Summary
Her presenterer vi en detaljert protokoll for isolering og identifisering av antibiotikaresistente bakterier fra vann og molekylær karakterisering av deres antibiotikaresistensgener (ARGs). Bruken av kulturbaserte og ikke-kulturbaserte (metagenomiske analyser) teknikker gir fullstendig informasjon om det totale bakterielle mangfoldet og det totale bassenget av forskjellige ARG-er som finnes i ferskvann fra Mumbai, India.
Abstract
Utviklingen og spredningen av antibiotikaresistens (AR) gjennom mikrobiota assosiert med ferskvannsforekomster er et stort globalt helseproblem. I denne studien ble ferskvannsprøver samlet inn og analysert med hensyn til det totale bakteriemangfoldet og AR-gener (ARG) ved hjelp av både konvensjonelle kulturbaserte teknikker og en kulturuavhengig metagenomisk tilnærming med høy gjennomstrømning. Denne artikkelen presenterer en systematisk protokoll for oppregning av de totale og antibiotikaresistente dyrkbare bakteriene fra ferskvannsprøver og bestemmelse av fenotypisk og genotypisk resistens i de dyrkbare isolatene. Videre rapporterer vi bruken av hele metagenomisk analyse av det totale metagenomiske DNA ekstrahert fra ferskvannsprøven for identifisering av det totale bakterielle mangfoldet, inkludert ikke-dyrkbare bakterier, og identifisering av det totale bassenget av forskjellige ARG-er (resistom) i vannkroppen. Etter disse detaljerte protokollene observerte vi en høy antibiotikaresistent bakteriebelastning i området 9,6 × 10 5-1,2 × 10 9 CFU/ml. De fleste isolatene var resistente mot de mange testede antibiotika, inkludert cefotaksim, ampicillin, levofloksacin, kloramfenikol, ceftriaxon, gentamicin, neomycin, trimetoprim og ciprofloxacin, med flere antibiotikaresistensindekser (MAR) på ≥0,2, noe som indikerer høye nivåer av resistens i isolatene. 16S rRNA-sekvenseringen identifiserte potensielle humane patogener, som Klebsiella pneumoniae, og opportunistiske bakterier, som Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp., og Aeromonas spp. Den molekylære karakteriseringen av isolatene viste tilstedeværelsen av forskjellige ARG-er, som blaTEM, blaCTX-M (β-laktamer), aadA, aac (6')-Ib (aminoglykosider) og dfr1 (trimetoprimer), som også ble bekreftet av hele metagenomisk DNA-analyse. En høy forekomst av andre ARG-er som koder for antibiotiske efflukspumper-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-laktamaser-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, kloramfenikol acetyltransferase-genet catB10 og rifampicinresistensgenet rphB-ble også påvist i metagenomisk DNA. Ved hjelp av protokollene som ble diskutert i denne studien, bekreftet vi tilstedeværelsen av vannbårne MAR-bakterier med forskjellige AR-fenotypiske og genotypiske egenskaper. Dermed kan hele metagenomisk DNA-analyse brukes som en komplementær teknikk til konvensjonelle kulturbaserte teknikker for å bestemme den generelle AR-statusen til en vannkropp.
Introduction
Antimikrobiell resistens (AMR) har blitt identifisert som et av de mest presserende globale problemene. Den raske utviklingen av AMR og dens verdensomspennende spredning er en av de største truslene mot menneskers helse og den globale økonomien når det gjelder helsekostnadene forbundet med den1. Overforbruk og misbruk av antibiotika har ført til en økning i AR. Dette har blitt fremhevet av COVID-19-pandemien, der behandlingen av tilknyttede sekundære infeksjoner i mange tilfeller ble enormt kompromittert på grunn av AMR hos de berørte pasientene2. Foruten direkte bruk / misbruk av antibiotika av mennesker, er overforbruk og misbruk av antibiotika i landbruk og husdyrhold og deres upassende utslipp i miljøet, inkludert vannforekomster, en stor bekymring3. Fremveksten av nye resistensegenskaper og multiresistens hos bakterier understreker behovet for en bedre forståelse av faktorene som fører til utvikling av AR og spredning av disse. Flere antibiotikaresistente bakterier, som ofte bærer flere AR-gener (ARG) på mobile genetiske elementer som plasmider, kan overføre disse resistensgenene til ikke-resistente mikroorganismer, inkludert potensielle humane patogener, og dermed føre til fremveksten av superbugs som ikke kan behandles med selv siste utvei antibiotika4. Disse flere antibiotikaresistente bakteriene, hvis de finnes i vannøkosystemer, kan direkte komme inn i menneskets tarm via forbruk av forurensede vannbaserte matvarer som fisk, krabber og bløtdyr. Tidligere studier har vist at spredningen av AR-bakterier i naturlig forekommende vannsystemer også kan nå andre vannforsyninger, inkludert drikkevann, og dermed kan komme inn i den menneskelige næringskjeden 5,6,7.
Målet med denne studien er å gi en omfattende protokoll ved hjelp av en kombinasjon av kulturbaserte og ikke-kulturbaserte (hele metagenomiske analyser) teknikker for å oppnå fullstendig informasjon om det totale bakterielle mangfoldet og det totale bassenget av forskjellige ARG-er som er tilstede i en vannkropp i Mumbai, India. Konvensjonelt har kulturbaserte teknikker blitt brukt til å studere bakteriemangfoldet i vannforekomster. Siden dyrkbare mikroorganismer bare utgjør en liten prosentandel av den totale mikrobiotaen i en hvilken som helst nisje, for å få en bedre forståelse av den generelle statusen for bakteriemangfold og de forskjellige resistente egenskapene som er utbredt i en prøve, må forskjellige kulturbaserte og kulturuavhengige teknikker brukes i tandem. En slik robust og pålitelig kulturuavhengig teknikk er hele metagenomisk DNA-analyse. Denne metoden med høy gjennomstrømning har blitt brukt med suksess i ulike studier av bakteriemangfold eller funksjonelle merknader fra forskjellige ARGs 8,9. Denne teknikken bruker metagenomet (det totale genetiske materialet i en prøve) som utgangsmateriale for ulike analyser og er derfor kulturuavhengig. Protokollene i denne studien kan brukes til fullmetagenomisk DNA-analyse for å få informasjon om det totale bakteriemangfoldet og ulike ARG-er (resistom) i vannprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøveinnsamling og behandling
- Eksempel på samling
- Samle riktig volum av vannprøven i steril prøvebeholder(e), slik at ikke mer enn 3/4 av beholderen er fylt.
