Biorreactor de perfusión multiflujo integrado con fraccionamiento de salida para cultivo celular dinámico

Summary

Este artículo presenta un método para construir y operar un sistema de cultivo celular de perfusión multicanal de bajo costo para medir la dinámica de las tasas de secreción y absorción de solutos en procesos celulares. El sistema también puede exponer las células a perfiles de estímulo dinámicos.

Abstract

Ciertas funciones celulares y tisulares operan dentro de la escala de tiempo dinámica de minutos a horas que están mal resueltas por los sistemas de cultivo convencionales. Este trabajo ha desarrollado un sistema de biorreactor de perfusión de bajo costo que permite que el medio de cultivo se perfunda continuamente en un módulo de cultivo celular y se fraccione en un módulo aguas abajo para medir la dinámica a esta escala. El sistema está construido casi en su totalidad a partir de piezas disponibles comercialmente y se puede paralelizar para realizar experimentos independientes en placas de cultivo celular convencionales de múltiples pozos simultáneamente. Este artículo de vídeo muestra cómo ensamblar la configuración de la base, que requiere solo una bomba de jeringa multicanal y un colector de fracción modificado para perfundir hasta seis cultivos en paralelo. También se presentan variantes útiles en el diseño modular que permiten una dinámica de estimulación controlada, como pulsos de soluto o perfiles farmacocinéticos. Es importante destacar que, a medida que las señales de soluto viajan a través del sistema, se distorsionan debido a la dispersión de solutos. Además, se describe un método para medir las distribuciones de tiempo de residencia (RTD) de los componentes de la configuración de perfusión con un trazador utilizando MATLAB. Los RTD son útiles para calcular cómo las señales de soluto son distorsionadas por el flujo en el sistema multicompartimento. Este sistema es altamente robusto y reproducible, por lo que los investigadores básicos pueden adoptarlo fácilmente sin la necesidad de instalaciones de fabricación especializadas.

Introduction

Muchos procesos biológicos importantes ocurren en cultivos celulares y tisulares en la escala de tiempo de minutos a horas ^1,2,3. Si bien algunos de estos fenómenos pueden observarse y registrarse de manera automatizada utilizando microscopía de lapso de tiempo⁴, bioluminiscencia¹ u otros métodos, los experimentos que involucran la recolección de muestras de sobrenadantes de cultivo para análisis químico a menudo se realizan manualmente en cultivos celulares estáticos. El muestreo manual limita la viabilidad de ciertos estudios debido a la inconveniencia de los puntos de tiempo de muestreo frecuentes o fuera del horario laboral. Otras deficiencias de los métodos de cultivo estático incluyen experimentos que involucran exposiciones controladas y transitorias a estímulos químicos. En los cultivos estáticos, los estímulos deben agregarse y eliminarse manualmente, y los perfiles de estímulo se limitan a los cambios de paso a lo largo del tiempo, mientras que los cambios de medio también agregan y eliminan otros componentes del medio, que pueden afectar a las células de manera incontrolada⁵. Los sistemas fluídicos pueden superar estos desafíos, pero los dispositivos existentes plantean otros desafíos. Los dispositivos microfluídicos vienen con los costos prohibitivos de equipos especializados y capacitación para producir y usar, requieren métodos microanalíticos para procesar muestras y las células son difíciles de recuperar de los dispositivos después de la perfusión⁶. Se han creado pocos sistemas macrofluídicos para los tipos de experimentos descritos aquí 7,8,9,10, y están construidos con múltiples piezas personalizadas hechas internamente y requieren múltiples bombas o colectores de fracción. Además, los autores no tienen conocimiento de ningún sistema de cultivo de células de perfusión macrofluídica disponible comercialmente que no sean biorreactores de tanque agitado para cultivo en suspensión, que son útiles para la biofabricación, aunque no están diseñados para modelar y estudiar la fisiología.

Los autores informaron previamente sobre el diseño de un sistema de biorreactor de perfusión de bajo costo compuesto casi en su totalidad por partes¹¹ disponibles comercialmente. La versión base del sistema permite que múltiples cultivos en una placa de pozo se mantengan en una incubadora de CO₂ y se perfundan continuamente con el medio de una bomba de jeringa, mientras que las corrientes de medios de efluentes de los cultivos se fraccionan automáticamente en muestras a lo largo del tiempo utilizando un colector de fracción con una modificación personalizada. Por lo tanto, este sistema permite el muestreo automatizado del sobrenadante del medio de cultivo y la entrada continua de solutos a los cultivos a lo largo del tiempo. El sistema es macrofluídico y modular y se puede modificar fácilmente para satisfacer las necesidades de nuevos diseños de experimentos.

El objetivo general del método presentado aquí es construir, caracterizar y utilizar un sistema de cultivo celular de perfusión que permita experimentos en los que se midan las tasas de secreción o absorción de sustancias por parte de las células a lo largo del tiempo, y / o las células estén expuestas a señales de soluto precisas y transitorias. Este artículo en video explica cómo ensamblar la configuración de la base, que es capaz de perfundir hasta seis cultivos celulares simultáneamente utilizando una sola bomba de jeringa y un colector de fracción modificado. También se presentan dos variantes útiles en el sistema base que hacen uso de bombas y piezas adicionales para permitir experimentos que exponen a las células a señales transitorias de concentración de solutos, incluidos pulsos breves y perfiles farmacocinéticos¹², que se muestran en la Figura 1.

