Summary
Konstruerte klaffer krever et innebygd funksjonelt vaskulært nettverk. I denne protokollen presenterer vi en metode for å fremstille en 3D-trykt vevsklaff som inneholder et hierarkisk vaskulært nettverk og dets direkte mikrokirurgiske anastomoser til rotte femoral arterie.
Abstract
Engineering implanterbare, funksjonelle, tykke vev krever å designe et hierarkisk vaskulært nettverk. 3D bioprinting er en teknologi som brukes til å skape vev ved å legge lag på lag av utskrivbare biomaterialer, betegnet bioinks og celler på en ryddig og automatisk måte, noe som gjør det mulig å skape svært intrikate strukturer som tradisjonelle vevsteknikker ikke kan oppnå. Dermed er 3D bioprinting en tiltalende in vitro tilnærming for å etterligne den innfødte vaskulaturkompleksstrukturen, alt fra millimetriske kar til mikrovaskulære nettverk.
Fremskritt innen 3D-bioprinting i granulære hydrogeler gjorde det mulig med høyoppløselig ekstrudering av ekstracellulære bioinks med lav viskositet. Dette arbeidet presenterer en kombinert 3D bioprinting og offer mold-basert 3D-utskrift tilnærming for fabrikasjon konstruerte vaskulære vev klaffer. 3D bioprinting av endotel- og støtteceller ved hjelp av rekombinant kollagen-metakrylat bioink i et gelatinstøttebad brukes til fremstilling av et selvmontert kapillærnettverk. Denne trykte mikrovaskulaturen er montert rundt et mesoskala karlignende porøst stillas, fremstilt ved hjelp av en offer 3D-trykt form, og er frøet med endotelceller.
Denne samlingen induserer endotelet til mesoskalafartøyet til anastomose med det omkringliggende kapillære nettverket, og etablerer et hierarkisk vaskulært nettverk i en konstruert vevsklaff. Den konstruerte klaffen implanteres deretter direkte ved kirurgisk anastomose til en rotte femoral arterie ved hjelp av en mansjettteknikk. De beskrevne metodene kan utvides for fabrikasjon av ulike vaskulære vevsklaffer for bruk i rekonstruksjonskirurgi og vaskulariseringsstudier.
Introduction
Alvorlige vevsfeil er forårsaket av traumatiske skader, medfødte defekter eller sykdom, og den nåværende gullstandarden for behandling av disse feilene er ved å bruke autologe transplantater, vaskulære vevsklaffer og mikrovaskulære frie klaffer som vevserstatninger. Imidlertid har disse alternativene ulempene med begrenset donorvev og donorstedsmorbiditet1. Dermed er det en økende etterspørsel etter alternative vevserstatninger som kan brukes til å korrigere disse feilene2. Tykkelsen på de konstruerte vevskonstruksjonene er begrenset av diffusjon av næringsstoffer og gasser mot cellene, og derfor er et riktig vaskulært nettverk avgjørende for å generere store, tykke og riktig nærede stillaser.
Flere tilnærminger har blitt brukt for å fremme vaskulærisering av konstruerte implantater3, inkludert in vivo-rekruttering av vaskulær støtte fra verten, levering av vekstfaktorer og cytokiner i stillasene, prevaskularisering av implantater, generering av en perfusabel forgreningsmikroveselen seng ved hjelp av mikropatterningsteknikker4, bruk av offermaterialer for vaskulær kanal / nettverksdannelse5 , samt opprettelse av kanaler innenfor 3D bioprinted konstruksjoner 5,6. Vaskulærisering av tykt vev krever inkorporering av et hierarkisk vaskulært nettverk som består av makroskala og mikrokapillære kar. De makroskala karene distribuerer blod effektivt gjennom hele konstruksjonen og tillater mikrokirurgiske anastomoser med vertsblodkarene, mens mikrokapillære kar gir mulighet for næringsdiffusjon.
Bioprinting har fått sterk oppmerksomhet de siste årene på grunn av fordelene det tilbyr over konvensjonelle vevsteknikksmetoder. Vev og organer er komplekse og intrikate 3D-objekter med en bestemt arkitektur. 3D-bioprinting, med sin evne til å deponere lag av biomaterialer i høy oppløsning, muliggjør evnen til å skape komplekse vevs- og organerstatninger (f.eks. nyre, lunge, lever)7. Flere utskriftsteknologier er tilpasset bioprinting, inkludert ekstruderingsbasert,blekkskriver 8, laserassistert avsetning 9,10 og stereolitografibasert11,12 bioprinting. Den ekstruderingsbaserte teknologien er avhengig av å ekstrudere materialet gjennom en dyse ved å legge trykk på material bulkoverflaten motsatt dysen.
Friform reversibel innebygging av suspenderte hydrogeler (FRESH) er en bioprinting teknikk13,14 som bruker et granulært støttemateriale der det ekstruderte materialet deponeres og festes på plass av støttebadet. Støttebadet gir mekanisk støtte for den ekstruderte, forhåndskryssede bioinken til krysskoblingen. Den største fordelen med denne teknikken er at støttebadet gjør det mulig å ekstrudere materialer med lav viskositet som ikke kan opprettholde formen etter ekstrudering og før krysskobling15. Dette utvider bassenget med tilgjengelige materialer som kan brukes som bioinks.
Dette papiret presenterer en protokoll for generering av en vaskulær klaff som kombinerer mikroskala og mesoskala vaskulaturer. For å oppnå dette genereres bioprintede, selvmontering, mikrovaskulære nettverk i rekombinant human kollagenmetakrylat (rhCollMA) hydrogel, som deretter kobles til interiøret i et større, implanterbart, vaskulært stillas, noe som resulterer i en fullt konstruert vevsklaff16. For å etablere rask og direkte perfusjon av konstruert vev, er det nødvendig med en direkte mikrokirurgisk anastomose for å være vert for fartøy. Det vaskulære stillaset har ikke tilstrekkelig suturretensjonsstyrke til å bli anastomosed ved hjelp av tradisjonell mikrokirurgisk karvegg suturering. Derfor beskriver vi en "mansjett"17,18,19 metode for å oppnå en anastomose med en rottes vanlige lårarterie. I denne metoden er fartøyets ender sikret med omkrets suturer, uten behov for å perforere karveggen.
