Summary
מטרת פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת על הכנת דגימה נכונה לניתוח שומנים ומטבוליטים ברקמות קטנות, כגון מוח דרוזופילה , באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסות בסיוע מטריצה.
Abstract
פרופיל שומנים, או lipidomics, היא טכניקה מבוססת היטב המשמשת לחקר כל תוכן השומנים של תא או רקמה. מידע הנרכש מליפידומיקה הוא בעל ערך בחקר המסלולים המעורבים בהתפתחות, מחלות ומטבוליזם תאי. כלים ומכשור רבים סייעו לפרויקטים של ליפידומיקה, בעיקר שילובים שונים של ספקטרומטריית מסות וטכניקות כרומטוגרפיה נוזלית. דימות ספקטרומטריית מסות (MALDI MSI) בסיוע מטריקס התגלה לאחרונה כטכניקת הדמיה רבת עוצמה המשלימה גישות קונבנציונליות. טכניקה חדשנית זו מספקת מידע ייחודי על ההתפלגות המרחבית של שומנים בתוך תאי רקמות, אשר בעבר לא ניתן היה להשיג ללא שימוש בשינויים מוגזמים. הכנת המדגם של גישת MALDI MSI היא קריטית, ולכן היא המוקד של מאמר זה. מאמר זה מציג ניתוח שומנים מהיר של מספר רב של מוחות Drosophila המשובצים בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) כדי לספק פרוטוקול מפורט להכנת רקמות קטנות לניתוח שומנים או מטבוליט ומולקולות קטנות באמצעות MALDI MSI.
Introduction
ליפידים מעורבים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים וניתן לסווגם באופן נרחב לחמש קטגוריות בהתבסס על המגוון המבני שלהם: חומצות שומן, טריאצילגליצרולים (TAGs), פוספוליפידים, ליפידים סטרולים וספינגוליפידים1. הפונקציות הבסיסיות של שומנים הן לספק מקורות אנרגיה לתהליכים ביולוגיים (כלומר, TAGs) וליצור ממברנות תאיות (כלומר, פוספוליפידים וכולסטרול). עם זאת, תפקידים נוספים של שומנים נצפו בהתפתחות ובמחלות, ונחקרו בהרחבה בתחום הביו-רפואי. לדוגמה, דיווחים הראו כי חומצות שומן באורכים שונים עשויות להיות בעלות תפקידים טיפוליים ייחודיים. שרשראות קצרות של חומצות שומן יכולות להיות מעורבות במנגנוני הגנה מפני מחלות אוטואימוניות, שרשראות של חומצות שומן באורך בינוני מייצרות מטבוליטים שיכולים למתן התקפים, ושרשראות ארוכות של חומצות שומן מייצרות מטבוליטים שיכולים לשמש לטיפול בהפרעות מטבוליות2. במערכת העצבים, כולסטרול ופוספוליפידים שמקורם בגליה הוכחו כחיוניים לסינפטוגנזה 3,4. סוגים אחרים של שומנים הראו הבטחה ביישומים רפואיים, כולל ספינגוליפידים המשמשים במערכות אספקת תרופות וסכרוליפידים המשמשים לתמיכה במערכת החיסון 5,6. התפקידים הרבים והיישומים הטיפוליים הפוטנציאליים של שומנים בתחום הביו-רפואי הפכו את הליפידומיה – חקר המסלולים והאינטראקציות של ליפידים תאיים – לתחום קריטי וחשוב יותר ויותר.
ליפידומיקה עושה שימוש בכימיה אנליטית כדי לחקור את הליפידום בקנה מידה גדול. שיטות הניסוי העיקריות המשמשות בליפידומיקה מבוססות על ספקטרומטריית מסה (MS) בשילוב עם כרומטוגרפיה וטכניקות שונות של ניידות יונים 7,8. השימוש בטרשת נפוצה באזור הוא יתרון בשל הספציפיות והרגישות הגבוהה שלה, מהירות הרכישה והיכולות הייחודיות שלה (1) לזהות שומנים ומטבוליטים של שומנים המתרחשים גם ברמות נמוכות וחולפות, (2) לזהות מאות תרכובות שומנים שונות בניסוי יחיד, (3) לזהות שומנים שלא היו ידועים קודם לכן, ו-(4) להבחין בין איזומרים של שומנים. בין ההתפתחויות בטרשת נפוצה, כולל יינון אלקטרוספריי של ספיגה (DESI), MALDI וספקטרומטריית מסת יונים משנית (SIMS), MALDI MSI התפתחה כטכניקת הדמיה רבת עוצמה המשלימה גישות קונבנציונליות מבוססות MS על ידי מתן מידע ייחודי על ההתפלגות המרחבית של שומנים בתוך תאי רקמה 9,10.