Figura 1: Tres variaciones en el diseño del sistema de perfusión. (Arriba) El sistema básico de perfusión. (Medio) El sistema de perfusión con una llave de paso para múltiples fuentes medias. (Abajo) El sistema de perfusión con un tanque agitado para imitar un volumen de distribución bien mezclado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Debido a la dispersión y difusión dentro del flujo, las señales de soluto se distorsionan o "manchan" a medida que viajan a través del sistema de flujo. Esta distorsión puede cuantificarse mediante el uso de distribuciones de tiempo de residencia (IDT)¹³. En este artículo se explica cómo realizar experimentos de trazador en componentes del sistema de perfusión (Figura 2) y se proporcionan scripts de MATLAB para generar RTD a partir de datos medidos. Una explicación detallada de este análisis se puede encontrar en el artículo anterior de los autores¹¹. Los scripts adicionales de MATLAB se ajustan a las funciones adecuadas a los RTD y extraen parámetros físicos, y realizan la convolución de la señal utilizando RTD para predecir cómo se propagará y distorsionará la entrada de señal de soluto por parte del usuario a través del sistema de perfusión¹⁴.

Figura 2: Distribuciones del tiempo de residencia. Los RTD de los componentes del sistema de flujo, como esta longitud de tubería, se miden introduciendo un pulso de trazador en el sistema y midiendo cómo se "mancha" en el momento en que sale a las fracciones recolectadas. Esta cifra ha sido modificada a partir de Erickson et ^al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Prepare las piezas para la perfusión de la placa del pozo

1. Preparar tubos
   1. Cortar dos longitudes de tubo de silicona (1,6 mm de diámetro interior) para cada cultivo celular a perfundir. Asegúrese de que la pieza utilizada como tubo aguas arriba sea lo suficientemente larga como para llegar desde la bomba de la jeringa hasta el cultivo celular dentro de la incubadora, y que la pieza aguas abajo pueda llegar desde el cultivo celular hasta la posición extendida más lejana del colector de fracción.
   2. Dale a cada pieza de tubo una etiqueta única en ambos extremos con cinta adhesiva.
2. Preparar tapones para la placa del pozo
   1. Obtenga un tapón de silicona para cada pozo de la placa del pozo a perfundir, con un diámetro apropiado para encajar cómodamente en los pozos con un sello hermético.
   2. Corte el exceso de material de los fondos del tapón para que encajen en los pozos mientras deja espacio en el interior para el aire por encima del nivel de líquido previsto.
   3. Empuje dos agujas romas de 18 G a través de cada tapón, hacia la parte superior y hacia afuera desde la parte inferior para servir como entrada y salida para el flujo a través del pozo, diametralmente opuestas entre sí para maximizar la distancia entre sus puntas dentro del pozo.
   4. Ajuste las alturas de las agujas dentro del pozo tapado, ya que la altura de la aguja de salida determinará la altura estable del nivel de líquido en el pozo durante la perfusión.
      NOTA: Si la perfusión se inicia con la aguja de salida por encima del nivel de líquido, entonces el líquido se acumulará en el pozo hasta que el nivel alcance la aguja. Si la perfusión se inicia con la aguja de salida por debajo del nivel de líquido, el nivel de líquido se mantendrá estable a menos que las burbujas de aire fluyan hacia el pozo, lo que hará que la altura del líquido disminuya hasta que tenga la misma altura que la aguja de salida.
3. Reunir piezas adicionales
   1. Obtenga una jeringa estéril para cada cultivo celular a perfundir que sea lo suficientemente grande como para contener suficiente medio para toda la perfusión, más una cantidad adicional de medio para llenar inicialmente el tubo.
   2. Para cada cultivo que se perfunda, obtenga un conector Luer de hembra a púa y dos de macho a púa, así como dos tapas Luer hembra y dos macho.
4. Limpiar y esterilizar piezas
   1. Si las piezas se han utilizado anteriormente, límpielas perfundiéndolas con 0.1 N NaOH, seguido de un enjuague con agua desionizada.
   2. Mediante autoclave o de otro modo, asegúrese de la esterilidad de todas las piezas enumeradas anteriormente.

2. Corte con láser el dispensador de múltiples cabezales y conéctelo a un colector de fracción

1. Vuelva a crear el modelo de dispensador multicabezal de la Figura 3 en un programa de diseño asistido por ordenador o descargue el archivo DXF de modelo proporcionado (Archivo suplementario 1).
2. Use un cortador láser para cortar el diseño de una lámina acrílica de 1/8.
3. Retire los tres tornillos que sujetan el cabezal dispensador a la base móvil del colector de fracción.
4. Alinee los tres orificios más pequeños del dispensador de varias cabezales con los orificios de los tornillos de la base móvil y vuelva a atornillar los tornillos a través de los orificios que desea conectar.
5. Ajuste la estanqueidad de los tres tornillos para inclinar el dispensador de múltiples cabezales hacia arriba y hacia abajo hasta que la fila de orificios de dispensación esté alineada con los tubos de recolección debajo de él.
6. Coloque cuidadosamente las puntas de pipeta de 300 μL a través de los orificios deseados para que sirvan como puntas dispensadoras.
   NOTA: El colector de fracción se puede utilizar sin el dispensador de múltiples cabezales para perfundir un cultivo de una sola célula.

