Summary
Les volets d’ingénierie nécessitent un réseau vasculaire fonctionnel intégré. Dans ce protocole, nous présentons une méthode de fabrication d’un lambeau de tissu imprimé en 3D contenant un réseau vasculaire hiérarchique et ses anastomoses microchirurgicales directes à l’artère fémorale du rat.
Abstract
L’ingénierie de tissus implantables, fonctionnels et épais nécessite la conception d’un réseau vasculaire hiérarchique. La bioimpression 3D est une technologie utilisée pour créer des tissus en ajoutant couche après couche de biomatériaux imprimables, appelés bioencres, et de cellules de manière ordonnée et automatique, ce qui permet de créer des structures très complexes que les techniques traditionnelles d’ingénierie tissulaire ne peuvent pas réaliser. Ainsi, la bioimpression 3D est une approche in vitro attrayante pour imiter la structure complexe vasculaire native, allant des vaisseaux millimétriques aux réseaux microvasculaires.
Les progrès de la bioimpression 3D dans des hydrogels granulaires ont permis l’extrusion à haute résolution de bioencres à matrice extracellulaire à faible viscosité. Ce travail présente une approche combinée de bio-impression 3D et d’impression 3D basée sur des moules sacrificiels pour la fabrication de lambeaux de tissus vascularisés d’ingénierie. La bioimpression 3D de cellules endothéliales et de soutien à l’aide d’une bioencre recombinante collagène-méthacrylate dans un bain de support en gélatine est utilisée pour la fabrication d’un réseau capillaire auto-assemblé. Cette microvascularisation imprimée est assemblée autour d’un échafaudage poreux en forme de vaisseau méso-échelle, fabriquée à l’aide d’un moule sacrificiel imprimé en 3D, et est ensemencée avec des cellules endothéliales.
Cet assemblage induit l’endothélium du vaisseau méso-échelle à s’anastomose avec le réseau capillaire environnant, établissant un réseau vasculaire hiérarchique dans un lambeau de tissu modifié. Le lambeau artificiel est ensuite directement implanté par anastomose chirurgicale sur une artère fémorale de rat à l’aide d’une technique de brassard. Les méthodes décrites peuvent être étendues pour la fabrication de divers lambeaux de tissu vascularisés destinés à être utilisés dans la chirurgie de reconstruction et les études de vascularisation.
Introduction
Les défauts tissulaires graves sont causés par des blessures traumatiques, des défauts congénitaux ou des maladies, et la norme d’or actuelle pour traiter ces défauts consiste à utiliser des greffes autologues, des lambeaux de tissus vascularisés et des lambeaux libres microvasculaires comme substituts tissulaires. Cependant, ces options présentent les inconvénients d’une morbidité limitée des tissus du site donneur et du site donneur1. Ainsi, il existe une demande croissante de substituts tissulaires alternatifs pouvant être utilisés pour corriger ces défauts2. L’épaisseur des constructions tissulaires modifiées est limitée par la diffusion des nutriments et des gaz vers les cellules et, par conséquent, un réseau vasculaire approprié est essentiel pour générer de grands échafaudages épais et correctement nourris.
Plusieurs approches ont été appliquées pour favoriser la vascularisation des implants3, notamment le recrutement in vivo du support vasculaire de l’hôte, l’administration de facteurs de croissance et de cytokines dans les échafaudages, la prévascularisation des implants, la génération d’un lit de microvasculaire ramifié perfusable à l’aide de techniques de micromotif4, l’utilisation de matériaux sacrificiels pour la formation de canaux/réseaux vasculaires5 , ainsi que la création de canaux dans les constructions bioimprimées en 3D 5,6. La vascularisation des tissus épais nécessite l’incorporation d’un réseau vasculaire hiérarchique composé de vaisseaux à l’échelle macro et à l’échelle microcapillaire. Les vaisseaux à l’échelle macro distribuent efficacement le sang dans toute la construction et permettent des anastomoses microchirurgicales avec les vaisseaux sanguins hôtes, tandis que les vaisseaux à l’échelle microcapillaire permettent la diffusion des nutriments.
La bio-impression a attiré l’attention ces dernières années en raison des avantages qu’elle offre par rapport aux méthodes conventionnelles d’ingénierie tissulaire. Les tissus et les organes sont des objets 3D complexes et complexes avec une architecture spécifique. La bioimpression 3D, avec sa capacité à déposer des couches de biomatériaux en haute résolution, permet de créer des substituts complexes de tissus et d’organes (par exemple, reins, poumons, foie)7. Plusieurs technologies d’impression ont été adaptées pour la bio-impression, notamment la bioimpressionà base d’extrusion, à jet d’encre 8, le dépôt assisté par laser 9,10 et la bioimpression11,12 basée sur la stéréolithographie. Les technologies basées sur l’extrusion reposent sur l’extrusion du matériau à travers une buse en appliquant une pression sur la surface en vrac du matériau opposée à la buse.
L’incorporation réversible de forme libre d’hydrogels suspendus (FRESH) est une technique de bio-impression13,14 qui utilise un matériau de support granulaire dans lequel le matériau extrudé est déposé et fixé en place par le bain de support. Le bain de support donne un support mécanique pour la bioencre extrudée et pré-réticulée jusqu’à sa réticulation. Le principal avantage de cette technique est que le bain de support permet d’extruder des matériaux à faible viscosité qui ne peuvent pas maintenir leur forme après l’extrusion et avant la réticulation15. Cela élargit le bassin de matériaux disponibles qui peuvent être utilisés comme bioencres.
Cet article présente un protocole pour la génération d’un lambeau vascularisé qui combine des vascularisations à micro-échelle et à méso-échelle. Pour ce faire, des réseaux microvasculaires bio-imprimés et auto-assemblés sont générés dans un hydrogel de méthacrylate de collagène humain recombinant (rhCollMA), qui se connecte ensuite à l’intérieur d’un échafaudage vasculaire implantable plus grand, résultant en un lambeau de tissu16 entièrement conçu. Pour établir une perfusion rapide et directe des tissus modifiés, une anastomose microchirurgicale directe aux vaisseaux hôtes est nécessaire. L’échafaudage vasculaire n’a pas une force de rétention de suture suffisante pour être anastomisé à l’aide de la suture traditionnelle de la paroi des vaisseaux microchirurgicaux. Par conséquent, nous décrivons une méthode « brassard»17,18,19 pour obtenir une anastomose avec l’artère fémorale commune d’un rat. Dans cette méthode, les extrémités du vaisseau sont fixées avec des sutures circonférentielles, sans qu’il soit nécessaire de perforer la paroi du vaisseau.
