Summary
Cet article présente une méthode pour construire et exploiter un système de culture cellulaire de perfusion multicanal à faible coût pour mesurer la dynamique des taux de sécrétion et d’absorption des solutés dans les processus cellulaires. Le système peut également exposer les cellules à des profils de stimulus dynamiques.
Abstract
Certaines fonctions cellulaires et tissulaires fonctionnent dans un délai dynamique de quelques minutes à quelques heures qui sont mal résolues par les systèmes de culture conventionnels. Ce travail a permis de développer un système de bioréacteur de perfusion à faible coût qui permet de perfuser continuellement le milieu de culture dans un module de culture cellulaire et de fractionner dans un module en aval pour mesurer la dynamique à cette échelle. Le système est construit presque entièrement à partir de pièces disponibles dans le commerce et peut être parallélisé pour mener simultanément des expériences indépendantes dans des plaques de culture cellulaire conventionnelles multi-puits. Cet article vidéo montre comment assembler la configuration de base, qui ne nécessite qu’une seule pompe à seringue multicanal et un collecteur de fraction modifié pour perfuser jusqu’à six cultures en parallèle. Des variantes utiles de la conception modulaire sont également présentées qui permettent une dynamique de stimulation contrôlée, telle que des impulsions de soluté ou des profils de type pharmacocinétique. Il est important de noter que lorsque les signaux de soluté traversent le système, ils sont déformés en raison de la dispersion des solutés. En outre, une méthode de mesure des distributions de temps de séjour (RTD) des composants de la configuration de perfusion avec un traceur utilisant MATLAB est décrite. Les RTD sont utiles pour calculer comment les signaux de soluté sont déformés par le flux dans le système à compartiments multiples. Ce système est très robuste et reproductible, de sorte que les chercheurs de base peuvent facilement l’adopter sans avoir besoin d’installations de fabrication spécialisées.
Introduction
De nombreux processus biologiques importants se produisent dans les cultures cellulaires et tissulaires sur une échelle de minutes àquelques heures 1,2,3. Bien que certains de ces phénomènes puissent être observés et enregistrés de manière automatisée à l’aide de la microscopie time-lapse4, de la bioluminescence1 ou d’autres méthodes, les expériences impliquant la collecte d’échantillons de surnageants de culture pour analyse chimique sont souvent effectuées manuellement dans des cultures cellulaires statiques. L’échantillonnage manuel limite la faisabilité de certaines études en raison des inconvénients des points de temps d’échantillonnage fréquents ou après les heures d’ouverture. D’autres lacunes des méthodes de culture statique comprennent des expériences impliquant des expositions contrôlées et transitoires à des stimuli chimiques. Dans les cultures statiques, les stimuli doivent être ajoutés et supprimés manuellement, et les profils de stimulus sont limités aux changements d’étape au fil du temps, tandis que les changements de milieu ajoutent et suppriment également d’autres composants du milieu, ce qui peut affecter les cellules de manière incontrôlée5. Les systèmes fluidiques peuvent surmonter ces défis, mais les dispositifs existants posent d’autres défis. Les dispositifs microfluidiques s’accompagnent des coûts prohibitifs de l’équipement spécialisé et de la formation à la production et à l’utilisation, nécessitent des méthodes microanalytiques pour traiter les échantillons et les cellules sont difficiles à récupérer des dispositifs après perfusion6. Peu de systèmes macrofluidiques ont été créés pour les types d’expériences décrits ici 7,8,9,10, et ils sont construits à partir de plusieurs pièces personnalisées fabriquées en interne et nécessitent plusieurs pompes ou collecteurs de fractions. En outre, les auteurs n’ont connaissance d’aucun système de culture cellulaire de perfusion macrofluidique disponible dans le commerce autre que les bioréacteurs à réservoir agité pour la culture en suspension, qui sont utiles pour la biofabrication, bien qu’ils ne soient pas conçus pour la modélisation et l’étude de la physiologie.
Les auteurs ont déjà fait état de la conception d’un système de bioréacteur de perfusion à faible coût composé presque entièrement de pièces11 disponibles dans le commerce. La version de base du système permet de conserver plusieurs cultures dans une plaque de puits dans un incubateur à CO2 et de les perfuser en continu avec du milieu provenant d’une pompe à seringue, tandis que les flux de milieu d’effluent des cultures sont automatiquement fractionnés en échantillons au fil du temps à l’aide d’un collecteur de fractions avec une modification personnalisée. Ainsi, ce système permet l’échantillonnage automatisé du milieu de culture surnageant et l’entrée continue de soluté dans les cultures au fil du temps. Le système est macrofluidique et modulaire et peut être facilement modifié pour répondre aux besoins de nouvelles conceptions d’expériences.
L’objectif global de la méthode présentée ici est de construire, de caractériser et d’utiliser un système de culture cellulaire par perfusion qui permet des expériences dans lesquelles les taux de sécrétion ou d’absorption de substances par les cellules au fil du temps sont mesurés et / ou les cellules sont exposées à des signaux de soluté précis et transitoires. Cet article vidéo explique comment assembler la configuration de base, qui est capable de perfuser jusqu’à six cultures cellulaires simultanément à l’aide d’une seule pompe à seringue et d’un collecteur de fraction modifié. Deux variantes utiles du système de base qui utilisent des pompes et des pièces supplémentaires pour permettre des expériences qui exposent les cellules à des signaux de concentration transitoires de soluté, y compris de brèves impulsions et des profils pharmacocinétiques12, sont également présentées, illustrées à la figure 1.