3. Mida los RTD de los componentes y realice la convolución de la señal

1. Configure bombas y jeringas para el pulso del trazador como se muestra en la Figura 2.
   1. Obtenga dos bombas de jeringa de un solo canal o multicanal.
   2. Elija una solución de fondo para representar el medio que se utilizará en el sistema de flujo durante los experimentos de cultivo celular. Asegúrese de que la solución de fondo tenga propiedades de transferencia de masa similares a las del medio. En muchos casos, el agua desionizada es una opción apropiada.
   3. Elija una sustancia trazadora para representar el soluto que será de interés durante los experimentos de cultivo celular. Asegúrese de que el trazador tenga propiedades de transferencia de masa similares al soluto de interés, y su concentración debe poder medirse. En muchos casos, el colorante alimentario es una opción apropiada.
   4. Disuelva la sustancia trazadora en la solución de fondo para hacer la solución trazadora.
   5. Llene una jeringa con una solución de fondo y cárguela en una bomba de jeringa. Llene otra jeringa con solución trazadora y cárguela en la segunda bomba de jeringa.
   6. Conecte ambas jeringas a dos de los tres puertos de una llave de paso de cuatro vías mediante conectores Luer.
   7. Cierre la llave de paso a la solución de fondo y bombee la solución trazadora en la llave de paso hasta que comience a gotear el puerto abierto. Detenga la bomba y no ajuste más la jeringa.
      NOTA: Es importante que la barra móvil de la bomba de la jeringa se empuje hacia arriba contra los émbolos de la jeringa antes de que comiencen las partes cronometradas del experimento. Esto permitirá que el flujo comience inmediatamente cuando se inicie la bomba. De lo contrario, la bomba puede arrancarse, pero el flujo no comenzará realmente hasta que la barra móvil alcance la posición del émbolo.
   8. Cierre la llave de paso a la solución trazadora y bombee la solución de fondo a la llave de paso hasta que toda la solución trazadora residual se haya eliminado del puerto abierto. Detenga la bomba y no ajuste más la jeringa.
2. Configurar el componente de interés del sistema de flujo y el colector de fracciones
   1. Configure el componente del sistema de flujo deseado para el análisis RTD. Asegúrese de que el componente a medir termine con una pieza de tubo aguas abajo de longitud y flexibilidad adecuadas para llegar al colector de fracción durante la operación.
   2. Inserte el extremo del tubo aguas abajo en un dispensador de punta de pipeta en el dispensador de múltiples cabezales de modo que esté cómodamente conectado.
   3. Conecte el puerto abierto de la llave de paso de cuatro vías a la entrada del componente que se va a medir. Bombee la solución de fondo a través del componente hasta que se llene por completo como lo haría durante un experimento de cultivo celular, y comience a gotear fuera de la punta dispensadora del colector de fracción. Detenga la bomba.
3. Inyecte el pulso del trazador, recolecte fracciones y mida el trazador
   1. Ajuste la bomba para la solución trazadora al caudal deseado. Cierre la llave de paso a la solución de fondo e inicie el flujo de la solución trazadora. Al mismo tiempo, inicie el colector de fracciones.
   2. Continúe el flujo de la solución del trazador durante un corto período de tiempo para aproximarse a una entrada de impulso del trazador. Se encontró que una duración del pulso de 10 minutos funciona bien para rtD a una velocidad de flujo de 1 ml / h.
      NOTA: Si el pulso del trazador es demasiado breve, no entrará suficiente trazador en el flujo para ser medible. Si el pulso es demasiado largo, ya no se aproximará a un impulso y cambiará la forma del RTD.
   3. Al final del período de pulso de la solución trazadora, detenga la bomba de solución trazadora. Cierre rápidamente la llave de paso a la solución trazadora e inicie el flujo de la solución de fondo al mismo caudal.
   4. Permita que la solución de fondo fluya y que las fracciones se recolecten hasta que todo el trazador haya pasado a través del sistema y a las fracciones recolectadas.
   5. Detenga el sistema y mida la concentración del trazador en las fracciones. Solo incluye fracciones que fueron dispensadas por completo. Si la colección se detiene a mitad de camino a través de la colección de una fracción, no incluya esa fracción.
4. Calcular la distribución del tiempo de residencia (IDT) a partir de los datos medidos en MATLAB
   NOTA: Una explicación escrita del análisis realizado por este script de MATLAB se puede encontrar en la publicación anterior de los autores¹¹, y las discusiones de la teoría están ampliamente disponibles en la literatura¹³.
   1. Produzca un archivo .xlsx que contenga los datos de concentración en el formato de la hoja de cálculo example_tracer_data.xlsx proporcionada en el Archivo suplementario 2. Introduzca los valores de concentración del trazador en las fracciones (cualquier unidad) en orden cronológico de izquierda a derecha en la fila 2. Introduzca el tiempo transcurrido desde el inicio del pulso hasta el final de la última fracción en la celda A5, e introduzca la longitud del pulso trazador en minutos en la celda A8.
   2. Guarde el archivo .xlsx en el directorio de MATLAB.
   3. Abra el script RTD_From_Data.m, desde el archivo complementario 3, en el editor de MATLAB.
   4. Reemplace el nombre del archivo de .xlsx entre paréntesis en la primera línea de la sección Cargar datos del script por el nombre del nuevo archivo de datos de .xlsx, siguiendo las instrucciones escritas en el archivo de script. Ejecute el script.
   5. Asegúrese de que el script realiza correctamente el análisis RTD¹³, produciendo una gráfica del RTD y devolviendo el valor de la integral numérica sobre la RTD igual a 1. Busque el vector de tiempo (t) y el vector de valores RTD asociado (Et) guardados por el script en el directorio de MATLAB.
5. Ajuste de una función de modelo al RTD en MATLAB
   1. Abra el script Fit_RTD_Function.m en el editor de MATLAB desde el archivo complementario 4.
   2. Elija una de las tres funciones de modelo comentadas para adaptarse al RTD: el modelo de dispersión axial¹³, que se ajusta a los RTD para el flujo laminar en tubos cilíndricos; el modelo^{CSTR 13}, que se adapta a tanques bien agitados; y el modelo n-CSTR¹⁵, que se adapta aproximadamente a placas de pozo más grandes. Para adaptarse a otro modelo no incluido aquí, agréguelo al script en el mismo formato.
   3. Quite los comentarios de la sección del script que contiene el modelo elegido para la adaptación.
   4. Cambie los valores de las conjeturas iniciales para los parámetros a los apropiados para el RTD.
   5. Ejecute el script para producir un gráfico de la función de ajuste superpuesta en los datos RTD e imprimir los valores de los parámetros de ajuste para la función. Si el ajuste es muy deficiente o se producen errores, cambie las conjeturas iniciales del parámetro y vuelva a ejecutar el script.
6. Realizar la convolución de la señal en MATLAB
   1. Elija una señal y un RTD o dos RTD para convolver.
   2. Abra el script Signal_Convolution.m, desde el archivo suplementario 5, en el editor de MATLAB.
   3. Para cada una de las dos señales a contornear (es decir, una señal y una RTD, o dos RTD), defina un vector de puntos de tiempo espaciados uniformemente en las unidades deseadas y un vector correspondiente de valores de señal en esos momentos.
      NOTA: Los vectores de las dos señales deben tener el mismo número de elementos y los mismos pasos de tiempo de tamaño. Es por eso que es útil tener el RTD como una función continua que se puede muestrear para un número arbitrario de puntos en cualquier intervalo de tiempo.
   4. Introduzca las dos señales en MATLAB y ejecute el script para obtener los vectores de tiempo y señal de la señal de salida.