זרימת העבודה הטיפוסית של lipidomics מורכבת מהכנת מדגם, רכישת נתונים באמצעות טכנולוגיית ספקטרומטריית מסה, וניתוח נתונים11. המחקר של שומנים ומטבוליטים בדגימות הוביל להופעת טכניקות להבנת התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של תהליכים מטבוליים באורגניזמים. בעוד שהבנת אינטראקציות ביולוגיות חשובה, הרגישות של שומנים ומטבוליטים מקשה על הדמיה וזיהוי ללא צבעים או שינויים אחרים. שינויים ברמות המטבוליטים או בהתפלגותם עלולים להוביל לשינויים פנוטיפיים. אחד הכלים המשמשים ליצירת פרופילים מטבוליים הוא MALDI MSI, טכניקת הדמיה באתרה נטולת תוויות המסוגלת לזהות מאות מולקולות בו זמנית. הדמיית MALDI מאפשרת הדמיה של מטבוליטים ושומנים בדגימות תוך שמירה על שלמותם והתפלגותם המרחבית. טכנולוגיה קודמת ליצירת פרופילים של שומנים כללה שימוש בכימיקלים רדיואקטיביים למיפוי שומנים בנפרד, בעוד שהדמיית MALDI מוותרת על כך ומאפשרת זיהוי של מגוון שומנים בו זמנית.
מטבוליזם של שומנים והומאוסטזיס ממלאים תפקידים חשובים בפיזיולוגיה של התא, כגון תחזוקה ופיתוח של מערכת העצבים. היבט חיוני אחד של חילוף החומרים של שומנים במערכת העצבים הוא סגירת השומנים בין תאי עצב לתאי גליה, המתווכת על ידי ליפופרוטאינים נשאים מולקולריים, כולל ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL), ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה (LDL) וליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה (HDL)12. ליפופרוטאינים מכילים אפוליפופרוטאינים (Apo), כגון ApoB ו-ApoD, המתפקדים כבלוקים מבניים של מטען שומנים וכליגנדות לקולטני ליפופרוטאין. ה-neuron-glia crosstalk של השומנים כולל מספר שחקנים כגון ApoD, ApoE ו-ApoJ שמקורם בגליה, וקולטני ה-LDL העצביים שלהם (LDLRs)13,14. בדרוזופילה, אפוליפופורין, בן למשפחת ה-ApoB, הוא נשא שומנים המולימפי15. לאפוליפופורין יש שני קולטני ליפופורין קרובים (LpRs), LpR1 ו-LpR2, שהם הומולוגים של יונקים LDLR15,16. במחקרים קודמים התגלו הליפוקלין גליאל לזארילו (GLaz) המופרש על ידי אסטרוציטים, הומולוג דרוזופילה של ApoD אנושי, והקולטן העצבי שלו LpR1 כדי לתווך בשיתוף פעולה את סגירת השומנים של נוירון-גליה, ובכך מווסת את מורפוגנזה דנדריט17. לכן, הועלתה השערה כי אובדן של LpR1 יגרום לירידה בתכולת השומנים הכוללת במוח Drosophila. MALDI MSI יהיה כלי מתאים ליצירת פרופיל של תכולת השומנים ברקמות קטנות של LpR1−/− מוחות דרוזופילה מוטנטיים ופראיים, כפי שהוכח במחקר זה.
למרות הפופולריות הגוברת של MALDI MSI, העלות הגבוהה של המכשיר ומורכבות הניסוי מעכבות לעתים קרובות את יישומו במעבדות בודדות. לפיכך, רוב מחקרי MALDI MSI נערכים באמצעות מתקני ליבה משותפים. כמו ביישומים אחרים של MALDI MSI, תהליך הכנת דגימה זהיר עבור lipidomics הוא קריטי כדי להשיג תוצאות אמינות. עם זאת, מכיוון שהכנת שקופיות לדוגמה מתבצעת בדרך כלל במעבדות מחקר בודדות, קיימת אפשרות של שונות ברכישת MALDI MSI. כדי להילחם בכך, מאמר זה נועד לספק פרוטוקול מפורט להכנת דגימות ביולוגיות קטנות לפני מדידת MALDI MSI באמצעות ניתוח שומנים של קבוצה גדולה של מוחות דרוזופילה בוגרים במצב יון חיובי כדוגמה11,17. עם זאת, כמה מחלקות פוספוליפידים ורוב המטבוליטים הקטנים מזוהים לטובה על ידי הדמיית MALDI במצב יון שלילי, שתואר קודםלכן 11. לכן, בעזרת שני מחקרים לדוגמה אלה, אנו מקווים לספק פרוטוקולי הכנת דגימות מפורטים של שילובים שונים: רקמה גדולה העומדת בפני עצמה לעומת רקמה קטנה מוטבעת, הרכבה על הפשרה לעומת הרכבה בהחלקה חמה, ומצב יון חיובי לעומת מצב יון שלילי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הטמעת ראש זבוב
הערה: ההליך כולו אורך ~ 45-60 דקות.
- הכינו את תרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (תרכובת OCT) עם משטח שטוח.
