोपण26 पर सुगंधित किया जा सकता है . इस काम में, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो माइक्रोस्केल और मेसोस्केल वास्कुलचर से बना पदानुक्रमित पोत नेटवर्क बनाने के लिए दो 3 डी प्रिंटिंग तौर-तरीकों का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल एक मेसोस्केल संवहनी मचान के साथ एक 3 डी बायोप्रिंटेड, स्व-इकट्ठे माइक्रोवास्कुलर नेटवर्क को जोड़ती है, जो एक प्रत्यारोपण योग्य, संवहनी फ्लैप प्राप्त करती है। इसके अलावा, यह पेपर चूहे की ऊरु धमनी के लिए इस फ्लैप को सीधे एनास्टोमोस करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।

पारंपरिक ऊतक इंजीनियरिंग तकनीकों पर अपनी बहुमुखी प्रतिभा के कारण 3 डी बायोप्रिंटिंग ने हाल के वर्षों में रुचि प्राप्त की है। जबकि यह प्रोटोकॉल आरएचकोल्मा बायोइंक में एक माइक्रोवास्कुलर नेटवर्क की पीढ़ी का वर्णन करता है, उपयोग किए जाने वाले तरीकों को अध्ययन और उपन्यास बायोइंक और समर्थन स्नान27,28 की अधिकता से कई अन्य बायोइंक में कुछ संशोधनों के साथ लागू किया जा सकता है। हमने मानव ईसीएम में टाइप I कोलेजन की प्रचुरता के कारण बायोइंक के रूप में आरएचकोल्मा का उपयोग करना चुना, जो सेल लगाव के लिए एक उपयुक्त वातावरण प्रदान करता है। इसके अलावा, यह पौधों में पुनः संयोजक रूप से उत्पादित होता है और आगे मेथैक्रिलेट समूहों के साथ संशोधित किया जाता है, जो फोटोपोलिमराइजेशन और स्थिर 3 डी हाइड्रोगेल29,30 के गठन की अनुमति देता है। फोटोक्रॉसलिंकिंग को फोटोइनिशिएटर एलएपी के अलावा प्राप्त किया गया था, जिसे गैर-विषैले दिखाया गया है और यूवी प्रकाश की संभावित फोटोटॉक्सिसिटी को कम करते हुए 405 एनएम नीली रोशनी के संपर्क में सक्रिय है। हालांकि, फोटोसेंसिटिव बायोइंक के उपयोग से बायोइंक और समर्थन सामग्री की तैयारी के लिए फिनोल लाल मुक्त संस्कृति माध्यम के उपयोग की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल जिलेटिन समर्थन सामग्री के उपयोग का वर्णन करता है, जो आरएचकोल्मा जैसे बायोइंक के उच्च-निष्ठा एक्सट्रूज़न को सक्षम बनाता है। इस प्रकार, इसकी तैयारी और प्रिंटर बिस्तर के शीतलन के दौरान ठंडे माध्यम के उपयोग को सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। क्रॉसलिंकिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रकाश स्रोत या ऊंचे परिवेश के तापमान के कारण अत्यधिक हीटिंग हो सकती है।

बायोप्रिंटेड माइक्रोवास्कुलर नेटवर्क बनाने के लिए यहां एक एक्सट्रूज़न-आधारित बायोप्रिंटर का उपयोग किया गया है, और वर्तमान में कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बायोप्रिंटर हैं जो समान निर्माण उत्पन्न कर सकते हैं। इसके अलावा, प्रस्तावित तरीकों को आसानी से संशोधित किया जा सकता है और विभिन्न ज्यामिति, आकार और इनफिल पैटर्न का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। इस काम में, इंटरकनेक्टेड छिद्रों को बनाने के लिए एक रेक्टिलिनियर इनफिल पैटर्न चुना गया था, और इसे उच्च निष्ठा के साथ अपेक्षाकृत जल्दी से मुद्रित किया जा सकता है।

हवा के बुलबुले बाहर निकालना बायोप्रिंटिंग में एक महत्वपूर्ण चुनौती पेश करते हैं, खासकर समर्थन सामग्री के अंदर। इसलिए, समर्थन सामग्री के हस्तांतरण, बायोइंक-सेल निलंबन की तैयारी और मुद्रण कारतूस में उनके हस्तांतरण के लिए सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके इन बुलबुले की उपस्थिति और गठन को कम करना महत्वपूर्ण है।

