Summary
Syftet med detta protokoll är att ge detaljerad vägledning om korrekt provberedning för lipid- och metabolitanalys i små vävnader, såsom Drosophila-hjärnan , med hjälp av matrisassisterad laserdesorption / jonisering (MALDI) masspektrometriavbildning.
Abstract
Lipidprofilering, eller lipidomik, är en väletablerad teknik som används för att studera hela lipidinnehållet i en cell eller vävnad. Information som förvärvats från lipidomik är värdefull för att studera de vägar som är involverade i utveckling, sjukdom och cellulär metabolism. Många verktyg och instrument har hjälpt lipidomikprojekt, framför allt olika kombinationer av masspektrometri och vätskekromatografitekniker. Matrisassisterad laserdesorption/jonisering masspektrometriavbildning (MALDI MSI) har nyligen framträtt som en kraftfull avbildningsteknik som kompletterar konventionella metoder. Denna nya teknik ger unik information om den rumsliga fördelningen av lipider i vävnadsfack, vilket tidigare var ouppnåeligt utan användning av överdrivna modifieringar. Provberedningen av MALDI MSI-metoden är kritisk och är därför fokus för detta dokument. Detta dokument presenterar en snabb lipidanalys av ett stort antal Drosophila-hjärnor inbäddade i optimal skärtemperaturförening (OCT) för att ge ett detaljerat protokoll för beredning av små vävnader för lipidanalys eller metabolit- och småmolekylanalys genom MALDI MSI.
Introduction
Lipider är involverade i ett brett spektrum av biologiska processer och kan i stort sett klassificeras i fem kategorier baserat på deras strukturella mångfald: fettsyror, triacylglyceroler (TAG), fosfolipider, sterollipider och sfingolipider1. De grundläggande funktionerna hos lipider är att tillhandahålla energikällor för biologiska processer (dvs. TAG) och bilda cellulära membran (dvs fosfolipider och kolesterol). Emellertid, ytterligare roller av lipider har noterats i utveckling och sjukdomar, och har studerats omfattande inom det biomedicinska området. Till exempel har rapporter visat att fettsyror av olika längd kan ha unika terapeutiska roller. Korta fettsyrakedjor kan vara involverade i försvarsmekanismer mot autoimmuna sjukdomar, medellånga fettsyrakedjor producerar metaboliter som kan mildra anfall och långa fettsyrakedjor genererar metaboliter som kan användas för att behandla metaboliska störningar2. I nervsystemet har glia-härledda kolesterol och fosfolipider visat sig vara avgörande för synaptogenes 3,4. Andra typer av lipider har visat löfte i medicinska applikationer, inklusive sfingolipider som används i läkemedelsleveranssystem och sackarolipider som används för att stödja immunsystemet 5,6. De många rollerna och potentiella terapeutiska tillämpningarna av lipider inom det biomedicinska området har gjort lipidomik - studien av vägar och interaktioner mellan cellulära lipider - till ett kritiskt och allt viktigare område.
Lipidomics använder analytisk kemi för att studera lipidomet i stor skala. De huvudsakliga experimentella metoderna som används inom lipidomik är baserade på masspektrometri (MS) i kombination med olika kromatografi- och jonmobilitetstekniker 7,8. Användningen av MS i området är fördelaktig på grund av dess höga specificitet och känslighet, förvärvshastighet och unika förmåga att (1) detektera lipider och lipidmetaboliter som förekommer även vid låga och övergående nivåer, (2) upptäcka hundratals olika lipidföreningar i ett enda experiment, (3) identifiera tidigare okända lipider och (4) skilja mellan lipidisomerer. Bland utvecklingen inom MS, inklusive desorptionselektrosprayjonisering (DESI), MALDI och sekundär jonmasspektrometri (SIMS), HAR MALDI MSI framstått som en kraftfull bildteknik som kompletterar konventionella MS-baserade metoder genom att ge unik information om den rumsliga fördelningen av lipider i vävnadsfack 9,10.