- הוסיפו OCT לתוך קריומולד מפלסטיק (15 מ"מ x 15 מ"מ x 5 מ"מ) למחצית מעומק הקריומולד והימנעו מהיווצרות בועות. השאירו את התבנית על משטח שטוח במשך מספר דקות, ולאחר מכן להעביר אותו על קרח יבש.
- השאירו את הקריומולד שטוח על הקרח היבש ואפשרו ל-OCT ליצור משטח שטוח ואחיד. המתן עד שה-OCT יתמצק במלואו בתבנית. השתמש בשלבי OCT הקפואים באופן מיידי או אחסן אותם בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.
- הרדמת זבובים בוגרים באמצעות CO 2 (כלומר, כרית CO2 ).
- הכינו צלחת פטרי המכילה חתיכת מגבון מעבדה. השתמשו במים כדי להרטיב חלק מהמגבון כדי להפחית את החשמל הסטטי. יש לשמור את המגבון חצי לח וחצי יבש.
- תחת היקף ניתוח 1, השתמש במלקחיים כדי לחתוך את ראש הזבוב. אספו 4-5 ראשים בכל פעם והניחו אותם על האזור היבש של מגבון המעבדה.
הערה: אוסף של 4 - 5 ראשים לוקח ~ 2 דקות.
- העבירו את שלב ה-OCT מקרח יבש להיקף הדיסקציה.
- קח את שלב OCT מקרח יבש למיקרוסקופ 2, העבר מיד את הראשים לשלב OCT, וסדר אותם במהירות, מה שלוקח ~ 30 שניות כדי למנוע המסה של OCT. השאירו ~ 1 מ"מ של שטח ריק סביב כל מוח זבוב כדי להבטיח תמיכה מספקת מה- OCT ו- 4-5 מ"מ של שטח ריק מקצה הבלוק כדי לספק מספיק מקום לטפל בקטע. אם הפרובוסקיס ארוך מדי, הסר את הקצה; אם זה לא ארוך מדי, לשמור אותו שלם. החזירו את שלב ה-OCT לקרח היבש ותנו לו להישאר דולק למשך ~3 דקות כדי לוודא ששלב ה-OCT יישאר קפוא ומוצק.
- כאשר שלב ה-OCT חוזר על הקרח היבש וממתין להתמצקות, אספו סבב נוסף של ראשים. חזור על שלבים 1.2 ו- 1.3 כדי להעביר דגימות נוספות לשטח הנותר על הבמה.
הערה: בדרך כלל מכינים שמונה ראשים לכל גנוטיפ, וארבעה גנוטיפים משמשים בשלב OCT אחד במעבדה זו. - השתמש בשני מיקרוסקופי דיסקציה, זה לצד זה, כדי למנוע שינוי מיקוד והגדלת הזמן שלוקח להעביר ולסדר את הראשים על שלב ה-OCT ולהפחית את הסיכון להתמוססות שלב ה-OCT.
- לאחר שכל ראשי הזבובים מיושרים, הניחו לשלב ה-OCT לשבת על הקרח היבש למשך 5-10 דקות נוספות.
- קח את שלב OCT הרחק מן הקרח היבש, לשים אותו על משטח שטוח (ספסל), ולאחר מכן, במהירות, להוסיף כמות גדולה של תרכובת OCT כדי לכסות את כל הדגימות ולמלא את כל cryomold, אשר לוקח ~ 3 שניות.
- מעבירים מיד את הקריומולד בחזרה לקרח יבש ומקפיאים את כל בלוק ה-OCT המכיל את הרקמות המשובצות. תנו לשלב ה-OCT לשבת על הקרח היבש עוד 5-10 דקות. תייג את הדוגמאות בשולי הקריומולד.
- אחסנו את הדוגמאות הקפואות בטמפרטורה של 80°C- עד שיהיו מוכנות לחיתוך.
2. קריוקציה של הרקמה
הערה: בעת טיפול במגלשות תחמוצת בדיל אינדיום (ITO), יש ללבוש כפפות בכל עת כדי למנוע זיהום רקמות. מומלץ גם לעטות מסכה כדי להימנע מנשימה ישירות על המגלשה.
- אשר את הצד המצופה ב- ITO על-ידי בדיקת המוליכות של שקופיות ה- ITO באמצעות מד מתח המוגדר להתנגדות. סמן את הצד במדידת התנגדות כצד שאליו יש לדבוק ברקמה. תייג אותו והגדר תמיד מגבון מעבדה בתחתית השקופית כדי למנוע זיהום שקופיות.
- אפשרו לרקמות להתאזן בתא הקריוסטאט למשך 30-45 דקות.
- כדי למנוע התכה של OCT, הניחו את כל הכלים הדרושים כגון מלקחיים ומברשת אמן בעלת קצה דק בתא הקריוסטאט מבעוד מועד כדי להקדים אותם.