- Transport prøvene til laboratoriet under aseptiske forhold så snart som mulig etter innsamling og umiddelbart behandle dem.
- Prøvebehandling
- Aseptisk filtrere vannprøven gjennom en steril musselin klut for å fjerne eventuelle svevestøv.
- Utfør passende serielle fortynninger av det filtrerte vannet for videre analyse.
2. Estimering av total bakteriebelastning og antall antibiotikaresistente bakterier
- Bestemmelse av total bakteriebelastning
- Suspender 18,12 g R2A agar, modifisert pulver i 1000 ml dobbeltdestillert vann, og oppløs blandingen ved oppvarming. Autoklav den oppløste blandingen ved 121 °C, 15 psi i 20 min. Klargjør R2A Agar, Modifiserte plater ved å helle riktig mengde av den autoklaverte blandingen i sterile petriplater (f.eks. tilsett ca. 20 ml autoklaveret sterilt medium til en 90 mm steril petriplate).
- Jevnt fordelt 100 μL av passende fortynninger av den filtrerte vannprøven på R2A Agar, Modifisert plate når mediet stivner. Utfør eksperimentet i duplikat.
- Inkuber alle de ovennevnte platene ved 35-37 °C i 48 timer (varier temperatur og inkubasjonstid avhengig av mediet som brukes til isolasjon).
- Uttrykke den totale bakteriebelastningen i form av kolonidannende enheter per milliliter (CFU / ml) ved hjelp av ligning (1):
(1)
- Bestemmelse av AR-bakterietallet
- Følg trinn 2.1.1-2.1.4. Men i stedet for R2A Agar, Modifiserte plater, bruk R2A Agar, Modifiserte plater supplert individuelt med fem forskjellige antibiotika, nemlig cefotaksim (3 μg / ml), ciprofloxacin (0,5 μg / ml), erytromycin (20 μg / ml), kanamycin (15 μg / ml) og vankomycin (3 μg / ml).
- Tilsett antibiotika separat i rør som inneholder 20 ml sterilt smeltet R2A Agar, Modifisert (med temperaturen på smeltet R2A Agar, Modifisert ved ≤40 °C) for å oppnå den endelige antibiotikakonsentrasjonen som nevnt i trinn 2.2.1.
- Virvle for jevn blanding og hell på sterile petriplater før agaren stivner. Utfør eksperimentet i duplikat.
- Inkuber alle de ovennevnte platene ved 35-37 °C i 48 timer (hvis du bruker et annet medium, kan temperaturen og inkubasjonstiden variere).
- For kvalitetskontroll og kontroll av effekten av antibiotika, spre 100 μL bakterielle suspensjoner av Escherichia coli ATCC 25922 og Staphylococcus aureus ATCC 29213-stammer på deres respektive antibiotikaholdige R2A Agar, Modifiserte plater (sørg for at tettheten av den friske kulturen som brukes til inokulasjonen er OD = 0,5 ved 600 nm).
- Bestem det antibiotikaresistente bakterietallet i form av CFU/ml som beskrevet i trinn 2.1.4.
- Glyserollagre av isolatene
- Velg morfologisk distinkte AR-kolonier.
- Suspender en enkelt isolert koloni i 2 ml steril Luria-Bertani-buljong som inneholder det respektive antibiotika (f.eks. Hvis en koloni ble valgt fra en plate som inneholder cefotaxim, inokuler kolonien fra trinn 2.3.1 i steril Luria-Bertani-buljong som inneholder cefotaksim ved dens respektive konsentrasjon).
- Inkuber de inokulerte rørene ved 37 °C ved 80 o/min til OD600 når 0,5.
- Klargjør glyserollagre av isolatene ved å blande 750 μL av kultursuspensjonen fra trinn 2.3.3 til 250 μL steril 100% glyserol under aseptiske forhold.
- Oppbevar glyserollagrene ved -80 ° C til videre analyse.
MERK: For gjenoppliving av kulturene fra glyserolbestandene, tine glyserollagrene ved 4 ° C. Inokulere en løkke av denne bestanden i 2 ml steril Luria-Bertani buljong som inneholder det respektive antibiotika og la vokse.
(1)3. Identifisering av dyrkbare bakterier ved 16S rRNA-gensekvensering
- Fremstilling av DNA-mal fra isolatene for PCR
MERK: Protokollen beskrevet for fremstilling av DNA-mal for PCR for isolering av rå DNA fra bakteriene er gitt av Carlson et al.10.- Bruk en steril tannpirker, ta en enkelt, isolert, ren koloni av isolatet som vokser på en petriplate. Suspender bakteriekolonien i 100 μL sterilt dobbeltdestillert vann i et sterilt mikrosentrifugerør og kok i 10 minutter.
- Sentrifuger suspensjonen ved 10 000 × g i 2 minutter for å pelletere ruskene, og overfør supernatanten til et friskt sterilt mikrosentrifugerrør for bruk som rå DNA-mal.
- Målrettet PCR-forsterkning av V3-regionen av 16S rRNA-genet og sekvensering
- Forbered 40 μL av reaksjonsblandingen i et PCR-rør for PCR-forsterkning, som nevnt i tabell 1.
MERK: DNA-preparatet skal utføres på en isblokk mens du minimerer sjansen for forurensning (bruk hansker under håndtering av reagensene, og rengjør arbeidsflaten grundig med 70% etanol). - Plasser røret i termisk blokk, og kjør riktig program i PCR termisk cycler. Se tabell 2 for de standardiserte PCR-syklusforholdene og primerinformasjonen for amplifisering av V3-regionene av 16S rRNA-gener.
- For å løse amplikonene og visualiseringen, utfør agarosegelelektroforese (AGE). Bland 10 μL av det forsterkede PCR-produktet og 2 μL 6x gelbelastningsbuffer (tabell 3), og legg denne blandingen i brønner på 1,5% agarosegel (oppløs 1,5 g agarosepulver i 100 ml 1x TAE-buffer [tabell 3]) som inneholder 5 μL av 10 mg / ml ethidiumbromid (EtBr) til en endelig konsentrasjon på 0,5 μg / ml EtBr i 100 ml av agarosegelen.
FORSIKTIG: EtBr er et kraftig kreftfremkallende stoff. Hansker skal brukes til enhver tid under håndtering av EtBr og geler som inneholder EtBr. - Legg til DNA-stige for estimering av størrelsen på amplikonene.
- Utfør elektroforese av gelen i en TAE-tankbuffer ved 80-100 V.
- Når sporingsfargestoffet kjører 3/4 av gelen, stopper du elektroforesen og visualiserer amplikonbåndene under en UV-transilluminator.