Selv om den foreslåtte protokollen er utarbeidet for å studere hierarkisk vaskulatur i rhCollMA-miljøet, kan denne tilnærmingen utvides og brukes på en rekke nye applikasjoner. Protokollen kan brukes på bioprinting av ulike vevsspesifikke celler i forskjellige bioinks. Videre kan geometrien og størrelsen på konstruksjonene enkelt endres for å passe til spesifikke krav, for eksempel stor vevsrekonstruksjon eller biologiske studier.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble godkjent og gjennomført under veiledning av Technion Pre-Clinical Research Authority (PCRA Technion, etikkgodkjenning nr. 058-05-20). Mannlige Sprague-Dawley rotter (275-350 g) ble brukt til disse studiene. Se materialfortegnelsen hvis du vil ha mer informasjon om alt materiale, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen.
1. Vaskulær stillasproduksjon
- Lag en 3D-datamodell av ønsket vaskulær stillasform ved hjelp av cad-programvare (computer-aided design) eller last ned en 3D-fil med ønsket vaskulær struktur fra online depoter.
- Lag en sylinder med en indre diameter på 0, 9 mm, en ytre diameter på 2 mm og en høyde på 18 mm. Tilsett radiale fenestrations med en diameter på 0, 22 mm ved siden av sylinderveggen.
- Lag en form for stillaset ved hjelp av 3D-designprogramvaren og eksporter den som en . STL-fil. Deretter legger du til en trakt til designet for å lette fyllingen av formen senere.
- Importer . STL fil inn i kutte programvare for smeltet avsetning modellering (FDM) 3D-skriver. Del opp modellen med en laghøyde på 0,1 mm, og eksporter den som GCODE eller send den direkte til 3D-skriveren.
- 3D skriver ut formen på en FDM 3D-skriver utstyrt med en 0,25 mm dyse, ved hjelp av vannløselig butene-diol vinylalkoholkopolymer (BVOH) filament. Oppbevar de trykte formene i et vakuumkammer til bruk.
FORSIKTIG: Unngå å håndtere BVOH-filamentet med bare hender, da det er fuktfølsomt. I tillegg anbefales det å lagre filamentet i et vakuumkammer for å unngå eksponering for fuktighet. - Forbered en polymerløsning av en 1:1 blanding av poly-L-melkesyre (PLLA) og polylaktisk-co-glykolsyre (PLGA) i 1,4-dioksan.
- Vei 350 mg PLLA og 350 mg PLGA og overfør til et 20 ml hetteglass.
- Mål 10 ml 1,4-dioksan og overfør til hetteglasset i glass ved hjelp av en glasspipette. Tilsett en liten magnetisk rørestang til hetteglasset i glass.
FORSIKTIG: 1,4-Dioksan er et farlig organisk løsningsmiddel. Bruk egnet personlig sikkerhetsutstyr og arbeid inne i en avtrekkshette. - Plasser hetteglasset i et varmtvannsbad oppvarmet til 70 °C og bland innholdet over natten til alle polymerene er helt oppløst. Oppbevar oppløsningen i en lufttett glassbeholder til bruk.
- Fyll BVOH-formene med PLLA:PLGA-oppløsningen.
- Bruk en positiv forskyvningspipette, mål 30 μL av polymeroppløsningen og fyll ut formen.
MERK: Volumet som trengs for å fylle formen, endres i henhold til volumet på det designede fartøyet. Fortsett å legge til polymerløsningen til muggtrakten er helt fylt. - Sentrifuger formen på 100 × g i 2 min. Fyll formen med ytterligere 20 μL av polymerløsningen for å sikre fullstendig fylling.
- Bruk en positiv forskyvningspipette, mål 30 μL av polymeroppløsningen og fyll ut formen.
- Frys de fylte formene ved -80 °C i minst 30 minutter for å sikre at all polymeroppløsningen fryser. Fjern løsningsmidlet fra formene ved å lyofilisere dem over natten.
MERK: Fargen på polymeren i formen skal vende seg fra klar til hvit etter frysetørkingsprosessen. - For å fjerne offerformmaterialet, overfør formene etter frysetørkingsprosessen til et 5 L deionisert vannbad under forsiktig omrøring. Bytt ut vannet i badekaret når det blir overskyet. Når alle BVOH-ene oppløses, tørker du stillasene luft og oppbevarer dem i et vakuumkammer til bruk.
2. Belegg det vaskulære stillaset med fibronectin
- Desinfiser PLLA:PLGA vaskulære stillaser ved å nedsenke dem i 70% etanol i 30 minutter.
- Vask stillasene 3x 5 min med PBS.
- Forbered en fortynning av 50 μg/ml human fibronectin i PBS og belegge stillasene.
- Bland 500 μL av lagerfibronektinoppløsning (1 mg/ml) med 9,5 ml PBS.
- Senk de desinfiserte vaskulære stillasene ned i denne fibronektinoppløsningen og inkuber dem ved 37 °C i 60 minutter for å tillate protein adsorpsjon.
- Etter inkubasjon, skyll stillasene med PBS for å fjerne den ubundne fibronectin. Oppbevar disse belagte stillasene ved 4 °C i opptil 1 uke.
3. rhCollMA bioink forberedelse
- Forbered en fosfatbuffer for å nøytralisere den sure rhCollMA bioink-bestanden.
- Forbered en 10x bestand av fosfatbuffer ved å oppløse 5,495 g Na2HPO4, 1,55 g NaH2PO4 og 30 mg NaCl i 50 ml deionisert vann.
- Forbered en 10 ganger fortynning av 10x bestandsfosfatbufferen ved å kombinere 1 del av 10x fosfatbuffer med 9 deler deionisert vann.
- Kombiner 900 μL av bestands rhCollMA-oppløsning med 100 μL 10x fosfatbuffer for å nøytralisere den sure rhCollMA-løsningen.
- Fortynn den nøytraliserte rhCollMA-løsningen til ønsket konsentrasjon på 10 mg/ml ved å blande den med den nødvendige mengden 1x fosfatbuffer.
MERK: Lagerkonsentrasjonen av rhCollMA varierer mellom mye. Derfor vil volumet av 1x fosfatbuffer som trengs for å nå ønsket konsentrasjon variere. - Klargjør porogen-fotoinitiatorløsningen (PEO-LAP) som skal kombineres med den fortynnede nøytrale rhCollMA.
- Forbered en 1,6% (w / v) løsning av poly (etylenoksid) (PEO) i fenol rødfri DMEM ved å oppløse 160 mg PEO i 10 ml DMEM.
- Tilsett 20 mg litiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosponat (LAP) til denne løsningen for å oppnå 0,2% (w / v) LAP i løsningen. Fra dette punktet, dekk løsningen med aluminiumsfolie eller hold den på et mørkt sted for å beskytte den mot lys.