Figure 1: Trois variantes de la conception du système de perfusion. (En haut) Le système de perfusion de base. (Au milieu) Le système de perfusion avec un robinet d’arrêt pour plusieurs sources de milieu. (En bas) Le système de perfusion avec un réservoir agité pour imiter un volume de distribution bien mélangé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
En raison de la dispersion et de la diffusion dans le flux, les signaux de soluté se déforment ou « s’enduire » lorsqu’ils se déplacent dans le système d’écoulement. Cette distorsion peut être quantifiée par l’utilisation de distributions de temps de séjour (RDT)13. Cet article explique comment effectuer des expériences de traçage sur des composants du système de perfusion (Figure 2) et fournit des scripts MATLAB pour générer des RTD à partir de données mesurées. Une explication détaillée de cette analyse peut être trouvée dans l’article précédent des auteurs11. Des scripts MATLAB supplémentaires adaptent les fonctions appropriées aux RTD et extraient les paramètres physiques, et effectuent la convolution du signal à l’aide de RTD pour prédire comment l’entrée du signal de soluté par l’utilisateur se propagera et se déformera à travers le système de perfusion14.
Figure 2 : Distributions du temps de résidence. Les RTD des composants du système d’écoulement, tels que cette longueur de tuyau, sont mesurés en entrant une impulsion de traceur dans le système et en mesurant comment il « frottis » au moment où il sort dans les fractions collectées. Ce chiffre a été modifié à partir d’Erickson et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Protocol
1. Préparer les pièces pour la perfusion de la plaque de puits
- Préparer les tubes
- Couper deux longueurs de tube en silicone (1,6 mm de diamètre intérieur) pour chaque culture cellulaire à perfuser. Assurez-vous que la pièce utilisée comme tube en amont est suffisamment longue pour atteindre la pompe à seringue à la culture cellulaire à l’intérieur de l’incubateur, et que la pièce en aval peut atteindre de la culture cellulaire à la position la plus étendue du collecteur de fractions.
- Donnez à chaque morceau de tube une étiquette unique à ses deux extrémités avec du ruban adhésif étiqueté.
- Préparer les bouchons pour la plaque de puits
- Obtenez un bouchon en silicone pour chaque puits de la plaque de puits à perfuser, avec un diamètre approprié pour s’adapter confortablement dans les puits avec un joint étanche à l’air.
- Coupez l’excès de matière du fond du bouchon afin qu’il s’insère dans les puits tout en laissant de l’espace à l’intérieur pour l’air au-dessus du niveau de liquide prévu.
- Poussez deux aiguilles émoussées de 18 G à travers chaque bouchon, dans le haut et hors du bas pour servir d’entrée et de sortie pour le flux à travers le puits, diamétralement opposées l’une à l’autre pour maximiser la distance entre leurs extrémités à l’intérieur du puits.
- Ajustez la hauteur des aiguilles dans le puits bouché, car la hauteur de l’aiguille de sortie déterminera la hauteur stable du niveau de liquide dans le puits pendant la perfusion.
REMARQUE: Si la perfusion est commencée avec l’aiguille de sortie au-dessus du niveau de liquide, le liquide s’accumulera dans le puits jusqu’à ce que le niveau atteigne l’aiguille. Si la perfusion est démarrée avec l’aiguille de sortie en dessous du niveau de liquide, le niveau de liquide restera stable à moins que des bulles d’air ne s’écoulent dans le puits, ce qui entraînera une baisse de la hauteur du liquide jusqu’à ce qu’elle soit à la même hauteur que l’aiguille de sortie.
- Rassembler des pièces supplémentaires
- Obtenez une seringue stérile pour chaque culture cellulaire à perfuser qui est suffisamment grande pour contenir suffisamment de milieu pour toute la perfusion, plus une quantité supplémentaire de milieu pour remplir initialement le tube.
- Pour chaque culture à perfuser, obtenez un connecteur Luer femelle-barbe et deux connecteurs Luer mâle-barbe, ainsi que deux bonnets Luer femelles et deux mâles.
- Nettoyer et stériliser les pièces
- Si des pièces ont déjà été utilisées, nettoyez-les en les parfumant avec 0,1 N NaOH, suivi d’un rinçage à l’eau désionisée.
- Par autoclavage ou autre, assurez-vous de la stérilité de toutes les pièces énumérées ci-dessus.
2. Découpez au laser le distributeur multi-têtes et fixez-le à un collecteur de fractions
- Recréez le modèle de distributeur multi-têtes de la Figure 3 dans un programme de conception assistée par ordinateur ou téléchargez le fichier DXF du modèle fourni (fichier supplémentaire 1).
- Utilisez une découpeuse laser pour découper le dessin à partir d’une feuille acrylique 1/8.
- Retirez les trois vis qui fixent la tête de distribution à la base mobile du collecteur de fractions.
- Alignez les trois plus petits trous du distributeur à plusieurs têtes avec les trous de vis dans la base mobile et revissez les vis à travers les trous à fixer.
- Ajustez l’étanchéité des trois vis pour incliner le distributeur multi-têtes de haut en bas jusqu’à ce que la rangée de trous de distribution soit alignée avec les tubes de collecte en dessous.
- Placez soigneusement les embouts de pipette de 300 μL à travers les trous souhaités pour servir d’embouts de distribution.
REMARQUE: Le collecteur de fraction peut être utilisé sans le distributeur à plusieurs têtes pour perfuser une seule culture cellulaire.
3. Mesurer les RTD des composants et effectuer la convolution du signal
- Configurez des pompes et des seringues pour l’impulsion de traçage comme illustré à la figure 2.
- Procurez-vous deux pompes à seringues monocanaux ou multicanaux.
- Choisissez une solution d’arrière-plan pour représenter le milieu qui sera utilisé dans le système d’écoulement pendant les expériences de culture cellulaire. Assurez-vous que la solution d’arrière-plan possède des propriétés de transfert de masse similaires à celles du support. Dans de nombreux cas, l’eau désionisée est un choix approprié.
- Choisissez une substance traceuse pour représenter le soluté qui sera d’intérêt lors des expériences de culture cellulaire. S’assurer que le traceur a des propriétés de transfert de masse similaires à celles du soluté d’intérêt et que sa concentration doit pouvoir être mesurée. Dans de nombreux cas, le colorant alimentaire est un choix approprié.
