Summary
该协议展示了一种使用具有不同生物标志物（即神经丝200，水泡乙酰胆碱转运蛋白，α-蹦极毒素和S100）的荧光免疫组织化学来检查大鼠内侧腓肠肌中突触前末端，突触后受体和突触周围施万细胞之间空间相关性的方法。
Abstract
神经肌肉接头（NMJ）是一种复杂的结构，用于从运动神经元到骨骼肌的信号通信，由三个基本的组织学成分组成：突触前运动轴突末端，突触后烟碱乙酰胆碱受体（AchRs）和突触周围施万细胞（PSC）。为了证明NMJ的形态学特征，选择大鼠内侧腓肠肌作为靶组织，并使用多种生物标志物进行荧光染色，包括神经丝200（NF200）和用于运动神经纤维及其突触前末端的水泡乙酰胆碱转运蛋白（VAChT），突触后烟碱AchR的α-蹦极毒素（α-BTX），进行检查， 和 S100 用于 PSC。在这项研究中，在两组中进行染色：在第一组中，用NF200，VAChT和α-BTX染色样品，在第二组中，样品用NF200，α-BTX和S100染色。结果表明，这两种协议都能有效地证明NMJ的详细结构。利用共聚焦显微镜观察突触前终末梢、突触后受体和PSC的形态特征，并以三维模式重建其Z-stacks图像，以进一步分析不同标记之间的空间相关性。从方法论上看，这些方案为研究NMJ在生理条件下的形态特征提供了有价值的参考，也适合于评价NMJ的病理改变，如周围神经损伤和再生。
Introduction
由于神经肌肉接头（NMJ）1，2，3，4的三个基本结构成分，突触前运动轴突末端的形态学方面，含有烟碱乙酰胆碱受体（AchRs）的突触后膜和突触周围施万细胞（PSC）已被广泛研究。骨骼肌的薄切片和整个安装标本已经用不同的组织学技术进行了检查，例如电子显微镜5，6，共聚焦显微镜7，8和光片显微镜9，10。虽然这些技术已经从不同方面证明了NMJ的形态特征，但作为比较，共聚焦显微镜仍然是对NMJ的详细形态进行成像的理想选择。
最近，已经开发了许多新技术来显示NMJ的结构部件。例如，thy1-YFP转基因荧光小鼠已被直接用于观察体内和体外的运动轴突和运动端板10，11。此外，静脉注射荧光α-BTX已应用于揭示野生型和转基因荧光小鼠全安装骨骼肌中运动端板的空间分布，方法是使用组织光学清除处理用光片显微镜检查9，12。然而，除了可以通过这些高级方法查看的突触前和突触后元素外，PSC不能同时被证明。
越来越多的证据表明，PSC作为外周神经胶质细胞，与突触前末梢密切相关，有助于NMJ的发展和稳定性，调节生理条件下NMJ的突触活性，以及神经损伤后NMJ的再生13，14，15.考虑到NMJ的细胞结构，该协议是同时标记PSC，突触前和突触后元素的适当候选者，并且可能用于评估NMJ在正常和病理条件下的完整性和可塑性。 例如，比较 NMJ 的强度、突触后运动端板的形态和体积、NMJ 的神经支配和去神经支配以及生理和病理状态肌肉中 PSC 的数量。
腓肠肌是形成小腿凸起的最大肌肉，通过从肢体上去除皮肤和股二头肌很容易解剖。肌肉通常被选择来评估肌肉萎缩、神经肌肉变性、肌肉表现和离体或体内运动单位力16、17、18。然而，该技术也适用于从各种骨骼肌中揭示NMJ的形态特征。同时，与薄切片7，8和挑逗的肌肉纤维19相比，厚厚的肌肉切片可以揭示更完整的NMJ形态和数量。
根据这些研究，本研究选择大鼠内侧腓肠肌作为靶组织，并根据NMJ的结构成分，以80μm的厚度切片，用各种生物标志物进行多次荧光染色。这里分别使用神经丝200（NF200）20，21，水泡乙酰胆碱转运蛋白（VAChT）22，α-蹦珠毒素（α-BTX）23，24和S10025，26分别用于标记神经纤维，突触前终末梢，突触后AchR和PSC。此外，肌肉组织和细胞核的背景进一步用鬼瘠瘩素和DAPI进行复染。
在这项研究中，我们期望开发一种改进的方案，用于在较厚的固定标本上同时染色NMJ的细胞结构及其相应的生物标志物，这更便于在共聚焦显微镜中使用，并有助于获得有关PSC，突触前和突触后元素的详细结构以及它们彼此之间的空间相关性的更多信息。从方法论的角度来看，该方案可能有助于评估NMJ在正常和病理条件下的形态特征。
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Protocol
本研究经中国中医科学院针灸研究所伦理学委员会批准（批准号：2021-04-15-1）。所有程序都是根据《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》（国家科学院出版社，华盛顿特区，1996年）进行的。使用三只成年雄性大鼠（斯普拉格 - 道利，体重230±15克）。将大鼠饲养在12小时的光/暗循环中，温度和湿度受控，并且可以自由获取食物和水。本研究的仪器和材料如图 1所示。
1. 灌注
- 腹膜内注射250mg / kg三溴乙醇溶液以诱导大鼠安乐死。