Det typiska arbetsflödet för lipidomik består av provberedning, datainsamling med hjälp av masspektrometriteknik och dataanalys11. Studien av lipider och metaboliter i prover har lett till framväxten av tekniker för att förstå de fysiologiska och patologiska förhållandena för metaboliska processer i organismer. Även om det är viktigt att förstå biologiska interaktioner gör känsligheten hos lipider och metaboliter dem svåra att avbilda och identifiera utan färgämnen eller annan modifiering. Förändringar i metabolitnivåer eller distribution kan leda till fenotypiska förändringar. Ett verktyg som används för metabolomisk profilering är MALDI MSI, en etikettfri, in situ-avbildningsteknik som kan detektera hundratals molekyler samtidigt. MALDI-avbildning möjliggör visualisering av metaboliter och lipider i prover samtidigt som deras integritet och rumsliga fördelning bevaras. Tidigare teknik för lipidprofilering involverade användning av radioaktiva kemikalier för att individuellt kartlägga lipider, medan MALDI-avbildning avstår från detta och möjliggör detektering av en rad lipider samtidigt.
Lipidmetabolism och homeostas spelar viktiga funktioner i cellfysiologin, såsom underhåll och utveckling av nervsystemet. En viktig aspekt av nervsystemets lipidmetabolism är lipidkänseln mellan nervceller och gliaceller, som förmedlas av molekylära bärarlipoproteiner, inklusive lipoprotein med mycket låg densitet (VLDL), lipoproteiner med låg densitet (LDL) och lipoproteiner med hög densitet (HDL)12. Lipoproteiner innehåller apolipoproteiner (Apo), såsom ApoB och ApoD, som fungerar som strukturella block av lipidlast och som ligander för lipoproteinreceptorer. Neuron-glia-överhörningen av lipider involverar flera spelare såsom glia-härledd ApoD, ApoE och ApoJ, och deras neuronala LDL-receptorer (LDLR)13,14. I Drosophila är apolipophorin, en medlem av ApoB-familjen, en stor hemolymflipidbärare15. Apolipophorin har två närbesläktade lipoforinreceptorer (LpR), LpR1 och LpR2, som är homologer av däggdjur LDLR15,16. I tidigare studier upptäcktes det astrocytutsöndrade lipokalinet Glial Lazarillo (GLaz), en Drosophila-homolog av humant ApoD, och dess neuronala receptor LpR1 för att kooperativt förmedla neuron-glia lipid shuttling, vilket reglerar dendrit morfogenes17. Därför spekulerades det i att förlusten av LpR1 skulle orsaka en minskning av det totala lipidinnehållet i Drosophila-hjärnan. MALDI MSI skulle vara ett lämpligt verktyg för att profilera lipidinnehållet i små vävnader i LpR1−/− mutanta och vilda Drosophila-hjärnor, vilket demonstreras i denna studie.
Trots den växande populariteten hos MALDI MSI hindrar instrumentets höga kostnad och experimentella komplexitet ofta dess implementering i enskilda laboratorier. Således utförs de flesta MALDI MSI-studier med hjälp av delade kärnfaciliteter. Som med andra tillämpningar av MALDI MSI är en noggrann provberedningsprocess för lipidomik avgörande för att uppnå tillförlitliga resultat. Men eftersom provbildsberedning vanligtvis utförs i enskilda forskningslaboratorier finns det en möjlighet till variation i MALDI MSI-förvärv. För att bekämpa detta syftar detta dokument till att tillhandahålla ett detaljerat protokoll för provberedning av små biologiska prover före MALDI MSI-mätning med lipidanalys av en stor grupp vuxna Drosophila-hjärnor i positivt jonläge som ett exempel11,17. Vissa fosfolipidklasser och majoriteten av små metaboliter detekteras emellertid positivt genom MALDI-avbildning i negativt jonläge, vilket beskrivits tidigare11. Därför, med dessa två exempelstudier, hoppas vi kunna tillhandahålla detaljerade provberedningsprotokoll av olika kombinationer: fristående stor vävnad kontra inbäddad liten vävnad, upptining kontra varmglidning och positivt jonläge kontra negativt jonläge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inbäddning av flyghuvud
OBS: Hela proceduren tar ~ 45-60 min.