- Dissoudre la substance traceuse dans la solution de fond pour obtenir la solution traceuse.
- Remplissez une seringue avec une solution de fond et chargez-la dans une pompe à seringue. Remplissez une autre seringue avec une solution traceuse et chargez-la dans la deuxième pompe à seringue.
- Connectez les deux seringues à deux des trois ports d’un robinet d’arrêt à quatre voies à l’aide de connecteurs Luer.
- Fermez le robinet d’arrêt à la solution d’arrière-plan et pompez la solution de traceur dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce qu’il commence à s’égoutter sur le port ouvert. Arrêtez la pompe et n’ajustez pas la seringue davantage.
REMARQUE: Il est important que la barre mobile de la pompe à seringue soit poussée contre les pistons de la seringue avant le début des parties chronométrées de l’expérience. Cela permettra au débit de commencer immédiatement au démarrage de la pompe. Sinon, la pompe peut être démarrée, mais le débit ne commencera pas réellement tant que la barre mobile n’aura pas rattrapé la position du piston. - Fermez le robinet d’arrêt à la solution de traceur et pompez la solution d’arrière-plan dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce que toute la solution résiduelle de traceur ait été évacuée du port ouvert. Arrêtez la pompe et n’ajustez pas la seringue davantage.
- Configurer le composant d’intérêt du système d’écoulement et le collecteur de fractions
- Configurez le composant du système de flux souhaité pour l’analyse RTD. Assurez-vous que le composant à mesurer se termine par un morceau de tuyau en aval de longueur et de flexibilité appropriées pour atteindre le collecteur de fraction pendant le fonctionnement.
- Insérez l’extrémité du tuyau en aval dans un distributeur de pointe de pipette dans le distributeur à plusieurs têtes de manière à ce qu’il soit bien connecté.
- Fixez l’orifice ouvert du robinet d’arrêt à quatre voies à l’entrée du composant à mesurer. Pomper la solution de fond à travers le composant jusqu’à ce qu’il soit entièrement rempli comme il le serait lors d’une expérience de culture cellulaire, et il commence à s’égoutter hors de la pointe de distribution du collecteur de fractions. Arrêtez la pompe.
- Injecter l’impulsion du traceur, collecter les fractions et mesurer le traceur
- Réglez la pompe de la solution de traçage sur le débit souhaité. Fermez le robinet d’arrêt sur la solution d’arrière-plan et démarrez le flux de la solution de traçage. Dans le même temps, démarrez le collecteur de fractions.
- Continuez l’écoulement de la solution traceuse pendant une courte période de temps pour approximer une entrée d’impulsion du traceur. Une durée d’impulsion de 10 minutes s’est avérée efficace pour les RTD à un débit de 1 mL/h.
REMARQUE: Si l’impulsion du traceur est trop brève, le traceur n’entrera pas suffisamment dans le flux pour être mesurable. Si l’impulsion est trop longue, elle ne se rapprochera plus d’une impulsion et changera la forme du RTD. - À la fin de la période d’impulsion de la solution traceuse, arrêtez la pompe de solution traceuse. Fermez rapidement le robinet d’arrêt à la solution de traçage et démarrez le flux de la solution d’arrière-plan au même débit.
- Laissez la solution d’arrière-plan s’écouler et les fractions être collectées jusqu’à ce que tout le traceur ait traversé le système et dans les fractions collectées.
- Arrêtez le système et mesurez la concentration du traceur dans les fractions. N’incluez que les fractions qui ont été complètement distribuées. Si la collection est arrêtée à mi-chemin de la collection d’une fraction, n’incluez pas cette fraction.
- Calculer la distribution du temps de séjour (RTD) à partir des données mesurées dans MATLAB
REMARQUE: Une explication écrite de l’analyse effectuée par ce script MATLAB peut être trouvée dans la publication précédente des auteurs11, et les discussions sur la théorie sont largement disponibles dans la littérature13.- Produire un fichier .xlsx contenant les données de concentration dans le format de la feuille de calcul example_tracer_data.xlsx fournie dans le fichier supplémentaire 2. Entrez les valeurs de concentration du traceur dans les fractions (toutes les unités) dans l’ordre chronologique de gauche à droite à la ligne 2. Entrez le temps écoulé entre le début de l’impulsion et la fin de la dernière fraction dans la cellule A5 et entrez la longueur de l’impulsion traceur en minutes dans la cellule A8.
- Enregistrez le fichier .xlsx dans le répertoire MATLAB.
- Ouvrez le script RTD_From_Data.m, à partir du fichier supplémentaire 3, dans l’éditeur MATLAB.
- Remplacez le nom du fichier .xlsx entre parenthèses dans la première ligne de la section Charger les données du script par le nom du nouveau fichier de données .xlsx, en suivant les instructions écrites dans le fichier de script. Exécutez le script.
- Assurez-vous que le script effectue avec succès l’analyse RTD13, en produisant un tracé de la RTD et en renvoyant la valeur de l’intégrale numérique sur la RTD égale à 1. Recherchez le vecteur temps (t) et le vecteur de valeurs RTD (Et) associés enregistrés par le script dans le répertoire MATLAB.
- Adapter une fonction de modèle au RTD dans MATLAB
- Ouvrez le script Fit_RTD_Function.m dans l’éditeur MATLAB à partir du fichier supplémentaire 4.
- Choisissez l’une des trois fonctions du modèle commenté pour s’adapter au RTD : le modèle de dispersion axiale13, qui s’adapte aux RTD pour l’écoulement laminaire dans les tubes cylindriques ; le modèle CSTR13, qui s’adapte aux réservoirs bien agités; et le modèle n-CSTR15, qui s’adapte approximativement à des plaques de puits plus grandes. Pour adapter un autre modèle non inclus ici, ajoutez-le au script dans le même format.
- Supprimez les commentaires dans la section du script contenant le modèle choisi pour le raccord.