4. Configure el sistema básico de perfusión con células en una placa de pozo

1. Preparar el plato del pozo
   1. Asegúrese de que el cultivo de la placa del pozo tenga la profundidad media adecuada para el experimento de perfusión. Realice cualquier cambio final de medio, estimulación u otros pasos según lo desee antes de comenzar la perfusión. Si se están perfundiendo células de suspensión, centrífuga la placa para asegurarse de que estén en la parte inferior.
   2. En condiciones estériles, inserte los tapones con agujas en los cultivos de la placa del pozo con las agujas levantadas. Después de que el tapón esté en su lugar, baje las agujas a la altura deseada para la perfusión, ya que la altura de la aguja de salida determina el nivel estable de líquido.
   3. Tapa las agujas con tapas Luer macho y mantén toda la placa del pozo en una incubadora hasta su uso.
2. Preparar las jeringas y los tubos aguas arriba
   1. En condiciones estériles, llene una jeringa para cada cultivo que se perfunda con suficiente medio para la duración deseada de la perfusión, más suficiente medio adicional para llenar el tubo aguas arriba.
   2. Conecte el tubo aguas arriba a la jeringa utilizando un conector Luer de hembra a púa. En el otro extremo del tubo, inserte un conector Luer macho a púa.
   3. Dispense el medio de la jeringa hasta que el tubo aguas arriba esté completamente lleno de medio.
   4. Tapa el extremo abierto del tubo con una gorra Luer hembra.
      NOTA: Todas las jeringas replicadas deben tener exactamente el mismo volumen en este punto. Si sus volúmenes no son iguales, sus émbolos estarán en diferentes posiciones y no todos encajarán bien en una sola bomba de jeringa multicanal.
3. En condiciones estériles, inserte un conector Luer macho a púa en un extremo del tubo aguas abajo y cúbralo con una tapa Luer hembra.
4. Lleve cuidadosamente todos los tubos preparados, las jeringas y la placa del pozo a la incubadora que se utilizará para la perfusión.
5. Coloque la bomba de jeringa y el colector de fracción en los lugares deseados cerca de la incubadora. Coloque la bomba de jeringa encima o cerca de la incubadora, y coloque el colector de fracción al lado de la incubadora, cerca del puerto.
6. Agrupe los extremos tapados de todos los tubos aguas arriba y aguas abajo y empuje desde el exterior de la incubadora hacia el interior a través del puerto.
7. Cargue las jeringas en la bomba de la jeringa e inserte los extremos abiertos de los tubos aguas abajo en las puntas de la pipeta dispensadora del dispensador de múltiples cabezales del colector de fracciones.
8. Dentro de la incubadora, tire de la mayor cantidad posible de holgura de los tubos aguas arriba en la incubadora para maximizar la longitud del tubo a través del cual el medio que fluye puede recibir calor y CO2 del aire de la incubadora. Mientras los mantiene en su lugar, saque los tubos aguas abajo de la incubadora, lo suficiente para que puedan alcanzar el punto extendido más lejano en el colector de fracciones mientras mantienen los extremos tapados dentro de la incubadora.
9. Para cada pozo enchufado, destapar rápidamente las agujas y los tubos aguas arriba y aguas abajo para ese pozo y conectarlos junto con sus conectores Luer.
10. Una vez que todas las piezas estén conectadas, haga funcionar brevemente la bomba de la jeringa a una velocidad relativamente alta para asegurarse de que todas las corrientes fluyan correctamente.
11. En este punto, si se desea comenzar el experimento con los tubos aguas abajo llenos del medio, continúe haciendo funcionar la bomba hasta que todos estén llenos. De lo contrario, detenga la bomba.
12. Ajuste el caudal de la bomba de jeringa y la frecuencia de recolección de fracciones y arranque ambas máquinas simultáneamente para comenzar el experimento. Recolectar fracciones para la duración deseada del experimento.