- Förbered det optimala skärtemperaturföreningssteget (OCT-förening) med en plan yta.
- Tillsätt OCT i ett plastkryomold (15 mm x 15 mm x 5 mm) till hälften av kryomrörets djup och undvik bubbelbildning. Låt formen stå på en plan yta i flera minuter och överför den sedan till torris.
- Håll kryomröret plant på torrisen och låt OCT bilda en plan och jämn yta. Vänta tills OCT är helt stelnat i formen. Använd de frysta ULT-stegen omedelbart eller förvara dem vid −80 °C.
- Bedöva vuxna flugor med CO 2 (dvs en CO2-kudde).
- Förbered en petriskål som innehåller en bit laboratorieservett. Använd vatten för att fukta en del av torkduken för att minska den statiska elektriciteten. Håll torken hälften våt och hälften torr.
- Under dissekeringsområde 1, använd pincett för att skära flughuvudet. Samla 4-5 huvuden varje gång och lägg dem på det torra området av laboratorietorken.
OBS: Samlingen av 4-5 huvuden tar ~ 2 minuter.
- Överför ULT-steget från torris till dissektionsomfånget.
- Ta OCT-steget från torris till mikroskop 2, överför omedelbart huvudena till OCT-scenen och ordna dem snabbt, vilket tar ~ 30 s för att undvika OCT-smältning. Lämna ~ 1 mm tomt utrymme runt varje flyghjärna för att säkerställa tillräckligt stöd från OCT och 4-5 mm tomt utrymme från blockets kant för att ge tillräckligt med utrymme för att hantera sektionen. Om proboscisen är för lång, ta bort spetsen; Om det inte är för långt, håll det intakt. Sätt tillbaka OCT-scenen på torrisen och låt den stanna kvar i ~ 3 minuter för att se till att OCT-scenen förblir frusen och fast.
- När OCT-scenen är tillbaka på torrisen och väntar på stelning, samla ytterligare en omgång huvuden. Upprepa steg 1.2 och 1.3 för att överföra ytterligare prover till det återstående utrymmet på scenen.
OBS: Åtta huvuden förbereds vanligtvis för varje genotyp, och fyra genotyper används i ett OCT-steg i detta laboratorium. - Använd två dissektionsmikroskop, sida vid sida, för att undvika att ändra fokus och öka tiden det tar att överföra och ordna huvudena på OCT-scenen och för att minska risken för att ULT-steget smälter.
- När alla flughuvuden är i linje, låt OCT-scenen sitta på torrisen i ytterligare 5-10 minuter.
- Ta bort OCT-scenen från torrisen, lägg den på en plan yta (bänk) och tillsätt sedan snabbt en stor mängd OCT-förening för att täcka alla prover och fyll hela kryomolden, som tar ~ 3 s.
- Överför omedelbart kryomolden tillbaka till torris och frys hela OCT-blocket som innehåller de inbäddade vävnaderna. Låt OCT-scenen sitta på torrisen i ytterligare 5-10 min. Märk proverna på kryomoldens marginal.
- Förvara de frysta proverna vid −80 °C tills de är klara för sektionering.
2. Kryosektion av vävnaden
OBS: Vid hantering av indiumtennoxid (ITO) -glas, använd alltid handskar för att undvika vävnadskontaminering. Att bära en mask rekommenderas också för att undvika att andas direkt på bilden.
- Bekräfta den ITO-belagda sidan genom att testa konduktiviteten hos ITO-bilderna med en voltmeter inställd på motstånd. Markera sidan med en motståndsmätning som den sida du ska fästa vävnaden på. Märk den och ställ alltid in en laboratorieservett på botten av bilden för att undvika glidkontaminering.
- Låt vävnaderna balansera i kryostatkammaren i 30-45 min.
- För att undvika smältning av OCT, placera alla nödvändiga verktyg som pincett och en tunnspetsad konstnärsborste i kryostatkammaren i förväg för att förkyla dem.