- Remplacez les valeurs des estimations initiales des paramètres par celles appropriées pour le RDT.
- Exécutez le script pour produire un tracé de la fonction d’ajustement superposée aux données RTD et pour imprimer les valeurs des paramètres d’ajustement de la fonction. Si l’ajustement est très mauvais ou si des erreurs se produisent, modifiez les suppositions initiales du paramètre et exécutez à nouveau le script.
- Effectuer la convolution du signal dans MATLAB
- Choisissez un signal et un RTD ou deux RTD à convolve.
- Ouvrez le script Signal_Convolution.m, à partir du fichier supplémentaire 5, dans l’éditeur MATLAB.
- Pour chacun des deux signaux à convoluer (c’est-à-dire un signal et un RTD, ou deux RTD), définissez un vecteur de points temporels uniformément espacés dans les unités souhaitées et un vecteur correspondant de valeurs de signal à ces moments.
REMARQUE: Les vecteurs des deux signaux doivent avoir le même nombre d’éléments et les mêmes pas de temps de taille. C’est pourquoi il est utile d’avoir le RTD comme une fonction continue qui peut être échantillonnée pour un nombre arbitraire de points à n’importe quel intervalle de temps. - Entrez les deux signaux dans MATLAB et exécutez le script pour obtenir les vecteurs de temps et de signal du signal de sortie.
4. Mettre en place le système de perfusion de base avec des cellules dans une plaque de puits
- Préparer la plaque de puits
- Assurez-vous que la culture sur plaque de puits a la profondeur moyenne appropriée pour l’expérience de perfusion. Effectuez tout changement de milieu final, stimulation ou autre étape souhaitée avant de commencer la perfusion. Si des cellules de suspension sont perfusées, centrifugez la plaque pour vous assurer qu’elles sont au fond.
- Dans des conditions stériles, insérez les bouchons avec des aiguilles dans les cultures de plaques de puits avec les aiguilles tirées vers le haut. Une fois le bouchon en place, abaissez les aiguilles à la hauteur souhaitée pour la perfusion, car la hauteur de l’aiguille de sortie détermine le niveau de liquide stable.
- Boucher les aiguilles avec des bouchons Luer mâles et garder toute la plaque de puits dans un incubateur jusqu’à utilisation.
- Préparer les seringues et les tubes en amont
- Dans des conditions stériles, remplissez une seringue pour chaque culture à perfuser avec suffisamment de milieu pour la durée souhaitée de la perfusion, plus suffisamment de milieu supplémentaire pour remplir le tube en amont.
- Fixez le tube en amont à la seringue à l’aide d’un connecteur Luer femelle-barbe. À l’autre extrémité du tube, insérez un connecteur Luer mâle-barbe.
- Distribuer le milieu de la seringue jusqu’à ce que le tube en amont soit entièrement rempli de milieu.
- Coiffez l’extrémité ouverte du tube avec un capuchon Luer femelle.
REMARQUE: Toutes les seringues répliquées doivent avoir exactement le même volume à ce stade. Si leurs volumes ne sont pas égaux, leurs pistons seront dans des positions différentes et ils ne s’intégreront pas tous bien dans une seule pompe à seringue multicanal.
- Dans des conditions stériles, insérez un connecteur Luer mâle-barbe dans une extrémité du tube en aval et recouvrez-le d’un capuchon Luer femelle.
- Apportez soigneusement tous les tubes préparés, les seringues et la plaque de puits à l’incubateur qui sera utilisé pour la perfusion.
- Placez la pompe à seringue et le collecteur de fractions aux endroits souhaités près de l’incubateur. Placez la pompe à seringue sur ou près de l’incubateur et placez le collecteur de fraction à côté de l’incubateur, près du port.
- Regroupez les extrémités coiffées de tous les tubes en amont et en aval et poussez-les de l’extérieur de l’incubateur vers l’intérieur à travers le port.
- Chargez les seringues dans la pompe à seringue et insérez les extrémités ouvertes des tubes en aval dans les embouts de la pipette de distribution du distributeur à plusieurs têtes du collecteur de fractions.
- À l’intérieur de l’incubateur, tirez autant de mou que possible des tubes en amont dans l’incubateur pour maximiser la longueur des tubes à travers lesquels le fluide qui circule peut recevoir de la chaleur et du CO2 de l’air de l’incubateur. Tout en les maintenant en place, retirez les tubes en aval de l’incubateur, juste assez pour qu’ils puissent atteindre le point le plus étendu du collecteur de fractions tout en gardant les extrémités coiffées à l’intérieur de l’incubateur.
- Pour chaque puits bouché, décapsulez rapidement les aiguilles et les tubes en amont et en aval de ce puits et fixez-les ensemble avec leurs connecteurs Luer.
- Une fois que toutes les pièces sont connectées, faites fonctionner brièvement la pompe à seringue à une vitesse relativement élevée pour vous assurer que tous les flux s’écoulent correctement.
- À ce stade, si vous souhaitez commencer l’expérience avec les tubes en aval remplis du milieu, continuez à faire fonctionner la pompe jusqu’à ce que tous soient remplis. Sinon, arrêtez la pompe.
- Réglez le débit de la pompe à seringue et la fréquence de collecte des fractions et démarrez les deux machines simultanément pour commencer l’expérience. Collectez des fractions pour la durée d’expérience souhaitée.
5. Configurez le système de perfusion avec un robinet d’arrêt pour plusieurs sources de milieu
- Effectuez toutes les sous-étapes de l’étape 4.1 ci-dessus.
- Préparez les deux milieux à utiliser dans la perfusion, en étiquetant le milieu qui sera distribué en premier comme 1 et l’autre comme milieu 2.
- Pour chaque culture à perfuser, remplissez une seringue avec suffisamment de milieu 1 pour la durée de sa dispensation, plus suffisamment de volume pour remplir initialement le système de perfusion. Remplissez une deuxième seringue avec suffisamment de milieu 2 pour la durée de sa dispensation.
