Summary
Il protocollo mostra un metodo per esaminare la correlazione spaziale tra i terminali pre-sinaptici, i recettori post-sinaptici e le cellule di Schwann peri-sinaptiche nel muscolo gastrocnemio mediale del ratto utilizzando immunoistochimica fluorescente con diversi biomarcatori, vale a dire, neurofilamento 200, trasportatore vescicolare dell'acetilcolina, alfa-bungarotossina e S100.
Abstract
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è una struttura complessa che serve per la comunicazione del segnale dal motoneurone al muscolo scheletrico ed è costituita da tre componenti istologiche essenziali: i terminali dell'assone motorio pre-sinaptico, i recettori nicotinici post-sinaptici dell'acetilcolina (AchRs) e le cellule di Schwann peri-sinaptiche (PSC). Al fine di dimostrare le caratteristiche morfologiche di NMJ, il muscolo gastrocnemio mediale del ratto è stato selezionato come tessuto bersaglio ed esaminato utilizzando colorazioni fluorescenti multiple con vari tipi di biomarcatori, tra cui neurofilamento 200 (NF200) e trasportatore vescicolare di acetilcolina (VAChT) per le fibre nervose motorie e i loro terminali pre-sinaptici, alfa-bungarotossina (α-BTX) per gli AchR nicotinici post-sinaptici, e S100 per gli sportelli unici. In questo studio, la colorazione è stata eseguita in due gruppi: nel primo gruppo, i campioni sono stati colorati con NF200, VAChT e α-BTX, e nel secondo gruppo, i campioni sono stati colorati con NF200, α-BTX e S100. È stato dimostrato che entrambi i protocolli possono dimostrare efficacemente la struttura dettagliata di NMJ. Utilizzando il microscopio confocale, sono state osservate le caratteristiche morfologiche dei terminali pre-sinaptici, dei recettori post-sinaptici e del PSC e le loro immagini Z-stacks sono state ricostruite in un modello tridimensionale per analizzare ulteriormente la correlazione spaziale tra le diverse etichette. Dal punto di vista metodologico, questi protocolli forniscono un valido riferimento per indagare le caratteristiche morfologiche della NMJ in condizioni fisiologiche, che possono essere idonee anche a valutare l'alterazione patologica della NMJ, come la lesione e la rigenerazione del nervo periferico.
Introduction
Come tre componenti strutturali essenziali della giunzione neuromuscolare (NMJ)1,2,3,4, gli aspetti morfologici dei terminali dell'assone motorio pre-sinaptico, della membrana post-sinaptica contenente recettori nicotinici dell'acetilcolina (AchR) e delle cellule di Schwann peri-sinaptiche (PSC) sono stati ampiamente studiati. Sezioni sottili e campioni interi dei muscoli scheletrici sono stati esaminati con diverse tecniche istologiche, come la microscopia elettronica 5,6, la microscopia confocale 7,8 e la microscopia a foglio luminoso 9,10. Sebbene le caratteristiche morfologiche di NMJ siano state dimostrate da queste tecniche da diversi aspetti, come confronto, la microscopia confocale è ancora una scelta ideale per l'imaging della morfologia dettagliata di NMJ.
Recentemente, sono state sviluppate molte nuove tecnologie per mostrare i componenti strutturali di NMJ. Ad esempio, i topi fluorescenti transgenici thy1-YFP sono stati utilizzati direttamente per osservare gli assoni motori e le piastre terminali del motore in vivo e in vitro10,11. Inoltre, l'iniezione endovenosa di α-BTX fluorescente è stata applicata per rivelare la distribuzione spaziale delle piastre terminali motorie nei muscoli scheletrici a montaggio intero di topi fluorescenti wild-type e transgenici, utilizzando il trattamento di compensazione ottica dei tessuti per l'esame con microscopia a foglio luminoso 9,12. Tuttavia, a parte gli elementi pre e post-sinaptici che possono essere visualizzati con questi metodi avanzati, i PSC non possono essere dimostrati allo stesso tempo.
L'accumulo di prove indica che le PSC, come le cellule gliali periferiche, sono strettamente associate ai terminali pre-sinaptici che contribuiscono allo sviluppo e alla stabilità della NMJ, alla modulazione dell'attività sinaptica della NMJ nella condizione fisiologica e alla rigenerazione della NMJ dopo la lesione nervosa 13,14,15 . Considerando l'architettura cellulare di NMJ, questo protocollo è un candidato appropriato per etichettare contemporaneamente le PSC, gli elementi pre e post-sinaptici, ed è potenzialmente utilizzato per valutare l'integrità e la plasticità del NMJ in condizioni normali e patologiche. Ad esempio, confrontare l'intensità di NMJ, la morfologia e il volume delle placche motorie post-sinaptiche, l'innervazione e la denervazione di NMJ e il numero di PSC nei muscoli di stato fisiologico e patologico.
Il muscolo gastrocnemio è il muscolo più grande che forma il rigonfiamento nel polpaccio, che viene facilmente sezionato rimuovendo la pelle e il muscolo bicipite femorale dall'arto. Il muscolo viene spesso scelto per valutare l'atrofia muscolare, la degenerazione neuromuscolare, le prestazioni muscolari e la forza dell'unità motoria ex vivo o in vivo 16,17,18. Tuttavia, la tecnica è adatta anche per rivelare le caratteristiche morfologiche di NMJ da vari muscoli scheletrici. Allo stesso tempo, le sezioni muscolari spesse possono rivelare una morfologia e una quantità più complete di NMJ rispetto alle sezioni sottili 7,8 e alle fibre muscolari stuzzicate19.
In linea con questi studi, il muscolo gastrocnemio mediale del ratto è stato selezionato come tessuto bersaglio in questo studio ed è stato affettato ad uno spessore di 80 μm per la colorazione fluorescente multipla con vari tipi di biomarcatori in base ai componenti strutturali di NMJ. Qui, neurofilamento 200 (NF200) 20,21, trasportatore vescicolare di acetilcolina (VAChT) 22, alfa-bungarotossina (α-BTX) 23,24 e S10025,26 sono stati utilizzati per etichettare rispettivamente fibre nervose, terminali pre-sinaptici, AchR post-sinaptici e PSC. Inoltre, lo sfondo del tessuto muscolare e dei nuclei cellulari è stato ulteriormente controinziato con falloidina e DAPI.
In questo studio, ci aspettiamo di sviluppare un protocollo raffinato per colorare simultaneamente l'architettura cellulare di NMJ con i loro corrispondenti biomarcatori su campioni fissi più spessi, che è più conveniente per l'uso in microscopia confocale e aiuta a ottenere molte più informazioni sulla struttura dettagliata delle PSC, sugli elementi pre e post-sinaptici, nonché sulla loro correlazione spaziale tra loro. Dal punto di vista della metodologia, questo protocollo può trarre beneficio per valutare le caratteristiche morfologiche di NMJ in condizioni normali e patologiche.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto di Agopuntura e Moxibustione, China Academy of Chinese Medical Sciences (approvazione n. 2021-04-15-1). Tutte le procedure sono state condotte in conformità con la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Sono stati utilizzati tre ratti maschi adulti (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). I ratti sono stati alloggiati in un ciclo luce/buio di 12 ore con temperatura e umidità controllate e con libero accesso a cibo e acqua. Gli strumenti e i materiali per questo studio sono mostrati nella Figura 1.
1. Perfusione
- Iniettare 250 mg/kg di soluzione di tribromoetanolo per via intraperitoneale per indurre l'eutanasia dei ratti.
- Una volta che la respirazione si ferma, aprire la cavità toracica per accedere al cuore usando forbici e pinze. Inserire un catetere endovenoso dal ventricolo cardiaco sinistro verso l'aorta, quindi tagliare il padiglione auricolare destro.
- Perfondi i ratti sperimentali nel cappuccio. Iniziare perfondendo con 100 ml di soluzione salina normale allo 0,9% fino a quando il sangue che esce dal padiglione auricolare destro è chiaro, quindi continuare a perfondere con 250-300 ml di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M (PB, pH 7,4) per circa 10 minuti fino a quando la coda è difficile da piegare.
2. Anatomia regionale
- Dopo la perfusione, rimuovere la pelle dell'arto posteriore bilaterale utilizzando una lama chirurgica (Figura 2A) ed esporre il nervo sciatico bilaterale e il muscolo gastrocnemio mediale (Figura 2B).
- Sezionare accuratamente il muscolo gastrocnemio mediale bilaterale dall'arto posteriore usando una lama (Figura 2C) e post-fissare l'intero muscolo in 10 ml di paraformaldeide al 4% in 0,1 M PB per 2 ore.
- Rimuovere il muscolo dalla soluzione e crioproteggere il muscolo in 10 ml di saccarosio al 25% in 0,1 M PB per 1 giorno a 4 °C fino a quando il muscolo non è completamente immerso nella soluzione.
3. Criosezione del muscolo
- Una volta che il tessuto muscolare è immerso nella soluzione, fissarlo su uno stadio di congelamento di un sistema di microtomo scorrevole utilizzando un mezzo di sezione congelato. Affettare il muscolo orizzontalmente lungo l'asse lungo del muscolo allo spessore di 80 μm.
- Posizionare sette sezioni criologiche per pozzetto in modo ordinato in una piastra di coltura a sei pozzetti con 10 ml di PB 0,1 M (pH 7,4) usando un pennello.
NOTA: le sezioni sono disposte in ordine in modo che le sezioni in diversi pozzetti siano adiacenti, il che rende più coerenti le sezioni utilizzate per le diverse macchie.