- Steriliser PEO-LAP-oppløsningen ved å sende den gjennom et filter på 0,22 μm. Oppbevar denne oppløsningen ved 4 °C i opptil 1 uke.
- Før bioprinting blandes den fortynnede nøytrale rhCollMA-oppløsningen med PEO-LAP-oppløsningen i et 1:1-forhold for å oppnå den endelige bioinkløsningen. Bruk pipettering i stedet for en virvel for å blande løsningene samtidig som du unngår luftbobler.
- Hvis mange bobler blir introdusert i løsningen, sentrifugerer den på 2000 × g i 30 s. Etter sentrifugering blander du bioinkløsningen igjen for å sikre homogenitet.
4. Granulær støtte bad forberedelse
- Forbered gelatin granulært støttemateriale.
- I et biologisk sikkerhetsskap, del innholdet i ett 2 g rør med lyofilisert støttemateriale i to sterile 50 ml koniske rør, som hver inneholder ca. 1 g.
- Tilsett 40 ml kald (4 °C) fenolrød fri DMEM til hvert rør, og virvel kraftig til alt det lyofiliserte støttematerialet oppløses.
- La den resulterende slurry sitte ved 4 °C for å la støttematerialet rehydrere.
- Degas støttematerialet i et vakuumkammer i 30 min for å redusere bobler.
- Sentrifuger støttematerialet ved 2000 × g i 5 min. Forsikre deg om at materialet er på bunnen av røret og supernatanten er klar.
- Aspirer supernatanten, mens du er forsiktig så du ikke aspirerer støttematerialet nederst.
MERK: Støttematerialet skal ikke strømme under skråstilling av røret etter at supernatanten er fjernet. Hvis materialet flyter, sentrifugerer du det igjen med de samme innstillingene, men uten å legge til nytt supernatant.
- Overfør ca. 4 ml av det forberedte, komprimerte støttematerialet til hver brønn på en 12-brønnsplate ved hjelp av en positiv forskyvningspipette. Trykk på brønnplaten på en hard overflate for å tvinge støttematerialet til å spre seg jevnt i brønnen.
MERK: Det minimale anbefalte volumet av støttemateriale er 3 ganger volumet på konstruksjonen som skal skrives ut i den. - Plasser brønnplaten med støttematerialet på et avkjølt bioprinterstadium, eller ved 4 °C, til den brukes til å forhindre at gelatinpartiklene smelter.
5. Inkorporering av endotelceller og støtteceller med bioink
- Forbered endotelcellemedium i henhold til produsentens instruksjoner ved å blande basalmediet med den tilsvarende medium kit-komponenten, inkludert en antibiotikaløsning, foster bovint serum og endotelcelleveksttilskudd.
- Forbered tannmasse stamcellemedium ved å kombinere 500 ml lavglukose DMEM, 58 ml foster bovint serum, 5,8 ml ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 5,8 ml glutaminerstatning, 5,8 ml 1 M HEPES og 5,8 ml penicillin-streptomycin-nystatinoppløsning.
- Forbered en suspensjon som inneholder 2 × 106 ZsGreen1-uttrykkende humane fettmikrovaskulære endotelceller (HAMEC-ZsGreen1) og 6 × 106 dentalmasse stamceller (DPSCer) i 10 ml endotelcellemedium.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 200 × g i 4 min for å få en cellepellet. Aspirer det overnaturlige mediet.
- Resuspend cellepellet i 1 ml rhCollMA bioink tilberedt tidligere (inneholder PEO-LAP) for å oppnå en bioink med en total cellekonsentrasjon på 8 × 106 celler per 1 ml bioink.
FORSIKTIG: Etter å ha kombinert bioink med cellene, fortsett umiddelbart til neste trinn. Hvis cellene blir igjen i suspensjonen i lang tid, vil cellene synke til bunnen av røret, og deres levedyktighet vil forverres. For eksperimenter som ikke involverer celler, kan du enten hoppe over trinn 5.1-5.5, eller innlemme fluorescerende perler med bioink i stedet for celler for forbedret mikroskopisk visualisering av de trykte konstruksjonene. - Overfør celler-bioink-blandingen til utskrift av patroner.
- Monter en nål med 0,22 mm innvendig diameter på en 3 ml gul utskriftspatron og plasser patronen i et konisk rør på 50 ml.
- Overfør 1 ml av cellebioinkblandingen til utskriftspatronen ved å fylle den fra toppen ved hjelp av en positiv forskyvningspipette for å redusere bobler.
- Monter skriverpatronen i riktig verktøy på bioprinteren.
6. Bioprinting mikrofonvaskulære nettverk ved hjelp av rhCollMA bioink
- Lag en 3D CAD-design for det biotrykte mikrovaskulære nettverket.
- Skisser et 2D-mønster av en 4 mm firkant som inneholder en sirkulær kanal med 2 mm diameter i midten. Ekstruder skissen med 4 mm for å få en terning på 4 mm x 4 mm x 4 mm med en sentral kanal. Eksporter dette objektet som en . STL-fil.
- Importer en 12-brønnsplate . STL-mal i den solide modelleringsfanen i bioprinterens skjæreprogramvare og plasser den i det angitte området av den virtuelle utskriftssengen.
- Importer . STL-fil av kubeformen inn i den solide modelleringsfanen i bioprinter slicing programvare. Klikk på avmerkingsboksen bruk ekstern slicer | konfigurere slicer under delen for objektegenskaper . I popup-vinduet velger du et rettlinjet mønster for fyllmønsteret, og skriver inn 30 % i fylltettheten. Klikk Godta.
- Plasser en kopi av kubefiguren i hver ønskede virtuelle brønn ved å klikke på kuben og flytte den ved hjelp av musen.
- Lag nye materialinnstillinger for rhCollMA bioink i materialfanen til bioprinterens skjæreprogramvare ved å klikke på legg til materiale-knappen . Velg materialets innstillinger for utskrift. For trykk, skriv inn 2 psi i den tilsvarende boksen. For hastighet skriver du inn 20 mm/s i den tilsvarende boksen.
MERK: Hvert bioinkmateriale har sine egne forskjellige utskriftsinnstillinger som kan lagres i materiallisten i applikasjonen. - Tilordne verdiene for linjebredde og linjehøyde til 0,24 mm og akselerasjonsverdien til 400 mm/s2 ved å skrive inn disse verdiene i de tilsvarende boksene.
- I kategorien heldekkende modellering klikker du kubeobjektet, og deretter klikker du rhCollMA-materialet fra materialdelen for å tilordne det til kubefiguren. I kategorien biomontering klikker du på Send utskriftsjobb-knappen for å sende utskriftsjobben til bioprinteren.