इस काम में, मानव वसा-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं और दंत लुगदी स्टेम कोशिकाओं का उपयोग रोगियों से अपेक्षाकृत आसान अलगाव के कारण सहायक कोशिकाओं के रूप में किया गया था। इसके अलावा, 8 x 106 कोशिकाओं / एमएल की कुल सेल एकाग्रता को चुना गया था क्योंकि इस एकाग्रता को सबसे विकसित संवहनी नेटवर्क16 स्थापित करने के लिए दिखाया गया है। जबकि इस प्रोटोकॉल को विभिन्न सेल प्रकारों और स्रोतों के साथ-साथ विभिन्न बायोइंक का उपयोग करके माइक्रोवास्कुलचर उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, माइक्रोवास्कुलर नेटवर्क के विकास के लिए सर्वोत्तम स्थितियों को स्थापित करने के लिए सेल एकाग्रता का अंशांकन किया जाना चाहिए। इसके अलावा, ऊतक-विशिष्ट कोशिकाओं (यानी, मायोब्लास्ट या ओस्टियोब्लास्ट) को ऊतक-विशिष्ट संवहनी फ्लैप प्राप्त करने के लिए बायोइंक के भीतर शामिल किया जा सकता है।

झरझरा संवहनी मचान के लिए मोल्ड व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एक्सट्रूज़न 3 डी प्रिंटर पर 3 डी मुद्रित पानी में घुलनशील सामग्री का उपयोग करके गढ़ा गया था। इसके परिणामस्वरूप तेजी से प्रोटोटाइप प्लेटफार्मों के आधार पर एक लागत प्रभावी तकनीक होती है, जैसे कि संवहनी मचानों के कई अलग-अलग ज्यामिति और आकारों का अध्ययन और तेजी से जांच की जा सकती है। फिर भी, इस पद्धति की एक सीमा अधिकांश 3 डी प्रिंटर32 की रिज़ॉल्यूशन सीमा है। हालांकि, योजक विनिर्माण के आसपास तेजी से विकसित उद्योग के साथ, इन सीमाओं में समय के साथ सुधार होने की उम्मीद है। निर्माण प्रक्रिया के लिए कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग प्रोटोकॉल की एक और सीमा है, क्योंकि अधिकांश कार्बनिक सॉल्वैंट्स कोशिकाओं के लिए विषाक्त होते हैं, संवहनी पाड़ निर्माण प्रक्रिया के साथ बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया को संयोजित करने की क्षमता को रोकते हैं।

सेल निलंबन को धक्का देने के विरोध में आकांक्षा का उपयोग करके मचान के लुमेन को बोने की वर्णित विधि का वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के स्थानीयकरण पर बड़ा प्रभाव पड़ता है। नकारात्मक दबाव का उपयोग मचान की दीवार16 पर छिद्रों के माध्यम से सेल निलंबन के किसी भी स्पिलिंग को कम करते हुए मचान के आंतरिक लुमेन के एंडोथेलाइजेशन की अनुमति देता है।