- 呼吸停止后，打开胸腔，用剪刀和镊子进入心脏。从左心室向主动脉插入静脉导管，然后切开右耳廓。
- 在罩子里灌注实验大鼠。首先用100 mL 0.9%生理盐水灌注，直到从右耳廓流出的血液清澈，然后继续用250-300 mL 4%多聚甲醛在0.1 M磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）中灌注约10分钟，直到尾巴难以弯曲。
2. 区域解剖学
- 灌注后，使用手术刀片去除双侧后肢的皮肤（图2A），并暴露双侧坐骨神经和内侧腓肠肌（图2B）。
- 使用刀片从后肢小心地解剖双侧腓肠肌（图2C），并将整个肌肉固定在10mL 4%多聚甲醛中，在0.1M PB中持续2小时。
- 从溶液中取出肌肉，并在4°C下以10mL 25%蔗糖在0.1M PB中冷冻保护肌肉1天，直到肌肉完全浸入溶液中。
3. 肌肉的冷冻切片
- 一旦肌肉组织浸入溶液中，使用冷冻切片培养基将其固定在滑动切片机系统的冷冻阶段。将肌肉沿着肌肉的长轴水平切片，厚度为80μm。
- 使用刷子将每个孔的七个冷冻切片有序地放入具有10 mL 0.1 M PB（pH 7.4）的六孔培养板中。
注意：切片按顺序放置，以便不同孔中的切片相邻，这使得用于不同污渍的部分更加一致。
4. 使用 NF200、VAChT、α-BTX 和相位进行多重荧光染色
注意：分别应用NF200，VAChT，α-BTX和Pha的多重荧光染色来揭示神经纤维，突触前末端，突触后烟碱乙酰胆碱受体和肌肉纤维。
- 将每孔4个切片与1.5mL 0.1 M PB，其中75μL10%Triton X-100（0.5%）和45μL普通驴血清（3%）在轨道振荡器上以20rpm孵育30分钟。
- 将切片转移到1.5mL含有兔抗NF200（1：1，000），山羊抗VAChT（1：500）的一抗混合溶液中，在0.1M PB（pH 7.4）和1%正常驴血清和0.5%Triton X-100中，并在4°C下孵育过夜。 第二天，在轨道振荡器上以20 rpm的速度在0.1 M PB（pH 7.4）中洗涤切片3次，每次5分钟。
- 将含有驴抗兔AF488（1：500）和驴抗山羊AF546（1：500）的二抗混合溶液以及α-BTX，AF647（1：500）和鬼臼蛋白350（1：500）的生物标志物在室温下在0.1M PB（pH 7.4）中孵育1小时。避光。
- 在0.1 M PB（pH 7.4）中洗涤3x 5分钟后，将切片安装在显微镜载玻片上。在蒸馏水中使用50%甘油将盖板玻璃涂在切片上观察。
5. 使用 NF200、S100、α-BTX 和 DAPI 进行多重荧光染色
注：程序与步骤4类似;主要区别在于一抗与其相应的二抗之间。
- 使用以下一抗：步骤4.2中的鸡抗NF200（1：6，000），兔抗S100（1：2，500）及其相应的二抗：驴抗鸡AF488（1：500）和驴抗兔AF546（1：500），以及步骤4.3中α-BTX AF647（1：500）和DAPI（1：50000）的生物标志物。
6. 观察和分析
- 使用配备以下物镜的共聚焦成像系统观察标本并拍摄图像：NA为0.75的20x镜头和NA为0.95的40x镜头。
- 使用350纳米（Pha），488纳米（NF200），546纳米（VAChT和S100），647纳米（α-BTX）或DAPI的激发和发射波长对应于多次荧光染色。将图像捕获的分辨率设置为 640 x 640 像素。
注意：之所以选择 640 x 640 像素的分辨率，是因为图像是在 Z 轴堆栈中捕获的。1024 x 1024 像素分辨率会导致 Z 轴堆叠中的成像和光漂白速度变慢。 - 设置起始焦平面和结束焦平面。将步长设置为 1 μm 或 2 μm。选择深度图案、图像捕获和 Z 系列。
- 对于以20x拍摄的较低放大倍率图像，使用105μm针孔从每个80μm厚的部分以2μm步长捕获40张图像（Z-堆栈）。选择 Z 轴上的投影/地形模式和强度投影，将所有图像集成到单个对焦中。
- 对于以40x拍摄的更高放大倍率图像，从每个80μm厚的部分以1μm步长捕获80张图像（Z-stacks），并将变焦设置为2和105μm针孔。将所有图像集成到单个对焦中。
- 如前面27所述，使用图像处理系统重建三维图案中的图像。
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Representative Results
经过多次荧光染色后，在具有NF200阳性神经纤维，VAChT阳性突触前末端，α-BTX阳性突触后AchR，S100阳性PSCs，鬼臼蛋白阳性肌肉纤维和DAPI标记细胞核的大鼠内侧腓肠肌80μm厚切片上有序地显示相应的标记（图3 和 图4）。