- Bruk PCR-produktet (amplicon) for 16S rRNA-gensekvensering for å identifisere isolatet.
- Kvantifiser amplikonet ved å utsette det for spektrofotometrisk analyse ved hjelp av ligning (2).
(2) - For å kontrollere DNA-ets renhet, beregn forholdet mellom A260/A280.
MERK: Ideelt sett bør dette tallet være over 1,5 og helst mellom 1,8 og 2,0. - For å identifisere isolatene, sammenlign sekvensene som er oppnådd med sekvensdatabaser ved hjelp av et passende justeringssøkeverktøy.
- Forbered 40 μL av reaksjonsblandingen i et PCR-rør for PCR-forsterkning, som nevnt i tabell 1.
(2)4. Påvisning av antibiotikaresistens i isolatene ved bruk av antibiotikafølsomhetstesting
MERK: Denne protokollen beskriver metoden for antibiotisk følsomhetstesting (AST) ved skivediffusjon. Følgende antibiotikaskiver ble brukt: cefotaksim (5 μg), ampicillin (10 μg), levofloksacin (5 μg), kloramfenikol (30 μg), tigecyklin (15 μg), ceftriaxon (30 μg), imipenem (10 μg), gentamicin (10 μg), neomycin (10 μg), trimetoprim (5 μg) og ciprofloxacin (5 μg).
- Fremstilling av inokulum for AST
- Aseptisk inokulere en enkelt, isolert, renset AR-koloni ved hjelp av en steril sløyfe i 2 ml av et sterilt ikke-selektivt medium, slik som Luria-Bertani buljong (uten antibiotika), og inkubere ved 37 ° C ved 80 o / min over natten.
- Resuspend ved å ta 100-150 μL av den dyrkede kulturen over natten (omtrent OD 600 = 1,8-2,0) i 2 ml fersk ikke-selektiv Luria-Bertani buljongmedium og inkubere i 2-4 timer (til OD600 når 0,4-0,5).
- Fortynn denne nydyrkede kultursuspensjonen ved bruk av steril 0,85% saltoppløsning slik at tettheten av kulturen er lik 0,5 McFarland-standarden (omtrent OD600 = 0,1), som omtrent tilsvarer 1-2 × 108 celler / ml.
- Bland bakteriesuspensjonen forsiktig for en jevn cellefordeling.
- Bruk suspensjonen ovenfor innen 15 minutter etter fortynning.
- Inokulering av agarplatene
- Forbered Mueller-Hinton Agar (MHA) plater for å utføre AST ved å blande 38 g MHA i 1000 ml dobbeltdestillert vann, og oppløs blandingen ved oppvarming. Autoklav den oppløste blandingen ved 121 °C, 15 psi i 15 min.
- Sørg for at dybden av MHA i platene er 4 mm (25 ml medium per plate).
- Fjern samtidig antibiotikaplatene fra fryseren og varm dem til romtemperatur.
MERK: Antibiotikaskivene bør tines gradvis ved først å tine skivene ved 4 °C og senere ved romtemperatur for å redusere potensiell fare for kondens på skivene, noe som senere kan påvirke inhiberingssonen (ZOI). - Under aseptiske forhold, dypp en steril bomullspinne i inokulumet tilberedt i trinn 4.1, og fjern overflødig suspensjon for å unngå overinokulering av platene.
- Spred kulturen jevnt på platene, fra toppen av MHA-platen og gå frem og tilbake fra kant til kant. Roter platen med 60° mens du svaier.
- Påføring av antibiotikaplatene
- Ved hjelp av flammesteriliserte tang overfører du aseptisk antibiotikaskivene til de inokulerte MHA-platene, og trykker forsiktig på platene for å sikre fullstendig nivåkontakt med agar.
MERK: Denne prosedyren må gjøres innen 15 minutter etter inokuleringen av kulturen på platene. - Plasser riktig antall antibiotikaskiver på agarplaten ved å ta hensyn til organismen, antibiotika som brukes og størrelsen på platen for å unngå overlapping av inhiberingssonene.
MERK: Fire til fem plater kan innkvarteres på en 90 mm sirkulær plate.
- Ved hjelp av flammesteriliserte tang overfører du aseptisk antibiotikaskivene til de inokulerte MHA-platene, og trykker forsiktig på platene for å sikre fullstendig nivåkontakt med agar.
- Inkubasjon av platene
- Innen 15 minutter etter påføring av antibiotikaskivene, snu platene og inkuber ved 37 °C over natten.
- Tolkning av resultatene
- Mål ZOI-diameteren i millimeter (mm), og tolk i henhold til bruddpunktverdiene gitt av EUCAST11. Se de to eksemplene nedenfor.
- Sonediameterbruddpunktet (mm) for en ciprofloksacinantibiotisk plate (5 μg) for Enterobacterales er S ≥ 25 og R < 22, noe som betyr at den anses å være følsom (S) hvis ZOI ≥ 25 mm, mens den er resistent (R) hvis ZOI < 22 mm. Hvis ZOI-diameteren faller mellom 22 og 25, anses isolatet å være mellomliggende (I).
- Bruddpunktet for sonediameter (mm) for en kloramfenikolantibiotisk plate (30 μg) for Staphylococcus spp. er S ≥ 18 og R < 18, noe som betyr at den anses å være følsom hvis ZOI ≥ 18 mm, mens den er motstandsdyktig hvis ZOI < 18 mm.
- Bestem indeksen for multippel antibiotikaresistens (MAR) ved å finne forholdet mellom antall antibiotika som isolatet er resistent mot det totale antallet antibiotika som isolatet er utsatt for.
MERK: For kvalitetskontroll, E. coli ATCC 25922 og S. Aureus ATCC 29213 brukes som referansestammer etter protokollen som i trinn 4.
- Mål ZOI-diameteren i millimeter (mm), og tolk i henhold til bruddpunktverdiene gitt av EUCAST11. Se de to eksemplene nedenfor.
5. PCR-basert påvisning av antibiotikaresistensgener i isolatene
- Bruk en standard PCR-protokoll for identifisering av ARG-er i isolatene. Klargjør DNA-malen ved hjelp av protokollen gitt i trinn 3.1.
MERK: PCR-syklusforholdene som ble brukt i denne studien var 94 °C i 10 minutter, etterfulgt av 35 sykluser på 94 °C i 30 s, glødning i 30 s ved riktig temperatur (som standardisert for hvert primersett), forlengelse ved 72 °C i 40 s, og en endelig forlengelse ved 72 °C i 5 minutter. Reaksjonsblandingen er beskrevet i tabell 4. Listen over ARG-er, primere og glødetemperaturer er gitt i tabell 5. - For å løse, visualisere og kontrollere renheten til amplikonene, følg trinn 3.2.3-3.2.10.