Bien que le protocole proposé ait été préparé pour étudier la vascularisation hiérarchique dans l’environnement rhCollMA, cette approche peut être étendue et appliquée à une variété de nouvelles applications. Le protocole peut être appliqué à la bio-impression de diverses cellules spécifiques aux tissus dans différentes bioencres. De plus, la géométrie et la taille des constructions peuvent être facilement modifiées pour répondre à des exigences spécifiques, telles que la reconstruction de grands tissus ou des études biologiques.
Protocol
Toutes les procédures animales ont été approuvées et menées sous la supervision de l’Autorité de recherche préclinique du Technion (PCRA Technion, approbation éthique n° 058-05-20). Des rats Sprague-Dawley mâles (275-350 g) ont été utilisés pour ces études. Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.
1. Fabrication d’échafaudages vasculaires
- Créez un modèle informatique 3D de la forme d’échafaudage vasculaire souhaitée à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) ou téléchargez un fichier 3D d’une structure vasculaire souhaitée à partir de référentiels en ligne.
- Créez un cylindre d’un diamètre intérieur de 0,9 mm, d’un diamètre extérieur de 2 mm et d’une hauteur de 18 mm. Ajouter des fenestrations radiales d’un diamètre de 0,22 mm le long de la paroi du cylindre.
- Créez un moule pour l’échafaudage à l’aide du logiciel de conception 3D et exportez-le en tant que fichier . STL. Ensuite, ajoutez un entonnoir à la conception pour faciliter le remplissage du moule plus tard.
- Importez le fichier . STL dans le logiciel de découpage pour l’imprimante 3D de modélisation par dépôt fondu (FDM). Découpez le modèle avec une hauteur de calque de 0,1 mm et exportez-le au format .gcode ou envoyez-le directement à l’imprimante 3D.
- Imprimez le moule en 3D sur une imprimante 3D FDM équipée d’une buse de 0,25 mm, en utilisant un filament de copolymère d’alcool vinylique (BVOH) soluble dans l’eau. Conservez les moules imprimés dans une chambre à vide jusqu’à utilisation.
ATTENTION : Évitez de manipuler le filament BVOH à mains nues car il est sensible à l’humidité. De plus, il est recommandé de stocker le filament dans une chambre à vide pour éviter toute exposition à l’humidité. - Préparer une solution polymère d’un mélange 1:1 d’acide poly-L-lactique (PLLA) et d’acide polylactique-co-glycolique (PLGA) dans du 1,4-dioxane.
- Peser 350 mg de PLLA et 350 mg de PLGA et transférer dans un flacon en verre de 20 mL.
- Mesurer 10 mL de 1,4-dioxane et transférer dans le flacon en verre à l’aide d’une pipette en verre. Ajouter une petite barre d’agitation magnétique au flacon en verre.
ATTENTION : Le 1,4-dioxane est un solvant organique dangereux. Utilisez l’équipement de sécurité personnelle approprié et travaillez à l’intérieur d’une hotte. - Placez le flacon en verre à l’intérieur d’un bain d’eau chaude chauffé à 70 °C et mélangez le contenu pendant la nuit jusqu’à ce que tous les polymères se dissolvent complètement. Conservez la solution dans un récipient en verre hermétique jusqu’à son utilisation.
- Remplissez les moules BVOH avec la solution PLLA:PLGA.
- À l’aide d’une pipette volumétrique, mesurez 30 μL de la solution de polymère et remplissez le moule.
REMARQUE: Le volume nécessaire pour remplir le moule changera en fonction du volume du récipient conçu. Continuez à ajouter la solution de polymère jusqu’à ce que l’entonnoir du moule soit entièrement rempli. - Centrifuger le moule à 100 × g pendant 2 min. Complétez le moule avec 20 μL supplémentaires de la solution de polymère pour assurer un remplissage complet.
- À l’aide d’une pipette volumétrique, mesurez 30 μL de la solution de polymère et remplissez le moule.
- Congelez les moules remplis à -80 °C pendant au moins 30 min pour vous assurer que toute la solution de polymère gèle. Retirez le solvant des moules en les lyophilisant pendant la nuit.
REMARQUE: La couleur du polymère dans le moule doit passer de claire à blanche après le processus de lyophilisation. - Pour enlever le matériau de moule sacrificiel, transférez les moules après le processus de lyophilisation dans un bain-marie désionisé de 5 L sous agitation douce. Remplacez l’eau dans le bain lorsqu’il fait nuageux. Lorsque tout le BVOH se dissout, séchez les échafaudages à l’air libre et stockez-les dans une chambre à vide jusqu’à utilisation.
2. Revêtement de l’échafaudage vasculaire avec de la fibronectine
- Désinfectez les échafaudages vasculaires PLLA:PLGA en les immergeant dans de l’éthanol à 70% pendant 30 min.
- Lavez les échafaudages 3x 5 min avec PBS.
- Préparer une dilution de 50 μg/mL de fibronectine humaine dans du PBS et recouvrir les échafaudages.
- Mélanger 500 μL de solution mère de fibronectine (1 mg/mL) avec 9,5 mL de PBS.
- Immerger les échafaudages vasculaires désinfectés dans cette solution de fibronectine et les incuber à 37 °C pendant 60 min pour permettre l’adsorption des protéines.
- Après l’incubation, rincez les échafaudages avec du PBS pour enlever la fibronectine non liée. Conservez ces échafaudages revêtus à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
3. Préparation de bioencre rhCollMA
- Préparez un tampon phosphate pour neutraliser le stock acide rhCollMA bioink.
- Préparer un stock 10x de tampon phosphate en dissolvant 5,495 g de Na2HPO4, 1,55 g de NaH2PO4 et 30 mg de NaCl dans 50 mL d’eau désionisée.
- Préparer une dilution 10 fois du tampon phosphate 10x stock en combinant 1 partie du tampon phosphate 10x avec 9 parties d’eau désionisée.
- Mélanger 900 μL de solution rhCollMA mère avec 100 μL de tampon phosphate 10x pour neutraliser la solution acide de rhCollMA.
- Diluer la solution de rhCollMA neutralisée à la concentration souhaitée de 10 mg/mL en la mélangeant avec la quantité requise de tampon phosphate 1x.