- Connectez les deux seringues à deux des trois orifices d’un robinet d’arrêt à quatre voies.
REMARQUE: Une longueur de tuyau pour connecter les seringues aux robinets d’arrêt peut être nécessaire. - Préparez le robinet d’arrêt et les seringues de la même manière que les étapes 3.1.7 à 3.1.8 ci-dessus en fermant le robinet d’arrêt au milieu 1 et en distribuant le milieu 2 dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce qu’il commence à s’égoutter sur le port ouvert.
- Fermez le robinet d’arrêt au milieu 2 et distribuez le milieu 1 dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce que tout le milieu résiduel 2 ait été évacué du port ouvert.
- Fixez le tube en amont à l’orifice ouvert du robinet d’arrêt à l’aide d’un connecteur Luer femelle-barbe. À l’autre extrémité du tube, insérez un connecteur Luer mâle-barbe.
- Distribuer le milieu 1 de la seringue jusqu’à ce que le tube en amont soit entièrement rempli de milieu.
- Passez aux étapes 4.3 à 4.11 ci-dessus, en chargeant les deux seringues dans des pompes à seringues séparées et en ne distribuant que le milieu 1.
- Réglez le débit de la pompe à seringue pour le milieu 1 et la fréquence de collecte des fractions, puis démarrez les deux machines simultanément pour commencer l’expérience.
- Lorsque la source de milieu doit être changée, arrêtez rapidement la pompe à seringue pour le milieu 1, fermez le robinet d’arrêt au milieu 1 et démarrez la pompe à seringue pour le milieu 2. Si vous le souhaitez plus tard, remettez la source au milieu 1 de la même manière.
- Collectez des fractions pour la durée d’expérience souhaitée.
6. Configurez le système de perfusion avec un réservoir agité pour imiter la pharmacocinétique
- Obtenir des données pharmacocinétiques pour le médicament d’intérêt et s’assurer qu’il se compose d’un pic de concentration suivi d’une désintégration exponentielle.
- Après avoir réglé le pic sur l’heure 0 et supprimé les points de données avant le pic, utilisez le script Stirred_Tank_Fit.m (fichier supplémentaire 6) pour adapter l’équation RTD du réservoir agité aux données. L’entrée v (le débit de perfusion souhaité) et les données à ajuster sous forme de paire de vecteurs directement dans le script, ainsi que t et C pour les valeurs de temps et de concentration, respectivement. Exécutez le script pour imprimer le paramètre V, qui est le volume de réservoir agité requis.
- Planifiez une disposition du système de perfusion comprenant deux pompes à seringues et un agitateur à plaques en amont de l’incubateur.
- Mesurer les RTD des composants du système de perfusion au-delà du robinet d’arrêt et effectuer la convolution du signal des RTD avec différentes durées et concentrations d’impulsions médicamenteuses pour trouver un profil pharmacocinétique approprié. Utilisez l’équation RTD du réservoir agité d’ajustement dans ce calcul.
- Passez aux étapes 5.1 à 5.8 ci-dessus.
- Utilisez une plaque de puits supplémentaire de taille appropriée comme réservoir agité pour l’installation. Chaque puits peut servir de réservoir agité pour une culture perfusée. Remplissez le puits avec le volume requis de milieu, V, et branchez le puits avec les aiguilles initialement tirées vers le haut, puis poussées au fond du puits, et boucher les aiguilles.
- Chargez les seringues dans les pompes à seringues et connectez rapidement les tubes des seringues aux aiguilles d’entrée bouchées des réservoirs agités. Ensuite, connectez les entrées du tube de culture cellulaire en amont aux aiguilles de sortie des réservoirs agités.
- Passez aux étapes 5.9 à 5.10.
- Au moment souhaité, passez au milieu de distribution 2 contenant le médicament, comme décrit à l’étape 5.11. Revenez au milieu 1 lorsque la perfusion du médicament est terminée.
- Passez à l’étape 5.12.
Figure 3 : Le distributeur multi-têtes. Conception pour le distributeur multi-têtes découpé au laser. Ce chiffre a été modifié à partir d’Erickson et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
Le système de perfusion avec plusieurs sources de milieu de la section 5 du protocole a été utilisé pour mesurer la dynamique d’expression d’un gène rapporteur piloté par le facteur nucléaire kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) transcription factor in human embryonic kidney 293 (HEK293) cells en réponse à une impulsion de 1,5 h de facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α). Les cellules HEK293 ont été transduites de manière stable à l’aide de vecteurs lentiviraux avec une construction génique contenant de la gaussia luciférase (GLuc), entraînée par un promoteur appelé NFKB contenant l’élément de réponse NF-κB pour créer des cellules NFKB-GLuc HEK293, qui ont été triées via le tri des cellules activées par fluorescence (FACS) pour isoler les cellules transduites. Les cellules triées ont été cryoconservées jusqu’à leur utilisation.
Pour chaque culture perfusée, la configuration de perfusion comprenait une section en amont de 1 m de tuyau menant à une plaque bouchée de 48 puits contenant les cellules, suivie de 1 m de tube en aval menant au collecteur de fractions à plusieurs têtes, avec un débit de 0,5 mL/h (0,0083 mL/min). Les RTD du tube de 1 m seul et de la configuration complète (tube de 1 m + plaque de 48 puits + tube de 1 m) ont été mesurés en utilisant un débit de 0,5 mL/h avec une impulsion de traçage de 20 min. La solution de fond était de l’eau désionisée, avec une solution traceur de colorant alimentaire bleu dilué dans de l’eau désionisée, et les fractions ont été collectées à raison de 1 fraction / h à l’aide du distributeur à plusieurs têtes. Les concentrations de traceurs dans des échantillons de 100 μL des fractions ont été mesurées dans un lecteur de plaques par absorbance à 628 nm.
