Summary
Здесь мы представляем подробный протокол выделения и идентификации устойчивых к антибиотикам бактерий из воды и молекулярную характеристику их генов устойчивости к антибиотикам (ARG). Использование методов, основанных на культурах и не основанных на культурах (метагеномный анализ), дает полную информацию об общем бактериальном разнообразии и общем пуле различных ARG, присутствующих в пресных водах из Мумбаи, Индия.
Abstract
Развитие и распространение устойчивости к антибиотикам (АР) через микробиоту, связанную с пресноводными водоемами, является серьезной глобальной проблемой здравоохранения. В настоящем исследовании образцы пресной воды были собраны и проанализированы в отношении общего бактериального разнообразия и генов AR (ARG) с использованием как традиционных методов, основанных на культурах, так и метагеномного подхода, независимого от культуры. В данной работе представлен систематический протокол перечисления общих и устойчивых к антибиотикам культивируемых бактерий из образцов пресной воды и определения фенотипической и генотипической резистентности в культивируемых изолятах. Кроме того, мы сообщаем об использовании полного метагеномного анализа общей метагеномной ДНК, извлеченной из образца пресной воды, для идентификации общего бактериального разнообразия, включая некультивируемые бактерии, и идентификации общего пула различных ARG (резистома) в водном объекте. Следуя этим подробным протоколам, мы наблюдали высокую устойчивую к антибиотикам бактериальную нагрузку в диапазоне 9,6 × 10 5-1,2 × 109 КОЕ/мл. Большинство изолятов были устойчивы к множественным протестированным антибиотикам, включая цефотаксим, ампициллин, левофлоксацин, хлорамфеникол, цефтриаксон, гентамицин, неомицин, триметоприм и ципрофлоксацин, с индексами множественной устойчивости к антибиотикам (MAR) ≥0,2, что указывает на высокие уровни резистентности в изолятах. Секвенирование 16S рРНК выявило потенциальные патогены человека, такие как Klebsiella pneumoniae, и оппортунистические бактерии, такие как Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. и Aeromonas spp. Молекулярная характеристика изолятов показала наличие различных ARG, таких как blaTEM, blaCTX-M (β-лактамы), aadA, aac (6')-Ib (аминогликозиды) и dfr1 (триметопримы), что также было подтверждено всем метагеномным анализом ДНК. В метагеномной ДНК также была обнаружена высокая распространенность других АРГ, кодирующих для насосов оттока антибиотиков - mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, гена хлорамфениколацетилтрансферазы catB10 и гена устойчивости к рифампицину rphB-. С помощью протоколов, обсуждаемых в этом исследовании, мы подтвердили наличие передаваемых через воду бактерий MAR с различными фенотипическими и генотипическими признаками AR. Таким образом, весь метагеномный анализ ДНК может быть использован в качестве дополнительного метода к традиционным методам, основанным на культурах, для определения общего статуса AR водного объекта.
Introduction
Устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) была определена в качестве одной из наиболее актуальных глобальных проблем. Быстрая эволюция УПП и его распространение во всем мире являются одной из самых больших угроз здоровью человека и мировой экономике с точки зрения связанных с ним расходов наздравоохранение1. Чрезмерное и неправильное использование антибиотиков привело к увеличению AR. Это было подчеркнуто пандемией COVID-19, во время которой лечение ассоциированных вторичных инфекций во многих случаях было чрезвычайно скомпрометировано из-за УПП у пострадавших пациентов2. Помимо прямого использования/неправильного использования антибиотиков людьми, серьезнойпроблемой является чрезмерное и неправильное использование антибиотиков в сельском хозяйстве и животноводстве и их ненадлежащий сброс в окружающую среду, включая водные объекты3. Появление новых признаков резистентности и множественной лекарственной устойчивости у бактерий настоятельно подчеркивает необходимость лучшего понимания факторов, ведущих к развитию АР и его распространению. Множественные устойчивые к антибиотикам бактерии, которые часто несут несколько генов AR (ARG) на мобильных генетических элементах, таких как плазмиды, могут передавать эти гены устойчивости нерезистентным микроорганизмам, включая потенциальные патогены человека, что приводит к появлению супербактерий, которые не поддаются лечению даже антибиотиками последней инстанции4. Эти множественные устойчивые к антибиотикам бактерии, если они присутствуют в водных экосистемах, могут непосредственно проникать в кишечник человека через потребление загрязненных продуктов на водной основе, таких как рыба, крабы и моллюски. Предыдущие исследования показали, что распространение бактерий AR в естественных водных системах может также достигать других источников воды, включая питьевую воду, и, таким образом, может попасть в пищевую цепь человека 5,6,7.
Целью настоящего исследования является предоставление всеобъемлющего протокола с использованием комбинации методов, основанных на культурах и не основанных на культурах (весь метагеномный анализ), для получения полной информации об общем бактериальном разнообразии и общем пуле различных ARG, присутствующих в водном объекте в Мумбаи, Индия. Традиционно для изучения бактериального разнообразия в водоемах используются методы, основанные на культурах. Поскольку культивируемые микроорганизмы составляют лишь небольшой процент от общей микробиоты в любой нише, чтобы лучше понять общее состояние бактериального разнообразия и различные устойчивые признаки, преобладающие в любом образце, необходимо использовать различные методы, основанные на культуре и независимые от культуры методы. Одним из таких надежных и надежных методов, не зависящих от культуры, является анализ всей метагеномной ДНК. Этот высокопроизводительный метод был успешно использован в различных исследованиях бактериального разнообразия или функциональных аннотаций различных ARG 8,9. Этот метод использует метагеном (общий генетический материал в образце) в качестве исходного материала для различных анализов и, следовательно, не зависит от культуры. Протоколы в настоящем исследовании могут быть использованы для анализа всей метагеномной ДНК для получения информации об общем бактериальном разнообразии и различных ARG (резистоме) в образцах воды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сбор и обработка образцов
- Сбор образцов
- Соберите соответствующий объем пробы воды в стерильный контейнер (контейнеры) для проб, обеспечив заполнение не более 3/4 контейнера.
- Транспортируйте образцы в лабораторию в асептических условиях как можно скорее после сбора и немедленно обрабатывайте их.
- Обработка образцов
- Асептически фильтруйте образец воды через стерильную муслиновую ткань, чтобы удалить любые твердые частицы.
- Проводят соответствующие последовательные разбавления отфильтрованной воды для дальнейшего анализа.