REMARQUE: La concentration en stock de rhCollMA varie d’un lot à l’autre. Par conséquent, le volume de tampon phosphate 1x nécessaire pour atteindre la concentration souhaitée variera. - Préparer la solution porogène-photoinitiateur (PEO-LAP) à combiner avec le rhCollMA neutre dilué.
- Préparer une solution à 1,6 % (p/v) de poly(oxyde d’éthylène) (PEO) dans du DMEM sans phénol en dissolvant 160 mg de PEO dans 10 mL de DMEM.
- Ajouter 20 mg de lithium phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate (LAP) à cette solution pour obtenir 0,2 % (p/v) de LAP dans la solution. À partir de ce moment, couvrez la solution avec du papier d’aluminium ou conservez-la dans un endroit sombre pour la protéger de la lumière.
- Stériliser la solution PEO-LAP en la faisant passer à travers un filtre de 0,22 μm. Conserver cette solution à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
- Avant la bioimpression, mélanger la solution neutre diluée de rhCollMA avec la solution PEO-LAP dans un rapport de 1:1 pour obtenir la solution bioencre finale. Utilisez le pipetage, plutôt qu’un vortex, pour mélanger les solutions tout en évitant les bulles d’air.
- Si beaucoup de bulles sont introduites dans la solution, centrifugez-la à 2 000 × g pendant 30 s. Après centrifugation, mélanger à nouveau la solution bioink pour assurer l’homogénéité.
4. Préparation granulaire du bain de soutien
- Préparez un matériau de support granulaire en gélatine.
- Dans une armoire de sécurité biologique, diviser le contenu d’un tube de 2 g de matériau de support lyophilisé en deux tubes coniques stériles de 50 mL, contenant chacun environ 1 g.
- Ajouter 40 mL de DMEM froid (4 °C) sans phénol dans chaque tube et vortex vigoureusement jusqu’à ce que tout le matériau de support lyophilisé se dissout.
- Laisser reposer la boue résultante à 4 °C pour permettre au matériau de support de se réhydrater.
- Dégazez le matériau de support dans une chambre à vide pendant 30 minutes pour réduire les bulles.
- Centrifuger le matériau de support à 2 000 × g pendant 5 min. Assurez-vous que le matériau se trouve au fond du tube et que le surnageant est clair.
- Aspirez le surnageant, tout en veillant à ne pas aspirer le matériau de support en bas.
REMARQUE: Le matériau de support ne doit pas s’écouler en inclinant le tube après avoir retiré le surnageant. Si le matériau s’écoule, centrifugez-le à nouveau en utilisant les mêmes réglages, mais sans ajouter de nouveau surnageant.
- Transférer environ 4 mL du matériau de support préparé et compacté dans chaque puits d’une plaque de 12 puits à l’aide d’une pipette à déplacement positif. Tapotez la plaque du puits sur une surface dure pour forcer le matériau de support à se répandre uniformément dans le puits.
REMARQUE: Le volume minimal recommandé de matériel de support est de 3 fois le volume de la construction qui y sera imprimée. - Placez la plaque de puits avec le matériau de support sur une étape de bio-imprimante refroidie, ou à 4 °C, jusqu’à son utilisation pour empêcher les particules de gélatine de fondre.
5. Incorporation de cellules endothéliales et de cellules de soutien avec la bioencre
- Préparez le milieu cellulaire endothélial conformément aux instructions du fabricant en mélangeant le milieu basal avec son composant de kit de milieu correspondant, y compris une solution antibiotique, du sérum bovin fœtal et des suppléments de croissance cellulaire endothéliale.
- Préparer un milieu de cellules souches de la pulpe dentaire en combinant 500 mL de DMEM à faible teneur en glucose, 58 mL de sérum bovin fœtal, 5,8 mL d’acides aminés non essentiels (NEAA), 5,8 mL de substitut de glutamine, 5,8 mL de 1 M HEPES et 5,8 mL de solution de pénicilline-streptomycine-nystatine.
- Préparer une suspension contenant 2 × 10cellules endothéliales microvasculaires microvasculaires humaines exprimant 6 ZsGreen1 (HAMEC-ZsGreen1) et 6 × 106 cellules souches de la pulpe dentaire (CSPS) dans 10 mL de milieu cellulaire endothélial.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 200 × g pendant 4 min pour obtenir une pastille de cellule. Aspirer le milieu surnageant.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de bioencre rhCollMA préparée précédemment (contenant PEO-LAP) pour obtenir une bioencre avec une concentration cellulaire totale de 8 × 106 cellules pour 1 mL de bioencre.
ATTENTION: Après avoir combiné la bioencre avec les cellules, passez immédiatement à l’étape suivante. Si les cellules sont laissées dans la suspension pendant une longue période, les cellules vont couler au fond du tube et leur viabilité va se détériorer. Pour les expériences n’impliquant pas de cellules, sautez les étapes 5.1 à 5.5 ou incorporez des billes fluorescentes avec la bioencre au lieu de cellules pour une visualisation microscopique améliorée des constructions imprimées. - Transférer le mélange cellules-bioencre dans des cartouches d’impression.
- Placez une aiguille de 0,22 mm de diamètre interne sur une cartouche d’impression ambrée de 3 mL et placez la cartouche dans un tube conique de 50 mL.
- Transférer 1 mL du mélange cellules-bioencre dans la cartouche d’impression en la remplissant par le haut, à l’aide d’une pipette à déplacement positif pour réduire les bulles.
- Installez la cartouche d’impression dans l’outil approprié au niveau de la bioimprimante.
6. Bio-impression de réseaux microvasculaires à l’aide de rhCollMA bioink
- Créez une conception CAO 3D pour le réseau microvasculaire bioimprimé.
- Esquissez un motif 2D d’un carré de 4 mm contenant un canal circulaire de 2 mm de diamètre en son centre. Extruder l’esquisse de 4 mm pour obtenir un cube de 4 mm x 4 mm x 4 mm avec un canal central. Exportez cet objet en tant que fichier . STL.
- Importez une plaque de 12 puits. Modèle STL dans l’onglet de modélisation solide du logiciel de découpage de la bioimprimante et placez-le dans la zone désignée du lit d’impression virtuel.
- Importez le fichier . STL de la forme du cube dans l’onglet de modélisation solide du logiciel de découpage de la bioimprimante. Cliquez sur la case à cocher Utiliser le segment externe | configurer le segment sous la section des propriétés de l’objet . Dans la fenêtre contextuelle, choisissez un motif rectiligne pour le motif de remplissage et tapez 30 % dans la densité de remplissage. Cliquez sur Accepter.