5. Configure el sistema de perfusión con una llave de paso para múltiples fuentes de medios

1. Realice todos los subpasos del paso 4.1 anterior.
2. Preparar los dos medios a utilizar en la perfusión, etiquetando el medio que se dispensará primero como 1, y el otro como medio 2.
3. Para cada cultivo que se perfunda, llene una jeringa con suficiente medio 1 durante la duración de su dispensación, más suficiente volumen para llenar inicialmente el sistema de perfusión. Llene una segunda jeringa con suficiente medio 2 durante la duración de su dispensación.
4. Conecte ambas jeringas a dos de los tres puertos de una llave de paso de cuatro vías.
   NOTA: Es posible que se requiera una longitud de tubo para conectar las jeringas a las llaves de paso.
5. Prepare la llave de paso y las jeringas de manera similar a los pasos 3.1.7-3.1.8 anteriores cerrando la llave de paso al medio 1 y dispensando el medio 2 en la llave de paso hasta que comience a gotear por el puerto abierto.
6. Cierre la llave de paso al medio 2 y dispense el medio 1 en la llave de paso hasta que todo el medio residual 2 haya sido expulsado del puerto abierto.
7. Conecte el tubo aguas arriba al puerto de llave de paso abierto mediante un conector Luer de hembra a púa. En el otro extremo del tubo, inserte un conector Luer macho a púa.
8. Dispense el medio 1 de la jeringa hasta que el tubo aguas arriba esté completamente lleno de medio.
9. Continúe con los pasos 4.3-4.11 anteriores, cargando ambas jeringas en bombas de jeringa separadas y solo dispensando el medio 1.
10. Ajuste el caudal de la bomba de jeringa para el medio 1 y la frecuencia de recolección de fracciones, y encienda ambas máquinas simultáneamente para comenzar el experimento.
11. Cuando se vaya a cambiar la fuente del medio, detenga rápidamente la bomba de la jeringa para el medio 1, gire la llave de paso cerrada al medio 1 y encienda la bomba de la jeringa para el medio 2. Si lo desea más adelante, vuelva a cambiar la fuente al medio 1 de manera similar.
12. Recolectar fracciones para la duración deseada del experimento.

6. Configure el sistema de perfusión con un tanque agitado para imitar la farmacocinética

1. Obtener datos farmacocinéticos para el fármaco de interés y asegurarse de que consiste en un pico de concentración seguido de un decaimiento exponencial.
2. Después de establecer el pico en la hora 0 y eliminar los puntos de datos antes del pico, use el script Stirred_Tank_Fit.m (Archivo suplementario 6) para ajustar la ecuación RTD del tanque agitado a los datos. Entrada v (el caudal de perfusión deseado) y los datos que se ajustarán como un par de vectores directamente en el script, junto con t y C para los valores de tiempo y los valores de concentración, respectivamente. Ejecute el script para imprimir el parámetro V, que es el volumen de tanque agitado requerido.
3. Planifique un diseño para el sistema de perfusión que incluya dos bombas de jeringa y un agitador de placas aguas arriba de la incubadora.
4. Mida los RTD de los componentes del sistema de perfusión más allá de la llave de paso y realice la convolución de la señal de los RTD con varias duraciones y concentraciones de pulsos de fármacos para encontrar un perfil farmacocinético adecuado. Utilice la ecuación RTD del tanque agitado de ajuste en este cálculo.
5. Continúe con los pasos 5.1-5.8 anteriores.
6. Use una placa de pozo adicional del tamaño apropiado como el tanque agitado para la configuración. Cada pozo puede servir como un tanque agitado para un cultivo perfundido. Llene el pozo con el volumen requerido de medio, V, y tapone el pozo con las agujas inicialmente levantadas, luego empujado al fondo del pozo y tapone las agujas.
7. Cargue las jeringas en las bombas de jeringa y conecte rápidamente el tubo de las jeringas a las agujas de entrada tapadas de los tanques agitados. A continuación, conecte las entradas del tubo aguas arriba del cultivo celular a las agujas de salida de los tanques agitados.
8. Continúe con los pasos 5.9-5.10.
9. En el momento deseado, cambie al medio dispensador 2 que contiene el medicamento, como se describe en el paso 5.11. Vuelva al medio 1 cuando se complete la infusión del medicamento.
10. Continúe con el paso 5.12.

Figura 3: El dispensador multicabezal. Diseño para el dispensador multicabezal cortado con láser. Esta cifra ha sido modificada a partir de Erickson et ^al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

El sistema de perfusión con múltiples fuentes de medios de la sección 5 del protocolo se utilizó para medir la dinámica de expresión de un gen reportero impulsado por el factor de transcripción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-κB) del factor de necrosis tumoral activado del factor de necrosis tumoral de 1,5 h (TNF-α). Las células HEK293 se transdujeron de manera estable utilizando vectores lentivirales con una construcción genética que contenía Gaussia luciferasa (GLuc), impulsada por un promotor llamado NFKB que contenía el elemento de respuesta NF-κB para crear células NFKB-GLuc HEK293, que se clasificaron a través de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para aislar las células transducidas. Las células clasificadas se criopreservaron hasta su uso.

Para cada cultivo perfundido, la configuración de perfusión incluyó una sección aguas arriba de 1 m de tubería que conduce a una placa tapada de 48 pocillos que contiene las células, seguida de 1 m de tubería aguas abajo que conduce al colector de fracción de múltiples cabezales, con un caudal de 0,5 ml / h (0,0083 ml / min). Los RTD del tubo de 1 m solo y de la configuración completa (tubo de 1 m + placa de 48 pocillos + tubo de 1 m) se midieron utilizando un caudal de 0,5 ml / h con un pulso de trazador de 20 minutos. La solución de fondo fue agua desionizada, con una solución trazadora de colorante alimentario azul diluido en agua desionizada, y se recolectaron fracciones a una velocidad de 1 fracción / h utilizando el dispensador de múltiples cabezales. Las concentraciones de trazadores en muestras de 100 μL de las fracciones se midieron en un lector de placas mediante absorbancia a 628 nm.