2. Оценка общей бактериальной нагрузки и количества устойчивых к антибиотикам бактерий
- Определение общей бактериальной нагрузки
- Суспендировать 18,12 г агара R2A, модифицированный порошок в 1000 мл двойной дистиллированной воды, и растворить смесь путем нагревания. Автоклав растворенной смеси при 121 °C, 15 psi в течение 20 мин. Готовят R2A Agar, модифицированные пластины, заливая соответствующее количество автоклавной смеси в стерильные пластины Петри (например, добавляют приблизительно 20 мл автоклавной стерильной среды к 90 мм стерильной пластине Петри).
- Равномерно распределите 100 мкл соответствующих разбавлений образца отфильтрованной воды на Агар R2A, модифицированную пластину, как только среда затвердеет. Выполните эксперимент в двух экземплярах.
- Инкубировать все вышеперечисленные пластины при 35-37 °C в течение 48 ч (изменять температуру и время инкубации в зависимости от среды, используемой для изоляции).
- Выражайте общую бактериальную нагрузку в единицах колониеобразования на миллилитр (КОЕ/мл) с помощью уравнения (1):
(1)
- Определение количества бактерий AR
- Выполните шаги 2.1.1-2.1.4. Однако вместо R2A Agar, модифицированных пластин, используйте R2A Agar, модифицированные пластины, дополненные индивидуально пятью различными антибиотиками, а именно цефотаксимом (3 мкг / мл), ципрофлоксацином (0,5 мкг / мл), эритромицином (20 мкг / мл), канамицином (15 мкг / мл) и ванкомицином (3 мкг / мл).
- Добавляют антибиотики отдельно в пробирки, содержащие 20 мл стерильного расплавленного R2A-агара, модифицированного (с температурой расплавленного R2A-агара, модифицированного при ≤40 °C) для достижения конечной концентрации антибиотика, как указано на этапе 2.2.1.
- Закрутите для равномерного перемешивания и вылейте на стерильные тарелки Петри до того, как агар затвердеет. Выполните эксперимент в двух экземплярах.
- Инкубировать все вышеперечисленные пластины при 35-37 °С в течение 48 ч (при использовании другой среды температура и время инкубации могут варьироваться).
- Для контроля качества и проверки эффективности антибиотиков наносите 100 мкл бактериальных суспензий Escherichia coli ATCC 25922 и Staphylococcus aureus ATCC 29213 на их соответствующие антибиотикосодержащие R2A agar, модифицированные пластины (убедитесь, что плотность свежей культуры, используемой для посева, составляет OD = 0,5 при 600 нм).
- Определите количество устойчивых к антибиотикам бактерий в пересчете на КОЕ/мл, как описано в шаге 2.1.4.
- Глицериновые запасы изолятов
- Выберите морфологически различные колонии AR.
- Суспендировать одну изолированную колонию в 2 мл стерильного бульона Луриа-Бертани, содержащего соответствующий антибиотик (например, если колонию отобрали из пластины, содержащей цефотаксим, инокулируют колонию со стадии 2.3.1 в стерильный бульон Лурия-Бертани, содержащий цефотаксим в соответствующей концентрации).
- Инкубируйте инокулированные трубки при 37 °C при 80 об/мин до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,5.
- Получают глицериновые запасы изолятов путем смешивания 750 мкл суспензии культуры со стадии 2.3.3 в 250 мкл стерильного 100% глицерина в асептических условиях.
- Хранить запасы глицерина при температуре −80 °C до дальнейшего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для возрождения культур из запасов глицерина разморозьте запасы глицерина при 4 °C. Инокулируют петлю этого бульона в 2 мл стерильного бульона Лурия-Бертани, содержащего соответствующий антибиотик, и дают расти.
(1)3. Идентификация культивируемых бактерий путем секвенирования гена 16S рРНК
- Подготовка шаблона ДНК из изолятов для ПЦР
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный для подготовки шаблона ДНК для ПЦР для выделения сырой ДНК из бактерий, приведен Carlson et al.10.- Используя стерильную зубочистку, возьмите единичную, изолированную, чистую колонию изолята, растущую на пластине Петри. Суспендировать бактериальную колонию в 100 мкл стерильной двойной дистиллированной воды в стерильной микроцентрифужной трубке и кипятить в течение 10 мин.
- Центрифугируйте суспензию при 10 000 × г в течение 2 мин, чтобы гранулировать мусор, и перенесите супернатант в свежую стерильную микроцентрифужную трубку для использования в качестве шаблона сырой ДНК.
- Таргетная амплификация ПЦР области V3 гена 16S рРНК и секвенирование
- Готовят 40 мкл реакционной смеси в ПЦР-трубке для амплификации ПЦР, как указано в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка ДНК должна проводиться на ледяной глыбе, минимизируя вероятность загрязнения (надевайте перчатки при работе с реагентами и тщательно очищайте рабочую поверхность 70% этанолом). - Поместите трубку в термоблок и запустите соответствующую программу в термоциклере ПЦР. См. таблицу 2 для стандартизированных условий цикла ПЦР и информацию праймера для амплификации областей V3 генов 16S рРНК.
- Для разрешения ампликонов и визуализации проводят электрофорез агарозного геля (AGE). Смешайте 10 мкл амплифицированного продукта ПЦР и 2 мкл 6-кратного гелевого нагрузочного буфера (таблица 3) и загрузите эту смесь в лунки на 1,5% агарозном геле (растворите 1,5 г порошка агарозы в 100 мл 1x буфера TAE [Таблица 3]), содержащего 5 мкл 10 мг/мл бромида этидия (EtBr) до конечной концентрации 0,5 мкг/мл EtBr в 100 мл агарозного геля.
ВНИМАНИЕ: EtBr является мощным канцерогеном. Перчатки следует носить постоянно при обращении с EtBr и гелями, содержащими EtBr. - Добавьте лестницу ДНК для оценки размера ампликонов.
- Проводят электрофорез геля в буфере резервуара TAE при 80-100 В.
- Как только следящий краситель пройдет 3/4 геля, остановите электрофорез и визуализируйте ампликонные полосы под УФ-трансиллюминатором.
- Используйте продукт ПЦР (ампликон) для секвенирования гена 16S рРНК для идентификации изолята.
- Количественно оцените ампликон, подвергнув его спектрофотометрическому анализу с помощью уравнения (2).
(2) - Чтобы проверить чистоту ДНК, рассчитайте соотношение А260/А280.