- Placez une copie de la forme du cube dans chaque puits virtuel souhaité en cliquant sur le cube et en le déplaçant à l’aide de la souris.
- Créez de nouveaux paramètres de matériau pour rhCollMA bioink dans l’onglet Matériaux du logiciel de tranchage de bio-imprimante en cliquant sur le bouton Ajouter un matériau . Choisissez les paramètres d’impression du matériau. Pour la pression, tapez 2 psi dans la boîte correspondante. Pour la vitesse, tapez 20 mm/s dans la case correspondante.
REMARQUE: Chaque matériau bioink a ses propres paramètres d’impression différents qui peuvent être enregistrés dans la liste des matériaux de l’application. - Attribuez les valeurs de largeur de ligne et de hauteur de ligne à 0,24 mm et la valeur d’accélération à 400 mm/s2, en tapant ces valeurs dans les cases correspondantes.
- Dans l’onglet Modélisation solide , cliquez sur l’objet cube, puis cliquez sur le matériau rhCollMA dans la section matériaux pour l’affecter à la forme du cube. Dans l’onglet bioassemblage , cliquez sur le bouton Envoyer le travail d’impression pour envoyer le travail d’impression à la bioimprimante.
- Chargez la cartouche d’impression chargée avec la bioencre cellulaire dans l’outil de distribution pneumatique ambiant de 3 mL de la bioimprimante à base d’extrusion 3D.
- Réglez la température du lit d’impression à 4 °C en cliquant sur le bouton de refroidissement sous l’onglet Contrôle-Chauffage/Refroidissement de l’écran de l’interface de la bioimprimante. Chargez la plaque avec le bain de support sur le lit de l’imprimante.
REMARQUE: Les paramètres du matériau pour la pression et la vitesse d’impression peuvent changer en raison de différences de température ambiante ou de variabilité des lots de bioencres. Par exemple, les jours plus froids, une pression plus élevée ou une vitesse plus lente est nécessaire pour extruder la même quantité de matériau. - Dans l’onglet d’impression de l’écran de l’interface de la bioimprimante, cliquez sur le travail d’impression envoyé à l’étape 6.7. et cliquez sur Démarrer | aller pour commencer le travail d’impression.
- Après l’impression, exposez la plaque du puits à une source lumineuse de 405 nm avec une intensité de 3 mW/cm2 pendant 30 s pour initier la réticulation de la bioencre rhCollMA.
- Après réticulation, incuber la plaque du puits à 37 °C et 5 % de CO2 pendant au moins 20 min jusqu’à ce que tout le bain de support fonde.
- Aspirer doucement le bain de soutien liquéfié et le remplacer par un milieu cellulaire endothélial. Incuber les constructions à 37 °C et 5 % de CO2 jusqu’à utilisation dans les étapes suivantes.
REMARQUE : En raison de la contraction de la construction après l’impression, il est recommandé d’effectuer l’étape d’assemblage 7 le même jour que l’étape 6.
7. Assemblage du réseau microvasculaire bio-imprimé avec l’échafaudage vasculaire pour obtenir le lambeau vascularisé d’ingénierie
- Immédiatement après le retrait du matériau de support du réseau microvasculaire bioimprimé, placez un échafaudage vasculaire PLLA:PLGA recouvert de fibronectine dans le canal principal de la structure bioimprimée.
- Incuber les constructions assemblées à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 2 jours.
- Tapisser la lumière de l’échafaudage vasculaire avec des cellules endothéliales.
- Préparer une suspension cellulaire de cellules endothéliales microvasculaires humaines exprimant tdTomato (HAMEC-tdTomato) à une concentration de 1 × 107 cellules/mL.
- Placez une gouttelette de 20 μL de cette suspension cellulaire sur une surface hydrophobe (c.-à-d. un plat de 10 cm de culture non tissulaire [nonTC]).
- Placez doucement les échafaudages vasculaires sur le dessus de la gouttelette, de sorte que la lumière de l’échafaudage à une extrémité entre en contact avec la gouttelette cellulaire.
- Aspirer la gouttelette de l’extrémité opposée de l’échafaudage (c’est-à-dire l’extrémité qui n’entre pas en contact avec la gouttelette), en remplissant sa lumière avec la suspension cellulaire.
- Placez l’échafaudage ensemencé dans un tube de microcentrifugation et placez-le dans un rotateur à l’intérieur dans un incubateur humidifié pendant 60 min. Ensuite, transférez l’échafaudage dans une plaque de 12 puits et ajoutez 2 mL de milieu cellulaire endothélial.
- Cultivez les lambeaux artificiels pendant 7 jours, tout en remplaçant le milieu tous les 2 jours par un milieu cellulaire endothélial frais.
8. Microscopie confocale et coloration par immunofluorescence des volets modifiés
- Après 4 jours et 7 jours de culture, effectuer une imagerie sur cellules vivantes des échafaudages assemblés à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser.
- Définissez les canaux de fluorescence pour les protéines fluorescentes ZsGreen1 et tdTomato sur le logiciel d’acquisition d’images au microscope.
- Choisissez un objectif 5x/0.16 avec zoom 0.5x (taille de pixel 5 μm) et définissez une pile Z avec 22 tranches d’une épaisseur de 41 μm chacune.
- Définissez une numérisation de tuiles 3 x 2 pour imager et capturer l’ensemble de la construction.
- Ajustez l’intensité du laser et les valeurs de gain pour obtenir un signal fluorescent clair sans saturation et avec un arrière-plan minimal et acquérir les images.
- Effectuez une projection d’intensité maximale de la pile Z acquise pour obtenir une seule image 2D à l’aide du logiciel d’acquisition d’images au microscope ou d’un logiciel d’analyse d’images similaire.
- Effectuez une imagerie à grossissement plus élevé d’une région d’intérêt.
- Passez à un objectif 10x/0.3 avec zoom 0,5 (taille de pixel 1,25 μm) et définissez une pile Z avec 9 tranches d’épaisseur de 41 μm.
- Effectuez les étapes 8.2.-8.3.
- Après 7 jours de culture, fixez les volets artificiels en les immergeant dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min.
- Lavez les constructions 3x 5 min avec PBS.
- Ajouter 0,3 % (v/v) de Triton-X en PBS aux constructions et incuber pendant 15 min à température ambiante pour perméabiliser les cellules.