- נקו את הקריוסטאט, רצוי עם 70% אתנול. נגבו את צלחת הגליל ואת הבמה והסירו להבים משומשים. השתמשו במגבונים נקיים נוספים כדי לוודא שהאתנול התאדה ושכל המשטחים יבשים לפני תחילת החתך.
- התאם את הטמפרטורה של תא הקריוסטאט וראש הדגימה בהתאם לסוג הרקמה (לדוגמה, −14 °C לכבד, −20 °C לשריר, ו-−25 °C לעור10; −18 °C לראשי זבובים בפרוטוקול זה).
- הרכב את הרקמה על מחזיק הדגימה באמצעות OCT. היזהר להשתמש במספיק OCT כדי לכסות את הבסיס של בלוק OCT ולהרכיב את הבלוק שטוח ככל האפשר.
- מניחים להב נקי בשלב ונועלים אותו. מקם את ראש הדגימה לכיוון השלב לפי הצורך כדי להשיג את זווית החיתוך הרצויה.
- מקם את גוש הדגימה בכיוון שבו כל הגנוטיפים/קבוצות הטיפול ממוקמים אנכית ללהב.
הערה: זה מבטיח מישור חיתוך עקבי ומונע זיהום צולב מקבוצות שונות. אם חותכים גוש אחר של רקמה, עברו ללהב חדש בין דגימות כדי למנוע זיהום צולב.
- מקם את גוש הדגימה בכיוון שבו כל הגנוטיפים/קבוצות הטיפול ממוקמים אנכית ללהב.
- מתחילים לחתוך במקטעים עבים (50-100 מיקרומטר) עד שנמצא אזור העניין (למשל, האזור הרצוי במוח).
- הברישו ללא הרף חלקים נוספים עם מברשת אמן מוכנה מראש כדי לשמור על הבמה נקייה.
- שנה את עובי המקטעים ל- 10-12 מיקרומטר לאחר ההגעה לאזור הרצוי.
- כוונן מעט את טמפרטורת התא לפי הצורך. לדוגמה, הגדר טמפרטורה גבוהה יותר אם החלק נוטה להתקלף או להתפרק בקלות.
הערה: הטמפרטורה המומלצת עבור בלוקים OCT היא −18 מעלות צלזיוס.
- כוונן מעט את טמפרטורת התא לפי הצורך. לדוגמה, הגדר טמפרטורה גבוהה יותר אם החלק נוטה להתקלף או להתפרק בקלות.
- אסוף בזהירות את הקטע הרצוי והדבק אותו בשקופית ITO. בצע פעולה זו בתא cryostat.
- קח מגלשת ITO בטמפרטורת החדר ומקם אותה מעל הקטע, התקרב לקטע בעדינות ובמהירות כדי שהקטע ייצמד לשקופית מבלי להשאיר עקבות על במת הקריוסטאט.
הערה: ה-OCT יימס וייצמד לשקופית.
- קח מגלשת ITO בטמפרטורת החדר ומקם אותה מעל הקטע, התקרב לקטע בעדינות ובמהירות כדי שהקטע ייצמד לשקופית מבלי להשאיר עקבות על במת הקריוסטאט.
- הניחו את המגלשה בצד במדף או במגבון מעבדה מחוץ לקריוסטאט בין אוספי החלקים המרובים.
- אם יש צורך בהשוואה בין דגימות שונות מאותה קבוצה, מקם את המקטעים מדגימות מרובות על שקופית אחת לצורך ניתוח סימולטני ושונות מינימלית. במידת הצורך, יש להפריד לשתי שקופיות, שכן מחזיק היעד MALDI יכול להכיל שתי שקופיות בריצה אחת.
- מעבירים את השקופיות בקופסת ואקום למייבש כביסה עם חומר ייבוש כשכבה התחתונה. יבשו את המגלשות תחת ואקום במשך 30-60 דקות.
הערה: לחלופין, אם המעבדה אינה מצוידת בייבוש ואקום, יש לשמור את השקופיות בטמפרטורה של −20°C לאורך כל התהליך עד לאחסון בטמפרטורה של −80°C תוך 24 שעות או משלוח על קרח יבש כדי למנוע הידרדרות של שומנים או מטבוליטים. - המשך לתצהיר מטריצה. השתמש בחומצה 2,5-דיהידרוקסיבנזואית (DHB) במתנול/מים (70/30, v/v) כמטריצה.
- אם השקופיות אינן מופעלות באופן מיידי, אחסנו את השקופיות בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס (עד חודש אחד עבור מקטעי מוח זבובים ו-6 חודשים עבור מקטעי מוח של מכרסמים), או שלחו מיד את הדגימה למתקני הליבה של MALDI עם קרח יבש הולם. לאחסון ומשלוח מיטביים, הכניסו את השקופיות למוביל שקופיות ואטמו היטב את הפתח באמצעות סרט שעווה. אטמו עם שקית רוכסן, הכניסו אותה לשקית רוכסן אחרת המכילה חומר ייבוש, ושתו את החלק החיצוני.