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале это число должно быть выше 1,5 и, предпочтительно, между 1,8 и 2,0. - Чтобы определить изоляты, сравните последовательности, полученные с базами данных последовательностей, используя соответствующее средство поиска выравнивания.
- Готовят 40 мкл реакционной смеси в ПЦР-трубке для амплификации ПЦР, как указано в таблице 1.
(2)4. Выявление устойчивости к антибиотикам в изолятах с помощью тестирования чувствительности к антибиотикам
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает метод тестирования чувствительности к антибиотикам (АСТ) путем диффузии диска. Использовались следующие диски антибиотиков: цефотаксим (5 мкг), ампициллин (10 мкг), левофлоксацин (5 мкг), левофлоксацин (5 мкг), хлорамфеникол (30 мкг), тигециклин (15 мкг), цефтриаксон (30 мкг), имипенем (10 мкг), гентамицин (10 мкг), неомицин (10 мкг), триметоприм (5 мкг) и ципрофлоксацин (5 мкг).
- Подготовка инокулята к АСТ
- Асептически инокулируют одну, изолированную, очищенную колонию AR, используя стерильную петлю в 2 мл стерильной неселективной среды, такой как бульон Лурии-Бертани (без какого-либо антибиотика), и инкубируют при 37 °C при 80 об/мин в течение ночи.
- Повторно суспендировать путем взятия 100-150 мкл выращенной на ночь культуры (приблизительно, OD600 = 1,8-2,0) в 2 мл свежей неселективной среды бульона Лурия-Бертани и инкубации в течение 2-4 ч (до тех пор, пока ОД600 не достигнет 0,4-0,5).
- Разбавляют эту свежевыращенную культуральную суспензию стерильным 0,85% физиологическим раствором таким образом, чтобы плотность культуры была равна 0,5 мкфарландской стандартной (приблизительно, OD600 = 0,1), что примерно соответствует 1-2 × 108 клеток/мл.
- Осторожно перемешайте бактериальную суспензию для равномерного распределения клеток.
- Используйте вышеуказанную суспензию в течение 15 мин после разведения.
- Инокуляция агаровых пластин
- Подготовьте пластины Мюллера-Хинтона Агара (MHA) для выполнения АСТ путем смешивания 38 г MHA в 1000 мл двойной дистиллированной воды и растворите смесь путем нагревания. Автоклав растворенной смеси при 121 °C, 15 psi в течение 15 мин.
- Убедитесь, что глубина MHA в пластинах составляет 4 мм (25 мл среды на пластину).
- Одновременно извлеките диски антибиотиков из морозильной камеры и нагрейте их до комнатной температуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Диски антибиотиков следует постепенно размораживать путем первоначального размораживания дисков при 4 °C, а затем при комнатной температуре, чтобы уменьшить любую потенциальную опасность конденсации на дисках, которая впоследствии может повлиять на зону ингибирования (ZOI). - В асептических условиях окуните стерильный ватный тампон в инокулят, приготовленный на этапе 4.1, и удалите лишнюю суспензию, чтобы избежать чрезмерной прививки пластин.
- Равномерно распределите культуру по тарелкам, начиная с верхней части пластины MHA и переходя взад и вперед от края к краю. Поверните пластину на 60° во время смазывания.
- Применение антибиотических дисков
- С помощью пламенно-стерилизованных щипцов асептически перенесите диски антибиотиков на инокулированные пластины MHA и осторожно надавите на диски, чтобы обеспечить полный контакт уровня с агаром.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура должна быть выполнена в течение 15 минут после посева культуры на пластинах. - Поместите соответствующее количество антибиотических дисков на агаровую пластину с учетом организма, используемого антибиотика и размера пластины, чтобы избежать перекрытия зон ингибирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре-пять дисков могут быть размещены на круглой пластине диаметром 90 мм.
- С помощью пламенно-стерилизованных щипцов асептически перенесите диски антибиотиков на инокулированные пластины MHA и осторожно надавите на диски, чтобы обеспечить полный контакт уровня с агаром.
- Инкубация плит
- В течение 15 мин после применения антибиотических дисков инвертируют пластины и инкубируют при 37 °C в течение ночи.
- Интерпретация результатов
- Измерьте диаметр ZOI в миллиметрах (мм) и интерпретируйте в соответствии со значениями точек останова, заданными EUCAST11. Смотрите два примера, приведенных ниже.
- Точка разрыва диаметра зоны (мм) для диска антибиотика ципрофлоксацина (5 мкг) для Enterobacterales составляет S ≥ 25 и R < 22, что означает, что он считается чувствительным (S), если ZOI ≥ 25 мм, в то время как он устойчив (R), если ZOI < 22 мм. Если диаметр ZOI падает между 22 и 25, изолят считается промежуточным (I).
- Точка разрыва диаметра зоны (мм) для диска антибиотика левомицетина (30 мкг) для Staphylococcus spp. составляет S ≥ 18 и R < 18, что означает, что он считается чувствительным, если ZOI ≥ 18 мм, в то время как он устойчив, если ZOI < 18 мм.
- Определите индекс множественной устойчивости к антибиотикам (MAR), найдя отношение количества антибиотиков, к которым изолят устойчив, к общему количеству антибиотиков, которым подвергается изолят.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля качества , E. coli ATCC 25922 и S. Стафилококк ATCC 29213 используются в качестве эталонных штаммов в соответствии с протоколом, как на шаге 4.
- Измерьте диаметр ZOI в миллиметрах (мм) и интерпретируйте в соответствии со значениями точек останова, заданными EUCAST11. Смотрите два примера, приведенных ниже.
5. Обнаружение генов устойчивости к антибиотикам в изолятах на основе ПЦР
- Используйте стандартный протокол ПЦР для идентификации ARG в изолятах. Подготовьте шаблон ДНК, используя протокол, приведенный в шаге 3.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия цикла ПЦР, использованные в этом исследовании, составляли 94 °C в течение 10 мин, за которыми следовали 35 циклов 94 °C в течение 30 с, отжиг в течение 30 с при соответствующей температуре (как стандартизовано для каждого набора грунтовки), удлинение при 72 °C в течение 40 с и окончательное расширение при 72 °C в течение 5 мин. Реакционная смесь описана в таблице 4. Список АРГ, грунтовок и температур отжига приведен в таблице 5. - Чтобы разрешить, визуализировать и проверить чистоту ампликонов, выполните шаги 3.2.3-3.2.10.