- Lavez les constructions 3x 5 min avec PBS.
- Préparer une solution bloquante en dissolvant 5 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS. Ajouter la solution de blocage aux volets techniques et incuber pendant 1 h à température ambiante.
- Préparer la solution d’anticorps primaire en diluant l’anticorps anti-actine musculaire lisse (anti-SMA) 1:50 de souris dans la solution de BSA à 5% préparée précédemment pour colorer les cellules de soutien exprimant la SMA.
- Incuber les échafaudages dans la solution d’anticorps primaire pendant la nuit à 4 °C.
- Laver 3x 5 min avec PBS.
- Préparer la solution d’anticorps secondaire en diluant l’anticorps IgG 1:400 de chèvre conjugué à Cy3 et le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 2,5 μg/mL) dans du PBS.
- Appliquer la solution d’anticorps secondaire sur les échafaudages et incuber pendant 3 h à température ambiante.
- Laver 3x 5 min avec PBS.
- Stockez les constructions à 4 °C dans PBS jusqu’à 1 mois.
- Imagez les échafaudages colorés à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser.
- Définissez les trois canaux de fluorescence (DAPI, ZsGreen et Cy3) sur le logiciel d’acquisition d’images au microscope.
- Définissez une pile Z avec une épaisseur de section de 2 μm couvrant une épaisseur totale de 50 μm. Ensuite, définissez une numérisation par vignette pour imager de plus grandes zones de la construction.
- Ajustez les paramètres d’acquisition pour obtenir un signal fluorescent clair sans saturation et avec un arrière-plan minimal.
- Acquérir les images à l’aide d’un objectif 20x/0.8 avec zoom 1.0x (taille de pixel 0.31 μm).
- Effectuez une projection d’intensité maximale de la pile Z acquise pour obtenir une seule image 2D à l’aide du logiciel d’acquisition d’images au microscope ou d’un logiciel d’analyse d’images similaire.
9. Anastomosing du lambeau artificiel directement sur l’artère fémorale d’un rat à l’aide d’une technique de brassard
- Préparer et stériliser (autoclave) les outils chirurgicaux suivants: scalpel n ° 15, une paire de pinces à dents fines et une petite paire de ciseaux à manche annulaire. En outre, préparez et stérilisez les outils microchirurgicaux suivants: une pince de bijoutier droite et fine n ° 3, une pince de bijoutier inclinée, un porte-aiguille à manche rond avec des mâchoires incurvées, une paire de dilatateurs de vaisseaux, des ciseaux disséquants, des ciseaux adventices, ainsi que des pinces à vaisseau avec leur applicateur.
- Préparer une solution de solution saline héparinisée de 100 UI/mL en diluant 5 mL de solution mère d’héparine avec 195 mL de solution saline.
- Couper et stériliser les poignets en polyimide.
- Couper des sections de 2,5 mm d’un tube de polyimide sous un microscope à dissection.
- À une extrémité de chaque section, faites une incision longitudinale de 1,25 mm dans la paroi du tube pour obtenir une poignée de brassard. Faites une coupe inclinée à l’autre extrémité du tube pour faciliter l’éversion du vaisseau.
- Immergez les poignets dans de l’éthanol à 70% suivi de deux lavages avec une solution saline héparinisée.
- Préparez un rat Sprague-Dawley mâle (275-350 g) pour la chirurgie.
- Sept jours avant la chirurgie, commencez à administrer une dose quotidienne sous-cutanée de cyclosporine (10 mg kg-1) pour obtenir une immunosuppression.
- Avant la chirurgie, anesthésier l’animal en utilisant 3% d’isoflurane par inhalation selon la POS institutionnelle à l’aide d’une chambre d’induction. Vérifiez l’anesthésie profonde en pinçant les deux pieds et en vérifiant les réflexes.
- Administrer une dose sous-cutanée de buprénorphine analgésique (0,03 mg kg-1) et d’héparine anticoagulante (200 UI kg-1).
- Appliquez une pommade lubrifiante pour les yeux de l’animal pour prévenir la déshydratation.
- Rasez la zone chirurgicale du rat et désinfectez le site avec de l’iode, puis de l’éthanol à 70%. Fixez les membres de l’animal à la table à l’aide de ruban adhésif.
- Exposez et isolez l’artère fémorale commune.
- Faites une incision oblique de 2 cm de long à travers la peau, le long de la concavité entre la jambe et l’abdomen.
- À l’aide de pinces et de ciseaux émoussés, libérez la peau du tissu sous-jacent pour visualiser le coussinet adipeux inguinal.
- À l’aide de ciseaux et de pinces, coupez à travers le coussinet de graisse autour des marges supérieures, médiales et inférieures. Faites attention à ne pas couper de gros vaisseaux sous le coussinet de graisse.
- Réfléchissez le coussinet de graisse latéralement, en laissant les vaisseaux épigastriques intacts. Placez une gaze humide sur le tampon de graisse réfléchi pour éviter le dessèchement et fixez-le en place. Assurez-vous que les vaisseaux fémoraux communs sont visibles.
REMARQUE: Le coussinet adipeux sera ensuite utilisé pour appliquer une pression douce sur les anastomoses. - Exposez l’artère fémorale du ligament inguinal par voie proximale au point de ramification de l’artère épigastrique distalement en l’extrayant de sa gaine.
ATTENTION: Il y a généralement une branche de l’artère fémorale qui court en dessous, communément appelée branche de Murphy. Faites attention à ne pas endommager cette branche difficile à voir. - Divisez la branche de Murphy en la ligaturant, puis ligaturez l’artère fémorale avec deux ligatures au milieu de l’artère espacées de 1 mm. Gardez une extrémité de la suture ligature longue pour l’utiliser plus tard pour tirer l’extrémité du vaisseau à travers le brassard.
- Coupez l’artère entre les deux ligatures à l’aide de ciseaux adventices.
ATTENTION: Il ne devrait pas y avoir de saignement lors de l’exécution de cette coupe. Si l’extrémité artérielle saigne, serrez l’artère et réappliquez une ligature. - À l’aide de l’extrémité longue de la suture ligature, insérez chaque extrémité du vaisseau dans un brassard en polyimide, tel que préparé à l’étape précédente, de sorte que les poignées des deux poignets pointent l’une vers l’autre.
- Après l’insertion, appliquez une pince simultanément sur le manche du brassard et le récipient, en fixant le brassard en place.