- Legg skriverpatronen som er lastet med den cellulære bioinken, i det 3 ml omgivende pneumatiske dispenseringsverktøyet til den 3D-ekstruderingsbaserte bioprinteren.
- Sett utskriftssengtemperaturen til 4 °C ved å klikke på den kjølige knappen under fanen Kontrolloppvarming/kjøling i skjermbildet for bioprintergrensesnittet. Legg platen med støttebadet på skriversengen.
MERK: Materialets innstillinger for utskriftstrykk og hastighet kan endres på grunn av forskjeller i omgivelsestemperatur eller variasjon i bioink-batchen. For eksempel, på kaldere dager, er det nødvendig med et høyere trykk eller langsommere hastighet for å ekstrudere samme mengde materiale. - I utskriftsfanen på skjermbildet for bioprintergrensesnittet klikker du på utskriftsjobben som ble sendt i trinn 6.7. og klikk start | gå for å starte utskriftsjobben.
- Etter utskrift, utsett brønnplaten til en 405 nm lyskilde med en intensitet på 3 mW/cm2 i 30 s for å starte krysskoblingen av rhCollMA bioink.
- Etter krysskobling, inkuber brønnplaten ved 37 °C og 5 % CO2 i minst 20 minutter til alt støttebadet smelter.
- Aspirer forsiktig det flytende støttebadet og erstatt det med endotelcellemedium. Inkuber konstruksjonene ved 37 °C og 5 % CO2 til bruk i ytterligere trinn.
MERK: På grunn av sammentrekningen av konstruksjonen etter utskrift, anbefales det å utføre monteringen trinn 7 samme dag som trinn 6.
7. Montering av det biotrykte mikrovaskulære nettverket med det vaskulære stillaset for å oppnå den konstruerte vaskulære klaffen
- Umiddelbart etter at du har støttet materialfjerning av det biotrykte mikrovaskulære nettverket, plasserer du et fibronectinbelagt PLLA: PLGA vaskulært stillas i hovedkanalen til den biotrykte strukturen.
- Inkuber de monterte konstruksjonene ved 37 °C og 5 % CO2 i 2 dager.
- Line lumen av vaskulær stillas med endotelceller.
- Forbered en celle suspensjon av tdTomato-uttrykkende humane fettmikrovaskulære endotelceller (HAMEC-tdTomato) i en konsentrasjon på 1 × 107 celler / ml.
- Plasser en 20 μL dråpe av denne cellefjæringen på en hydrofob overflate (dvs. en ikke-vevskultur [nonTC] 10 cm tallerken).
- Plasser forsiktig de vaskulære stillasene på toppen av dråpen, slik at lumen på stillaset i den ene enden kommer i kontakt med celledråpen.
- Aspirer dråpen fra den motsatte enden av stillaset (dvs. enden som ikke kommer i kontakt med dråpen), og fyll lumen med cellesuspensjonen.
- Plasser frøstillaset i et mikrocentrifugerør og legg det i en rotator inne i en fuktet inkubator i 60 minutter. Deretter overfører du stillaset til en 12-brønns plate og tilsett 2 ml endotelcellemedium.
- Kultur de konstruerte klaffene i 7 dager, samtidig som du erstatter mediet hver annen dag med fersk endotelcellemedium.
8. Konfektmikroskopi og immunfluorescensfarging av de konstruerte klaffene
- Etter 4 dager og 7 dager med kultur, utfør live-cell avbildning av de monterte stillasene ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop.
- Definer fluorescenskanalene for ZsGreen1 og tdTomato fluorescerende proteiner på programvaren for oppkjøp av mikroskopbilder.
- Velg et objektiv på 5x/0,16 med 0,5x zoom (pikselstørrelse 5 μm), og definer en Z-stabel med 22 skiver med en tykkelse på 41 μm hver.
- Definer en 3 x 2 flisskanning for å bilde og fange opp hele konstruksjonen.
- Juster laserintensiteten og forsterkningsverdiene for å oppnå et klart fluorescerende signal uten metning og minimal bakgrunn og skaffe bildene.
- Utfør en maksimal intensitetsprojeksjon av den oppkjøpte Z-stakken for å få et enkelt 2D-bilde ved hjelp av programvaren for oppkjøp av mikroskopbilder eller lignende bildeanalyseprogramvare.
- Utfør høyere forstørrelsesavbildning av et interesseområde.
- Bytt til et objektiv på 10x/0,3 med 0,5 zoom (pikselstørrelse 1,25 μm) og definer en Z-stabel med 9 tykkelser på 41 μm.
- Utfør trinn 8.2.-8.3.
- Etter 7 dager med kultur, fest de konstruerte klaffene ved å senke dem ned i 4% paraformaldehyd i 20 min.
- Vask konstruksjonene 3x 5 min med PBS.
- Tilsett 0,3% (v/v) Triton-X i PBS i konstruksjonene og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur for å permeabilisere cellene.
- Vask konstruksjonene 3x 5 min med PBS.
- Forbered en blokkeringsløsning ved å oppløse 5 % (w/v) bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Tilsett blokkeringsløsningen til de konstruerte klaffene og inkuber i 1 time ved romtemperatur.
- Forbered den primære antistoffløsningen ved å fortynne mus anti-glatt muskel actin (anti-SMA) 1:50 antistoff i 5% BSA-løsningen som tidligere er utarbeidet for å flekke de SMA-uttrykkende støttecellene.
- Inkuber stillasene i den primære antistoffløsningen over natten ved 4 °C.
- Vask 3x 5 min med PBS.
- Forbered den sekundære antistoffløsningen ved å fortynne Cy3-konjugert geit antimus IgG 1:400 antistoff og 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, 2,5 μg/ml) i PBS.
- Påfør den sekundære antistoffløsningen på stillasene og inkuber i 3 timer ved romtemperatur.
- Vask 3x 5 min med PBS.
- Oppbevar konstruksjonene ved 4 °C i PBS i opptil 1 måned.
- Se for deg de fargede stillasene ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop.
- Definer de tre fluorescenskanalene (DAPI, ZsGreen og Cy3) på programvaren for oppkjøp av mikroskopbilder.
- Definer en Z-stabel med en seksjonstykkelse på 2 μm som strekker seg over en total tykkelse på 50 μm. Deretter definerer du en flisskanning for å bilde større områder av konstruksjonen.