6. Hele metagenomisk DNA-analyse for identifisering av det totale bakterielle mangfoldet og påvisning av ARGs i metagenomet
- Ekstraksjon av totalt DNA (metagenom) fra vannprøven
- Trekk ut metagenomisk DNA fra de filtrerte vannprøvene.
MERK: I den nåværende studien ble det metagenomiske DNA (totalt DNA) ekstrahert fra de filtrerte vannprøvene ved hjelp av det refererte DNA-isolasjonssettet etter produsentens protokoll (se materialtabellen). - Kontroller kvaliteten på DNA ved å laste 3 μL av det ekstraherte metagenomiske DNA på en 0,8% agarosegel, og kjør gelen ved 80-110 V i ca. 30 minutter.
- Kontroller om det finnes et enkelt intakt bånd.
- Kontroller DNA-konsentrasjonen ved hjelp av et fluorometer.
- Trekk ut metagenomisk DNA fra de filtrerte vannprøvene.
- Bestemmelse av bakteriemangfold og påvisning av ARG ved bruk av metagenomisk DNA-sekvensering
- Bibliotekforberedelse og PCR-forsterkning:
- Forbered et parret sekvenseringsbibliotek ved hjelp av det refererte DNA-bibliotekets forberedelsessett (se materialtabellen).
- Klargjør DNA for adapterligering ved å ta 200 ng DNA og mekanisk skjære det i mindre fragmenter, etterfulgt av et kontinuerlig trinn med sluttreparasjon der en "A" legges til 3'-endene.
- Avhengig av plattformen som brukes til sekvensering, ligate spesifikke adaptere til begge ender av DNA-fragmentene.
MERK: Sekvenser som er avgjørende for å binde dobbeltstrekkodede biblioteker til en flytcelle for sekvensering, finnes i disse adapterne. Dette muliggjør PCR-forsterkning av de adapterligerte fragmentene og binding av standard sekvenseringsprimere. - For å sjekke kvaliteten og kvantiteten, analyser det forsterkede biblioteket ved hjelp av en høysensitiv DNA-brikke i henhold til produsentens instruksjoner.
- Klyngegenerering og sekvensering:
- Last det forsterkede biblioteket på riktig sekvenseringsplattform for klyngegenerering og påfølgende sekvensering.
MERK: Bibliotekmolekylene binder seg til de komplementære adapteroligoene på den sammenkoblede strømningscellen. Under sekvensering spaltes de fremre trådene selektivt etter resyntesen av den omvendte strengen. Denne kopierte omvendte strengen blir deretter sekvensert fra motsatt ende av fragmentet.
- Last det forsterkede biblioteket på riktig sekvenseringsplattform for klyngegenerering og påfølgende sekvensering.
- Bioinformatisk analyse:
- Generer stillaser fra data av høy kvalitet ved hjelp av riktig plattform.
- Underkaste disse stillasene bioinformatikkanalyse for taksonomisk klassifisering og identifisering av ARG-ene.
MERK: Arbeidsflyten for hele metagenomisk DNA-analyse for identifisering av det totale bakteriemangfoldet og påvisning av ARG i metagenomet er gitt i figur 1. Et flytskjema over den komplette metodikken beskrevet i manuskriptet er gitt i figur 2.
- Bibliotekforberedelse og PCR-forsterkning:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Total bakteriebelastning og antibiotikaresistente (AR) bakterietall
Oppregningen av den totale bakteriebelastningen ble utført ved å spre 10-4 til 10-6 ganger fortynninger av vannprøvene på R2A Agar, Modifisert medium. Ved opptelling av AR-bakterietallet ble 10−3 til 10−6 ganger fortynninger spredt på medieplater som inneholdt antibiotika (figur 3). Total- og AR-bakterietallet ble beregnet som CFU/ml, og alle pletteringsforsøkene ble utført i duplikat. Etter ovennevnte protokoller viste denne studien at det totale bakterietallet var 3,0 × 109 CFU/ml. AR-bakteriebelastningen ble funnet å være høy, i området 9,6 × 10 5-1,2 × 109 CFU/ml (tabell 6).
Identifisering av dyrkbare bakterier ved 16S rRNAgene-sekvensering
Rå DNA fra hvert isolat ble brukt som mal for å utføre 16S rRNA genspesifikk PCR. I de totalt 15 AR-isolatene som ble sekvensert, tilhørte 10 Enterobacteriaceae-familien, hvorav de fleste var Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae. Sjeldne opportunistiske bakterier som Comamonas spp. som tilhører familien Comamonadaceae, Micrococcus spp. og Arthrobacter spp. tilhører familien Micrococcaceae, og Aeromonas spp. tilhørende familien Aeromonadaceae ble også identifisert fra vannprøven (tabell 7).
Påvisning av antibiotikaresistens i de dyrkbare bakteriene ved bruk av antibiotisk følsomhetstesting
Antibiotikaresistensprofilen til de ovenfor identifiserte isolatene ble generert ved å utføre ASAT ved bruk av skivediffusjonsmetoden (figur 4). Av de 15 isolerte isolatene hadde 8 en MAR-indeks på ≥0,2, noe som indikerer en høy grad av resistens. Videre viste mange av isolatene koresistensprofiler (resistens mot samme sett antibiotika). Isolater som Comamonas spp. og Arthrobacter spp. viste imidlertid ikke resistens mot noen av de undersøkte antibiotika (tab 8).
Påvisning og identifisering av antibiotikaresistensgener i de dyrkbare bakteriene
Totalt 10 AR-isolater ble screenet for tilstedeværelse av ARG-er ved hjelp av PCR. Den mest utbredte ARG i de dyrkbare isolatene var blaTEM-koding for β-laktamase, etterfulgt av aminoglykosidresistensgenet aadA. Andre forsterkede ARG-er var blaCTX-M, dfr1 og aac(6')-Ib som ga resistens mot henholdsvis β-laktamer, trimetoprim og aminoglykosider. De representative resultatene av forsterkningen av ARG-ene er vist i figur 5. For de fleste av de identifiserte isolatene ble fenotypisk resistens (ASAT) bekreftet på molekylært nivå via PCR-basert genotypisk AR-profilering.
Identifisering av det totale bakteriemangfoldet i det metagenomiske DNA
For å kontrollere tilstedeværelsen av alle mulige bakterier (både dyrkbare og ikke-dyrkbare) og for å identifisere deres relative overflod, ble det utført en metagenomisk DNA-analyse for det totale bakterielle mangfoldet. Ved å bruke den neste generasjons sekvenseringsmetoden (HT-NGS) med høy gjennomstrømning, ble ~ 96,94% av de totale sekvensavlesningene oppnådd, noe som resulterte i høy dekning. Taksonomisk annotasjon ble utført for å klassifisere lesningene i ulike taksonomiske grupper fra fylum til slektsnivå (figur 6 og figur 7). Totalt 50 phyla kunne identifiseres i metagenomet, noe som indikerer det høye bakterielle mangfoldet i vannprøven. Proteobakterier var den mest dominerende phylum, bestående av alfaproteobakterier, betaproteobakterier og gammaproteobakterier. På ordensnivå var Burkholderiales den mest utbredte ordenen, som tilhørte Betaproteobacteria-klassen. Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium og Comamonas var noen av de mange slektene som ble funnet i vannprøven.
Påvisning av ARG fra metagenomisk DNA
For å forstå det totale bassenget av ARG-er i metagenomet til vannprøven, ble det utført hel metagenomisk sekvensering, etterfulgt av identifisering av ARG-er ved hjelp av passende bioinformatikkverktøy. Den metagenomiske tilnærmingen sikrer at ARG-ene som er tilstede i både dyrkbare og ikke-dyrkbare mikroorganismer i prøven, oppdages. En rekke gener som gir resistens mot β-laktamer (SMB-1, ampC1, VIM-20, ccrA, nmcR, ARL-1, blaZ); aminogylkosider (AAC(6')-34); kinoloner (qnrS6, qnrVC5); antibiotiske efflukspumper-motstand-nodulering-celledeling (RND) (evgA, mtrA, mdtA, acrD), ATP-bindende kassett (ABC) (oleC, macB, patA, bcrA) og stor tilrettelegger superfamilie (MFS) (abaQ); trimetoprimresistent dihydrofolatreduktase (dfrD, dfrA20); rifampin fosfotransferase (rphB); og kloramfenikol acetyltransferase (CAT) (catB10) ble påvist i metagenomet. ARG-ene som ble påvist via PCR i de dyrkbare isolatene (blaTEM, blaCTX-M, aadA, aac(6')-Ib, dfr1) ble også påvist ved hel metagenomisk sekvensering, og bekreftet dermed deres tilstedeværelse i vannprøven. De representative resultatene av ARG-ene identifisert i metagenomet ved hjelp av hele metagenomisk DNA-analyse er gitt i tabell 9.
Figur 1: Arbeidsflyt for hele metagenomisk DNA-analyse. Den trinnvise arbeidsflyten for identifisering av det totale bakterielle mangfoldet og påvisning av ARG-ene fra metagenomet presenteres. De samlede trinnene involverer metagenomisk DNA-forberedelse, forsterkning og identifikasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Flytskjema for komplett metodikk. Den trinnvise arbeidsflyten til metodikken som ble brukt i denne studien. En kombinasjon av både kulturbaserte og ikke-kulturbaserte teknikker brukes for å få fullstendig informasjon om bakteriemangfoldet og identiteten til ARG-ene som er tilstede i vannprøven. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilder av isolerte kolonier på antibiotikaholdige R2A Agar, modifiserte plater. Vannprøver belagt på cefotaksim (3 μg/ml)-holdige R2A agar, modifiserte plater. Prøven ble serielt fortynnet og belagt i duplikat-A1, A2: 10−4; B1, B2: 10−5; C1, C2: 10−6. Etter riktig inkubasjonsperiode var de isolerte koloniene synlige på platene B1, B2, C1 og C2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Antibiotisk følsomhetstest ved diskdiffusjonsmetode. Representative bilder av AST ved skivediffusjonsmetoden for et Escherichia coli-isolat . AST ble utført i duplikat-A1, A2: CTX, IPM, C, CIP; B1, B2: LE, TGC, AMP, GEN; C1, C2: TR, N, K, CTR. Diametrene til ZOIene ble målt i millimeter (mm). For å tolke om isolatet er resistent eller følsomt for antibiotika som brukes, ble ZOI sammenlignet med de nyeste EUCAST-tabellene. Forkortelser: AST = antibiotisk følsomhetstest; CTX = cefotaksim; IPM = imipenem; C = kloramfenikol; CIP = ciprofloxacin; LE = levofloxacin; TGC = tigecyklin; AMP = ampicillin; GEN = gentamicin; TR = trimetoprim; N = neomycin; K = kanamycin; CTR = ceftriaxon; ZOI = sone av inhibering; EUCAST = Den europeiske komité for testing av mottakelighet av antibiotika. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: PCR-amplifisering av antibiotikaresistensgener fra dyrkbare bakterier. Agarosegelelektroforese etter PCR ble utført for visualisering av forsterkede bånd for å kontrollere tilstedeværelsen av ARG-er i isolatene. Separerte bånd av PCR-amplikoner kan ses på gelen. Størrelsen på de enkelte PCR-amplikonene sammenlignes med en passende DNA-markør. Lane L1: 100 bp DNA stige; Baner 1-5: 1: DFR1 (425 BP); Kjørefelt 2: blaTEM (310 bp); Kjørefelt 3: blaCTX-M (500 bp); Bane 4: aac(6')-Ib ( 395 bp); Bane 5: aadA (624 bp). Forkortelse: ARGs = antibiotikaresistensgener. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Taksonomisk klassifikasjon for fylum- og klassetrinn . (A) Søylediagram som viser den taksonomiske overflodsfordelingen av bakteriemetagenomet i vannprøven. Totalt 50 bakterielle phyla ble identifisert ved metagenomisk analyse. De første 12 dominerende phyla av bakterier er vist. (B) Søylediagram som viser klassenivå taksonomisk overflodsfordeling av bakteriemetagenomet i vannprøven. Totalt 50 bakterieklasser ble identifisert ved metagenomisk analyse. De første 15 dominerende klassene av bakterier er vist. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Taksonomisk klassifikasjon for ordens- og slektsnivå . (A) Søylediagram som viser den taksonomiske mengdefordelingen av bakteriemetagenomet i vannprøven. Totalt 50 bakterieordrer ble identifisert ved den metagenomiske analysen. De første 14 dominerende ordrene av bakterier er vist i figuren. (B) Søylediagram som viser den taksonomiske overflodsfordelingen av bakteriemetagenomet i vannprøven. Totalt 50 bakterieslekter ble identifisert ved metagenomisk analyse. De første 15 dominerende bakterieslektene er vist er vist i figuren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| PCR-reagenser | Volum (μL) |
| 2x Taq Master Mix | 20 |
| Fremover primer (10 pico mol) | 1.5 |
| Omvendt primer (10 pico mol) | 1.5 |
| Rå DNA-mal | 1.5 |
| Sterilt molekylærbiologisk vann | 15.5 |
| Totalt volum | 40 |
Tabell 1: PCR mastermix bestanddeler. Reaksjonsblandingssammensetningen av forskjellige PCR-reagenser.