माइक्रोसर्जिकल एनास्टोमोस के लिए वर्णित "कफ" विधि को आसानी से संशोधित किया जा सकता है और विभिन्न संवहनी पाड़ सामग्री या आकारों के साथ-साथ पशु मॉडल के व्यापक पैमाने पर विभिन्न धमनियों और नसों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल के अनुकूलन में विभिन्न पॉलीमाइड ट्यूब आकार और सिवनी आकार शामिल होंगे। इस विधि को मचान की दीवार के छिद्र की आवश्यकता नहीं होती है, जिससे दोषों का विकास हो सकता है। यह काम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जिसे कई अनुप्रयोगों में विस्तारित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलुओं, जिसमें मेसो- और माइक्रोस्केल वास्कुलचर और उनकी असेंबली और आरोपण का निर्माण शामिल है, पुनर्निर्माण अनुप्रयोगों के साथ-साथ संवहनी और अन्य ऊतक इंजीनियरिंग अध्ययनों के लिए इंजीनियर फ्लैप के महत्वपूर्ण पहलुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान समझौता संख्या 818808) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से धन प्राप्त हुआ। आरएचकोल्मा को उदारतापूर्वक कोलप्लांट (रेहोवट, इज़राइल) द्वारा प्रदान किया गया था। लेखकों ने जानवरों की देखभाल के साथ सहायता के लिए टेक्नियन के पूर्व-नैदानिक अनुसंधान प्राधिकरण के साथ-साथ जेनेट ज़विन, गैलिया बेन डेविड और इडान रेडेंस्की को धन्यवाद दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dioxane Biosolve Chemical 42405
27 G x 0.5" blunt tip dispensing needles CML supply 901-27-050
3cc amber syringe barrel & piston set Nordson EFD 7012085 Amber syringes used to block light and prevent premature crosslinking
5-0 AssuCryl PGA absorbale suture Assut Sutures Absorbable sutures used for skin wound closure
6-0 polypropelene sutures Assut Sutures 9351
Acland clamps S&T B-1V
Adventitia scissors S&T SAS-15
Angled no.3 jeweler's forceps S&T JFAL-3-18
BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter Advanced Solutions a 6-axis 3D bioprinter
Bovine albumin serum Probumin Millipore  82-045-1
Buprenorphine vetmarket B15100
BVOH filament Verbatim 55903 a water-soluble 1.75 mm diameter filament
Clamp applying forceps S&T CAF-4
Dental pulp stem cells Lonza PT-5025
Dietrich bulldog clamps Fine Science Tools (FST) 18039-45
di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) Carlo Erba Reagents 480141
Dissection scissors S&T 18039-45
DMEM, High Glucose, No Phenol Red Sartorius 01-053-1A
Duratears Alcon DJ03
ECM media + bullet kit Sciencell #1001
Ethanol 96% Gadot-Group 64-17-5
GlutaMAX Gibco 35050061 glutamine substitute
Goat anti-mouse Cy3 antibody Jackson 115-166-072
Heparin Sodium  5,000 I.U./mL Panpharma -
Human adipose microvascular cells Sciencell #7200
Human fibronectin Sigma F0895-5MG A stock concentration of 1 mg/mL
Isoflurane, USP Terrell Piramal Critical Care NDC 66794-011-25
LifeSupport Advanced Biomatrix 5244 a gelatin support slurry for FRESH 3D bioprinting
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Sigma-Aldrich 900889
Low-glucose DMEM Biological Industries 01-050-1A
MICROMAN E M1000E, 100-1,000 µL Gilson FD10006
Mouse anti-SMA antibody Dako M0851
NEAA Gibco 11140068
Needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Paraformaldehyde solution 4% in PBS ChemCruz  SC-281692
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution Biological Industries 03-032-1B
Phospate buffered saline (PBS) Sigma P5368-10PAK
Poly(ethylene oxide), M.W. 250,000 to 400,000 Acros Organics 178602500
Poly(L-lactic acid), IV 5.0 dl/g (PLLA) Polysciencse, Inc. 18582-10
Polyimide tubing, ID: 0.0249", OD: 0.0273" Cole-Parmer 95820-05 A thin-walled tube used to fabricate cuffs for microsurgical anastomoses
Prusa I3 MK2.5 3D Printer Prusa Research http://www.prusa3d.com/ a popular commercial 3D printer
Resomer RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) Evonik Industries 719870
rhCollMA CollPlant https://collplant.com/ generously provided by CollPlant (Rehovot, Israel)
round-handled needle holder S&T B-15-8
Scalpel handle - #3 Fine Science Tools (FST) 10003-12
small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
Sodium Chloride Biosolve Chemical 19030591
Sodium Phosphate dibasic (NaH2PO4) Riedel-de Haen 4276
Solidworks Dassault Systems CAD software
Straight no.3 jeweler's forceps S&T JF-3-18
Straight serrated forceps Fine Science Tools (FST) 11050-10
Surgical Scalpel Blade No.15 Swann-Morton Limited 305
Triton-X 100 BioLab LTD 57836
TSIM Advanced Solutions 3D slicing and design software for the BioAssembly Bot
Vessel dilator S&T D-5a.1
Zeiss Tivato 700 surgical microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallace, C. G., Wei, F. -C. C. The current status, evolution and future of facial reconstruction. Chang Gung Medical Journal. 31 (5), 441-449 (2008).
  2. Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering complex tissues. Science Translational Medicine. 4 (160), 12 (2012).