- Juster anskaffelsesparametrene for å oppnå et klart fluorescerende signal uten metning og minimal bakgrunn.
- Skaff bildene ved hjelp av 20x/0.8 målsetting med 1.0x zoom (pikselstørrelse 0.31 μm).
- Utfør en maksimal intensitetsprojeksjon av den oppkjøpte Z-stakken for å få et enkelt 2D-bilde ved hjelp av programvaren for oppkjøp av mikroskopbilder eller lignende bildeanalyseprogramvare.
9. Anastomosing den konstruerte klaffen direkte til en rottes lårarterie ved hjelp av en mansjettteknikk
- Forbered og steriliser (autoklaver) følgende kirurgiske verktøy: Nr. 15 skalpell, et par fine tannede tang og et lite par ringhåndtert saks. I tillegg kan du forberede og sterilisere følgende mikrokirurgiske verktøy: en rett finspisset No. 3 juveler tang, en vinklet gullsmed tang tang, en rundhåndtert nålholder med buede kjever, et par kardilatorer, dissekering saks, adventitia saks, samt karklemmer med applikatoren.
- Forbered en løsning på 100 IE / ml heparinisert saltvann ved å fortynne 5 ml lager heparinoppløsning med 195 ml saltvann.
- Klipp og steriliser polyimidmansjetter.
- Klipp 2,5 mm deler av et polyimidrør under et dissekeringsmikroskop.
- I den ene enden av hver seksjon gjør du et 1,25 mm på langsgående snitt i rørets vegg for å få et mansjetthåndtak. Lag et vinklet kutt i den andre enden av røret for å lette fartøyets eversjon.
- Senk mansjettene ned i 70% etanol etterfulgt av to vasker med heparinisert saltvann.
- Forbered en mannlig Sprague-Dawley rotte (275-350 g) for kirurgi.
- Syv dager før operasjonen begynner du å administrere en subkutan daglig dose ciklosporin (10 mg kg-1) for å oppnå immunundertrykking.
- Før operasjonen bedøver dyret ved hjelp av 3% isofluraninnånding i henhold til institusjonell SOP ved hjelp av et induksjonskammer. Kontroller dypbedøvelse ved å klemme begge føttene og se etter reflekser.
- Administrer en subkutan dose smertestillende buprenorfin (0,03 mg kg-1) og antikoagulerende heparin (200 IE kg-1).
- Påfør en smørende øyesalve på dyrets øyne for å forhindre dehydrering.
- Barber det kirurgiske området av rotten og desinfiser stedet med jod og deretter 70% etanol. Fest dyrets lemmer til bordet ved hjelp av tape.
- Eksponere og isolere den vanlige lårarterien.
- Lag et 2 cm langt, skrå snitt gjennom huden, langs konkavititeten mellom benet og magen.
- Bruk tang og stump saks, slipp huden fra det underliggende vevet for å visualisere den inguinale fettputen.
- Bruk saks og tang, kutt rett gjennom fettputen rundt øvre, medial og nedre marger. Vær oppmerksom på ikke å kutte store kar under fettputen.
- Reflekter fettputen sidelengs, slik at de epigastriske karene er intakte. Legg en våt gasbind på den reflekterte fettputen for å forhindre tørking og fikse den på plass. Sørg for at de vanlige lårfartøyene er synlige.
MERK: Fettputen vil senere bli brukt til å påføre mykt trykk på anastomosene. - Utsett lårarterien fra inguinal ligamentet proksimalt til det epigastriske arterieforgreningspunktet distalt ved å trekke det ut fra hylsen.
FORSIKTIG: Det er vanligvis en gren av lårarterien som går under den, ofte kalt Murphys gren. Vær oppmerksom på ikke å skade denne vanskelig å se grenen. - Del Murphys gren ved å ligating den, og deretter ligate lårarterien med to ligaturer midt i arterien fordelt 1 mm fra hverandre. Hold den ene enden av ligatursugingen lang å bruke senere for å trekke karenden gjennom mansjetten.
- Klipp arterien mellom de to ligaturene ved hjelp av adventitia saks.
FORSIKTIG: Det skal ikke være blødninger når du utfører dette kuttet. Hvis arteriell ende blør, klem arterien og bruk en ligatur på nytt. - Bruk den lange enden av ligatursugingen, sett hver karende inn i en polyimidmansjett, som utarbeidet i forrige trinn, slik at de to mansjettenes håndtak peker bort fra hverandre.
- Etter innsetting, bruk en klemme samtidig på mansjetthåndtaket og karet, og fest mansjetten på plass.
- Forbered en heparinisert saltløsning i en sprøyte utstyrt med en 27 G nål.
- Trekk i den ligaterte fartøyets ende og kutt den nær ligaturen. Vask straks karets ende grundig med den hepariniserte saltvannssalinen til det ikke er noe blod synlig i lumen.
FORSIKTIG: Sørg for at karenden vaskes godt siden blod som er igjen inne vil danne en blodpropp, som vil bli introdusert til blodet når du fullfører prosedyren. Dette kan føre til okklusjon av fartøyet og tap av perfusjon til beinet. - Utvid lumen av fartøyet ved å holde det ved sin kappe med den ene hånden og utvide lumen med kardilatoren med den andre hånden.
- Plasser en løs 6-0 polypropylenomkrets sutur rundt mansjettkroppen. Evert fartøyets ende ved hjelp av to kardilatorer over mansjettkroppen og fest den ved å stramme den omkretsmessige suturen.
MERK: Hvis det lekker blod gjennom det klemte karet under manipulasjonene, vask lumen grundig med heparinisert saltvann. - Skyll den konstruerte klaffen med heparinisert saltvann, og sett deretter den karforede mansjetten inn i lumen på det vaskulære stillaset. Fest stillaset på plass ved å plassere en omkrets 6-0 polypropylen sutur rundt stillaset og mansjettkroppen. Gjør dette trinnet for begge sider av det vaskulære stillaset.
- Pakk et 0,2 μm polystyrenmembranfilter rundt anastomosene for å isolere den konstruerte klaffen fra det omkringliggende vevet.
- Slipp den distale klemmen først; Slipp deretter den proksimale klemmen for å gjenopprette blodstrømmen gjennom karet.
- For å stoppe blødninger gjennom anastomosene, reflektere fettputen tilbake over lårkarene og bruke forsiktig trykk ved hjelp av en steril gasbind i 3 min.
- Suturer fettputen tilbake på plass ved hjelp av 6-0 polypropylen; Deretter suturerer du huden ved hjelp av 5-0 PGA absorberbare suturer.