6. Полный метагеномный анализ ДНК для идентификации общего бактериального разнообразия и обнаружения ARG в метагеноме
- Извлечение общей ДНК (метагенома) из образца воды
- Извлеките метагеномную ДНК из образцов отфильтрованной воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании метагеномная ДНК (общая ДНК) была извлечена из образцов отфильтрованной воды с использованием ссылочного набора изоляции ДНК в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов). - Проверьте качество ДНК, загрузив 3 мкл экстрагированной метагеномной ДНК на 0,8% агарозный гель, и запустите гель при 80-110 В в течение примерно 30 минут.
- Проверьте наличие одной неповрежденной полосы.
- Проверьте концентрацию ДНК с помощью флуорометра.
- Извлеките метагеномную ДНК из образцов отфильтрованной воды.
- Определение бактериального разнообразия и обнаружение ARG с помощью секвенирования всей метагеномной ДНК
- Подготовка библиотеки и ПЦР-амплификация:
- Подготовьте библиотеку парного секвенирования с помощью набора для подготовки библиотеки ДНК, на который имеются ссылки (см. Таблицу материалов).
- Подготовьте ДНК к перевязке адаптера, взяв 200 нг ДНК и механически разрезав ее на более мелкие фрагменты, после чего следует непрерывный этап конечного восстановления, в котором «А» добавляется к 3'-концам.
- В зависимости от платформы, используемой для секвенирования, разложите конкретные адаптеры на обоих концах фрагментов ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности, имеющие решающее значение для привязки библиотек с двойным штрих-кодом к проточной ячейке для секвенирования, присутствуют в этих адаптерах. Это позволяет проводить ПЦР-амплификацию лигированных адаптером фрагментов и связывание стандартных праймеров секвенирования. - Чтобы проверить качество и количество, проанализируйте амплифицированную библиотеку с помощью высокочувствительного днк-чипа в соответствии с инструкциями производителя.
- Генерация и секвенирование кластеров:
- Загрузите усиленную библиотеку на соответствующую платформу виртуализации для создания кластера и последующего секвенирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Молекулы библиотеки связываются с комплементарным адаптером олигоса на парной концевой проточной ячейке. Во время секвенирования передние нити избирательно расщепляются после ресинтеза обратной нити. Эта скопированная обратная нить затем секвенируется с противоположного конца фрагмента.
- Загрузите усиленную библиотеку на соответствующую платформу виртуализации для создания кластера и последующего секвенирования.
- Биоинформационный анализ:
- Генерируйте каркасы из высококачественных данных с помощью соответствующей платформы.
- Подвергнуть эти каркасы биоинформаматическому анализу для таксономической классификации и идентификации ARG.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс для всего метагеномного анализа ДНК для идентификации общего бактериального разнообразия и обнаружения ARG в метагеноме приведен на рисунке 1. Технологическая схема полной методологии, описанной в рукописи, приведена на рисунке 2.
- Подготовка библиотеки и ПЦР-амплификация:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общая бактериальная нагрузка и количество устойчивых к антибиотикам (AR) бактерий
Перечисление общей бактериальной нагрузки проводилось путем распределения 10−4-10−6-кратных разбавлений проб воды на R2A Agar, модифицированной среде. Для перечисления количества бактерий АР на пластины среды, содержащие антибиотики, были распределены разведения от 10−3 до 10−6 раз. Общее количество бактерий и БАКТЕРИЙ AR были рассчитаны как КОЕ / мл, и все эксперименты по нанесению покрытий были выполнены в двух экземплярах. Следуя вышеуказанным протоколам, настоящее исследование показало, что общее количество бактерий составляет 3,0 × 109 КОЕ / мл. Бактериальная нагрузка AR оказалась высокой, в диапазоне 9,6 × 10 5-1,2 × 109 КОЕ/мл (таблица 6).
Идентификация культивируемых бактерий методом секвенирования 16S rRNAgene
Сырая ДНК из каждого изолята использовалась в качестве шаблона для выполнения ПЦР, специфичной для гена 16S рРНК. В общей сложности 15 секвенированных изолятов AR 10 принадлежали к семейству Enterobacteriaceae , причем большинство из них были Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae. Редкие условно-патогенные бактерии, такие как Comamonas spp. , принадлежащие к семейству Comamonadaceae, Micrococcus spp. и Arthrobacter spp. принадлежащие к семейству Micrococcaceae, и Aeromonas spp., принадлежащие к семейству Aeromonadaceae , также были идентифицированы из образца воды (таблица 7).
Выявление устойчивости к антибиотикам у культивируемых бактерий с помощью тестирования чувствительности к антибиотикам
Профиль устойчивости к антибиотикам вышеуказанных идентифицированных изолятов был получен путем выполнения АСТ с использованием метода диффузии диска (рисунок 4). Из 15 протестированных изолятов 8 имели индекс MAR ≥0,2, что указывает на высокую степень сопротивления. Более того, многие из изолятов показали профили корезистентности (резистентность к одному и тому же набору антибиотиков). Однако изоляты, такие как Comamonas spp. и Arthrobacter spp., не показали устойчивости ни к одному из протестированных антибиотиков (таблица 8).
Обнаружение и идентификация генов устойчивости к антибиотикам у культивируемых бактерий
В общей сложности 10 изолятов AR были проверены на наличие ARG с использованием ПЦР. Наиболее распространенным ARG в культивируемых изолятах был blaTEM, кодирующий β-лактамазу, за которым следовал ген устойчивости к аминогликозидам aadA. Другими усиленными ARG были blaCTX-M, dfr1 и aac(6')-Ib , придающие устойчивость β-лактамам, триметоприму и аминогликозидам соответственно. Репрезентативные результаты усиления АРГ показаны на рисунке 5. Для большинства идентифицированных изолятов фенотипическая резистентность (АСТ) была подтверждена на молекулярном уровне с помощью генотипического профилирования AR на основе ПЦР.
Идентификация общего бактериального разнообразия в метагеномной ДНК
Для проверки наличия всех возможных бактерий (как культивируемых, так и некультивируемых) и выявления их относительного обилия был проведен метагеномный анализ ДНК на общее бактериальное разнообразие. Используя высокопроизводительный подход секвенирования следующего поколения (HT-NGS), было получено ~96,94% от общего числа считываний последовательностей, что привело к высокому охвату. Таксономическая аннотация проводилась для классификации считываний на различные таксономические группы от типа до уровня рода (рис. 6 и фиг.7). В общей сложности 50 типов могут быть идентифицированы в метагеноме, что указывает на высокое бактериальное разнообразие в образце воды. Протеобактерии были наиболее доминирующим типом, состоящим из классов альфапротеобактерий, бетапротеобактерий и гаммапротеобактерий. На уровне отряда Burkholderiales был наиболее распространенным отрядом, принадлежащим к классу бетапротеобактерий. Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium и Comamonas были одними из распространенных родов, обнаруженных в образце воды.
Обнаружение ARG из метагеномной ДНК
Чтобы понять общий пул ARG в метагеноме образца воды, было проведено полное метагеномное секвенирование с последующей идентификацией ARG с использованием соответствующих инструментов биоинформатики. Метагеномный подход обеспечивает обнаружение ARG, присутствующих как в культивируемых, так и в некультивируемых микроорганизмах в образце. Различные гены, придающие устойчивость к β-лактамам (SMB-1, ampC1, VIM-20, ccrA, nmcR, ARL-1, blaZ); аминогирлкозиды (aac(6')-34); хинолоны (qnrS6, qnrVC5); антибиотические эффлюксные насосы-резистентность-узелка-деление клеток (RND) (evgA, mtrA, mdtA, acrD), АТФ-связывающая кассета (ABC) (oleC, macB, patA, bcrA) и суперсемейство основных фасилитаторов (MFS) (abaQ); триметоприм-резистентная дигидрофолатредуктаза (dfrD, dfrA20); рифампинфосфотрансфераза (rphB); и хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT) (catB10) были обнаружены в метагеноме. ARG, обнаруженные с помощью ПЦР в культивируемых изолятах (blaTEM, blaCTX-M, aadA, aac(6')-Ib, dfr1), также были обнаружены путем полного метагеномного секвенирования, тем самым подтверждая их присутствие в образце воды. Репрезентативные результаты АРГ, идентифицированных в метагеноме с использованием анализа всей метагеномной ДНК, приведены в таблице 9.
Рисунок 1: Рабочий процесс для анализа всей метагеномной ДНК. Представлен пошаговый рабочий процесс для идентификации общего бактериального разнообразия и обнаружения ARG из метагенома. Общие шаги включают метагеномную подготовку ДНК, амплификацию и идентификацию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Технологическая схема полной методологии. Пошаговый рабочий процесс методологии, использованной в настоящем исследовании. Сочетание методов, основанных на культуре, так и методов, не основанных на культурах, используется для получения полной информации о бактериальном разнообразии и идентичности ARG, присутствующих в образце воды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные изображения изолированных колоний на антибиотиксодержащих R2A агаре, модифицированных пластинах. Образцы воды, покрытые цефотаксимом (3 мкг/мл), содержащими R2A agar, модифицированными пластинами. Образец последовательно разбавляли и покрывали дубликатами - А1, А2: 10−4; В1, В2: 10−5; С1, С2: 10−6. После соответствующего инкубационного периода изолированные колонии были видны на пластинах B1, B2, C1 и C2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Тест на чувствительность к антибиотикам методом диффузии диска. Репрезентативные изображения АСТ методом диффузии диска для изолята кишечной палочки . АСТ выполнялся в дубликатах-А1, А2: CTX, IPM, C, CIP; B1, B2: LE, TGC, AMP, GEN; C1, C2: TR, N, K, CTR. Диаметры ЗОИ измерялись в миллиметрах (мм). Чтобы интерпретировать, является ли изолят устойчивым или восприимчивым к используемому антибиотику, ZOI сравнивали с последними таблицами EUCAST. Сокращения: АСТ = тест на чувствительность к антибиотикам; CTX = цефотаксим; IPM = имипенем; C = хлорамфеникол; CIP = ципрофлоксацин; LE = левофлоксацин; TGC = тигециклин; AMP = ампициллин; GEN = гентамицин; TR = триметоприм; N = неомицин; К = канамицин; CTR = цефтриаксон; ZOI = зона торможения; EUCAST = Европейский комитет по тестированию чувствительности к антибиотикам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: ПЦР-амплификация генов устойчивости к антибиотикам из культивируемых бактерий. Электрофорез агарозного геля после ПЦР проводили для визуализации амплифицированных полос для проверки наличия АРГ в изолятах. На геле можно увидеть разделенные полосы ампликонов ПЦР. Размер отдельных ампликонов ПЦР сравнивается с соответствующим маркером ДНК. Полоса L1: лестница ДНК 100 bp; Дорожки 1-5: 1: dfr1 (425 bp); Полоса 2: blaTEM (310 bp); Полоса 3: blaCTX-M (500 bp); Полоса 4: aac(6')-Ib (395 bp); Полоса 5: aadA (624 bp). Аббревиатура: ARG = гены устойчивости к антибиотикам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Таксономическая классификация для типов и уровней классов. (A) Гистограмма, показывающая таксономическое распределение содержания бактериального метагенома в образце воды на уровне типа. В общей сложности 50 бактериальных типов были идентифицированы метагеномным анализом. Показаны первые 12 доминантных типов бактерий. (B) Линейчатая диаграмма, показывающая таксономическое распределение бактериального метагенома на уровне класса в образце воды. В общей сложности 50 классов бактерий были идентифицированы метагеномным анализом. Показаны первые 15 доминирующих классов бактерий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Таксономическая классификация для уровней порядка и рода. (A) Гистограмма, показывающая распределение таксономического изобилия бактериального метагенома на уровне порядка в образце воды. В общей сложности 50 бактериальных отрядов были идентифицированы метагеномным анализом. Первые 14 доминирующих отрядов бактерий показаны на рисунке. (B) Линейчатая диаграмма, показывающая таксономическое распределение бактериального метагенома на уровне рода в образце воды. В общей сложности 50 бактериальных родов были идентифицированы метагеномным анализом. Показаны первые 15 доминантных родов бактерий, показанных на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Реагенты ПЦР | Объем (мкл) |
| 2x Так Мастер Микс | 20 |
| Прямая грунтовка (10 пико моль) | 1.5 |
| Обратная грунтовка (10 пико молей) | 1.5 |
| Шаблон сырой ДНК | 1.5 |
| Стерильная молекулярно-биологическая вода | 15.5 |
| Общий объем | 40 |
Таблица 1: Компоненты ПЦР-мастермикса. Реакционная смесь состава различных реагентов ПЦР.