- Rengör kryostaten, helst med 70% etanol. Torka av rullplattan och scenen och ta bort använda blad. Använd ytterligare rena våtservetter för att säkerställa att etanolen har avdunstat och att alla ytor är torra innan sektionering börjar.
- Justera temperaturen på kryostatkammaren och provhuvudet efter vävnadstyp (t.ex. −14 °C för lever, −20 °C för muskler och −25 °C för hud10; −18 °C för flughuvuden i detta protokoll).
- Montera vävnaden på provhållaren med OCT. Var noga med att använda tillräckligt med OCT för att täcka basen på OCT-blocket och montera blocket så platt som möjligt.
- Placera ett rent blad i scenen och lås det. Placera provets huvud mot scenen efter behov för att uppnå önskad skärvinkel.
- Placera provblocket i en riktning där alla genotyper/behandlingsgrupper är placerade vertikalt mot bladet.
OBS: Detta säkerställer ett konsekvent skärplan och undviker korskontaminering från olika grupper. Om du skär ett annat vävnadsblock, byt till ett nytt blad mellan proverna för att förhindra korskontaminering.
- Placera provblocket i en riktning där alla genotyper/behandlingsgrupper är placerade vertikalt mot bladet.
- Börja skära i tjocka sektioner (50-100 μm) tills intresseområdet (t.ex. den önskade regionen i hjärnan) hittas.
- Borsta ständigt bort extra bitar med en förkyld artistborste för att hålla scenen ren.
- Ändra tjockleken på sektionerna till 10-12 μm när önskad region har uppnåtts.
- Justera kammartemperaturen något efter behov. Ställ till exempel in en högre temperatur om sektionen tenderar att flagna eller falla isär lätt.
OBS: Den rekommenderade temperaturen för OCT-block är −18 °C.
- Justera kammartemperaturen något efter behov. Ställ till exempel in en högre temperatur om sektionen tenderar att flagna eller falla isär lätt.
- Samla försiktigt den önskade sektionen och fäst den på ITO-bilden. Utför denna operation i kryostatkammaren.
- Ta en ITO-bild i rumstemperatur och placera den över sektionen, närma dig sektionen försiktigt och snabbt så att sektionen fäster vid bilden utan att lämna spår på kryostatsteget.
OBS: OCT smälter och klamrar sig fast vid bilden.
- Ta en ITO-bild i rumstemperatur och placera den över sektionen, närma dig sektionen försiktigt och snabbt så att sektionen fäster vid bilden utan att lämna spår på kryostatsteget.
- Placera bilden åt sidan i ett ställ eller laboratorieservett utanför kryostaten mellan samlingarna av flera sektioner.
- Om jämförelse mellan olika prover av samma kohort önskas, placera sektionerna från flera prover på en enda bild för samtidig analys och minimal variation. Om det behövs, separera till två bilder, eftersom MALDI-målhållaren kan rymma två bilder i en enda körning.
- Transportera bilderna i en vakuumlåda till en exsickator med torkmedel som bottenskikt. Torka bilderna under vakuum i 30-60 min.
OBS: Alternativt, om labbet inte är utrustat med en vakuumutsugningsmedel, bör objektglasen hållas vid −20 °C under hela processen tills de förvaras vid −80 °C inom 24 timmar eller transporteras på torris för att undvika försämring av lipider eller metaboliter. - Fortsätt till matrisavsättning. Använd 2,5-dihydroxibensoesyra (DHB) i metanol/vatten (70/30, v/v) som matris.
- Om objektsglasen inte körs omedelbart, förvara antingen objektglasen vid −80 °C (upp till 1 månad för flyghjärnsektioner och 6 månader för hjärnsektioner hos gnagare) eller skicka omedelbart provet till MALDI:s kärnanläggningar med tillräcklig torris. För optimal förvaring och frakt, placera bilderna i en glidtransportör och försegla öppningen ordentligt med vaxfilm. Försegla med en zip-påse, lägg den i en annan zip-påse som innehåller torkmedel och märk utsidan.