| Retning | Primer Sekvens 5 '- 3' | PCR-forhold | Antall sykluser |
| Fremover | GGAGGCAGCAGTAAGGAAT | 94 °C i 10 minutter | 1 |
| Denaturering ved 94 °C i 30 s | 35 | ||
| Annealing ved 50 °C i 30 s | |||
| Forlengelse ved 72 °C i 40 s | |||
| Omvendt | CTACCGGGGTATCTAATCC | Endelig forlengelse ved 72 °C i 5 min | 1 |
Tabell 2: PCR-syklusbetingelser for forsterkning av 16S rRNA-genet. PCR-syklusforholdene som kreves for 16S rRNA-genforsterkning er vist. Trinnene inkluderer et innledende denatureringstrinn, etterfulgt av 35 sykluser med denaturering, glødning og forlengelse, og et siste forlengelsestrinn.
| 6x lastegel | |
| Innhold | Kvantitet |
| Bromfenol blå | 25 mg |
| 85% glyserol | 7,06 ml |
| Milli-Q vann | 2,94 ml |
| Totalt volum | 10 ml |
| 50x Tris-acetate-EDTA (TAE) lager buffer sammensetning | |
| Innhold | Kvantitet |
| Tris-basen | 242 g i 700 ml dobbeltdestillert vann |
| Iseddik (GAA) | 57,1 ml |
| 0,5 m (EDTA) pH 8,0 | 100 ml |
| Juster pH til 8,5 og gjør opp volumet til 1000 ml med dobbelt destillert vann | |
| For 1x TAE: 20 ml 50x TAE buffer + 980 ml dobbeltdestillert vann | |
Tabell 3: Sammensetning av 6x gelbelastningsbuffer og 50x Tris-acetat-EDTA-lagerbuffer. 6x gelbelastningsbufferen blandes med prøven som skal kjøres på agarosegelelektroforese. Den inneholder bromfenolblått som sporingsfargestoff. Glyserol øker tettheten av prøven som lastes for riktig lasting i brønnene. Sammensetningen av de forskjellige reagensene som kreves for fremstilling av 50xTAE-lagerbufferen er også vist. TAE-buffer er en av de vanligste bufferne som brukes til AGE, og den opprettholder pH ved 8,5 og muliggjør migrering av forsterket DNA under AGE. Forkortelser: TAE = Tris-acetate-EDTA; ALDER = agarosegelelektroforese.
| PCR-reagenser | Volum (μL) |
| 2x Taq Master Mix | 5 |
| Fremover primer (10 pico mol) | 0.5 |
| Omvendt primer (10 pico mol) | 0.5 |
| Rå DNA-mal | 1.5 |
| Sterilt molekylærbiologi-grade vann | 2.5 |
| Totalt volum | 10 |
Tabell 4: PCR mastermix sammensetning for identifisering av ARGs. Reaksjonsblandingssammensetningen av forskjellige PCR-reagenser som kreves for å utføre PCR-eksperimentet.
| Sr. nr. | Målgen | Motstand mot | Grunning | Primer sekvens (5'-3') | Amplicon størrelse (bp) | Annealing temperatur (°C) | Referanser | ||||
| 1 | DFR En | Trimetoprim | Fremover | TGGTAGCTATATC GAAGAATGGAGT |
425 | 59 | Racewicz et al., 19 | ||||
| Omvendt | TATGTTAGAGGCG AAGTCTTGGGTA |
||||||||||
| 2 | blaTEM | β – laktamer | Fremover | GCACGAGTGGG TTACATCGA |
310 | 60 | Gebreyes, Thakur20 | ||||
| Omvendt | GGTCCTCCGAT CGTTGTCAG |
||||||||||
| 3 | blaCTX-M | β – laktamer | Fremover | CGATGGGACG ATGTCACTG |
500 | 52 | Li mfl. 21 | ||||
| Omvendt | CGGCTTTCTG CCTTAGGTT |
||||||||||
| 4 | aac(6')-Ib | Aminoglykosider | Fremover | TATGAGTGGC TAAATCGAT |
395 | 50 | Akers mfl. 22 | ||||
| Omvendt | CCCGCTTTCT CGTAGCA |
||||||||||
| 5 | AAD En | Aminoglykosider | Fremover | ACCGTAAGGC TTGATGAAACA |
624 | 58 | Ciesielczuk 23 | ||||
| Omvendt | GCCGACTACC TTGGTGATCTC |
||||||||||
Tabell 5: Primere for PCR av ARG i dyrkbare bakterier. De forskjellige ARG-ene som ble brukt i denne studien sammen med deres respektive primersekvenser, vises. Den forventede størrelsen på amplikonen er gitt i basepar. Glødetemperaturen til hvert primersett er også nevnt.
| Antibiotikum | Konsentrasjon av antibiotika (μg / ml) | CFU/ml |
| - | - | 3,0 x 109 |
| CTX | 3 | 4,5 x 107 |
| CIP | 0.5 | 3,2 x 108 |
| K | 15 | 9,6 x 105 |
| E | 20 | 1,6 x 108 |
| VA | 3 | 1,2 x 109 |
Tabell 6: Totalt antall og antibiotikaresistente bakterier. Fem antibiotika ble brukt til den første isoleringen av de antibiotikaresistente bakteriene fra vannprøven. De totale bakterietallene (uten antibiotika) og AR-bakterietallene presenteres i form av kolonidannende enheter per milliliter (CFU / ml). Forkortelser: AR = antibiotikaresistent; CFU = kolonidannende enheter; CTX = cefotaksim; CIP = ciprofloxacin; K = kanamycin; E = erytromycin; VA = vancomycin.