  3. Duan, B. State-of-the-art review of 3D bioprinting for cardiovascular tissue engineering. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 195-209 (2017).
  4. Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
  5. Ouyang, L., Armstrong, J. P. K., Chen, Q., Lin, Y., Stevens, M. M. Void-free 3D bioprinting for in situ endothelialization and microfluidic perfusion. Advanced Functional Materials. 30 (1), 1908349 (2020).
  6. Baltazar, T., et al. Three dimensional bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes, fibroblasts, pericytes, and endothelial cells. Tissue Engineering - Part A. 26 (5-6), 227-238 (2020).
  7. Chia, H. N., Wu, B. M. Recent advances in 3D printing of biomaterials. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 4 (2015).
  8. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  9. Guillotin, B., et al. Laser assisted bioprinting of engineered tissue with high cell density and microscale organization. Biomaterials. 31 (28), 7250-7256 (2010).
  10. Catros, S., et al. Laser-assisted bioprinting for creating on-demand patterns of human osteoprogenitor cells and nano-hydroxyapatite. Biofabrication. 3 (2), (2011).
  11. Ronca, A., Ambrosio, L., Grijpma, D. W. Preparation of designed poly(d,l-lactide)/nanosized hydroxyapatite composite structures by stereolithography. Acta Biomaterialia. 9 (4), 5989-5996 (2013).
  12. Lan, P. X., Lee, J. W., Seol, Y. J., Cho, D. W. Development of 3D PPF/DEF scaffolds using micro-stereolithography and surface modification. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 20 (1), 271-279 (2009).
  13. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
  14. Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  15. Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).
  16. Szklanny, A. A., et al. 3D bioprinting of engineered tissue flaps with hierarchical vessel networks (VesselNet) for direct host-to-implant perfusion. Advanced Materials. 33 (42), 2102661 (2021).
  17. Schleimer, K., et al. Training a sophisticated microsurgical technique: interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats. Journal of Visualized Experiments JoVE. (69), (2012).
  18. Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: A new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
  19. Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), (2014).
  20. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  21. Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
  22. Szklanny, A. A., et al. High-throughput scaffold system for studying the effect of local geometry and topology on the development and orientation of sprouting blood vessels. Advanced Functional Materials. 1901335, 1-13 (2019).
  23. Song, W., et al. Engineering transferrable microvascular meshes for subcutaneous islet transplantation. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  24. Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).
  25. Ying, G. L., et al. Aqueous two-phase emulsion bioink-enabled 3D bioprinting of porous hydrogels. Advanced Materials. 30 (50), 1-9 (2018).
  26. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  27. Jang, J., Park, J. Y., Gao, G., Cho, D. W. Biomaterials-based 3D cell printing for next-generation therapeutics and diagnostics. Biomaterials. 156, 88-106 (2018).
  28. Suntornnond, R., An, J., Chua, C. K. Roles of support materials in 3D bioprinting - present and future. International Journal of Bioprinting. 3 (1), 83-86 (2017).
  29. Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human recombinant type I collagen produced in plants. Tissue Engineering - Part A. 19 (13-14), 1527-1533 (2013).
  30. Stein, H., et al. Production of bioactive, post-translationally modified, heterotrimeric, human recombinant type-I collagen in transgenic tobacco. Biomacromolecules. 10 (9), 2640-2645 (2009).
  31. Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of precision polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , 120062 (2020).
  32. Karakurt, I., Lin, L. 3D printing technologies: techniques, materials, and post-processing. Current Opinion in Chemical Engineering. 28, 134-143 (2020).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 183
3 डी प्रिंटिंग प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके इंजीनियर संवहनी फ्लैप का निर्माण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Machour, M., Szklanny, A. A.,… More

Machour, M., Szklanny, A. A., Levenberg, S. Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies. J. Vis. Exp. (183), e63920, doi:10.3791/63920 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter