Summary

בידוד וזיהוי חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה במים ואפיון מולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה ממים ולאפיון המולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם (ARGs). השימוש בטכניקות מבוססות תרבית ולא מבוססות תרבית (ניתוח מטגנומי) מספק מידע מלא על מגוון החיידקים הכולל ועל המאגר הכולל של ARGs שונים הנמצאים במים מתוקים ממומבאי, הודו.

Abstract

הפיתוח וההתפשטות של עמידות לאנטיביוטיקה (AR) באמצעות מיקרוביוטה הקשורה לגופי מים מתוקים הוא דאגה בריאותית עולמית מרכזית. במחקר הנוכחי, דגימות מים מתוקים נאספו ונותחו ביחס למגוון החיידקים הכולל ולגנים של AR (ARGs) תוך שימוש הן בטכניקות קונבנציונליות מבוססות תרבית והן בגישה מטגנומית בלתי תלויה בתרבית בתפוקה גבוהה. מאמר זה מציג פרוטוקול שיטתי לספירה של החיידקים הכוללים והעמידים לאנטיביוטיקה מדגימות מים מתוקים ולקביעת עמידות פנוטיפית וגנוטיפית במבודדים הניתנים לתרבות. יתר על כן, אנו מדווחים על שימוש באנליזה מטא-גנומית שלמה של סך הדנ”א המטגנומי המופק מדגימת המים המתוקים לצורך זיהוי מגוון החיידקים הכולל, כולל חיידקים שאינם ניתנים לתרבות, וזיהוי המאגר הכולל של ARGs שונים (התנגדות) בגוף המים. בעקבות הפרוטוקולים המפורטים האלה, ראינו עומס חיידקים גבוה עמיד לאנטיביוטיקה בטווח של 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU/mL. רוב המבודדים היו עמידים לאנטיביוטיקה הנפוצה שנבדקה, כולל cefotaxime, ampicillin, levofloxacin, chloramphenicol, ceftriaxone, gentamicin, neomycin, trimethoprim, ו ciprofloxacin, עם מספר אינדקסים של עמידות לאנטיביוטיקה (MAR) של ≥0.2, מה שמעיד על רמות גבוהות של עמידות בבידודים. ריצוף 16S rRNA זיהה פתוגנים אנושיים פוטנציאליים, כגון דלקת ריאות קלבסיאלה, וחיידקים אופורטוניסטיים, כגון Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp., ו- Aeromonas spp. האפיון המולקולרי של המבודדים הראה נוכחות של ARGs שונים, כגון blaTEM, blaCTX-M (β-לקטאמים), aadA, aac (6′)-Ib (אמינוגליקוזידים) ו-dfr1 (טרימתופרימים), אשר אושרה גם על ידי ניתוח הדנ”א המטגנומי כולו. שכיחות גבוהה של קידוד ARGs אחרים עבור משאבות שטף אנטיביוטיקה-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, הגן כלורמפניקול אצטילטרנספראז catB10, ואת גן עמידות rifampicin rphB-זוהה גם בדנ”א המטגנומי. בעזרת הפרוטוקולים שנדונו במחקר זה, אישרנו את נוכחותם של חיידקי MAR הנישאים במים עם תכונות פנוטיפיות וגנוטיפיות מגוונות של AR. לפיכך, ניתוח דנ”א מטגנומי שלם יכול לשמש כטכניקה משלימה לטכניקות קונבנציונליות המבוססות על תרביות כדי לקבוע את מצב ה-AR הכולל של גוף מים.

Introduction

עמידות מיקרוביאלית (AMR) זוהתה כאחת הבעיות העולמיות הדחופות ביותר. ההתפתחות המהירה של AMR והתפשטותו העולמית הם אחד האיומים הגדולים ביותר על בריאות האדם ועל הכלכלה העולמית במונחים של עלויות הבריאות הכרוכות בו1. שימוש יתר ושימוש לרעה באנטיביוטיקה הובילו לעלייה ב-AR. זה הודגש על ידי מגיפת COVID-19, שבמהלכה הטיפול בזיהומים משניים הקשורים, במקרים רבים, נפגע מאוד בגלל AMR בחולים שנפגעו2. מלבד השימוש הישיר/שימוש לרעה באנטיביוטיקה על ידי בני אדם, שימוש יתר ושימוש לרעה באנטיביוטיקה בחקלאות ובגידול בעלי חיים והזרמתן הבלתי הולמת לסביבה, כולל גופי מים, הם דאגה מרכזית3. עלייתן של תכונות עמידות חדשות ועמידות רב-ממדית בחיידקים מדגישה בדחיפות את הצורך בהבנה טובה יותר של הגורמים המובילים להתפתחות AR והפצתו. חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה מרובים, שלעתים קרובות נושאים גנים מרובים של AR (ARGs) על אלמנטים גנטיים ניידים כגון פלסמידים, יכולים להעביר את גני העמידות האלה למיקרואורגניזמים שאינם עמידים, כולל פתוגנים אנושיים פוטנציאליים, ובכך להוביל להופעתם של חיידקי-על שאינם ניתנים לריפוי אפילו עם אנטיביוטיקה של מוצא אחרון4. החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה המרובים האלה, אם הם נמצאים במערכות אקולוגיות של מים, יכולים להיכנס ישירות למעי האנושי באמצעות צריכת מזונות מזוהמים על בסיס מים, כגון דגים, סרטנים ורכיכות. מחקרים קודמים הראו כי התפשטות חיידקי AR במערכות מים טבעיות יכולה להגיע גם לאספקת מים אחרת, כולל מי שתייה, ובכך יכולה להיכנס לשרשרת המזון האנושית 5,6,7.

מטרת המחקר הנוכחי היא לספק פרוטוקול מקיף תוך שימוש בשילוב של טכניקות מבוססות תרבית ולא מבוססות תרבית (ניתוח מטגנומי שלם) כדי לקבל מידע מלא על מגוון החיידקים הכולל ועל המאגר הכולל של ARGs שונים הנמצאים בגוף מים במומבאי, הודו. באופן קונבנציונלי, נעשה שימוש בטכניקות מבוססות תרבית כדי לחקור את מגוון החיידקים בגופי מים. מכיוון שמיקרואורגניזמים תרבותיים מהווים רק אחוז קטן מכלל המיקרוביוטה בכל נישה, כדי להבין טוב יותר את המצב הכללי של מגוון החיידקים ואת תכונות העמידות השונות הנפוצות בכל דגימה, יש להשתמש בטכניקות שונות המבוססות על תרבית ובלתי תלויות בתרבית במקביל. טכניקה אחת חזקה ואמינה כזו, שאינה תלויה בתרבות, היא ניתוח דנ”א מטגנומי שלם. שיטה זו בעלת תפוקה גבוהה שימשה בהצלחה במחקרים שונים על מגוון חיידקים או על ביאורים פונקציונליים של ARGsשונים 8,9. טכניקה זו משתמשת במטגנום (החומר הגנטי הכולל בדגימה) כחומר המוצא לניתוחים שונים, ולכן היא בלתי תלויה בתרבית. הפרוטוקולים במחקר הנוכחי יכולים לשמש לניתוח דנ”א מטגנומי שלם כדי לקבל מידע על מגוון החיידקים הכולל ועל ARGs (התנגדות) שונים בדגימות מים.

Protocol

1. איסוף ועיבוד דגימות איסוף דגימותאסוף את הנפח המתאים של דגימת המים במיכלי דגימה סטריליים, וודא שלא יותר מ-3/4 מהמיכל ימולא. להעביר את הדגימות למעבדה בתנאים אספטיים בהקדם האפשרי לאחר האיסוף ומיד לעבד אותם. עיבוד דוגמאותמסננים באופן אספטי את דגימת ה?…

Representative Results

סך כל עומס החיידקים וספירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה (AR)הספירה של עומס החיידקים הכולל בוצעה על ידי פיזור 10−4 עד 10−6 דילולים של דגימות המים על R2A Agar, מדיום שונה. לצורך הספירה של ספירת חיידקי ה-AR, 10−3 עד 10−6 דילולים של פי 6 הופצו על לוחות מדיה המכילים אנטי…

Discussion

איסוף הדגימות ועיבודן ממלאים תפקיד משמעותי ועשויים להשפיע על התוצאות והפרשנות של המחקר. לפיכך, כדי לשלול שונות בדגימות, חשוב לבצע דיגום במספר מוקדים של גוף המים המתוקים הנחקרים. שמירה על תנאי סביבה אספטיים נאותים בעת טיפול בדגימות כאלה יכולה למנוע זיהום. יתר על כן, כדי למנוע שינויים בהרכב …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מענקים כספיים מהמחלקה למדע וטכנולוגיה – קידום מחקר אוניברסיטאי ומצוינות מדעית (DST-PURSE) של אוניברסיטת מומבאי. דוויקה גדיגאונקר עבדה כעמיתת פרויקט במסגרת התוכנית. העזרה הטכנית שניתנה על ידי Harshali Shinde, עמית מחקר בכיר תחת המחלקה למדע וטכנולוגיה-מדע והנדסה מחקר המועצה למחקר (DST-SERB) פרויקט מספר: CRG/2018/003624, היא מוכרת.

Materials

100 bp DNA ladder Himedia MBT049-50LN For estimation of size of the amplicons
2x PCR Taq mastermix HiMedia MBT061-50R For making PCR reaction mixture
37 °C Incubator GS-192, Gayatri Scientific NA For incubation of bacteria
6x Gel Loading Buffer HiMedia ML015-1ML Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis
Agarose powder Himedia MB229-50G For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Ampicillin antibiotic disc HiMedia SD002 For performing AST
Autoclave Equitron NA Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies NA To check the quality and quantity of the amplified library
Bisafety B2 Cabinet IMSET IMSET BSC-Class II Type B2 Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc.
Cefotaxime antibiotic disc HiMedia SD295E-5VL For performing AST
Cefotaxime antibiotic powder HiMedia TC352-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Ceftriaxone antibiotic disc HiMedia SD065 For performing AST
Centrifuge Minispin Eppendorf Minispin Plus-5453 Used to pellet the debris during crude DNA preparation
Chloramphenicol antibiotic disc HiMedia SD006-5x50DS For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic disc HiMedia SD060-5x50DS For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic powder HiMedia TC447-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Colorimeter Quest NA For checking the OD of culture suspensions
Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/
Cooling Shaker Incubator BTL41 Allied Scientific NA For incubation of media plates for culturing bacteria
Deep Freezer (-40 °C)  Haier DW40L, Haier Biomedicals For storage of glycerol stocks
DNA Library Prep Kit NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NA Paired-end sequencing library preparation
EDTA HiMedia GRM1195-100G For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Electrophoresis Apparatus TechResource 15 cm gel casting tray For making the agarose gel  and carrying out electrophoresis 
Electrophoresis Power pack with electrodes Genei NA For running the AGE 
Erythromycin antibiotic disc HiMedia SD222-5VL For performing AST
Erythromycin antibiotic powder HiMedia CMS528-1G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Erythromycin antibiotic powder HiMedia TC024-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Escherichia coli ATCC 25922     HiMedia 0335X-1 Used as a control while performing AST
Ethidium Bromide HiMedia MB071-1G Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System
Fluorometer Qubit 2.0 NA For determining concentration of extracted metagenomic DNA
Gel Documentation System BioRad Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis
Gentamicin antibiotic disc HiMedia SD170-5x50DS For performing AST
Glacial Acetic Acid HiMedia AS119-500ML For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Glycerol HiMedia GRM1027-500ML For making glycerol stocks
Imipenem antibiotic disc HiMedia SD073 For performing AST
Kaiju Database NA NA For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/
Kanamycin antibiotic disc HiMedia SD017-5x50DS For performing AST
Kanamycin antibiotic powder HiMedia MB105-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Levofloxacin antibiotic disc HiMedia SD216-5VL For performing AST
Luria Bertani broth Himedia M1245-500G For enrichment of cultures
McFarland Standards Himedia R092-1No To compare density of culture suspension
Molecular Biology water HiMedia TCL018-500ML For making PCR reaction mixture
Mueller-Hinton Agar (MHA)  HiMedia M173-500G For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST)
Neomycin antibiotic disc HiMedia SD731-5x50DS For performing AST
PCR Gradient Thermal Cycler Eppendorf Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz  Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes
Primers  Xcelris NA For PCR amplication 
R2A Agar, Modified HiMedia M1743 For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load
Scaffold generation CLC Genomics Workbench 6.0 NA For generation of scaffolds
Sequencer Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) NA Sequencing of amplified library
Sodium Chloride  HiMedia TC046-500G For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample
Soil DNA isolation Kit Xcelgen NA For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample 
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 HiMedia 0365P Used as a control while performing AST
Taxonomical Classification Kaiju ioinformatics tool NA For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level 
The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) NA NA For functional annotation of ARGs
Tigecycline antibiotic disc HiMedia SD278 For performing AST
Trimethoprim antibiotic disc HiMedia SD039-5x50DS For performing AST
Tris base HiMedia TC072-500G For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Vancomycin antibiotic powder HiMedia CMS217 For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Weighing Balance Mettler Toledo ME204 Mettler Toledo Used for weighing media powders, reagent powders etc.
NA – Not Applicable

References

  1. Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
  2. Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
  3. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
  4. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
  5. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
  6. Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
  7. Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
  8. Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
  9. de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
  10. Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
  11. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022)
  12. Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
  13. Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
  14. Clinical and Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , (2015).
  15. Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , (2021).
  16. Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
  17. Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  18. Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
  19. Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
  20. Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
  21. Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
  22. Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
  23. Ciesielczuk, H. . Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , (2015).

Play Video

Cite This Article
Ghadigaonkar, D., Rath, A. Isolation and Identification of Waterborne Antibiotic-Resistant Bacteria and Molecular Characterization of their Antibiotic Resistance Genes. J. Vis. Exp. (193), e63934, doi:10.3791/63934 (2023).

View Video