| Isolere kode | Mikroorganismer | Familie |
| 1 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 2 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 3 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 4 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 5 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 6 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 7 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 9 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 10 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 11 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 12 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 13 | Micrococcus spp. | Micrococcaceae |
| 14 | Arthrobacter spp. | Micrococcaceae |
| 15 | Aeromonas spp. | Aeromonadaceae |
Tabell 7: Identifisering av antibiotikaresistente isolater ved 16S rRNA-gensekvensering. Colony PCR ble utført for hvert isolat ved bruk av 16S rRNA genspesifikke primere. De oppnådde amplikonene ble deretter sekvensert og identifisert ved hjelp av passende bioinformatikkverktøy.
| Isoler nr. | Isolere | CTX | AMP | LE | C | TGC | CTR | IPM | GEN | N | ST | CIP | SKJEMME | MAR-indeks | ||
| 1 | Escherichia coli | 13R | 0R | 0R | 28S | 23S | 11R | 39S | 20-ÅRENE | 18S | 0R | 0R | 6 | 0.5 | ||
| 2 | Escherichia coli | 31S | 0R | 12R | 29S | 23S | 32S | 37S | 19S | 16S | 0R | 14R | 4 | 0.4 | ||
| 3 | Escherichia coli | 14R | 0R | 14R | 14R | 21S | 10R | 34S | 17S | 11R | 24S | 16R | 7 | 0.6 | ||
| 4 | Escherichia coli | 28S | 13R | 18R | 26S | 21S | 28S | 32S | 16R | 11R | 24S | 19R | 5 | 0.4 | ||
| 5 | Escherichia coli | 11R | 0R | 12R | 26S | 21S | 10R | 31S | 17S | 16S | 22S | 11R | 5 | 0.4 | ||
| 6 | Escherichia coli | 27S | 0R | 12R | 12R | 22S | 30-ÅRENE | 32S | 19S | 11R | 0R | 14R | 6 | 0.5 | ||
| 7 | Klebsiella pneumoniae | 28S | 0R | 17R | 27S | 22S | 30-ÅRENE | 32S | 18S | 22S | 0R | 16R | 4 | 0.4 | ||
| 8 | Klebsiella pneumoniae | 29S | 11R | 26S | 24S | 22S | 30-ÅRENE | 28S | 17S | 16S | 24S | 23S | 1 | 0.1 | ||
| 9 | Klebsiella pneumoniae | 29S | 13R | 25S | 24S | 22S | 28S | 29S | 18S | 17S | 24S | 25S | 1 | 0.1 | ||
| 10 | Klebsiella pneumoniae | 33S | 14S | 26S | 28S | 22S | 31S | 32S | 19S | 20-ÅRENE | 24S | 29S | 0 | 0 | ||
| 11 | Comamonas spp. | - | - | - | 23S | - | - | 37S | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 12 | Comamonas spp. | - | - | - | 27S | - | - | 42S | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 13 | Micrococcus spp. | 25S | 17R | 24S | 32S | 22S | 34S | 28S | 20-ÅRENE | - | 21S | 26S | 1 | 0.1 | ||
| 14 | Arthrobacter spp. | 45S | 57S | 28S | 26S | 34S | 27S | 39S | 26S | - | 28S | 28S | 0 | 0 | ||
| 15 | Aeromonas spp. | - | - | 20R | - | - | - | - | - | - | - | 20R | 2 | 1 | ||
Tabell 8: Antibiotikaresistensfenotype av bakterieisolatene analysert ved ASAT. Fenotypisk resistens i isolatene ble analysert ved hjelp av skivediffusjonsmetoden. Tallene indikerer ZOI i millimeter (mm). For MAR-indeksen indikerer tallene det totale antallet antibiotika som et isolat er resistent mot. Forkortelser: AST = antibiotisk følsomhetstest; CTX = cefotaksim; AMP = ampicillin; LE = levofloxacin; C = kloramfenikol; TGC = tigecyklin; CTR = ceftriaxon; IPM = imipenem; GEN = gentamicin; N = neomycin; TR = trimetoprim; CIP = ciprofloxacin; R = motstandsdyktig; S = følsom; MAR = multippel antibiotikaresistens; ZOI = sone av inhibering.
| AMR-GENFAMILIEN | GEN(ER) |
| SMB beta-laktamase | SMB-1 |
| ampC-type beta-laktamase | ampC1 |
| VIM beta-laktamase | VIM-20 |
| CcrA beta-laktamase | CCRA |
| NmcA beta-laktamase | nmcR |
| ARL Beta-laktamase | ARL-1 |
| blaZ beta-laktamase | blaZ |
| blaTEM beta-laktamase | blaTEM* |
| blaCTX beta-laktamase | blaCTX |
| AAC(6') | aac(6')-Ib, aac(6')-34 |
| MAUR(3'') | aadA |
| Protein med kinolonresistens (QNR) | qnrS6, qnrVC5 |
| resistens-nodulering-celledeling (RND) antibiotisk efflukspumpe | evgA, mtrA, mdtA, acrD |
| ATP-bindende kassett (ABC) antibiotisk efflukspumpe | oleC, macB, patA, bcrA |
| major facilitator superfamily (MFS) antibiotika effluks pumpe | abaQ |
| Trimetoprimresistent dihydrofolatreduktase DFR | dfr1, dfrD, dfrA20 |
| rifampin fosfotransferase | RFFB |
| Undecaprenyl pyrofosfat relaterte proteiner | bcrC |
| meticillinresistent PBP2 | mekD |
| vanJ membranprotein | vanj |
| tetracyklinresistent ribosomalt beskyttelsesprotein | tetT |
| kloramfenikol acetyltransferase (CAT) | catB10 |
| Erm 23S ribosomal RNA-metyltransferase | ERM(37) |
| glykopeptidresistensgenklynge | vanRB, vanRE, vanRD |
| MCR fosfoetanolamintransferase | McR-9 |
| sulfonamidresistent sul | Sul3 |
| *understrekede gener ble også påvist i de dyrkbare mikroorganismene | |
Tabell 9: ARGs identifisert ved hjelp av hele metagenomisk DNA-analyse. Det totale metagenomet til vannprøven ble brukt til fullmetagenomisk sekvensering, og de oppnådde sekvensene ble kommentert ved hjelp av den aktuelle ARG-databasen. De representative resultatene av noen av de viktige ARG-ene som er identifisert i det metagenomiske DNA, er vist. De understrekede genene ble også påvist i de dyrkbare mikroorganismene. Forkortelse: ARG = antibiotikaresistent gen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prøveinnsamlingen og behandlingen spiller en betydelig rolle og kan påvirke resultatene og tolkningen av studien. For å utelukke variasjon i prøvene er det derfor viktig å utføre prøvetaking på flere steder i ferskvannskroppen som studeres. Å opprettholde riktige aseptiske miljøforhold ved håndtering av slike prøver kan forhindre forurensning. Videre, for å forhindre endringer i bakteriesammensetningen som kan påvirke kvaliteten og mengden av ekstraherte nukleinsyrer, bør transittbetingelsene opprettholdes ved 4 ° C, med minimal tidsforløp fra prøvetakingstidspunktet til den påfølgende behandlingen. Flere studier har fremhevet at denne mellomperioden mellom prøveinnsamling og prosessering kan gi variable resultater i senere analysestadier hvis det ikke gjøres nøye12,13.