הערה: עיין בעבודה הקודמת לקבלת השלבים הבאים של סריקת שקופיות, תצהיר מטריצה והליכי הדמיה של MALDI11. - בצע תצהיר מטריצה באמצעות מרסס מטריצת HTX M5 אוטומטי ותמיסת 40 מ"ג/מ"ל של DHB במתנול/מים (70/30, v/v). רססו את המטריצה בקצב זרימה מותאם אישית של 0.12 מ"ל/דקה וטמפרטורת זרבובית של 85 מעלות צלזיוס למשך 10 מעברים. השתמש בלחץ גז N2 של 10 psi.
הערה: אם לחץ הגז N2 במרסס יורד מתחת ל-5 psi, מנגנון בטיחות במרסס יכבה את התנור בבת אחת כדי למנוע נזק למרסס עם מהירות ריסוס של 1,300 מ"מ/דקה, מרווח מסלול של 2 מ"מ, קצב זרימה של 3 ליטר/דקה וגובה חריר של 40 מ"מ. - השתמש במכשיר זמן טיסה MALDI (TOF) MS (ראה טבלת החומרים) במצב יון חיובי כדי לרכוש ספקטרום מסה בטווח המסה שבין m/z 50-1,000.
- כדי לכייל את המכשיר, יש לזהות 0.5 μL של תחליב זרחן אדום באצטוניטריל על גבי החלקות ITO ולהשתמש בספקטרום שלו כדי לכייל את המכשיר בטווח המסה של 50-1,000 m/z על ידי הפעלת עקומת כיול ריבועית2.
- הגדר את קוטרי נקודת הלייזר לבינוניים, מכיוון שזהו פרופיל הקרן המווסתת לרוחב רסטר של 40 מיקרומטר, ואסוף נתוני הדמיה על ידי סיכום 500 צילומים בקצב חזרת לייזר של 1,000 הרץ לכל מיקום מערך.
- השתמש בתוכנה (ראה טבלת החומרים) כדי להקליט ולעבד את הנתונים הספקטרליים. בצע ניתוח נתוני הדמיה באמצעות נורמליזציה של ריבוע ממוצע שורש (RMS) כדי ליצור תמונות יונים ברוחב סל של ±0.10 Da. יישר את הספקטרום של ה-OCT ושל רקמת המוח מאותו ניסוי באמצעות התוכנה כדי להעריך את הפסגות החופפות ואת הפרעת דיכוי היונים של ה-OCT (איור משלים S1). לאחר הניסוי, מעבדים את שקופיות ה-MALDI המכילות את דגימות הרקמה על ידי צביעת המטוקסילין ואוזין (H&E), כפי שתואר קודםלכן 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההשערה היא כי אובדן הקולטן העצבי LpR1 של הליפוקלין גליאל לזריו (GLaz), הומולוג דרוזופילה של ApoD אנושי, היה מסוגל לגרום לירידה בתכולת השומנים הכוללת במוח Drosophila. כדי לבחון זאת, MALDI MSI שימש לפרופיל השומנים במוחות של LpR1−/− מוטנטים ודרוזופילה מסוג בר, עליהם נרחיב בהמשך.
הניסוי בוצע בהתאם לזרימת העבודה המוצגת באיור 1. מוחות של זבובים בוגרים נקטפו כמתואר לעיל. הם הוטמעו ב-OCT, וקרח יבש שימש להקפאת בלוק ה-OCT. בלוק רקמת ה-OCT הוקפא ב-12 מיקרומטר ובטמפרטורה של 18°C- הן עבור ראש הדגימה והן עבור התא. שקופיות ITO עם cryosections רכוב עליהם היו מיובשים בוואקום במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, תצהיר המטריצה בוצע באמצעות מרסס מטריצה HTX M5 אוטומטי ותמיסת 40 מ"ג/מ"ל של DHB במתנול/מים (70/30, v/v).
מכשיר זמן הטיסה MALDI (TOF) MS Autoflex במצב יון חיובי רכש ספקטרום מסה בטווח המסה שבין 50-1,000 m/z. הספקטרום של ה-OCT ושל רקמת המוח מאותו ניסוי הותאם ב-SCiLS כדי להעריך את הפסגות החופפות ואת הפרעת דיכוי היונים של ה-OCT (איור משלים S1).
התוצאות באיור 2 מראות תמונות פלט מתוכנת ניתוח הנתונים MALDI MSI של ספקטרום m/z נבחר, כאשר הערכים שנבחרו הראו הבדל משמעותי בהתפלגות השומנים בין נוקאאוט LpR1 לדרוזופילה מסוג פראי. הסריקות גילו הפחתה כללית בתכולת השומנים במוטציה LpR1−/−. כל ספקטרום נותח באופן ידני, וזיהוי אנליטי הושג על ידי הצלבת מסדי נתונים של METLIN ומחקרים שפורסמו בעבר 3,4. טריאצילגליצרול (TAG) ופוספטידיל-גליצרול (PG) התבטאו מאוד במוחות של ביקורת בהשוואה למוטציה של LpR1−/− (מראה שינוי של עד פי 10 ב-TAG). נוסף על כך, דיגליצרול (DAG), פוספטידילכולין (PC) ופוספטידיל-אתנולמין (PE) התבטאו גם הם באופן מינימלי בגנוטיפ המוטנטי LpR1−/−.