OBS: Se tidigare arbete för de följande stegen för bildskanning, matrisavsättning och MALDI-bildprocedurer11. - Utför matrisdeposition med hjälp av den automatiska HTX M5-matrissprutan och en 40 mg / ml lösning av DHB i metanol / vatten (70/30, v / v). Spraya matrisen med en anpassad flödeshastighet på 0,12 ml/min och en munstyckstemperatur på 85 °C i 10 pass. Använd ett N2-gastryck på 10 psi.
OBS: Om N2-gastrycket i sprutan sänks under 5 psi kommer en säkerhetsmekanism i sprutan att stänga av värmaren på en gång för att undvika skador på sprutan med en spruthastighet på 1 300 mm/min, 2 mm spåravstånd, 3 l/min flödeshastighet och 40 mm munstyckshöjd. - Använd ett MALDI time of flight (TOF) MS-instrument (se materialtabellen) i positivt jonläge för att förvärva ett massspektrum inom massområdena från m/z 50-1 000.
- För att kalibrera instrumentet, spot 0,5 μL röd fosforemulsion i acetonitril på ITO-objektglasen och använd dess spektra för att kalibrera instrumentet i massområdet 50-1,000 m / z genom att applicera en kvadratisk kalibreringskurva2.
- Ställ in laserpunktdiametrarna på Medium, eftersom det är den modulerade strålprofilen för 40 μm rasterbredd, och samla in bilddata genom att summera 500 bilder med en laserrepetitionshastighet på 1 000 Hz per matrisposition.
- Använd programvara (se materialförteckningen) för att registrera och bearbeta spektraldata. Utför bilddataanalys med hjälp av RMS-normalisering (root mean square) för att generera jonbilder med en fackbredd på ±0,10 Da. Justera spektra för både OCT och hjärnvävnad från samma experiment med hjälp av programvaran för att utvärdera de överlappande topparna och jonundertryckningsinterferensen hos OCT (Kompletterande figur S1). Efter experimentet, bearbeta MALDI-objektglasen som innehåller vävnadsproverna genom hematoxylin och eosin (H&E) färgning, som tidigare beskrivits11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förlusten av den neuronala receptorn LpR1 av det astrocytutsöndrade lipokalinet Glial Lazarillo (GLaz), en Drosophila-homolog av human ApoD, antogs kunna orsaka en minskning av det totala lipidinnehållet i Drosophila-hjärnan. För att testa detta användes MALDI MSI för att profilera lipiderna i LpR1−/− mutanta och vilda Drosophila-hjärnor, vilket utvecklas nedan.
Experimentet utfördes enligt arbetsflödet som visas i figur 1. Vuxna flughjärnor skördades enligt beskrivningen ovan. De var inbäddade i OCT, och torris användes för att frysa OCT-blocket. OCT-vävnadsblocket kryosektionerades med en tjocklek på 12 μm och vid −18 °C för både provhuvudet och kammaren. ITO-bilder med kryosektioner monterade på dem torkades i vakuum i 30 minuter vid rumstemperatur. Därefter utfördes matrisdeposition med användning av den automatiska HTX M5-matrissprutan och en 40 mg / ml lösning av DHB i metanol / vatten (70/30, v / v).
MALDI time of flight (TOF) MS Autoflex-instrumentet i positivt jonläge förvärvade ett massspektrum inom massområdena från 50-1 000 m/z. Spektrumet för både OCT och hjärnvävnad från samma experiment anpassades i SCiLS för att utvärdera de överlappande topparna och jonundertryckningsinterferensen hos OCT (kompletterande figur S1).
Resultaten i figur 2 visar utgångsbilder från MALDI MSI-dataanalysprogramvara för utvalda m / z-spektra där de valda värdena visade en signifikant skillnad i lipidfördelning mellan LpR1 knockout och wild-type Drosophila. Skanningarna avslöjade en allmän minskning av lipidinnehållet i LpR1−/−-mutanten. Varje spektrum analyserades manuellt och analytidentifiering uppnåddes genom korsreferenser till METLIN-databaser och tidigare publicerade studier 3,4. Triacylglycerol (TAG) och fosfatidylglycerol (PG) uttrycktes starkt i kontrollhjärnor jämfört med LpR1−/−-mutanten (visar upp till en 10-faldig förändring i TAG). Dessutom uttrycktes diglycerol (DAG), fosfatidylkolin (PC) och fosfatidyl-etanolamin (PE) också minimalt i LpR1−/− mutantgenotypen.