- Rengjør sårområdet med saltvann og påfør jodoppløsning.
- For postoperativ smerte og dyreforvaltning, lag en 0,1% (v / v) tramadol i drikkevann. Videre administrere en daglig dose heparin (200 IE kg-1) og ciklosporin (10 mg kg-1).
- Plasser dyret i et rent bur av seg selv plassert under en varmelampe. Fortsett å overvåke dyret til det gjenvinner tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal heftelse.
Representative Results
Denne protokollen beskriver fabrikasjonen av en konstruert klaff som består av et vaskulært stillas (figur 1Ai) og en biotrykt mikrovaskulatur (figur 1Aii), som ble montert for å oppnå mesoskala og mikroskala vaskulaturer (figur 1Aiii). Etter protokollen ble BVOH-former av det vaskulære stillaset designet og 3D-trykt (figur 1B, C). De oppnådde trykte strukturene ble visuelt inspisert for små tråder av BVOH, som kan finnes i de tomme områdene i formene (figur 1D). Disse trådene indikerer vanligvis feil materialinnstillinger eller at BVOH har absorbert fuktighet. Disse trådene bør fjernes, da de kan føre til ufullstendig fylling av formen og strukturelle feil i det resulterende vaskulære stillaset. Deretter ble formene fylt med PLLA: PLGA-løsning, etterfulgt av frysetørkingsprosessen og vasketrinnene, som beskrevet i protokollen. Det oppnådde PLLA:PLGA vaskulære stillaset ble visuelt inspisert for å verifisere fartøyets veggintegritet og lumen patency (figur 1E).
En nøytralisert rhCollMA bioink med en konsentrasjon på 10 mg/ml ble tilberedt og kombinert i et 1:1-forhold med PEO:LAP-løsningen. Humane adipose microvascular endotelceller merket med Zs-Green1 og dentalmasse stamceller ble resuspendert med rhCollMA bioink, og løsningen ble lastet inn i en utskrift patron og på skriveren. Boksformer med en sentral kanal med et rettlinjet mønster (figur 1D) ble bioprintet inne i gelatinstøttebadet. Etter utskrift ble konstruksjonene krysskoblet, og støttebadet ble oppløst og vasket. Etter 4 dager med kultur ble konstruksjonene live-avbildet for å se etter mikrovaskulær nettverks-selvmontering. Figur 1D viser et eksempel på et høyt utviklet HAMEC-ZsGreen1 mikrovaskulært nettverk i den biotrykte konstruksjonen.
Deretter ble et fibronektinbelagt vaskulært stillas satt inn i den sentrale kanalen til den trykte konstruksjonen (figur 2A). De monterte konstruksjonene ble dyrket i 2 dager, hvor cellene trekker gelen, fester den fast til det vaskulære stillaset. Deretter ble det vaskulære stillaset foret med HAMECer som uttrykte tdTomato, i henhold til protokollen. Etter 7 dager med kultur ble konstruksjonene fikset og avbildet. Figur 2B viser en sidevisning av de monterte konstruksjonene der endotelcellene i den biotrykte mikrovaskulaturen er avbildet i grønt, mens endotelforingen til det vaskulære stillaset er avbildet i rødt. Bildet viser en grønn mikrovaskulær selvmontering i den biotrykte gelen, mens det vaskulære stillaset er foret med røde endotelceller. Med høyere forstørrelse ses spirer som stammer fra det røde endotelfôret spirende og anastomosing med det biotrykte mikrovaskulære nettverket (figur 2C). Deretter ble konstruksjonene farget for α glatt muskel actin (SMA) som markør for tannmasse stamceller. Etter immuniseringen ble konstruksjonene avbildet ved hjelp av et laserskanningskonfokalt mikroskop (figur 2D).
Til slutt, etter 7 dager med kultur, ble de konstruerte klaffene mikrokirurgisk anastomosed til en rottes lårarterie, som beskrevet i protokollen. En video av en representativ prosedyre kan sees i Supplemental Video S1. Figur 2E viser et representativt bilde av en fullført anastomos før klemmefjerning, og figur 2F viser et representativt bilde av anastomoser etter klemmefjerning og hemostase. Det skal ikke være noen blødning synlig før sårlukking.
Figur 1: Representative bilder av de fabrikkerte meso- og mikroskalafartøyene. (A) Skjematisk oversikt over protokollens trinn. Gjengitt med tillatelse16. (B) CAD-design for offerformen til det vaskulære stillaset. (C) Sidevisning av en representativ 3D-trykt offerform (skalastang = 0,5 mm). (D) Toppvisning av offerform (skalastang = 0,5 mm) (E) Representativt vaskulært stillas fremstilt ved hjelp av beskriveprotokollen (skalastang = 5 mm). (F) CAD-design for 3D bioprinted rhCollMA mikrovaskulært nettverk. Gitterlinjer = 1 mm. (G) Representativt bilde av et høyt utviklet biotrykket vaskulært nettverk som viser HAMEC-ZsGreen1 i grønt. Skalastang = 200 μm. Forkortelser: CAD = dataassistert design; rhCollMA = rekombinant human kollagenmetakrylat; HAMEC = humane fettmikrovaskulære endotelceller; PLLA = poly-L-melkesyre; PLGA = polylaktisk-co-glykolsyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative bilder av den monterte vaskulære klaffen. (A) Et fotografi av en representativ montering av biotrykket mikrovaskulatur og det vaskulære stillaset. Skalastang = 1 mm. (B) Sidevisning av en representativ konstruert klaff avbildet 4 dager etter endotelforing av det vaskulære stillaset. Den biotrykte mikrovaskulaturen er vist i grønt (HAMEC-ZsGreen1), mens endotelforingen er vist i rødt (HAMEC-tdTomato). Skalastang = 1 mm. (C) Representativt bilde av anastomoser mellom den biotrykte vaskulaturen i grønt og endotelforingen i rødt. Skala bar = 200 μm. (D) Representativt bilde av immunostaining for glatt muskel aktin (rød), kjerner (blå) og endotelceller (grønn) etter 7 dager med inkubasjon. Skalastang = 0,1 mm. (E) Representativt bilde av en ferdig anastomos av den konstruerte klaffen med en rottes lårarterie før klemmefjerning og (F) etter klemmefjerning. Forkortelser: HAMEC = humane adipose mikrovaskulære endotelceller; SMA = glatt muskel aktin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende video S1: Representativ mikrokirurgisk prosedyre for anastomosing vaskulær stillas til en rottes lårbensarterie. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Discussion
Ingeniørvaskulært vev er en av hovedutfordringene ved vevsteknikk20. Nåværende metoder for å skape konstruert vaskulært vev fokuserer på å skape selvmontert mikrovaskulatur 21,22,23 eller fremstille mesoscale vaskulære stillaser24,25 og ikke på å gjenskape et system av hierarkisk vaskulatur, som kan perfused umiddelbart og direkte ved implantasjon26 . I dette arbeidet beskriver vi en protokoll som benytter to 3D-printing modaliteter for å fremstille et hierarkisk fartøynettverk sammensatt av mikroskala og mesoskala vaskulaturer. Protokollen kombinerer et 3D bioprinted, selvmontert mikrovaskulært nettverk med et mesoskala vaskulært stillas, og oppnår en implanterbar, vaskulær klaff. Videre presenterer dette papiret en protokoll for direkte anastomosing denne klaffen til en rottes lårarterie.