איור 1: זרימת עבודה של הדמיית ספקטרומטריית מסות MALDI-TOF. (A) מוחות דרוזופילה מיושרים ב-OCT ומונחים על גבי קרח יבש. (ב-ד) גוש הרקמה מותקף למקטעים בעובי 12 מיקרומטר בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס. החלק משוטח באמצעות מברשת מקוררת מראש ומפשיר על הצד המצופה ITO של מגלשת זכוכית שנשמרת בטמפרטורת החדר. (E) השקופית מסומנת בסמנים פידוקיאליים, מצופה במטריצה ומונחת במכשיר MALDI. (F) תמונת MALDI של מוח דרוזופילה מתקבלת ברזולוציה של 40 מיקרומטר באמצעות DHB כמטריצה. אזורי העיניים (אדום, m/z 370.2), רקמת הראש (ירוק, m/z 184.1) והמוח (כחול, m/z 788.6) מוצגים בתמונה הרב-ערוצית בעלת שכבת-העל. (G) צביעת H&E מתבצעת באותו מקטע רקמה לאחר MALDI MSI. (ח) זרימת העבודה של הכנת דגימות, אחסון והובלה. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר (F,G). קיצורים: MALDI-TOF = ספיגת לייזר בסיוע מטריצה / יינון-זמן טיסה; OCT = תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית; ITO = תחמוצת בדיל אינדיום; DHB = 2,5,-חומצה דיהידרוקסיבנזואית; H&E = המטוקסילין ואאוזין; MSI = הדמיית ספקטרומטריית מסות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תמונות מייצגות מניתוח MALDI MS החושפות ירידה כללית בתכולת השומנים במוח המוטנטי LpR1−/−. מוצגים מקטעי מוח של זבוב בוגר מוכתם H&E (משמאל). מיני השומנים, ערכי m/z המתאימים להם ומאזני מפת החום הם כפי שצוין. בתחתית, הקיפול הממוצע של ההפחתה במוטציה LpR1−/− בהשוואה לבקרות מארבעה שכפולים ביולוגיים לפחות מוצגים כמספרים ליד החצים. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. נתון זה שונה מ- Yin et al.17. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים S1: ספקטרום מסה של OCT ורקמת מוח דרוזופילה . הקריוסקסוציות של בלוק OCT במוח של Drosophila מאיור 1 כוסו באופן שווה במטריצת DHB לפני הדמיית MALDI. ספקטרום המסה של אזור ה-OCT הריק שנבחר ואזור רקמת המוח הן מזבובי בקרה והן מזבובים מוטנטיים הודגמו בטווח של m/z 1-1,000 ו-m/z 520-900 (מועשר בליפידים), בהתאמה. ההפרעה של OCT קשורה הן לתופעות דיכוי יונים והן לבעיות אות חופפות. קיצורים: OCT = תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית; DHB = 2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית; MALDI = ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריצה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כפי שהוכח במחקר על השינויים בהרכב השומנים במוחות דרוזופילה מוטנטיים ופראיים, MALDI MSI יכולה להיות טכניקת הדמיה רבת ערך ללא תוויות לניתוח in situ של דפוסי התפלגות מולקולרית בתוך איברים של חרקים קטנים. ואכן, מאחר שליפידים מופצים הן ברקמת המוח והן בגופי השומן של ראשי דרוזופילה, גישות ליפידומיות קונבנציונליות המבוססות על כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה (LC-MS) יכולות לזהות רק אותות משולבים משני האזורים כאשר נעשה שימוש במיצוי ראש שלם. באופן כללי, ניתוח ליפידומיקה דיפרנציאלית של אזורי משנה בתוך איברים של חרק כה קטן כמו דרוזופילה היא משימה מייגעת ומאתגרת מאוד עבור גישות LC-MS18. זה ידרוש ניתוח של אותם אזורים, מה שמציב אתגרים גדולים. לעומת זאת, MALDI MSI מספק רזולוציה מספקת כדי להבחין בין מבנים אנטומיים שונים, אפילו בתוך המוח הקטן של דרוזופילה. היתרון של כמות מינימלית של דרישת רקמות בהשוואה ל- LC-MS קונבנציונלי יכול להיות מיושם גם על דגימות יקרות ערך כגון ביופסיות קליניות. יתר על כן, ניתן לבחון את שקופיות המדגם שהוכנו עבור MALDI MSI גם על ידי טכניקות משלימות כגון TOF-SIMS ואימונוהיסטוכימיה, שיאפשרו שילוב של הנתונים המתקבלים מגישות בין-תחומיות19,20.