Figur 1: Arbetsflöde för MALDI-TOF masspektrometriavbildning. (A) Drosophila-hjärnor är inriktade i OCT placerade ovanpå torris. (B–D) Vävnadsblocket kryosektioneras i 12 μm tjocka sektioner vid −15 °C. Sektionen plattas till med en förkyld borste och tinas smält på den ITO-belagda sidan av en glasskiva som hålls vid rumstemperatur. (E) Bilden är markerad med fiduciella markörer, belagd med matris och placerad i MALDI-instrumentet. (F) MALDI-bilden av en Drosophila-hjärna erhålls med en upplösning på 40 μm med DHB som matris. Ögonregionerna (röd, m/z 370,2), huvudvävnad (grön, m/z 184,1) och hjärna (blå, m/z 788,6) visas i den överlagrade flerkanalsbilden. (G) H&E-färgning utförs på samma vävnadssektion efter MALDI MSI. (H) Arbetsflödet för beredning, lagring och transport av prover. Skalstänger = 500 μm (F,G). Förkortningar: MALDI-TOF = matrisassisterad laserdesorption/joniseringstid för flygning; OCT = optimal skärtemperaturförening; ITO = indium tennoxid; DHB = 2,5,-dihydroxibensoesyra; H&E = hematoxylin och eosin; MSI = masspektrometri avbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa bilder från MALDI MS-analys som avslöjar en allmän minskning av lipidinnehållet i LpR1−/− mutanthjärnan. Representativa H&E-färgade vuxna flughjärnsektioner visas (vänster). Lipidarterna, deras respektive m/z-värden och värmekartans skalor är som anges. Längst ner visas den genomsnittliga minskningsveckningen i LpR1−/−-mutanten jämfört med kontrollerna från minst fyra biologiska replikat som siffror bredvid pilarna. Skalstång = 1 mm. Denna siffra har modifierats från Yin et al.17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur S1: Masspektra av OCT och Drosophila hjärnvävnad. Kryosektionerna i Drosophila hjärn-OCT-blocket från figur 1 täcktes jämnt med DHB-matrisen före MALDI-avbildning. Massspektrumet för den valda tomma OCT-regionen och hjärnvävnadsregionen från både kontroll- och mutantflugor visades i intervallet m/z 1-1 000 respektive m/z 520-900 (lipidberikad). Störningen av OCT är förknippad med både jonundertryckningsfenomen och överlappande signalproblem. Förkortningar: OCT = optimal skärtemperaturförening; DHB = 2,5-dihydroxibensoesyra; MALDI = matrisassisterad laserdesorption/jonisering. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som visats i studien om variationerna i lipidsammansättning i mutanta och vilda Drosophila-hjärnor kan MALDI MSI vara en värdefull etikettfri bildteknik för in situ-analys av molekylära distributionsmönster i organ av små insekter. Eftersom lipider distribueras i både hjärnvävnaden och fettkropparna i Drosophila-huvuden, kan konventionella lipidomikmetoder baserade på vätskekromatografi och masspektrometri (LC-MS) endast detektera kombinerade signaler från båda regionerna när extraktion av hela huvudet används. I stort sett är differentiell lipidomikanalys av subregioner inom organ av en så liten insekt som Drosophila en mycket mödosam och utmanande uppgift för LC-MS-tillvägagångssätt18. Det skulle kräva en dissekering av dessa regioner, vilket innebär stora utmaningar. Däremot ger MALDI MSI tillräcklig upplösning för att skilja olika anatomiska strukturer, även inom den lilla Drosophila-hjärnan. Fördelen med ett minimikrav på vävnad jämfört med konventionell LC-MS skulle också kunna tillämpas på värdefulla prover såsom kliniska biopsier. Dessutom skulle de provglas som utarbetats för MALDI MSI också kunna undersökas med hjälp av kompletterande tekniker såsom TOF-SIMS och immunhistokemi, vilket skulle möjliggöra integrering av data som erhållits från tvärvetenskapliga tillvägagångssätt 19,20.