Los datos de concentración del trazador se procesaron en MATLAB para producir RTD para ambas configuraciones. Primero, los RTD de las dos configuraciones se calcularon a partir de los datos utilizando el script RTD_from_Data.m. Los puntos de datos RTD del tubo de 1 m y la configuración completa se muestran en la Figura 4.

Figura 4: Distribuciones de tiempo de residencia. (Izquierda) RTD para un tubo de 1 m a un caudal de 0,5 mL/h (0,0083 mL/min). (Derecha) RTD de la configuración de perfusión completa (tubo de 1 m + placa de 48 pocillos + tubo de 1 m) a un caudal de 0,5 ml / h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La IDT de los tubos solos se ajusta bien a la función de dispersión axial, lo que es de esperar según la literatura existente¹³. Múltiples piezas de tubos en serie también se ajustan bien por un solo modelo de dispersión axial, y agregar la placa de 48 pocillos en línea causa una desviación insignificante de este modelo, por lo que se esperaba que el tubo de 1 m solo y la configuración de tubo de 1 m + placa de 48 pocillos + tubo de 1 m estuvieran bien ajustados por un modelo de dispersión axial. Es común que se produzcan ajustes de modelo deficientes cuando las conjeturas iniciales para los parámetros del modelo están demasiado lejos de sus valores reales. Para demostrar esto, primero, el modelo de dispersión axial se ajustó a los datos del tubo de 1 m utilizando el script Fit_RTD_Function.m, utilizando Pe = 10 y tau = 30 min como las conjeturas iniciales para los parámetros de la función. La Figura 5 muestra que estas conjeturas dieron lugar a modelos de ajuste deficientes, trazados junto con los datos de IDT. Las conjeturas se cambiaron a Pe = 10 y tau = 300 min, lo que resultó en los buenos ajustes del modelo que se muestran en la Figura 5, ya que tau debe ser aproximadamente igual al volumen del sistema de perfusión dividido por su caudal volumétrico. Los parámetros de ajuste para el tubo de 1 m son Pe = 154.3, tau = 317.2 min, mientras que los parámetros para todo el sistema son Pe = 396.5, tau = 596.5 min.

Figura 5: Ejemplos de modelos buenos y malos que se ajustan a una IDT. Se ajustó un modelo de dispersión axial a los datos de IDT para un tubo de 1 m a un caudal de 0,5 ml/h (0,0083 ml/min). (Izquierda) Las conjeturas iniciales para la entrada de parámetros del modelo en el script de MATLAB estaban demasiado lejos de sus valores reales, lo que provocó que el script devolviera un ajuste de modelo deficiente. (Derecha) Se introdujeron mejores valores de parámetros en el script, lo que resultó en un buen ajuste del modelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La convolución de la señal se realizó utilizando estas funciones RTD de ajuste en el script Signal_Convolution.m para predecir cómo se propagaría a través del sistema un pulso de medio de 1,5 h que contenía 10 ng / ml de TNF-α en la entrada de la tubería aguas arriba. La señal de entrada se conplicó primero con el RTD de tubo de 1 m para determinar qué señal de TNF-α entraría en la placa del pozo. La señal de entrada también se conplicó con el RTD del tubo de 1 m + placa de 48 pocillos + tubo de 1 m para determinar cuál sería la señal TNF-α a la salida del sistema en las fracciones recogidas, donde aparecerá junto con la respuesta GLuc correspondiente de las células. La Figura 6 muestra la señal de pulso TNF- α de entrada se muestra junto con las señales predichas en la entrada del pozo y en la salida del sistema.

Figura 6: Predicción de señales de concentración de TNF-α en el sistema de perfusión. El medio que contiene TNF-α se infundió en el sistema de perfusión a 10 ng/mL durante los primeros 90 min de operación, representado por la señal rectangular azul. (Izquierda) Al hacer girar la señal de entrada con el modelo de dispersión axial de ajuste del RTD de tubo de 1 m, se predijo la señal de concentración de TNF-α en la entrada a la placa de 48 pocillos. (Derecha) Del mismo modo, utilizando el modelo RTD para todo el sistema, se predijo la señal TNF-α en la salida del sistema. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las células NFKB-GLuc HEK293 se descongelaron y se enchaparon en una placa de 48 pocillos a 1 x 10⁴ células/pozo en 0,4 mL del Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), y se incubaron durante 1 día a 37 °C con 5% de CO₂, después de lo cual se siguieron los pasos de la sección 5 del protocolo anterior para configurar el sistema de perfusión con una llave de paso para múltiples fuentes de medios. Se instalaron cuatro arroyos para perfundir cuatro pozos. Se cargó una bomba de jeringa multicanal con cuatro jeringas completas de 60 ml que contenían DMEM como medio 1. Una segunda bomba de jeringa se cargó con jeringas de 5 ml que contenían medio 2, dos de las cuales contenían DMEM simple como control, y dos contenían DMEM con 10 ng / ml de TNF-α como estímulo. Al comienzo del experimento, las jeringas de 5 ml que contenían TNF-α o el medio de control se dispensaron a 0,5 ml/h durante 1,5 h, después de lo cual se cambiaron las llaves de paso y se dispensaron las jeringas de 60 ml que contenían DMEM durante las siguientes 40 h. A las 24 h y al final de la perfusión, las fracciones de las cuatro corrientes, que se dispensaron en tubos de microcentrífuga, se etiquetaron y congelaron a -80 °C, y se restableció el colector de fracciones.

Después de la perfusión, todas las muestras se descongelaron y se midieron sus concentraciones de GLuc mediante un ensayo de bioluminiscencia, descrito previamente^11,16. Los valores de luminiscencia se convirtieron a tasas de luminiscencia/h dividiendo la luminiscencia de cada muestra de fracción por la duración temporal de esa fracción, y se trazaron como una serie temporal para cada una de las cuatro corrientes. El tiempo de cada medición de GLuc fue el punto medio del intervalo de tiempo durante el cual se recolectó esa fracción, menos el tiempo medio de residencia (tau = 317 min) del tubo aguas abajo del sistema de perfusión. La señal TNF-α que se predijo que estaría contenida dentro de las fracciones también se desplazó en el tiempo por el tiempo medio de residencia del tubo aguas abajo y se superpuso a los datos de GLuc, revelando la dinámica de estímulo-respuesta NF-κB impulsada por la expresión génica, que se muestra en la Figura 7.

Figura 7: Dinámica estímulo-respuesta medida mediante el sistema de perfusión. Se utilizó el sistema de perfusión con dos fuentes de medios para exponer transitoriamente dos cultivos celulares a un pulso de TNF-α con dos cultivos no expuestos como controles. Las células HEK293 fueron diseñadas para secretar GLuc impulsado por un promotor que contiene el elemento de respuesta NF-κB, que se recolectó en las fracciones de efluentes. El experimento revela un aumento dramático de la expresión impulsado por NF-κB después de la exposición al TNF-α. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La presencia de GLuc acumulado en los cultivos al comienzo de la perfusión causó la caída aparente en la señal de GLuc de la primera a la segunda fracción en las cuatro curvas. Este artefacto común se puede evitar en el sistema de perfusión cambiando el medio en los cultivos inmediatamente antes de comenzar las perfusiones. Los dos cultivos de control que no recibieron TNF-α mantuvieron una baja tasa de secreción de GLuc que aumentó gradualmente durante la duración del experimento. Este resultado puede reflejar el crecimiento de la población celular. Los cultivos estimulados inicialmente tenían la misma tasa de secreción de GLuc que los controles y luego aumentaron dramáticamente la secreción a medida que la expresión impulsada por NF-κB se activa en respuesta a un pulso de α TNF. La secreción de GLuc alcanza su punto máximo aproximadamente 9 h después de la primera llegada del TNF-α, después de lo cual disminuye con una desintegración exponencial.

Archivo suplementario 1: Archivo CAD: Multi-head_Dispenser.DFX: Este archivo contiene el modelo para el dispensador de cabezal múltiple que se puede cortar con láser y utilizar para modificar los colectores de fracción. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente complementario 2: example_tracer_data.xlsx. Contiene datos de experimentos de trazador de ejemplo para que los lea el script matlab de RTD_from_Data.m. También se puede utilizar como plantilla para nuevos datos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Archivo MATLAB: RTD_from_Data.m. Este script lee los datos del experimento del trazador de un archivo .xlsx y devuelve los vectores t y Et que representan el RTD. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: Archivo MATLAB: Fit_RTD_Function.m. Este script carga vectores RTD desde el script RTD_from_Data.m y devuelve un modelo ajustado para el RTD. El tipo de modelo es elegido por el usuario. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 5: Archivo MATLAB: Signal_Convolution.m. Este script toma una señal de soluto definida por el usuario y un RTD como entradas y predice cómo se cambiará la señal después de pasar por el sistema de flujo con ese RTD. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 6: Archivo MATLAB: Stirred_Tank_Fit.m. Este script ajusta una curva CSTR RTD a la entrada de datos farmacocinéticos por parte del usuario y devuelve el volumen del tanque requerido para producir el RTD para el caudal dado. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Este trabajo describe el ensamblaje y operación de un sistema de cultivo celular de perfusión con múltiples fuentes de medios demostradas con un ejemplo específico en el que se midió la dinámica de la expresión génica impulsada por NF-κB en respuesta a un pulso transitorio de TNF-α. Se midieron y modelaron los RTD de los componentes del sistema de perfusión, y se utilizó la convolución de la señal para predecir tanto la exposición de las células al pulso TNF-α como la distribución TNF-α en las fracciones medias del efluente recogidas. Las células se expusieron al pulso y las fracciones se recolectaron durante 40 h, después de lo cual el GLuc se midió en las fracciones y se trazó junto con la señal predicha de TNF-α para revelar la dinámica de estimulación-respuesta.

Este método de perfusión no está exento de deficiencias. En particular, el sistema conlleva un riesgo de esterilidad debido al breve paso crítico en el que el tubo se conecta a la placa del pozo después de instalarse dentro de la incubadora. En la experiencia de los autores, la contaminación es bastante rara; sin embargo, el riesgo de contaminación se puede mitigar de las siguientes maneras. El primero es realizar todos los procedimientos de manejo celular y conexiones estériles en un gabinete de bioseguridad. Una precaución adicional que se puede considerar para mejorar la esterilidad es la inclusión de un filtro de jeringa de 0,22 μm en línea en la entrada de los cultivos celulares. El uso de filtración estéril atrapará bacterias o microorganismos más grandes presentes en el medio antes de que entren en el cultivo celular, aunque aumenta los requisitos de presión para impulsar el flujo y puede obstruirse debido al ensuciamiento de la membrana. Las muestras salientes también se recogen en ambientes abiertos con riesgo de contaminación. La recolección de muestras en un sistema de gabinete, idealmente con filtración de aire, para el módulo de fraccionamiento eliminaría este problema en las futuras construcciones del sistema.