结果表明，NF200阳性神经纤维成束运行，并向VAChT阳性突触前末端伸出分支，与α-BTX-阳性突触后AchR形成镜像关系（图3）。此外，在靠近突触前末梢的NF200阳性神经纤维周围检测到S100阳性PSCs（图4）。
利用图像重构的优势，进一步展现了神经纤维、突触前末梢、PSC和突触后AchR的空间相关性，从不同角度显示了NMJ的详细形态特征（图3C、C1 和 图4C、C1）。
图 1.各种协议步骤的图像。 （A）在罩子里灌注老鼠。（B）解剖大鼠内侧腓肠肌。（C）在滑动切片机系统的冷冻阶段切割肌肉组织。（D）在六孔培养皿中有序地收集组织切片。（E）振荡器上的荧光染色。（F）将切片安装在显微镜载玻片上。（G）将盖玻片涂在含有50%甘油的切片上。（H）用共聚焦成像系统观察样品。 请点击此处查看此图的大图。
图 2.用于解剖大鼠内侧腓肠肌的区域解剖程序。（A）大鼠后肢肌肉外视图。（B）内侧腓肠肌及其神经支配的内视图。（C）解剖大鼠内侧腓肠肌。请点击此处查看此图的大图。
图 3.神经纤维、突触前末梢、突触后烟碱乙酰胆碱受体和大鼠内侧腓肠肌肌上的肌肉纤维的空间相关性。（A） 来自大鼠内侧腓肠肌的代表性图像，显示神经丝200（NF200），水泡乙酰胆碱转运蛋白（VAChT），α-蹦极毒素（α-BTX）和鬼瘩（Pha）的多次荧光染色。（B） 面板 A（箭头）的放大图像，详细显示了各种标签。B1-B4：图 B 与 NF200 （B1）、氮化氢化合物 （B2）、α-BTX （B3） 和相位 （B4） 一起单独显示。（C） 来自面板 B 的调整后图像，其中框架显示 （C） 中 3D 图案的前视图和 （C1） 中的后视图。B1-B4的比例尺与B中的比例尺相同 ，请点击此处查看此图的大图。
图 4.神经纤维、突触周围施万细胞、突触后烟碱乙酰胆碱受体和大鼠内侧腓肠肌上的细胞核的空间相关性。（A）来自大鼠内侧腓肠肌的代表性图像，显示神经丝200（NF200），施万细胞标志物（S100），α-蹦珠毒素（α-BTX）和细胞核标志物4'，6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）的多重荧光染色。（B） 面板 A（箭头）的放大图像，详细显示了各种标签。B1-B4：分别显示面板 B，包括 NF200 （B1）、S100 （B2）、α-BTX （B3） 和低密度聚乙烯 （B4）。（C） 来自面板 B 的调整后图像，其中框架采用 3D 模式（C），视图在 （C1） 中不带 S100 标签。B1-B4的比例尺与B中的比例尺相同，请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
我们已经描述了成功进行肌肉切片多次染色和使用荧光免疫组织化学在大鼠内侧腓肠肌厚切片上揭示NMJ的形态学特征所需的技术细节。通过使用这种方法，可以在共聚焦显微镜下分析和理解PSC与突触前后元素的精细细节和空间相关性，并以三维模式进一步重建。这里使用各种生物标志物来揭示NMJ的形态特征，其中，NF200在有髓鞘轴突20，21上高度表达，VAChT在突触前末端22上积累，α-BTX在突触后AchRs23，24上显示，S100在PSCs上显示25，26.将我们和以前研究的结果结合起来表明，这些生物标志物可以根据实验设计自由组合以标记NMJ的结构元素，以评估它们彼此之间的空间关系1，28，29。
为了使用这种技术获得理想的成像效果，修复后时间是一个需要注意的重要问题，因为过度固定可能导致高背景。因此，建议修复后时间在修复解决方案中不要超过 2 小时。此外，为了在肌肉切片中观察到更多的NMJ，沿着80 μm的长轴水平切片肌肉至关重要，这可以全面证明NMJ中突触前终末梢、突触后AchR和PSCs的空间相关性。在这里，应该强调的是，滑动切片机是切片肌肉组织的便捷工具。同样，低温恒温器和振动筛也可用于获得厚截面。
综上所述，NMJ的形态特征通过采用不同的技术，从二维组织学切片到三维全贴片组织得到了广泛的研究。考虑到使用电子显微镜和光片显微镜检查组织治疗费力且耗时，在较厚的组织切片上进行多次荧光染色仍然是使用共聚焦显微镜有效探索NMJ立体结构的便捷方法。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
本研究由CACMS创新基金资助（No.CI2021A03407），国家自然科学基金（第82004299号），中央公益事业单位基础研究基金（编号：ZZ13-YQ-068;ZZ14-YQ-032;ZZ14-YQ-034;ZZ201914001;ZZ202017006;ZZ202017015）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
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