Ved å bruke en rekke fortynninger for plating sikrer man at koloniene verken klumper seg sammen eller er for få kolonier å telle. Å utføre forsøkene i duplikat er nødvendig for å ta hensyn til variasjoner i CFU/ml som kan oppstå på grunn av pipetterings-/håndteringsfeil. Videre opprettholdes kontrollplater for hvert eksperiment for å sikre at antibiotika som brukes fungerer effektivt og at falske positive resultater elimineres. Derfor bør kontrollplatene ikke ha noen synlig kolonivekst. Dette indikerer effekten av antibiotika som brukes.
Under AST kan inokulumkulturtettheten og tykkelsen på agarplaten påvirke ZOIs diameter og dermed tolkningen av resultatene. Derfor bør det tas hensyn til å holde disse to faktorene ensartede når du utfører AST-eksperimentene. Det mest kritiske aspektet er antall bakterieceller som er tilstede i inokulumet. Vanligvis brukes 1 × 10 8-2 × 108 CFU / ml celler som inokulum, som er lik 0,5 McFarland-standarden14. Denne konsentrasjonen av inokulum må holdes konstant for å unngå variasjon i resultatene. Enhver konsentrasjon som er høyere eller lavere enn den nødvendige konsentrasjonen, må fortynnes ved hjelp av steril saltvann og brukes umiddelbart til inokulering innen 15 minutter. Mens du sprer inokulumet på agarplatene, må det tas hensyn til å unngå for mye inokulum. Overflødig inokulum kan fjernes ved å trykke vattpinnen på sidene av bakteriesuspensjonsrøret før den inokuleres til MHA-platen. Eventuelle avvik fra standard AST-prosedyre kan påvirke dataene som er oppnådd fra slike protokoller11,15 betydelig. En tidligere studie viste at en MAR-indeksverdi på ≥0,2 indikerer høy motstand i isolatene16. Siden tolkningen av resultatene av AST er basert på ZOI, bør under-inokulasjon eller over-inokulasjon av kulturen unngås.
For PCR bør mastermixen tilberedes på en isblokk for å minimere sjansen for nedbrytning av ingrediensene og tap av aktivitet av enzymet. Bruk av hansker mens du setter opp reaksjonen minimerer sjansen for ekstern forurensning17. Spenningen under AGE bør ikke være for høy, da dette kan føre til oppvarmingseffekt og nedbrytning av de lastede prøvene. Å utføre AGE med optimal spenning sikrer at båndene er godt separert og er skarpe uten dra- eller flekkeffekter.
Studier utført de siste tiårene har vist bruk av 16S rRNA-genamplikonsekvensering for identifisering av forskjellige mikroorganismer. For 16S rRNA-gensekvensering kan valg av metode for ekstraksjon av mal-DNA forårsake skjevheter, noe som igjen kan påvirke nedstrømsanalysen. Gram-positive bakterier har en tykk peptidoglykancellevegg som kan gjøre det vanskelig å trekke ut nukleinsyren. Derfor bør valget av ekstraksjonsmetode være slik at den effektivt fanger alle typer mikrobielt DNA. Den tradisjonelle kokemetoden for å trekke ut rå mal-DNA er en slik effektiv metode for å trekke ut innholdet i cellen, og dermed redusere skjevheter i resultatene.
For å forstå det komplette bakterielle samfunnet i vannkroppen, ble high-throughput neste generasjons sekvensering (HT-NGS) teknikk brukt i denne studien. Hele metagenomisk DNA-analyse tillater studiet av hele metagenomet til en gitt prøve. Kulturbaserte teknikker gir hovedsakelig en aerob telling av bakteriebelastningen, noe som indikerer den mikrobiologiske kvaliteten til en prøve. Imidlertid utgjør dyrkbare mikroorganismer bare 1% av de totale mikroorganismer. Den gjenværende mikrofloraen, som består av et mangfoldig utvalg av arter, inkludert anaerober, er dårlig karakterisert og ofte ignorert. Disse mikroorganismene kan bære AR-egenskaper. Videre er kommensale mikroorganismer et reservoar av AR-gener som kan overføres til patogener via ulike genetiske utvekslingshendelser18. Mange av disse commensals er ikke-dyrkbare og kan studeres ved en metagenomisk tilnærming som involverer HT-NGS, noe som gir større dekning for identifisering av mangfoldig mikroflora i en hvilken som helst prøve. Ved hjelp av metagenomisk analyse ble det oppnådd en detaljert profil av bakteriell taxa, som supplerte de dyrkbare dataene. Videre kan slike komplementære tilnærminger gi en ide om den generelle AR-statusen til vannkroppen som studeres.
I denne studien, ved hjelp av en kombinasjon av både konvensjonelle kulturbaserte og ikke-kulturbaserte metagenomiske teknikker, var vi i stand til å identifisere det totale bakterielle mangfoldet, forskjellige antibiotikaresistente bakterier og det totale bassenget av vannbårne ARGs. Metoden beskrevet i denne studien kan replikeres og tilpasses for identifisering av AR-patogener i andre vannkilder - kystvann, naturlig vann og menneskeskapt drikkevann. Den kan også brukes til å spore overføring av vannbårne nosokomiale patogener og for å overvåke sykehusassosierte infeksjoner på sykehus og klinikkinnstillinger gjennom vannkilder som vasker, toaletter, badekar og luftfuktere. Dette vil hjelpe til med overvåking av AMR og identifisering av vannbaserte AMR-hotspots.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen motstridende interesser å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av økonomiske tilskudd fra Institutt for vitenskap og teknologi-fremme av universitetsforskning og vitenskapelig fortreffelighet (DST-PURSE) Scheme ved University of Mumbai. Devika Ghadigaonkar jobbet som prosjektstipendiat under ordningen. Den tekniske hjelpen fra Harshali Shinde, seniorforsker under Department of Science and Technology-Science and Engineering Research Board (DST-SERB) Prosjektnr: CRG/2018/003624, er anerkjent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA - Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. , Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022).
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- Bayot, M., Bragg, B.
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).