Les données de concentration du traceur ont été traitées dans MATLAB pour produire des RTD pour les deux configurations. Tout d’abord, les RTD des deux configurations ont été calculés à partir des données à l’aide du script RTD_from_Data.m. Les points de données RTD du tube de 1 m et la configuration complète sont illustrés à la figure 4.
Figure 4: Distributions du temps de séjour. (à gauche) RTD pour un tube de 1 m à un débit de 0,5 mL/h (0,0083 mL/min). (À droite) RTD de la configuration de perfusion complète (tube de 1 m + plaque de 48 puits + tube de 1 m) à un débit de 0,5 mL/h. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La RDT des tubes seuls est bien adaptée à la fonction de dispersion axiale, ce qui est à prévoir sur la base de la littérature existante13. Plusieurs pièces de tubes en série sont également bien ajustées par un seul modèle de dispersion axiale, et l’ajout de la plaque de 48 puits en ligne provoque un écart négligeable par rapport à ce modèle, de sorte que le tube de 1 m seul et le tube de 1 m + plaque de 48 puits + tube de 1 m étaient tous censés être bien ajustés par un modèle de dispersion axiale. Il est courant que de mauvais ajustements de modèle se produisent lorsque les suppositions initiales pour les paramètres du modèle sont trop éloignées de leurs valeurs réelles. Pour le démontrer, tout d’abord, le modèle de dispersion axiale a été adapté aux données du tube de 1 m en utilisant le script Fit_RTD_Function.m, en utilisant Pe = 10 et tau = 30 min comme premières suppositions pour les paramètres de fonction. La figure 5 montre que ces suppositions ont abouti à des modèles mal ajustés, tracés à côté des données de RDT. Les suppositions ont été changées en Pe = 10 et tau = 300 min, ce qui a donné les bons ajustements de modèle illustrés à la figure 5, car tau devrait être approximativement égal au volume du système de perfusion divisé par son débit volumétrique. Les paramètres d’ajustement pour le tube de 1 m sont Pe = 154,3, tau = 317,2 min, tandis que les paramètres pour l’ensemble du système sont Pe = 396,5, tau = 596,5 min.
Figure 5 : Exemples de bons et de mauvais modèles adaptés à une RDT. Un modèle de dispersion axiale a été adapté aux données RTD pour un tube de 1 m à un débit de 0,5 mL/h (0,0083 mL/min). (À gauche) Les suppositions initiales pour les paramètres de modèle saisis dans le script MATLAB étaient trop éloignées de leurs valeurs réelles, ce qui a entraîné le retour du script à un mauvais ajustement du modèle. (À droite) De meilleures valeurs de paramètre ont été saisies dans le script, ce qui a permis d’obtenir un bon ajustement du modèle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La convolution du signal a été effectuée à l’aide de ces fonctions RTD d’ajustement dans le script Signal_Convolution m pour prédire comment une impulsion de 1,5 h de milieu contenant 10 ng/mL de TNF-α à l’entrée du tube en amont se propagerait à travers le système. Le signal d’entrée a d’abord été convolué avec le RTD de tube de 1 m pour déterminer quel signal TNF-α entrerait dans la plaque du puits. Le signal d’entrée a également été convolué avec le RTD du tube de 1 m + plaque de 48 puits + tube de 1 m pour déterminer quel serait le signal TNF-α à la sortie du système dans les fractions collectées, où il apparaîtra à côté de la réponse GLuc correspondante des cellules. La figure 6 montre l’entrée TNF- α signal d’impulsion est montré à côté des signaux prévus à l’entrée du puits et à la sortie du système.
Figure 6 : Prédiction des signaux de concentration de α TNF dans le système de perfusion. Un milieu contenant du TNF-α a été infusé dans le système de perfusion à 10 ng/mL pendant les 90 premières minutes de fonctionnement, représenté par le signal rectangulaire bleu. (À gauche) En convoluant le signal d’entrée avec le modèle de dispersion axiale d’ajustement du tube RTD de 1 m, le signal de concentration TNF-α à l’entrée de la plaque de 48 puits a été prédit. (À droite) De même, en utilisant le modèle RTD pour l’ensemble du système, le signal TNF-α à la sortie du système a été prédit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les cellules NFKB-GLuc HEK293 ont été décongelées et plaquées dans une plaque de 48 puits à 1 x 104 cellules/puits dans 0,4 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), et ont été incubées pendant 1 jour à 37 °C avec 5 % de CO2, après quoi les étapes de la section 5 du protocole ci-dessus ont été suivies pour mettre en place le système de perfusion avec un robinet d’arrêt pour plusieurs sources de milieu. Quatre cours d’eau ont été mis en place pour perfuser quatre puits. Une pompe à seringue multicanal a été chargée de quatre seringues complètes de 60 mL contenant du DMEM comme milieu 1. Une deuxième pompe à seringue a été chargée de seringues de 5 mL contenant du milieu 2, dont deux contenaient du DMEM ordinaire comme témoin, et deux contenant du DMEM avec 10 ng/mL de TNF-α comme stimulus. Au début de l’expérience, les seringues de 5 mL contenant du TNF-α ou le milieu témoin ont été distribuées à 0,5 mL/h pendant 1,5 h, après quoi les robinets d’arrêt ont été commutés et les seringues de 60 mL contenant du DMEM ont été distribuées pendant les 40 heures suivantes. À 24 h et à la fin de la perfusion, les fractions des quatre flux, qui ont été distribuées dans des tubes de microcentrifugation, ont été étiquetées et congelées à -80 °C, et le collecteur de fractions a été réinitialisé.