| Направление | Последовательность грунтовки 5' – 3' | Условия ПЦР | Количество циклов |
| Вперёд | GGAGGCAGCAGTAAGGAAT | 94 °C в течение 10 мин | 1 |
| Денатурация при 94 °C в течение 30 с | 35 | ||
| Отжиг при 50 °C в течение 30 с | |||
| Удлинение при 72 °C в течение 40 с | |||
| Обратный | CTACCGGGGTATCTAATCC | Окончательное удлинение при 72 °C в течение 5 мин | 1 |
Таблица 2: Условия цикла ПЦР для амплификации гена 16S рРНК. Показаны условия цикла ПЦР, необходимые для амплификации гена 16S рРНК. Этапы включают начальную стадию денатурации, за которой следуют 35 циклов денатурации, отжига и расширения, а также заключительная стадия расширения.
| 6x загрузочный гель | |
| Содержание | Количество |
| Бромфенол синий | 25 мг |
| 85% глицерина | 7.06 мл |
| Вода Milli-Q | 2.94 мл |
| Общий объем | 10 мл |
| 50x Трис-ацетат-ЭДТА (TAE) запасной буферный состав | |
| Содержание | Количество |
| База Трис | 242 г в 700 мл дистиллированной воды |
| Ледниковая уксусная кислота (GAA) | 57.1 мл |
| 0,5 М (ЭДТА) pH 8,0 | 100 мл |
| Отрегулируйте pH до 8,5 и увеличьте объем до 1000 мл с помощью двойной дистиллированной воды | |
| Для 1x TAE: 20 мл 50x TAE буфер + 980 мл двойной дистиллированной воды | |
Таблица 3: Состав 6-кратного буфера загрузки геля и 50-кратного буфера запаса трис-ацетата-ЭДТА. 6-кратный буфер нагрузки геля смешивается с образцом для запуска на электрофорезе агарозного геля. Он содержит бромфенол синий в качестве отслеживающего красителя. Глицерин увеличивает плотность загружаемого образца для правильной загрузки в скважины. Также показан состав различных реагентов, необходимых для приготовления буфера запаса 50xTAE. Буфер TAE является одним из наиболее распространенных буферов, используемых для AGE, и он поддерживает рН на уровне 8,5 и обеспечивает миграцию амплифицированной ДНК во время AGE. Сокращения: TAE = Трис-ацетат-ЭДТА; AGE = электрофорез агарозного геля.
| Реагенты ПЦР | Объем (мкл) |
| 2x Так Мастер Микс | 5 |
| Прямая грунтовка (10 пико моль) | 0.5 |
| Обратная грунтовка (10 пико молей) | 0.5 |
| Шаблон сырой ДНК | 1.5 |
| Стерильная вода молекулярной биологии | 2.5 |
| Общий объем | 10 |
Таблица 4: Композиция ПЦР-мастермикса для идентификации АРГ. Состав реакционной смеси различных ПЦР-реагентов, необходимых для проведения ПЦР-эксперимента.
| Старший No. | Ген-мишень | Устойчивость к | Букварь | Последовательность грунтовки (5'-3') | Размер ампликона (bp) | Температура отжига (°C) | Ссылки | ||||
| 1 | дкфр A | Триметоприм | Вперёд | TGGTAGCTATATC ГААГААТГГАГТ |
425 | 59 | Расевич и др., 19 | ||||
| Обратный | ТАТГТТАГАГГКГГ AAGTCTTGGGTA |
||||||||||
| 2 | блаТЕМ | β – лактамы | Вперёд | GCACGAGTGGG ТТАКАТКГА |
310 | 60 | Гебрейес, Тхакур20 | ||||
| Обратный | GGTCCTCCGAT CGTTGTCAG |
||||||||||
| 3 | blaCTX-M | β – лактамы | Вперёд | ЦГАТГГАЦГ ATGTCACTG |
500 | 52 | Ли и др. 21 | ||||
| Обратный | CGGCTTTCTG ЦКТТАГГТТ |
||||||||||
| 4 | aac(6')-Ib | Аминогликозиды | Вперёд | ТАТГАГТГГЦ ТАААТКГАТ |
395 | 50 | Акерс и др. 22 | ||||
| Обратный | CCCGCTTTCTCTCT CGTAGCA |
||||||||||
| 5 | аад A | Аминогликозиды | Вперёд | ACCGTAAGGC ТТГАТГАААКА |
624 | 58 | Цесельчук 23 | ||||
| Обратный | GCCGACTACC ТТГГТГАТКТК |
||||||||||
Таблица 5: Праймеры для ПЦР АРГ у культивируемых бактерий. Показаны различные ARG, используемые в настоящем исследовании, вместе с их соответствующими последовательностями праймеров. Ожидаемый размер ампликона приведен в парах оснований. Также упоминается температура отжига каждого набора грунтовки.
| Антибиотик | Концентрация антибиотика (мкг/мл) | КОЕ/мл |
| - | - | 3,0 х 109 |
| CTX | 3 | 4,5 х 107 |
| Безразборная мойка | 0.5 | 3,2 х 108 |
| K | 15 | 9,6 х 105 |
| E | 20 | 1,6 х 108 |
| ВА | 3 | 1,2 х 109 |
Таблица 6: Общее количество и количество устойчивых к антибиотикам бактерий. Пять антибиотиков были использованы для первоначального выделения устойчивых к антибиотикам бактерий из образца воды. Общее количество бактерий (без антибиотиков) и количество бактерий AR представлены в терминах колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ / мл). Сокращения: AR = устойчивость к антибиотикам; КОЕ = колониеобразующие единицы; CTX = цефотаксим; CIP = ципрофлоксацин; К = канамицин; E = эритромицин; VA = ванкомицин.
| Изолировать код | Микроорганизмов | Семья |
| 1 | Кишечная палочка | Энтеробактерии |
| 2 | Кишечная палочка | Энтеробактерии |
| 3 | Кишечная палочка | Энтеробактерии |
| 4 | Кишечная палочка | Энтеробактерии |
| 5 | Кишечная палочка | Энтеробактерии |
| 6 | Кишечная палочка | Энтеробактерии |
| 7 | Klebsiella pneumoniae | Энтеробактерии |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | Энтеробактерии |
| 9 | Klebsiella pneumoniae | Энтеробактерии |
| 10 | Klebsiella pneumoniae | Энтеробактерии |
| 11 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 12 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 13 | Micrococcus spp. | Микрококковые |
| 14 | Артробактер спп. | Микрококковые |
| 15 | Аэромонас спп. | Аэромонадацеи |
Таблица 7: Идентификация устойчивых к антибиотикам изолятов путем секвенирования гена 16S рРНК. Колониальную ПЦР проводили для каждого изолята с использованием 16S рРНК-специфических праймеров. Полученные ампликоны затем секвенировали и идентифицировали с использованием соответствующих инструментов биоинформатики.