Además, las señales secretadas por las células se distorsionan de acuerdo con la RTD de los tubos aguas abajo antes de ser fraccionadas y medidas. Por lo tanto, las señales medidas son versiones manchadas de las secretadas por las células. Teóricamente, esta mancha puede deshacerse realizando la deconvolución en la señal medida para eliminar el efecto de la RTD¹⁴ aguas abajo, pero es difícil aplicar esta técnica numérica con éxito a los datos no ideales a medida que el ruido de la señal se amplifica en gran medida. Sin embargo, muchas dinámicas biológicas de interés se desarrollan en la escala de tiempo de horas a decenas de horas, y por lo tanto se ven muy poco afectadas por los efectos de manchado de los RTD de tubos, que se desplazan en el tiempo pero cambian poco de forma. El método de medición de IDT que se muestra aquí también puede mejorarse mediante el uso de pulsos trazadores más cortos y el uso de soluciones de fondo y sustancias trazadoras que coincidan con las que se utilizarán en experimentos de cultivo celular. Sin embargo, se ha demostrado que los tiempos de pulso sugeridos aquí dan RTD idénticos a todos los tiempos de pulso más cortos y, por lo tanto, son adecuados para las mediciones de RTD, pero a medida que aumentan los tiempos de pulso, los RTD cambian más significativamente y, por lo tanto, no deben usarse. Los autores han encontrado previamente que tanto el colorante alimentario como el GLuc tienen RTD muy similares entre sí tanto en agua como en medio de cultivo¹¹, por lo que es poco probable que la especie molecular cambie mucho la IDT. Finalmente, no se observaron diferencias en los RTD para el colorante alimentario en agua cuando se midió a 20 °C frente a 37 °C, o en tubos rectos frente a tubos altamente enrollados¹¹. Estos datos, y los datos de IDT para una gama de geometrías y caudales del sistema de perfusión, se pueden encontrar en la publicación anterior de los autores¹¹, junto con una explicación detallada de las operaciones realizadas por el script de análisis de IDT en este artículo. En las referencias proporcionadas se pueden encontrar más detalles sobre la teoría 13 del análisis de IDT¹³ y ejemplos de aplicaciones de IDT a sistemas de biorreactores ^{17,18,19,20,21}.

Este método versátil se puede utilizar para medir las tasas de secreción o absorción de sustancias solubles en cultivos celulares, y las señales transitorias de soluto se pueden entregar a los cultivos cambiando las fuentes de medios aguas arriba. Las señales simples, como los pulsos de soluto o los cambios de paso, se pueden entregar simplemente cambiando la válvula de entrada. Se pueden producir señales de tipo farmacocinético colocando un tanque agitado con el volumen de líquido apropiado en línea aguas arriba del cultivo y entregando un pulso de soluto a través de él. Se pueden crear otras señales aplicando diferentes combinaciones de pulsos, cambios de paso y componentes con nuevos RTD para distorsionar los pulsos en las formas deseadas. Los métodos de cultivo celular estático existentes no pueden recolectar continuamente muestras de medios de manera automatizada y no se pueden usar para exponer las células a señales de soluto que varían suavemente. Los sistemas microfluídicos son caros y requieren experiencia, y no existen sistemas macrofluídicos disponibles comercialmente para esta clase de experimentos. El sistema simple y de bajo costo puede ser adoptado por los laboratorios para estudiar el comportamiento celular natural, las respuestas de impulso, los efectos de diferentes perfiles de solutos transitorios que pueden imitar medicamentos o la dinámica de señal de soluto endógeno, y puede reconfigurarse para satisfacer las necesidades de nuevos experimentos. Las aplicaciones futuras de esta técnica y las actualmente en curso incluyen: medir la dinámica de la tasa de secreción de citoquinas y exosomas a partir de una terapia celular ex vivo ; evaluar el efecto del tiempo del reloj circadiano en la respuesta celular a los fármacos; medir la tasa de crecimiento y el metabolismo de las biopelículas bacterianas; producir curvas dosis-respuesta para vectores de virus adenoasociados (AAV) in vitro; medir la tasa de producción dinámica de vectores lentivirales a partir de células productoras; e incorporar perfiles farmacocinéticos de fármacos de quimioterapia en biopsias de medicina personalizadas para la terapia de precisión contra el cáncer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines	Grainger	5FVK2
293T Cells	ATCC	CRL-3216	HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.
96-Well Clear Bottom Plates, Corning	VWR	89091-010	Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL	Fisher Scientific	14-829-45
BioFrac Fraction Collector	Bio-Rad	7410002	Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.
Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8"	McMaster-Carr	4615T93	This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.
Coelenterazine native	NanoLight Technology	303	Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells	Millipore Sigma	CLS3548	Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells	Fisher Scientific	720081	Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.
DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	11965126
Epilog Zing 24 Laser	Cutting Edge Systems	Epilog Zing 24	Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL	Fisher Scientific	14-955-460
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129	Microcentrifuge tubes for collecting fractions.
Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End	Fisher Scientific	14-961-26	Glass tubes for collecting fractions.
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered	Fisher Scientific	2707410	300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.
Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	21600010	Phosphate buffered saline.
Labline 4625 Titer Shaker	Marshall Scientific	Labline 4625 Titer Shaker	Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK	Cole-Parmer	EW-30600-04	Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK	Masterflex	UX-45501-28
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16"	Cole-Parmer	EW-45508-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID	Cole-Parmer	EW-45518-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK	Masterflex	EW-30800-30
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft	Masterflex	EW-96410-14
MATLAB	MathWorks	R2019b	Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE-1600
Rack Set F1	Bio-Rad	7410010	Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.
Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF	Bio-Techne	10291-TA-020	Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm	Saint Gobain	DX263015-50	Fits 48-well plates.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm	Saint Gobain	DX263027-10	Fits 12-well plates.
Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L	Spectrum Chemicals	S-395-1LT
SolidWorks	Dassault Systems	SolidWorks	CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.
Varioskan LUX multimode microplate reader	ThermoFisher Scientific	VL0000D0	Plate reader.
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue	Michaels	10404779	Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.