- Préparer une solution saline héparinisée dans une seringue équipée d’une aiguille de 27 G.
- Tirez sur l’extrémité du vaisseau ligaturé et coupez-la près de la ligature. Lavez immédiatement l’extrémité du vaisseau soigneusement avec la solution saline héparinisée jusqu’à ce qu’aucun sang ne soit visible dans la lumière.
ATTENTION: Assurez-vous que l’extrémité du vaisseau est bien lavée car tout sang laissé à l’intérieur formera un caillot, qui sera introduit dans la circulation sanguine à la fin de la procédure. Cela pourrait entraîner une occlusion du vaisseau et une perte de perfusion à la jambe. - Dilatez la lumière du vaisseau en le tenant par sa gaine d’une main et en dilatant sa lumière avec le dilatateur du vaisseau de l’autre main.
- Placez une suture circonférentielle en polypropylène 6-0 autour du corps du brassard. Evert l’extrémité du vaisseau à l’aide de deux dilatateurs de vaisseau sur le corps du brassard et fixez-le en place en resserrant la suture circonférentielle.
REMARQUE: Si du sang fuit à travers le vaisseau serré pendant les manipulations, lavez soigneusement la lumière avec une solution saline héparinisée. - Rincez le rabat d’ingénierie avec une solution saline héparinisée, puis insérez le brassard doublé dans la lumière de l’échafaudage vasculaire. Fixez l’échafaudage en place en plaçant une suture circonférentielle en polypropylène 6-0 autour de l’échafaudage et du corps du brassard. Faites cette étape pour les deux côtés de l’échafaudage vasculaire.
- Enroulez un filtre à membrane en polystyrène de 0,2 μm autour du site des anastomoses pour isoler le lambeau artificiel du tissu environnant.
- Relâchez d’abord la pince distale; ensuite, relâchez la pince proximale pour rétablir le flux sanguin à travers le vaisseau.
- Pour arrêter tout saignement à travers les anastomoses, réfléchissez le coussinet adipeux sur les vaisseaux fémoraux et appliquez une légère pression à l’aide d’une gaze stérile pendant 3 minutes.
- Suturer le coussinet de graisse en place en utilisant 6-0 polypropylène; ensuite, suturez la peau à l’aide de sutures résorbables 5-0 PGA.
- Nettoyez la zone de la plaie avec une solution saline et appliquez une solution d’iode.
- Pour la douleur postopératoire et la prise en charge des animaux, préparer un 0,1% (v / v) de tramadol dans l’eau potable. De plus, administrer une dose quotidienne d’héparine (200 UI kg-1) et de cyclosporine (10 mg kg-1).
- Placez l’animal dans une cage propre par lui-même placée sous une lampe chauffante. Continuez à surveiller l’animal jusqu’à ce qu’il reprenne suffisamment conscience pour maintenir la position couchée sternale.
Representative Results
Ce protocole décrit la fabrication d’un volet artificiel composé d’un échafaudage vasculaire (Figure 1Ai) et d’une microvascularisation bio-imprimée (Figure 1Aii), qui ont été assemblés pour réaliser des vascularisations à méso-échelle et micro-échelle (Figure 1Aiii). Conformément au protocole, des moules BVOH de l’échafaudage vasculaire ont été conçus et imprimés en 3D (Figure 1B,C). Les structures imprimées obtenues ont été inspectées visuellement pour détecter la présence de petits brins de BVOH, qui pourraient se trouver dans les espaces vides des moules (Figure 1D). Ces brins indiquent généralement des réglages de matériau incorrects ou que le BVOH a absorbé de l’humidité. Ces brins doivent être enlevés car ils pourraient entraîner un remplissage incomplet de la moisissure et des défauts structurels dans l’échafaudage vasculaire résultant. Ensuite, les moules ont été remplis avec une solution PLLA:PLGA, suivie du processus de lyophilisation et des étapes de lavage, comme décrit dans le protocole. L’échafaudage vasculaire PLLA:PLGA obtenu a été inspecté visuellement pour vérifier l’intégrité de la paroi des vaisseaux et la perméabilité de la lumière (figure 1E).
Une bioencre rhCollMA neutralisée à une concentration de 10 mg/mL a été préparée et combinée dans un rapport de 1:1 avec la solution PEO:LAP. Les cellules endothéliales microvasculaires adipeuses humaines marquées avec Zs-Green1 et les cellules souches de la pulpe dentaire ont été remises en suspension avec la bioencre rhCollMA, et la solution a été chargée dans une cartouche d’impression et sur l’imprimante. Les formes de boîte avec un canal central avec un motif rectiligne (Figure 1D) ont été bioimprimées à l’intérieur du bain de support en gélatine. Après l’impression, les constructions ont été réticulées et le bain de support a été dissous et lavé. Après 4 jours de culture, les constructions ont été imagées en direct pour vérifier l’auto-assemblage du réseau microvasculaire. La figure 1D montre un exemple d’un réseau microvasculaire HAMEC-ZsGreen1 hautement développé dans la construction bio-imprimée.
Ensuite, un échafaudage vasculaire revêtu de fibronectine a été inséré dans le canal central de la construction imprimée (Figure 2A). Les constructions assemblées ont été cultivées pendant 2 jours, au cours desquels les cellules contractent le gel, en le fixant fermement à l’échafaudage vasculaire. Ensuite, l’échafaudage vasculaire a été tapissé de HAMECs exprimant tdTomato, selon le protocole. Après 7 jours de culture, les constructions ont été fixées et imagées. La figure 2B montre une vue latérale des constructions assemblées où les cellules endothéliales de la microvascularisation bioimprimée sont représentées en vert, tandis que la muqueuse endothéliale de l’échafaudage vasculaire est représentée en rouge. L’image montre un auto-assemblage microvasculaire vert dans le gel bioimprimé, tandis que l’échafaudage vasculaire est tapissé de cellules endothéliales rouges. Avec un grossissement plus élevé, on voit des germes provenant de la muqueuse endothéliale rouge germer et anastomoser avec le réseau microvasculaire bio-imprimé (Figure 2C). Ensuite, les constructions ont été colorées pour l’actine musculaire α lisse (SMA) comme marqueur des cellules souches de la pulpe dentaire. Après l’immunocoloration, les constructions ont été imagées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (Figure 2D).