| Изолировать Нет. | Изолировать | CTX | АМПЕР | Меньше или равно | C | ТГК | CTR | ИПМ | ИНФОРМАЦИЯ | N | ТР | Безразборная мойка | ПОРТИТЬ | Индекс MAR | ||
| 1 | Кишечная палочка | 13Р | 0Р | 0Р | 28С | 23С | 11Р | 39С | 20С | 18С | 0Р | 0Р | 6 | 0.5 | ||
| 2 | Кишечная палочка | 31С | 0Р | 12Р | 29С | 23С | 222 | 37С | 19С | 16С | 0Р | 14Р | 4 | 0.4 | ||
| 3 | Кишечная палочка | 14Р | 0Р | 14Р | 14Р | 21С | 10Р | 34С | 17С | 11Р | 24С | 16Р | 7 | 0.6 | ||
| 4 | Кишечная палочка | 28С | 13Р | 18Р | 26С | 21С | 28С | 222 | 16Р | 11Р | 24С | 19Р | 5 | 0.4 | ||
| 5 | Кишечная палочка | 11Р | 0Р | 12Р | 26С | 21С | 10Р | 31С | 17С | 16С | 22С | 11Р | 5 | 0.4 | ||
| 6 | Кишечная палочка | 27С | 0Р | 12Р | 12Р | 22С | 30С | 32С | 19С | 11Р | 0Р | 14Р | 6 | 0.5 | ||
| 7 | Klebsiella pneumoniae | 28С | 0Р | 17Р | 27С | 22С | 30С | 222 | 18С | 22С | 0Р | 16Р | 4 | 0.4 | ||
| 8 | Klebsiella pneumoniae | 29С | 11Р | 26С | 24С | 22С | 30С | 28С | 17С | 16С | 24С | 23С | 1 | 0.1 | ||
| 9 | Klebsiella pneumoniae | 29С | 13Р | 25С | 24С | 22С | 28С | 29С | 18С | 17С | 24С | 25С | 1 | 0.1 | ||
| 10 | Klebsiella pneumoniae | 33С | 14С | 26С | 28С | 22С | 31С | 32С | 19С | 20С | 24С | 29С | 0 | 0 | ||
| 11 | Comamonas spp. | - | - | - | 23С | - | - | 37С | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 12 | Comamonas spp. | - | - | - | 27С | - | - | 42С | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 13 | Micrococcus spp. | 25С | 17Р | 24С | 222 | 22С | 34С | 28С | 20С | - | 21С | 26С | 1 | 0.1 | ||
| 14 | Артробактер спп. | 45С | 57С | 28С | 26С | 34С | 27С | 39С | 26С | - | 28С | 28С | 0 | 0 | ||
| 15 | Аэромонас спп. | - | - | 20Р | - | - | - | - | - | - | - | 20Р | 2 | 1 | ||
Таблица 8: Фенотип антибиотикорезистентности бактериальных изолятов, анализируемых методом АСТ. Фенотипическая резистентность в изолятах анализировали с помощью метода диффузии диска. Цифры обозначают ZOI в миллиметрах (мм). Для индекса MAR цифры указывают на общее количество антибиотиков, к которым устойчив изолят. Сокращения: АСТ = тест на чувствительность к антибиотикам; CTX = цефотаксим; AMP = ампициллин; LE = левофлоксацин; C = хлорамфеникол; TGC = тигециклин; CTR = цефтриаксон; IPM = имипенем; GEN = гентамицин; N = неомицин; TR = триметоприм; CIP = ципрофлоксацин; R = устойчивый; S = чувствительный; MAR = множественная устойчивость к антибиотикам; ZOI = зона торможения.
| СЕМЕЙСТВО ГЕНОВ AMR | ГЕН(Ы) |
| SMB бета-лактамаза | СМБ-1 |
| бета-лактамаза типа ampC | ампC1 |
| VIM бета-лактамаза | ВИМ-20 |
| CcrA бета-лактамаза | ccrA |
| NmcA бета-лактамаза | nmcR |
| ARL Бета-лактамаза | АРЛ-1 |
| блаЗ бета-лактамаза | блаЗ |
| blaTEM бета-лактамаза | блаТЕМ* |
| blaCTX бета-лактамаза | blaCTX |
| AAC(6') | aac(6')-Ib, aac(6')-34 |
| ANT(3'') | аадА |
| белок резистентности к хинолонам (qnr) | qnrS6, qnrVC5 |
| антибиотический эффлюксный насос с разделением клеток (RND) | evgA, mtrA, mdtA, acrD |
| АТФ-связывающий кассетный (ABC) насос для оттока антибиотиков | олеС, макБ, патА, бкрА |
| основной фасилитатор суперсемейства (MFS) антибиотический эффлюксный насос | abaQ |
| триметоприм устойчивая дигидрофолатредуктаза dfr | dfr1, dfrD, dfrA20 |
| рифампинфосфотрансфераза | рфБ |
| белки, связанные с ундекапренилпирофосфатом | bcrC |
| метициллин-резистентный PBP2 | мекД |
| мембранный белок vanJ | ванЖ |
| тетрациклин-резистентный рибосомный защитный белок | тетТ |
| хлорамфениколацетилтрансфераза (CAT) | катБ10 |
| Erm 23S рибосомная РНК метилтрансфераза | эрм(37) |
| кластер генов устойчивости к гликопептидам | ванРБ, ванРЕ, ванРД |
| MCR фосфоэтаноламинтрансфераза | МКР-9 |
| сульфаниламидно-стойкий сул | сул3 |
| * подчеркнутые гены также были обнаружены в культивируемых микроорганизмах | |
Таблица 9: ARG, идентифицированные с использованием анализа всей метагеномной ДНК. Общий метагеном образца воды использовали для полного метагеномного секвенирования, а полученные последовательности аннотировали с использованием соответствующей базы данных ARG. Показаны репрезентативные результаты некоторых важных ARG, идентифицированных в метагеномной ДНК. Подчеркнутые гены также были обнаружены в культивируемых микроорганизмах. Аббревиатура: ARG = ген, устойчивый к антибиотикам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сбор и обработка образцов играют важную роль и могут повлиять на результаты и интерпретацию исследования. Следовательно, чтобы исключить изменчивость проб, важно проводить отбор проб в нескольких местах исследуемого пресноводного водоема. Поддержание надлежащих асептических условий окружающей среды при обработке таких образцов может предотвратить загрязнение. Кроме того, для предотвращения изменений в бактериальном составе, которые могут повлиять на качество и количество экстрагированных нуклеиновых кислот, условия транзита должны поддерживаться при 4 °C с минимальным промежутком времени от точки сбора пробы до последующей обработки. В нескольких исследованиях было подчеркнуто, что этот промежуточный период между сбором и обработкой проб может дать переменные результаты на более поздних этапах анализа, если не сделать тщательно12,13.
Использование ряда разбавлений для покрытия гарантирует, что колонии не слипаются вместе и не слишком мало колоний для подсчета. Выполнение экспериментов в двух экземплярах необходимо для учета изменений в КОЕ/мл, которые могут возникнуть из-за ошибок пипетирования/обработки. Кроме того, контрольные пластины поддерживаются для каждого эксперимента, чтобы гарантировать, что используемые антибиотики работают эффективно и что ложноположительные результаты устранены. Следовательно, контрольные пластины не должны иметь видимого роста колонии. Это указывает на эффективность используемых антибиотиков.
Во время АСТ плотность посева инокулята и толщина агаровой пластины могут влиять на диаметр ZOI и, следовательно, на интерпретацию результатов. Поэтому следует позаботиться о том, чтобы эти два фактора были единообразными при выполнении экспериментов АСТ. Наиболее важным аспектом является количество бактериальных клеток, присутствующих в инокуляте. Как правило, в качестве инокулята используется 1 × 108-2 × 10 8 КОЕ/мл клеток, что равно стандарту 0,5 Макфарланда14. Эта концентрация инокулята должна быть постоянной, чтобы избежать каких-либо изменений в результатах. Любая концентрация выше или ниже требуемой концентрации должна быть разбавлена с помощью стерильного физиологического раствора и немедленно использована для прививки в течение 15 мин. При нанесении инокулята на агаровые пластины необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать чрезмерного количества инокулята. Избыток инокулята может быть удален путем нажатия тампона по бокам трубки бактериальной суспензии перед инокуляцией его на пластину MHA. Любое отклонение от стандартной процедуры АСТ может существенно повлиять на данные, полученные из таких протоколов11,15. Предыдущее исследование показало, что значение индекса MAR ≥0,2 указывает на высокую резистентность в изолятах16. Поскольку интерпретация результатов АСТ основана на ZOI, следует избегать недопрививки или чрезмерной вакцинации культуры.
Для ПЦР мастермикс должен быть приготовлен на ледяной глыбе, чтобы свести к минимуму вероятность деградации ингредиентов и потери активности фермента. Ношение перчаток при настройке реакции сводит к минимуму вероятность внешнего загрязнения17. Напряжение во время AGE не должно быть слишком высоким, так как это может привести к эффекту нагрева и деградации загруженных образцов. Выполнение AGE при оптимальном напряжении гарантирует, что полосы хорошо разделены и остры без каких-либо эффектов перетаскивания или размазывания.
Исследования, проведенные в последние несколько десятилетий, продемонстрировали использование секвенирования ампликона гена 16S рРНК для идентификации различных микроорганизмов. Для секвенирования гена 16S рРНК выбор метода извлечения шаблонной ДНК может вызвать смещения, которые, в свою очередь, могут повлиять на последующий анализ. Грамположительные бактерии имеют толстую клеточную стенку пептидогликана, что может затруднить извлечение нуклеиновой кислоты. Поэтому выбор метода экстракции должен быть таким, чтобы он эффективно захватывал все типы микробной ДНК. Традиционный метод кипячения для извлечения сырой шаблонной ДНК является одним из таких эффективных методов извлечения содержимого клетки, тем самым уменьшая смещения в результатах.
Чтобы понять полное бактериальное сообщество водного объекта, в этом исследовании был использован высокопроизводительный метод секвенирования следующего поколения (HT-NGS). Анализ всей метагеномной ДНК позволяет изучить весь метагеном данного образца. Методы, основанные на культурах, в основном дают аэробный подсчет бактериальной нагрузки, указывая на микробиологическое качество образца. Однако культивируемые микроорганизмы составляют всего 1% от общего числа микроорганизмов. Оставшаяся микрофлора, которая включает в себя разнообразный спектр видов, включая анаэробы, плохо характеризуется и часто игнорируется. Эти микроорганизмы могут нести признаки AR. Кроме того, комменсальные микроорганизмы являются резервуаром генов AR, которые могут передаваться патогенам через различные события генетического обмена18. Многие из этих комменсалов не поддаются культивированию и могут быть изучены с помощью метагеномного подхода с участием HT-NGS, обеспечивая больший охват для идентификации разнообразной микрофлоры в любом образце. С помощью метагеномного анализа был получен подробный профиль таксонов бактерий, который дополнил культивируемые данные. Более того, такие комплементарные подходы могут дать представление об общем состоянии АР исследуемого водного объекта.
В настоящем исследовании, используя комбинацию как обычных метагеномных методов, основанных на культуре, так и не основанных на культурах, мы смогли идентифицировать общее бактериальное разнообразие, различные устойчивые к антибиотикам бактерии и общий пул переносимых водой ARG. Методология, описанная в этом исследовании, может быть воспроизведена и настроена для идентификации патогенов AR в любом другом источнике воды - прибрежной воде, природной воде и искусственной питьевой воде. Он также может быть использован для отслеживания передачи внутрибольничных патогенов, передающихся через воду, и для мониторинга инфекций, связанных с больницей, в больничных и клинических учреждениях через источники воды, такие как раковины, туалеты, ванны и увлажнители. Это поможет в наблюдении за УПП и выявлении горячих точек УПП на водной основе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтующих интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана финансовыми грантами Департамента науки и техники - Содействие университетским исследованиям и научному совершенству (DST-PURSE) Схемы Университета Мумбаи. Девика Гадигаонкар работала в качестве стипендиата проекта по этой схеме. Техническая помощь, предоставленная Харшали Шинде, старшим научным сотрудником Департамента науки и техники, науки и инженерных исследований (DST-SERB) Проект No: CRG/2018/003624, приветствуется.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA - Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. , Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022).
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- Bayot, M., Bragg, B.
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).