Après la perfusion, tous les échantillons ont été décongelés et leurs concentrations de GLuc ont été mesurées à l’aide d’un test de bioluminescence, décrit précédemment11,16. Les valeurs de luminescence ont été converties en taux de luminescence/h en divisant la luminescence de chaque échantillon de fraction par la durée de cette fraction, et ont été tracées sous forme de série chronologique pour chacun des quatre flux. Le temps de chaque mesure GLuc était le point médian de l’intervalle de temps pendant lequel cette fraction était collectée, moins le temps de séjour moyen (tau = 317 min) du tube en aval du système de perfusion. Le signal TNF-α prévu pour être contenu dans les fractions a également été décalé dans le temps par le temps de séjour moyen du tube en aval et a été superposé aux données GLuc, révélant la dynamique stimulus-réponse NF-κB-expression génique induite par NF-κB, illustrée à la figure 7.
Figure 7 : Dynamique stimulus-réponse mesurée à l’aide du système de perfusion. Le système de perfusion avec deux sources de milieu a été utilisé pour exposer transitoirement deux cultures cellulaires à une impulsion de TNF-α avec deux cultures non exposées comme témoins. Les cellules HEK293 ont été conçues pour sécréter du GLuc entraîné par un promoteur contenant l’élément de réponse NF-κB, qui a été recueilli dans les fractions d’effluent. L’expérience révèle une augmentation spectaculaire de l’expression entraînée par NF-κB après une exposition au TNF-α. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La présence de GLuc accumulé dans les cultures au début de la perfusion a provoqué la chute apparente du signal GLuc de la première à la deuxième fraction dans les quatre courbes. Cet artefact commun peut être évité dans le système de perfusion en changeant le milieu dans les cultures immédiatement avant le début des perfusions. Les deux cultures témoins qui n’ont pas reçu de TNF-α ont maintenu un faible taux de sécrétion de GLuc qui a progressivement augmenté au cours de la durée de l’expérience. Ce résultat peut refléter la croissance de la population cellulaire. Les cultures stimulées avaient initialement le même taux de sécrétion de GLuc que les témoins, puis augmentaient considérablement la sécrétion à mesure que l’expression induite par NF-κB était activée en réponse à une impulsion α TNF. La sécrétion de GLuc culmine environ 9 h après la première arrivée du TNF-α, après quoi elle diminue avec une désintégration exponentielle.
Fichier supplémentaire 1 : Fichier CAO : Multi-head_Dispenser.DFX : Ce fichier contient le modèle du distributeur multi-têtes qui peut être découpé au laser et utilisé pour modifier les collecteurs de fractions. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2 : example_tracer_data.xlsx. Contient des exemples de données d’expérience de traceur à lire par le script MATLAB RTD_from_Data.m. Peut également être utilisé comme modèle pour de nouvelles données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 3 : Fichier MATLAB : RTD_from_Data.m. Ce script lit les données d’expérience de traçage d’un fichier .xlsx et renvoie les vecteurs t et Et représentant le RTD. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 4 : Fichier MATLAB : Fit_RTD_Function.m. Ce script charge les vecteurs RTD à partir du script RTD_from_Data.m et renvoie un modèle d’ajustement pour le RTD. Le type de modèle est choisi par l’utilisateur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 5 : Fichier MATLAB : Signal_Convolution.m. Ce script prend un signal de soluté défini par l’utilisateur et un RTD comme entrées et prédit comment le signal sera modifié après avoir traversé le système de flux avec ce RTD. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 6 : Fichier MATLAB : Stirred_Tank_Fit.m. Ce script adapte une courbe de RTD CSTR aux données pharmacocinétiques saisies par l’utilisateur et renvoie le volume de réservoir requis pour produire le RTD pour le débit donné. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Ce travail décrit l’assemblage et le fonctionnement d’un système de culture cellulaire par perfusion avec de multiples sources de milieu démontré avec un exemple spécifique dans lequel la dynamique de l’expression génique induite par NF-κB en réponse à une impulsion transitoire de TNF-α a été mesurée. Les RTD des composants du système de perfusion ont été mesurées et modélisées, et la convolution du signal a été utilisée pour prédire à la fois l’exposition des cellules à l’impulsion α TNF et la distribution α TNF dans les fractions moyennes d’effluents collectées. Les cellules ont été exposées au pouls et des fractions ont été collectées pendant 40 h, après quoi le GLuc a été mesuré dans les fractions et tracé à côté du signal prédit TNF-α pour révéler la dynamique stimulation-réponse.
Cette méthode de perfusion n’est pas sans défauts. Notamment, le système comporte un risque de stérilité en raison de la brève étape critique dans laquelle le tube est connecté à la plaque de puits après s’être installé dans l’incubateur. D’après l’expérience des auteurs, la contamination est assez rare; néanmoins, le risque de contamination peut être atténué des façons suivantes. La première consiste à effectuer toutes les procédures de manipulation des cellules et les connexions stériles dans une armoire de biosécurité. Une précaution supplémentaire qui peut être envisagée pour améliorer la stérilité est l’inclusion d’un filtre à seringue de 0,22 μm en ligne à l’entrée des cultures cellulaires. L’utilisation de la filtration stérile piègera les bactéries ou les micro-organismes plus gros présents dans le milieu avant qu’ils n’entrent dans la culture cellulaire, bien qu’elle augmente les exigences de pression pour entraîner le flux et puisse se boucher en raison de l’encrassement de la membrane. Les échantillons sortants sont également prélevés dans des environnements ouverts à risque de contamination. La collecte d’échantillons dans un système de boîtier, idéalement avec filtration de l’air, pour le module de fractionnement éliminerait ce problème dans les futures constructions du système.