Enfin, après 7 jours de culture, les lambeaux artificiels ont été anastomosés microchirurgicalement à l’artère fémorale d’un rat, comme décrit dans le protocole. Une vidéo d’une procédure représentative peut être visionnée dans la vidéo supplémentaire S1. La figure 2E montre une image représentative d’une anastomose terminée avant le retrait de la pince, et la figure 2F montre une image représentative du site des anastomoses après le retrait de la pince et l’hémostase. Il ne devrait pas y avoir de saignement visible avant la fermeture de la plaie.
Figure 1 : Images représentatives des vaisseaux méso- et micro-échelles fabriqués. (A) Aperçu schématique des étapes du protocole. Reproduit avec la permission16. (B) Conception CAO pour le moule sacrificiel de l’échafaudage vasculaire. (C) Vue latérale d’un moule sacrificiel représentatif imprimé en 3D (barre d’échelle = 0,5 mm). (D) Vue de dessus de la moisissure sacrificielle (barre d’échelle = 0,5 mm) (E) Échafaudage vasculaire représentatif fabriqué selon le protocole de description (barre d’échelle = 5 mm). (F) Conception CAO pour le réseau microvasculaire rhCollMA bioimprimé en 3D. Lignes de grille = 1 mm. (G) Image représentative d’un réseau vasculaire bioimprimé très développé montrant HAMEC-ZsGreen1 en vert. Barre d’échelle = 200 μm. Abréviations : CAD = conception assistée par ordinateur; rhCollMA = méthacrylate de collagène humain recombinant; HAMEC = cellules endothéliales microvasculaires adipeuses humaines; PLLA = acide poly-L-lactique; PLGA = acide polylactique-co-glycolique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images représentatives du volet vascularisé assemblé. (A) Photographie d’un assemblage représentatif de la microvascularisation bioimprimée et de l’échafaudage vasculaire. Barre d’échelle = 1 mm. (B) Vue latérale d’un volet d’ingénierie représentatif imagé 4 jours après la muqueuse endothéliale de l’échafaudage vasculaire. La microvascularisation bio-imprimée est représentée en vert (HAMEC-ZsGreen1), tandis que la muqueuse endothéliale est représentée en rouge (HAMEC-tdTomato). Barre d’échelle = 1 mm. (C) Image représentative des anastomoses entre la vascularisation bio-imprimée en vert et la muqueuse endothéliale en rouge. Barre d’échelle = 200 μm. (D) Image représentative de l’immunocoloration de l’actine musculaire lisse (rouge), des noyaux (bleu) et des cellules endothéliales (vert) après 7 jours d’incubation. Barre d’échelle = 0,1 mm. (E) Image représentative d’une anastomose terminée du volet artificiel avec l’artère fémorale d’un rat avant le retrait de la pince et (F) après le retrait de la pince. Abréviations : HAMEC = cellules endothéliales microvasculaires adipeuses humaines; SMA = actine musculaire lisse; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo supplémentaire S1: Procédure microchirurgicale représentative pour l’anastomosage de l’échafaudage vasculaire à l’artère fémorale d’un rat. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Discussion
L’ingénierie des tissus vascularisés est l’un des principaux défis de l’ingénierie tissulaire20. Les méthodes actuelles de création de tissu vasculaire artificiel se concentrent sur la créationd’une microvascularisation auto-assemblée 21,22,23 ou la fabrication d’échafaudages vasculaires à méso-échelle24,25 et non sur la recréation d’un système de vascularisation hiérarchique, qui peut être perfusé immédiatement et directement lors de l’implantation26 . Dans ce travail, nous décrivons un protocole qui utilise deux modalités d’impression 3D pour fabriquer un réseau de vaisseaux hiérarchique composé de vascularisations à micro-échelle et méso-échelle. Le protocole combine un réseau microvasculaire auto-assemblé bioimprimé en 3D avec un échafaudage vasculaire à méso-échelle, obtenant un lambeau implantable et vascularisé. De plus, cet article présente un protocole pour anastomoser directement ce lambeau à l’artère fémorale d’un rat.
La bio-impression 3D a suscité de l’intérêt ces dernières années en raison de sa polyvalence par rapport aux techniques traditionnelles d’ingénierie tissulaire. Bien que ce protocole décrive la génération d’un réseau microvasculaire dans rhCollMA bioink, les méthodes utilisées peuvent être appliquées avec peu de modifications à de nombreuses autres bioencres de la pléthore de bioencres étudiées et nouvelles et de bains de soutien27,28. Nous avons choisi d’utiliser rhCollMA comme bioencre en raison de l’abondance de collagène de type I dans l’ECM humain, fournissant un environnement approprié pour la fixation cellulaire. De plus, il est produit de manière recombinante dans les plantes et modifié avec des groupes méthacrylate, ce qui permet la photopolymérisation et la formation d’hydrogels 3D stables29,30. La photocroisillonnage a été réalisée par l’ajout du photoinitiateur LAP, qui s’est avéré non toxique et est activé par l’exposition à une lumière bleue de 405 nm, réduisant ainsi la phototoxicité possible de la lumière UV. Cependant, l’utilisation de bioencres photosensibles nécessite l’utilisation d’un milieu de culture sans rouge phénol pour la préparation de la bioencre et du matériau de support. En outre, le protocole décrit l’utilisation d’un matériau de support en gélatine, qui permet l’extrusion haute fidélité de bioencres tels que rhCollMA. Ainsi, il est essentiel d’assurer l’utilisation de fluide froid lors de sa préparation et du refroidissement du lit de l’imprimante. Un chauffage excessif peut se produire en raison de la source lumineuse utilisée pour la réticulation ou à des températures ambiantes élevées.
Une bioimprimante à base d’extrusion a été utilisée ici pour créer le réseau microvasculaire bioimprimé, et il existe actuellement de nombreuses bioimprimantes disponibles dans le commerce qui peuvent générer des constructions similaires. De plus, les méthodes proposées peuvent être facilement modifiées et appliquées pour étudier différentes géométries, tailles et modèles de remplissage. Dans ce travail, un motif de remplissage rectiligne a été choisi pour créer des pores interconnectés, et cela peut être imprimé relativement rapidement avec une haute fidélité.
Les bulles d’air présentent un défi important dans la bio-impression par extrusion, en particulier à l’intérieur des matériaux de support. Par conséquent, il est crucial de minimiser la présence et la formation de ces bulles en utilisant des pipettes à déplacement positif pour le transfert du matériau de support, la préparation de la suspension de cellules bioencres et leur transfert vers les cartouches d’impression.