Ett av de viktigaste stegen i MALDI MSI är provberedningen - den del av experimentet som står för de flesta skillnaderna i resultaten från metabolomikstudier som utförts i olika laboratorier21. Huvudmålet här är att tillhandahålla ett omfattande men ändå praktiskt provberedningsprotokoll för MALDI MSI-analys av lipider och metaboliter i organismer så små som Drosophila-insekter i hopp om att hjälpa forskare med implementeringen av MALDI MSI i sina studier från grundläggande biologi till translationell vetenskap.
Förutom de försiktighetsåtgärder för att minimera förändringar i molekylprofilerna (både överflöd och rumslig fördelning) som tidigare diskuterats11, måste flera andra metoder anpassas vid hantering av små vävnader. För det första bör tiden mellan biologisk vävnadsskörd och frysning i ULT minimeras för att minska sannolikheten för ischemiefter döden 21. För det andra bör man se till att ett plant stadium av OCT förbereds innan vävnaden placeras i blocket, vilket är avgörande för att ha sektioner från jämförbara plan över olika vävnader under sektionering. För det tredje kräver skärning av småskalig biologisk vävnad eller värdefulla prover adekvat övning före experimentet. Medan OCT hjälper till att skära jämna sektioner kan komplikationer uppstå när det gäller vävnadskrullning eller fjällning. För att bekämpa curling bör man låta sektionen vila på scenen i några sekunder innan man tar bort rullplattan. Med två borstar kan den ena användas för att hålla toppen av sektionen stilla, medan den andra kan användas för att veckla ut sektionen. Försiktighet bör vidtas för att minimera kontakten med vävnaden genom att främst arbeta med kanterna på blocksektionerna. För det fjärde, även om upptiningsmetoden skulle kunna användas för färre flyghjärnor (<10 hjärnor), skulle det vara omöjligt att överföra en sektion som innehåller ett stort antal flyghjärnor (>30 hjärnor) till en kall ITO-bild utan att förlora ett anmärkningsvärt antal hjärnor, som lätt skulle falla ut ur blocksektionen när den lyfts. För snabb analys av ett stort antal flughjärnor måste därför varmglidning användas. I synnerhet kommer temperaturskillnaden mellan OCT-sektionen och bilden att få sektionen att hålla fast och fästa vid bilden mycket snabbt. Därför bör man inte trycka den varma bilden mot sektionen och kryostatstadiet; istället måste man försiktigt och snabbt närma sig sektionerna så att sektionen kan fästas på ITO-bilden utan att vidröra kryostatsteget. Vi observerade inga märkbara spår av de sektioner som lämnats kvar på kryostatstadiet jämfört med upptiningsmetoden. För det femte är en enhetlig och fin avsättning av MALDI-matrisen avgörande för att uppnå stark och korrekt rumslig information under förvärvet. Det rekommenderas att använda en tom bild för att testa matrisavsättningen för korrekt täckning innan du fortsätter till bilden som innehåller provet.
Med sin växande popularitet och framsteg förväntas MALDI MSI nå en bredare bas av användare och bli ett standardverktyg för molekylära massmätningar av analyter såsom aminosyror, metaboliter, lipider, peptider och proteiner och andra små molekyler direkt extraherade från biologiska vävnader10. Det har dock sina egna begränsningar och utmaningar. Vid beredning av ömtåliga och småskaliga prover för MALDI MSI är inbäddningsmedel som OCT nödvändiga för sektionering. OCT innehåller emellertid en kombination av polymerer (poly (vinylalkohol), polyetylenglycerol och bensalkoniumklorid), vilket skapar en polymer bakgrundssignal som kan störa analytsignalen22. Alternativa inbäddningsföreningar såsom gelatin och karboximetylcellulosa (CMC) har rapporterats visa mindre jonundertryckande effekter. Gelatin visar mindre intensiva signaler som är mer spridda i lågmassområdet 100-600 m/z20,23,24. CMC har också använts i MALDI MSI av Drosophila för att visualisera metaboliter som GABA, även om det kräver nedsänkning av huvudena i 70% etanol före inbäddning för optimal vidhäftning25.