3D bioprinting har fått interesse de siste årene på grunn av sin allsidighet over tradisjonelle vevsteknikker. Mens denne protokollen beskriver genereringen av et mikrovaskulært nettverk i rhCollMA bioink, kan metodene som brukes brukes brukes med få modifikasjoner på mange andre bioinks fra mengden studert og nye bioinks og støtte bad27,28. Vi valgte å bruke rhCollMA som bioink på grunn av overflod av type I kollagen i den menneskelige ECM, noe som gir et passende miljø for cellevedlegg. Videre produseres det rekombinant i planter og videre modifisert med metakrylatgrupper, noe som muliggjør fotopolymerisering og dannelse av stabile 3D-hydrogeler29,30. Photocrosslinking ble oppnådd ved tilsetning av fotoinitiatoren LAP, som har vist seg å være giftfri og aktiveres ved eksponering for 405 nm blått lys, noe som reduserer mulig fototoksisitet av UV-lys. Imidlertid krever bruk av lysfølsomme bioinks bruk av et fenol rødfritt kulturmedium for fremstilling av bioink og støttematerialet. Videre beskriver protokollen bruken av gelatinstøttemateriale, noe som muliggjør ekstrudering av bioinks som rhCollMA. Dermed er det viktig å sikre bruk av kaldt medium under forberedelsen og kjølingen av skriversengen. Overdreven oppvarming kan oppstå på grunn av lyskilden som brukes til krysskobling eller fra forhøyede omgivelsestemperaturer.
En ekstruderingsbasert bioprinter har blitt brukt her for å skape det biotrykte mikrovaskulære nettverket, og det er for tiden mange kommersielt tilgjengelige bioprintere som kan generere lignende konstruksjoner. Videre kan de foreslåtte metodene enkelt endres og brukes til å studere forskjellige geometrier, størrelser og fyllingsmønstre. I dette arbeidet ble et rettlinjet fyllingsmønster valgt for å skape sammenkoblede porer, og dette kan skrives ut relativt raskt med høy kvalitet.
Luftbobler introduserer en betydelig utfordring i ekstruderingsbioprinting, spesielt inne i støttematerialer. Derfor er det avgjørende å minimere tilstedeværelsen og dannelsen av disse boblene ved å bruke positive forskyvningspipetter for overføring av støttematerialet, utarbeidelsen av bioink-cellefjæringen og overføringen til utskriftspatronene.
I dette arbeidet ble humane fettavledede endotelceller og tannmasse stamceller brukt som støtteceller på grunn av deres relativt enkle isolasjon fra pasienter. Videre ble en total cellekonsentrasjon på 8 x 106 celler / ml valgt siden denne konsentrasjonen har vist seg å etablere de mest utviklede vaskulære nettverkene16. Selv om denne protokollen kan brukes til å generere mikrovaskulatur ved hjelp av forskjellige celletyper og kilder, samt forskjellige bioinks, må det gjøres en kalibrering av cellekonsentrasjon for å etablere de beste forholdene for utviklingen av det mikrovaskulære nettverket. Videre kan vevsspesifikke celler (dvs. myoblaster eller osteoblaster) innlemmes i bioink for å oppnå vevsspesifikke vaskulære klaffer.
Formen til det porøse vaskulære stillaset ble fremstilt ved hjelp av 3D-trykt vannløselig materiale på en kommersielt tilgjengelig ekstruderings 3D-skriver. Dette resulterer i en kostnadseffektiv teknikk basert på raske prototypingsplattformer, slik at mange forskjellige geometrier og størrelser av vaskulære stillaser kan studeres og screenes raskt31. Likevel er en begrensning av denne metoden oppløsningsgrensen for de fleste 3D-skrivere32. Men med den raskt utviklende industrien rundt additiv tilvirkning, forventes disse grensene å forbedre seg over tid. Bruken av organiske løsningsmidler for fabrikasjonsprosessen er en annen begrensning i protokollen, da de fleste organiske løsningsmidler er giftige for celler, og forhindrer evnen til å kombinere bioprintprosedyren med den vaskulære stillasfabrikasjonsprosessen.
Den beskrevne metoden for såing av lumen av stillaset ved hjelp av aspirasjon i motsetning til å skyve celleopphenget har store effekter på lokaliseringen av frøcellene. Bruk av negativt trykk gjør det mulig å endotelisere stillasets indre lumen samtidig som det minimerer søl av cellefjæringen gjennom perforeringene på stillasets vegg16.