Dans ce travail, les cellules endothéliales adipeuses humaines et les cellules souches de la pulpe dentaire ont été utilisées comme cellules de soutien en raison de leur isolement relativement facile des patients. De plus, une concentration cellulaire totale de 8 x 106 cellules/mL a été choisie puisqu’il a été démontré que cette concentration établissait les réseaux vasculaires les plus développés16. Bien que ce protocole puisse être utilisé pour générer des microvascularisations en utilisant différents types et sources de cellules, ainsi que différentes bioencres, un étalonnage de la concentration cellulaire doit être effectué pour établir les meilleures conditions pour le développement du réseau microvasculaire. De plus, des cellules spécifiques aux tissus (c.-à-d. des myoblastes ou des ostéoblastes) peuvent être incorporées dans la bioencre pour obtenir des lambeaux vascularisés spécifiques aux tissus.
Le moule de l’échafaudage vasculaire poreux a été fabriqué à l’aide d’un matériau soluble dans l’eau imprimé en 3D sur une imprimante 3D d’extrusion disponible dans le commerce. Il en résulte une technique rentable basée sur des plates-formes de prototypage rapide, de sorte que de nombreuses géométries et tailles différentes d’échafaudages vasculaires peuvent être étudiées et criblées rapidement31. Néanmoins, une limitation de cette méthode est la limite de résolution de la plupart des imprimantes 3D32. Cependant, avec l’évolution rapide de l’industrie entourant la fabrication additive, ces limites devraient s’améliorer au fil du temps. L’utilisation de solvants organiques pour le processus de fabrication est une autre limitation du protocole, car la plupart des solvants organiques sont toxiques pour les cellules, empêchant la possibilité de combiner la procédure de bio-impression avec le processus de fabrication de l’échafaudage vasculaire.
La méthode décrite d’ensemencement de la lumière de l’échafaudage en utilisant l’aspiration plutôt que de pousser la suspension cellulaire a des effets majeurs sur la localisation des cellules ensemencées. L’utilisation d’une pression négative permet l’endothélisation de la lumière interne de l’échafaudage tout en minimisant tout déversement de la suspension cellulaire à travers les perforations sur la paroi de l’échafaudage16.
La méthode de « brassard » décrite pour les anastomoses microchirurgicales peut être facilement modifiée et adaptée à différents matériaux ou tailles d’échafaudage vasculaire, ainsi qu’à différentes artères et veines dans une large gamme de modèles animaux. Les adaptations au protocole incluraient différentes tailles de tubes en polyimide et tailles de suture. Cette méthode ne nécessite pas la perforation de la paroi de l’échafaudage, ce qui pourrait entraîner le développement de défauts. Ce travail présente un protocole qui peut être étendu à de nombreuses applications. Les aspects critiques de ce protocole, qui comprennent la fabrication de vascularisations à méso- et micro-échelle et leur assemblage et leur implantation, représentent des aspects critiques des lambeaux artificiels à la fois pour des applications reconstructives, ainsi que des études vasculaires et autres études d’ingénierie tissulaire.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet a reçu un financement du Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (convention de subvention n° 818808). rhCollMA a été généreusement fourni par CollPlant (Rehovot, Israël). Les auteurs remercient l’Autorité de recherche préclinique du Technion pour son aide en matière de soins aux animaux, ainsi que Janette Zavin, Galia Ben David et Idan Redenski.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dioxane | Biosolve Chemical | 42405 | |
| 27 G x 0.5" blunt tip dispensing needles | CML supply | 901-27-050 | |
| 3cc amber syringe barrel & piston set | Nordson EFD | 7012085 | Amber syringes used to block light and prevent premature crosslinking |
| 5-0 AssuCryl PGA absorbale suture | Assut Sutures | Absorbable sutures used for skin wound closure | |
| 6-0 polypropelene sutures | Assut Sutures | 9351 | |
| Acland clamps | S&T | B-1V | |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-15 | |
| Angled no.3 jeweler's forceps | S&T | JFAL-3-18 | |
| BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter | Advanced Solutions | a 6-axis 3D bioprinter | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Buprenorphine | vetmarket | B15100 | |
| BVOH filament | Verbatim | 55903 | a water-soluble 1.75 mm diameter filament |
| Clamp applying forceps | S&T | CAF-4 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| Dietrich bulldog clamps | Fine Science Tools (FST) | 18039-45 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carlo Erba Reagents | 480141 | |
| Dissection scissors | S&T | 18039-45 | |
| DMEM, High Glucose, No Phenol Red | Sartorius | 01-053-1A | |
| Duratears | Alcon | DJ03 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | glutamine substitute |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Heparin Sodium 5,000 I.U./mL | Panpharma | - | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | A stock concentration of 1 mg/mL |
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal Critical Care | NDC 66794-011-25 | |
| LifeSupport | Advanced Biomatrix | 5244 | a gelatin support slurry for FRESH 3D bioprinting |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| MICROMAN E M1000E, 100-1,000 µL | Gilson | FD10006 | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Poly(ethylene oxide), M.W. 250,000 to 400,000 | Acros Organics | 178602500 | |
| Poly(L-lactic acid), IV 5.0 dl/g (PLLA) | Polysciencse, Inc. | 18582-10 | |
| Polyimide tubing, ID: 0.0249", OD: 0.0273" | Cole-Parmer | 95820-05 | A thin-walled tube used to fabricate cuffs for microsurgical anastomoses |
| Prusa I3 MK2.5 3D Printer | Prusa Research | http://www.prusa3d.com/ | a popular commercial 3D printer |
| Resomer RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Evonik Industries | 719870 | |
| rhCollMA | CollPlant | https://collplant.com/ | generously provided by CollPlant (Rehovot, Israel) |
| round-handled needle holder | S&T | B-15-8 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
| Sodium Chloride | Biosolve Chemical | 19030591 | |
| Sodium Phosphate dibasic (NaH2PO4) | Riedel-de Haen | 4276 | |
| Solidworks | Dassault Systems | CAD software | |
| Straight no.3 jeweler's forceps | S&T | JF-3-18 | |
| Straight serrated forceps | Fine Science Tools (FST) | 11050-10 | |
| Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton Limited | 305 | |
| Triton-X 100 | BioLab LTD | 57836 | |
| TSIM | Advanced Solutions | 3D slicing and design software for the BioAssembly Bot | |
| Vessel dilator | S&T | D-5a.1 | |
| Zeiss Tivato 700 surgical microscope | Zeiss |
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