De plus, les signaux sécrétés par les cellules sont déformés en fonction de la RTD du tube en aval avant d’être fractionnés et mesurés. Ainsi, les signaux mesurés sont des versions maculées de ceux sécrétés par les cellules. Théoriquement, ce maculage peut être annulé en effectuant une déconvolution sur le signal mesuré pour éliminer l’effet de la RTD14 en aval, mais il est difficile d’appliquer cette technique numérique avec succès aux données non idéales car le bruit du signal devient considérablement amplifié. Cependant, de nombreuses dynamiques biologiques d’intérêt se déroulent sur une échelle de temps allant de quelques heures à des dizaines d’heures, et sont donc très peu affectées par les effets de frottis des RTD de tuyauterie, étant décalés dans le temps mais peu modifiés dans la forme. La méthode de mesure rtD présentée ici peut également être améliorée en utilisant des impulsions traçantes plus courtes et en utilisant des solutions de fond et des substances traceuses qui correspondent à celles qui seront utilisées dans les expériences de culture cellulaire. Cependant, il a été démontré que les temps d’impulsion suggérés ici donnent des RTD identiques à tous les temps d’impulsion plus courts et conviennent donc aux mesures de RTD, mais à mesure que les temps d’impulsion augmentent, les RTD changent de manière plus significative et ne doivent donc pas être utilisés. Les auteurs ont déjà constaté que le colorant alimentaire et le GLuc ont des RTD très similaires l’un à l’autre dans l’eau et le milieude culture 11, de sorte qu’il est peu probable que l’espèce moléculaire modifie beaucoup le RTD. Enfin, aucune différence dans les RTD n’a été observée pour les colorants alimentaires dans l’eau lorsqu’ils sont mesurés à 20 °C contre 37 °C, ou dans les tubes droits par rapport aux tubes fortement enroulés11. Ces données, ainsi que les données rtd pour une gamme de géométries et de débits de systèmes de perfusion, se trouvent dans la publication précédente11 des auteurs, ainsi qu’une explication détaillée des opérations effectuées par le script d’analyse RTD dans cet article. De plus amples détails sur la théorie de l’analyse de la RDT13 et des exemples d’applications de la RDT aux systèmes de bioréacteurs 17,18,19,20,21 peuvent être trouvés dans les références fournies.
Cette méthode polyvalente peut être utilisée pour mesurer les taux de sécrétion ou d’absorption de substances solubles dans les cultures cellulaires, et des signaux de soluté transitoires peuvent être transmis aux cultures en changeant de source de milieu en amont. Des signaux simples tels que des impulsions de soluté ou des changements de pas peuvent être délivrés simplement en changeant la vanne d’entrée. Des signaux de type pharmacocinétique peuvent être produits en plaçant un réservoir agité avec le volume de liquide approprié en ligne en amont de la culture et en y délivrant une impulsion de soluté. D’autres signaux peuvent être créés en appliquant différentes combinaisons d’impulsions, de changements d’étapes et de composants avec de nouveaux RTD pour déformer les impulsions dans les formes souhaitées. Les méthodes de culture cellulaire statique existantes sont incapables de prélever en continu des échantillons de milieu de manière automatisée et ne peuvent pas être utilisées pour exposer les cellules à des signaux de soluté variant en douceur. Les systèmes microfluidiques sont coûteux et nécessitent une expertise, et aucun système macrofluidique disponible dans le commerce n’existe pour cette classe d’expériences. Le système simple et peu coûteux peut être adopté par les laboratoires pour étudier le comportement naturel des cellules, les réponses impulsionnelles, les effets de différents profils de solutés transitoires qui peuvent imiter les médicaments ou la dynamique du signal de soluté endogène, et peut être reconfiguré pour répondre aux besoins de nouvelles expériences. Les applications futures de cette technique et de celles actuellement en cours comprennent: la mesure de la dynamique du taux de sécrétion des cytokines et des exosomes à partir d’une thérapie cellulaire ex vivo ; évaluer l’effet du temps d’horloge circadien sur la réponse cellulaire aux médicaments; mesurer le taux de croissance et le métabolisme des biofilms bactériens; produire des courbes dose-réponse pour les vecteurs du virus adéno-associé (VAA) in vitro; mesurer le taux de production dynamique des vecteurs lentiviraux à partir de cellules productrices; et l’intégration de profils de médicaments de chimiothérapie pharmacocinétiques dans des biopsies de médecine personnalisée pour le traitement de précision du cancer.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Cette recherche a été menée avec le soutien de Grant Nos. R01EB012521, R01EB028782 et T32 GM008339 des National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines | Grainger | 5FVK2 | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | HEK 293T cells used in the Representative Results experiment. |
| 96-Well Clear Bottom Plates, Corning | VWR | 89091-010 | Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams. |
| Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8" | McMaster-Carr | 4615T93 | This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector. |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results. |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells | Millipore Sigma | CLS3548 | Used to grow and perfuse 293T cells in representative results. |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells | Fisher Scientific | 720081 | Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion. |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 11965126 | |
| Epilog Zing 24 Laser | Cutting Edge Systems | Epilog Zing 24 | Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used. |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL | Fisher Scientific | 14-955-461 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | Microcentrifuge tubes for collecting fractions. |
| Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End | Fisher Scientific | 14-961-26 | Glass tubes for collecting fractions. |
| Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered | Fisher Scientific | 2707410 | 300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips. |
| Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 21600010 | Phosphate buffered saline. |
| Labline 4625 Titer Shaker | Marshall Scientific | Labline 4625 Titer Shaker | Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed. |
| Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK | Cole-Parmer | EW-30600-04 | Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments. |
| Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK | Masterflex | UX-45501-28 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16" | Cole-Parmer | EW-45508-00 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID | Cole-Parmer | EW-45518-00 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK | Masterflex | EW-30800-30 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft | Masterflex | EW-96410-14 | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work. |
| NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | |
| Rack Set F1 | Bio-Rad | 7410010 | Racks to hold collecting tubes in the fraction collector. |
| Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF | Bio-Techne | 10291-TA-020 | Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results. |
| Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm | Saint Gobain | DX263015-50 | Fits 48-well plates. |
| Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm | Saint Gobain | DX263027-10 | Fits 12-well plates. |
| Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L | Spectrum Chemicals | S-395-1LT | |
| SolidWorks | Dassault Systems | SolidWorks | CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file. |
| Varioskan LUX multimode microplate reader | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | Plate reader. |
| Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue | Michaels | 10404779 | Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm. |
References
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