Den beskrevne "mansjett" metoden for mikrokirurgiske anastomoser kan enkelt modifiseres og tilpasses forskjellige vaskulære stillasmaterialer eller størrelser, samt til forskjellige arterier og årer i en bred skala av dyremodeller. Tilpasningene til protokollen vil omfatte forskjellige polyimidrørstørrelser og suturstørrelser. Denne metoden krever ikke perforering av stillasveggen, noe som kan føre til utvikling av feil. Dette arbeidet presenterer en protokoll som kan utvides til mange programmer. De kritiske aspektene ved denne protokollen, som inkluderer fabrikasjon av meso- og mikroskala vaskulatur og deres montering og implantasjon, representerer kritiske aspekter ved konstruerte klaffer både for rekonstruktive applikasjoner, samt vaskulære og andre vevsteknikkstudier.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet fikk støtte fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 (tilskuddsavtale nr. 818808). rhCollMA ble sjenerøst levert av CollPlant (Rehovot, Israel). Forfatterne takker Technions prekliniske forskningsmyndighet for hjelpen med dyrepleie, samt Janette Zavin, Galia Ben David og Idan Redenski.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dioxane | Biosolve Chemical | 42405 | |
| 27 G x 0.5" blunt tip dispensing needles | CML supply | 901-27-050 | |
| 3cc amber syringe barrel & piston set | Nordson EFD | 7012085 | Amber syringes used to block light and prevent premature crosslinking |
| 5-0 AssuCryl PGA absorbale suture | Assut Sutures | Absorbable sutures used for skin wound closure | |
| 6-0 polypropelene sutures | Assut Sutures | 9351 | |
| Acland clamps | S&T | B-1V | |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-15 | |
| Angled no.3 jeweler's forceps | S&T | JFAL-3-18 | |
| BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter | Advanced Solutions | a 6-axis 3D bioprinter | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Buprenorphine | vetmarket | B15100 | |
| BVOH filament | Verbatim | 55903 | a water-soluble 1.75 mm diameter filament |
| Clamp applying forceps | S&T | CAF-4 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| Dietrich bulldog clamps | Fine Science Tools (FST) | 18039-45 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carlo Erba Reagents | 480141 | |
| Dissection scissors | S&T | 18039-45 | |
| DMEM, High Glucose, No Phenol Red | Sartorius | 01-053-1A | |
| Duratears | Alcon | DJ03 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | glutamine substitute |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Heparin Sodium 5,000 I.U./mL | Panpharma | - | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | A stock concentration of 1 mg/mL |
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal Critical Care | NDC 66794-011-25 | |
| LifeSupport | Advanced Biomatrix | 5244 | a gelatin support slurry for FRESH 3D bioprinting |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| MICROMAN E M1000E, 100-1,000 µL | Gilson | FD10006 | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Poly(ethylene oxide), M.W. 250,000 to 400,000 | Acros Organics | 178602500 | |
| Poly(L-lactic acid), IV 5.0 dl/g (PLLA) | Polysciencse, Inc. | 18582-10 | |
| Polyimide tubing, ID: 0.0249", OD: 0.0273" | Cole-Parmer | 95820-05 | A thin-walled tube used to fabricate cuffs for microsurgical anastomoses |
| Prusa I3 MK2.5 3D Printer | Prusa Research | http://www.prusa3d.com/ | a popular commercial 3D printer |
| Resomer RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Evonik Industries | 719870 | |
| rhCollMA | CollPlant | https://collplant.com/ | generously provided by CollPlant (Rehovot, Israel) |
| round-handled needle holder | S&T | B-15-8 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
| Sodium Chloride | Biosolve Chemical | 19030591 | |
| Sodium Phosphate dibasic (NaH2PO4) | Riedel-de Haen | 4276 | |
| Solidworks | Dassault Systems | CAD software | |
| Straight no.3 jeweler's forceps | S&T | JF-3-18 | |
| Straight serrated forceps | Fine Science Tools (FST) | 11050-10 | |
| Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton Limited | 305 | |
| Triton-X 100 | BioLab LTD | 57836 | |
| TSIM | Advanced Solutions | 3D slicing and design software for the BioAssembly Bot | |
| Vessel dilator | S&T | D-5a.1 | |
| Zeiss Tivato 700 surgical microscope | Zeiss |
References
- Wallace, C. G., Wei, F. -C. C. The current status, evolution and future of facial reconstruction. Chang Gung Medical Journal. 31 (5), 441-449 (2008).
- Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G.
- Duan, B. State-of-the-art review of 3D bioprinting for cardiovascular tissue engineering. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 195-209 (2017).
- Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
- Ouyang, L., Armstrong, J. P. K., Chen, Q., Lin, Y., Stevens, M. M. Void-free 3D bioprinting for in situ endothelialization and microfluidic perfusion. Advanced Functional Materials. 30 (1), 1908349 (2020).
- Baltazar, T., et al. Three dimensional bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes, fibroblasts, pericytes, and endothelial cells. Tissue Engineering - Part A. 26 (5-6), 227-238 (2020).
- Chia, H. N., Wu, B. M. Recent advances in 3D printing of biomaterials. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 4 (2015).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
- Guillotin, B., et al. Laser assisted bioprinting of engineered tissue with high cell density and microscale organization. Biomaterials. 31 (28), 7250-7256 (2010).
- Catros, S., et al. Laser-assisted bioprinting for creating on-demand patterns of human osteoprogenitor cells and nano-hydroxyapatite. Biofabrication. 3 (2), (2011).
- Ronca, A., Ambrosio, L., Grijpma, D. W. Preparation of designed poly(d,l-lactide)/nanosized hydroxyapatite composite structures by stereolithography. Acta Biomaterialia. 9 (4), 5989-5996 (2013).
- Lan, P. X., Lee, J. W., Seol, Y. J., Cho, D. W. Development of 3D PPF/DEF scaffolds using micro-stereolithography and surface modification. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 20 (1), 271-279 (2009).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- Bhattacharjee, T., et al.
- Szklanny, A. A., et al. 3D bioprinting of engineered tissue flaps with hierarchical vessel networks (VesselNet) for direct host-to-implant perfusion. Advanced Materials. 33 (42), 2102661 (2021).
- Schleimer, K., et al. Training a sophisticated microsurgical technique: interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats. Journal of Visualized Experiments JoVE. (69), (2012).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: A new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
- Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), (2014).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
- Szklanny, A. A., et al. High-throughput scaffold system for studying the effect of local geometry and topology on the development and orientation of sprouting blood vessels. Advanced Functional Materials. 1901335, 1-13 (2019).
- Song, W., et al. Engineering transferrable microvascular meshes for subcutaneous islet transplantation. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).
- Ying, G. L., et al. Aqueous two-phase emulsion bioink-enabled 3D bioprinting of porous hydrogels. Advanced Materials. 30 (50), 1-9 (2018).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Jang, J., Park, J. Y., Gao, G., Cho, D. W. Biomaterials-based 3D cell printing for next-generation therapeutics and diagnostics. Biomaterials. 156, 88-106 (2018).
- Suntornnond, R., An, J., Chua, C. K. Roles of support materials in 3D bioprinting - present and future. International Journal of Bioprinting. 3 (1), 83-86 (2017).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human recombinant type I collagen produced in plants. Tissue Engineering - Part A. 19 (13-14), 1527-1533 (2013).
- Stein, H., et al. Production of bioactive, post-translationally modified, heterotrimeric, human recombinant type-I collagen in transgenic tobacco. Biomacromolecules. 10 (9), 2640-2645 (2009).
- Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of precision polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , 120062 (2020).
- Karakurt, I., Lin, L. 3D printing technologies: techniques, materials, and post-processing. Current Opinion in Chemical Engineering. 28, 134-143 (2020).