אחד הצעדים החשובים ביותר ב-MALDI MSI הוא הכנת הדגימה – החלק בניסוי שמסביר את רוב ההבדלים בתוצאות ממחקרי מטבוליזם שבוצעו במעבדות שונות21. המטרה העיקרית כאן היא לספק פרוטוקול הכנת דגימות מקיף אך מעשי לניתוח MALDI MSI של שומנים ומטבוליטים באורגניזמים קטנים כמו חרקי דרוזופילה בתקווה לסייע לחוקרים ביישום MALDI MSI במחקריהם מביולוגיה בסיסית למדע תרגומי.
בנוסף לאמצעי הזהירות כדי למזער את השינויים בפרופילים המולקולריים (הן שפע והן פיזור מרחבי) כפי שנדון קודםלכן 11, יש להתאים מספר פרקטיקות אחרות בעת טיפול ברקמות קטנות. ראשית, יש למזער את הזמן בין קצירת רקמות ביולוגיות להקפאה ב-OCT כדי להפחית את הסבירות לאיסכמיה21 לאחר המוות. שנית, יש לוודא כי מכינים שלב שטוח של OCT לפני הכנסת הרקמה לתוך הבלוק, דבר חיוני לקיום מקטעים ממישורים דומים על פני רקמות שונות במהלך החתך. שלישית, חיתוך של רקמה ביולוגית בקנה מידה קטן או דגימות יקרות ערך דורש תרגול הולם לפני הניסוי. בעוד שה-OCT מסייע בחיתוך חתכים אחידים, סיבוכים עלולים להיווצר מבחינת סלסול רקמות או התקלפות. כדי להילחם בסלסול, יש לאפשר לקטע לנוח על הבמה במשך כמה שניות לפני הסרת צלחת הגליל. עם שתי מברשות, ניתן להשתמש באחת כדי להחזיק את החלק העליון של החלק עדיין, ואילו השנייה יכולה לשמש כדי לפתוח את הקטע. יש להקפיד למזער את המגע עם הרקמה על ידי עבודה בעיקר עם הקצוות של קטעי הבלוק. רביעית, אף על פי ששיטת ההפשרה יכולה לשמש עבור פחות מוחות זבובים (<10 מוחות), לא ניתן יהיה להעביר מקטע המכיל מספר רב של מוחות זבובים (>30 מוחות) לשקופית ITO קרה מבלי לאבד מספר מדהים של מוחות, אשר בקלות ייפול מקטע הבלוק לאחר הסרתו. לכן, עבור ניתוח מהיר של מספר רב של מוחות זבובים, הרכבה שקופית חמה צריך לשמש. יש לציין כי הפרש הטמפרטורה בין מקטע ה-OCT לשקופית יגרום לקטע להיצמד ולהיצמד לשקופית במהירות רבה. לפיכך, אין ללחוץ על השקופית החמה כנגד הקטע ושלב הקריוסטט; במקום זאת, יש לגשת בעדינות ובמהירות למקטעים כדי לאפשר לקטע להתחבר לשקופית ITO מבלי לגעת בשלב הקריוסטאט. לא ראינו שום זכר בולט למקטעים שנותרו מאחור על במת הקריוסטאט בהשוואה לשיטת ההפשרה. חמישית, תצהיר אחיד ועדין של מטריצת MALDI הוא חיוני להשגת מידע מרחבי חזק ומדויק במהלך הרכישה. מומלץ להשתמש בשקופית ריקה כדי לבדוק את תצהיר המטריצה לכיסוי תקין לפני שתמשיך לשקופית המכילה את הדוגמה.
עם הפופולריות וההתקדמות הגוברת שלו, MALDI MSI צפוי להגיע לבסיס רחב יותר של משתמשים ולהפוך לכלי סטנדרטי למדידת מסה מולקולרית של אנליטים כגון חומצות אמינו, מטבוליטים, שומנים, פפטידים וחלבונים, ומולקולות קטנות אחרות המופקות ישירות מרקמות ביולוגיות10. עם זאת, יש לה מגבלות ואתגרים משלה. בעת הכנת דגימות שבירות בקנה מידה קטן עבור MALDI MSI, סוכני הטמעה כגון OCT נחוצים לחתך. עם זאת, OCT מכיל שילוב של פולימרים (פולי(ויניל אלכוהול), פוליאתילן גליצרול ובנזלקוניום כלוריד), אשר יוצר אות רקע פולימרי שעלול להפריע לאות האנליט22. דווח כי תרכובות הטמעה חלופיות כגון ג'לטין וקרבוקסימתיל צלולוז (CMC) הדגימו פחות השפעות דיכוי יונים. ג'לטין מראה אותות פחות אינטנסיביים המפוזרים יותר בטווח המסה הנמוכה של 100-600 m/z20,23,24. CMC שימש גם ב- MALDI MSI של Drosophila כדי לדמיין מטבוליטים כגון GABA, אם כי זה דורש טבילה של הראשים ב 70% אתנול לפני הטבעה להדבקה אופטימלית25.