Trots OCT: s tendens till signalundertryckning fortsätter detta protokoll med dess användning på grund av OCT: s överlägsna förmåga att tillhandahålla tillförlitlig sektionering av ett stort antal prover samtidigt som hjärnmorfologin bevaras. Forskare har funnit att medan gelatin och CMC-sektion väl vid höga tjocklekar som 20 μm, kan endast OCT producera på varandra följande 12 μm sektioner på ett tillförlitligt sätt26. CMC och gelatin saknar den strukturella integriteten och det täta greppet om vävnad som OCT ger, vilket sätter gränsen för antalet små vävnader som flyghjärna som ska rymmas i ett block26. Det har rapporterats att MS-signaler från OCT-inbäddade flygsektioner är jämförbara med de som är inbäddade i gelatin och CMC26. Våra opublicerade data indikerade också att varmmonterade, OCT-inbäddade flyghjärnsektioner genererade robusta lipidsignaler jämförbara med upptiningsmonterad gelatinbäddad vävnad. Sammantaget, på grund av OCT: s överlägsna förmåga att bevara vävnadsmorfologins integritet och möjliggöra exakt provsektionering jämfört med andra inbäddningsföreningar, är dess användning med prover med hög bräcklighet, såsom arrays av Drosophila-hjärnor , fortfarande ett alternativ. I det scenariot bör endast den relativa kvantifieringen av jämförande prover från samma experiment, men inte absolut kvantifiering, göras. När det gäller vår rapporterade studie av Drosophila-modellen i lipidanalys drogs slutsatsen att fördelarna med OCT uppväger dess begränsningar. Dessutom måste försöksexperiment utföras för att testa om MS-signalerna från de riktade analyterna skulle maskeras av ULT-signalerna.
Dessutom måste flera metoder anpassas för att minimera effekterna av jonsuppression. Först bör man bearbeta proverna från olika grupper samtidigt för att säkerställa samma omfattning av jonsuppression, om det finns någon. För det andra, vid valet av den region som är av intresse för MALDI-skanning, bör man undvika ULT-regionen och endast beskriva vävnadsregionen. Slutligen bör ett område med blankt utomeuropeiskt land eller territorium väljas för att skannas som negativ kontroll för att utesluta signalerna från ULT under dataanalysen.
Området lipidomik uppstod i början av 2000-talet och har utvecklats snabbt de senaste åren, till stor del på grund av utvecklingen inom masspektrometri, inklusive MALDI MSI27. Dessa avancerade tekniker har hjälpt till att driva fältet mot biologiska och biomedicinska tillämpningar. Till exempel kan lipidomik användas i neurologiska studier eftersom förändringar i nivåer av hjärnlipidhandel och sammansättning kan användas som biomarkörer för sjukdom. Dessutom har lipidomik lett till identifiering av nya signalmolekyler, utveckling av läkemedelseffektivitetstester, upptäckt av mekanismer som ligger till grund för patofysiologiska tillstånd och mer28. Trots de anmärkningsvärda prestationer som gjorts av fältet under de senaste åren finns det fortfarande områden som kräver tillväxt. Till exempel är möjligheten för en lipid att kvantifieras exakt med nuvarande teknik fortfarande under debatt29. Dessutom har den fullständiga kartläggningen av det cellulära lipidomet mycket framsteg att göra. Det förväntas att dessa områden, bland annat inom området, kommer att uppleva en betydande tillväxt under de kommande åren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy och Mayan Hein stöds av Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP). Jun Yin stöds av det intramurala forskningsprogrammet för National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137. Stöd för detta projekt gavs av ett PSC-CUNY-pris till Ye He och Rinat Abzalimov, gemensamt finansierat av The Professional Staff Congress och City University of New York.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
- Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C.
- Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
- Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
- Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
- Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
- Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
- Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
- Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
- Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
- Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
- Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
- Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
- Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
- Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
- Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
- Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
- Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
- Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
- Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
- Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
- Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
- Han, X.
- Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).