למרות הנטייה של OCT לדיכוי אותות, פרוטוקול זה ממשיך בשימוש בו בשל היכולת המעולה של OCT לספק חתך אמין של מספר רב של דגימות תוך שמירה על המורפולוגיה של המוח. חוקרים מצאו כי בעוד שג'לטין ו-CMC מקטעים היטב בעוביים גבוהים כמו 20 מיקרומטר, רק OCT מסוגל לייצר מקטעים עוקבים של 12 מיקרומטר באופן אמין26. CMC וג'לטין חסרים את השלמות המבנית והאחיזה ההדוקה של רקמות ש- OCT מספק, מה שקובע את הגבול של מספר הרקמות הקטנות כגון מוח זבוב כדי להכיל בבלוקאחד 26. דווח כי אותות טרשת נפוצה מקטעי זבוב משובצים OCT דומים לאלה המוטמעים בג'לטין וב- CMC26. הנתונים שלנו שלא פורסמו הצביעו גם על כך שמקטעי מוח זבובים המורכבים על חום הגוף, המשובצים ב-OCT, יצרו אותות שומנים חזקים הדומים לרקמה המוטמעת בג'לטין המורכבת על הפשרה. באופן כללי, בשל היכולת המעולה של OCT לשמור על שלמות המורפולוגיה של רקמות ולאפשר חיתוך דגימה מדויק בהשוואה לתרכובות הטבעה אחרות, השימוש בו עם דגימות בעלות שבריריות גבוהה, כגון מערכים של מוחות דרוזופילה , נותר אופציה. בתרחיש זה, יש לבצע רק את הכימות היחסי של השוואת דגימות מאותו ניסוי, אך לא כימות מוחלט. ביחס למחקר המדווח שלנו על מודל Drosophila בניתוח שומנים, הגיע למסקנה כי היתרונות של OCT עולים על מגבלותיו. בנוסף, יש לבצע ניסויי ניסוי כדי לבחון אם אותות הטרשת הנפוצה של האנליטים הממוקדים יוסוו על ידי אותות ה-OCT.
יתר על כן, יש להתאים מספר פרקטיקות כדי למזער את ההשפעות של דיכוי יונים. ראשית, יש לעבד את הדגימות של קבוצות שונות בו זמנית כדי להבטיח את אותה מידה של דיכוי יונים, אם יש כאלה. שנית, בבחירת האזור המעניין לסריקת MALDI, יש להימנע מאזור ה- OCT ולתאר רק את אזור הרקמות. לבסוף, יש לבחור אזור של OCT ריק שייסרק כבקרה השלילית כדי לא לכלול את האותות מ- OCT במהלך ניתוח נתונים.
תחום הליפידומיקה התפתח בתחילת שנות ה-2000 והתקדם במהירות בשנים האחרונות, בעיקר בשל התפתחויות בספקטרומטריית מסות, כולל MALDI MSI27. טכניקות מתקדמות אלה סייעו להניע את התחום לעבר יישומים ביולוגיים וביו-רפואיים. לדוגמה, ניתן להשתמש בליפידומיקה במחקרים נוירולוגיים מכיוון ששינויים ברמות הסחר בשומנים במוח ובהרכבם יכולים לשמש כסמנים ביולוגיים של מחלות. בנוסף, ליפידומיקה הובילה לזיהוי מולקולות איתות חדשות, פיתוח בדיקות יעילות תרופות, גילוי מנגנונים העומדים בבסיס תנאים פתופיזיולוגיים ועוד28. למרות ההישגים המרשימים של התחום בשנים האחרונות, עדיין ישנם תחומים שדורשים צמיחה. לדוגמה, היכולת לכמת במדויק שומנים באמצעות הטכנולוגיה הנוכחית נותרה תחת ויכוח29. בנוסף, למיפוי המלא של הליפידום התאי יש התקדמות רבה לעשות. הצפי הוא כי תחומים אלה, בין היתר בתחום, יחוו צמיחה משמעותית בשנים הקרובות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
יוקי X. צ'ן, קלי ורסאמי ומאיה היין נתמכים על ידי תוכנית מחקר הקיץ של קרן סלואן CUNY (CSURP). ג'ון יין נתמך על ידי תוכנית המחקר התוך-מוחית של המכונים הלאומיים לבריאות פרויקט מספר 1ZIANS003137. התמיכה בפרויקט זה ניתנה על ידי פרס PSC-CUNY ל- Ye He ורינת אבזלימוב, במימון משותף של קונגרס הצוות המקצועי ואוניברסיטת העיר ניו יורק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
- Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C.
- Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
- Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
- Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
- Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
- Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
- Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
- Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
- Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
- Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
- Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
- Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
- Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
- Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
- Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
- Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
- Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
- Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
- Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
- Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
- Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
- Han, X.
- Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).