4. Colorazione fluorescente multipla con NF200, VAChT, α-BTX e Pha
NOTA: La colorazione fluorescente multipla con NF200, VAChT, α-BTX e Pha è stata applicata per rivelare rispettivamente le fibre nervose, i terminali pre-sinaptici, i recettori nicotinici dell'acetilcolina post-sinaptica e le fibre muscolari.
- Incubare quattro sezioni per pozzetto con 1,5 mL di 0,1 M PB contenenti 75 μL di 10% Triton X-100 (0,5%) e 45 μL di siero d'asino normale (3%) su uno shaker orbitale a 20 giri / min per 30 minuti.
- Trasferire le sezioni in 1,5 mL di soluzione mista di anticorpi primari contenenti anti-NF200 di coniglio (1:1.000), anti-VAChT di capra (1:500) in 0,1 M PB (pH 7,4) con siero d'asino normale all'1% e 0,5% di Triton X-100 e incubare durante la notte a 4 °C. Il giorno successivo, lavare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuna in 0,1 M PB (pH 7,4) su uno shaker orbitale a 20 giri / min.
- Incubare le sezioni in 1,5 mL di soluzione mista di anticorpi secondari contenenti asino anti-coniglio AF488 (1:500) e asino anti-capra AF546 (1:500), nonché i biomarcatori di α-BTX, AF647 (1:500) e falloidina 350 (1:500) in 0,1 M PB (pH 7,4) contenenti l'1% di siero d'asino normale e lo 0,5% di Triton X-100 per 1 ora a temperatura ambiente. Proteggere dalla luce.
- Dopo il lavaggio 3 volte per 5 minuti ciascuno in 0,1 M PB (pH 7,4), montare le sezioni su vetrini per microscopio. Applicare il vetro di copertura alle sezioni utilizzando il 50% di glicerina in acqua distillata per l'osservazione.
5. Colorazione fluorescente multipla con NF200, S100, α-BTX e DAPI
NOTA: le procedure sono simili a quelle del passaggio 4; la principale differenza è tra gli anticorpi primari e i loro corrispondenti anticorpi secondari.
- Utilizzare i seguenti anticorpi primari: pollo anti-NF200 (1:6.000), coniglio anti-S100 (1:2.500) nel passo 4.2 e i loro corrispondenti anticorpi secondari: asino anti-pollo AF488 (1:500) e asino anti-coniglio AF546 (1:500), così come i biomarcatori di α-BTX AF647 (1:500) e DAPI (1:50000) nel passaggio 4.3.
6. Osservazione e analisi
- Osservare il campione e scattare immagini utilizzando un sistema di imaging confocale dotato dei seguenti obiettivi: obiettivo 20x con NA di 0,75 e obiettivo 40x con NA di 0,95.
- Utilizzare lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 350 nm (Pha), 488 nm (NF200), 546 nm (VAChT e S100), 647 nm (α-BTX) o DAPI corrispondenti alla colorazione fluorescente multipla. Impostare la risoluzione di acquisizione dell'immagine su 640 x 640 pixel.
NOTA: la risoluzione di 640 x 640 pixel viene scelta perché le immagini sono state acquisite in Z-stack. Una risoluzione di 1024 x 1024 pixel si traduce in immagini lente e fotosbiancamento negli stack Z. - Impostare il piano focale iniziale e il piano focale finale. Impostare la dimensione del passo su 1 μm o 2 μm. Scegli il modello di profondità, l'acquisizione dell'immagine e la serie Z.
- Per le immagini a basso ingrandimento scattate a 20x, acquisire 40 immagini (Z-stacks) in 2 μm step size da ogni sezione spessa 80 μm utilizzando un foro stenopeico da 105 μm. Scegli la modalità di proiezione/topografia e la proiezione di intensità sull'asse Z per integrare tutte le immagini in un'unica messa a fuoco.
- Per le immagini con ingrandimento più elevato scattate a 40x, cattura 80 immagini (Z-stacks) in passi da 1 μm da ogni sezione spessa 80 μm con zoom impostato su 2 e un foro stenopeico da 105 μm. Integra tutte le immagini in un'unica messa a fuoco.
- Ricostruire le immagini nel modello tridimensionale con il sistema di elaborazione delle immagini come precedentemente descritto in27.
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Representative Results
Dopo una colorazione fluorescente multipla, l'etichettatura corrispondente è stata dimostrata ordinatamente sulle sezioni spesse 80 μm del muscolo gastrocnemio mediale del ratto con fibre nervose NF200-positive, terminali pre-sinaptici VAChT-positivi, AchR post-sinaptici α-BTX-positivi, PSC S100-positivi, fibre muscolari falloidine-positive e nuclei cellulari marcati CON DAPI (Figura 3 e Figura 4).
È stato dimostrato che le fibre nervose NF200-positive correvano in fascio e distribuivano rami ai terminali pre-sinaptici VAChT-positivi che formavano una relazione speculare con gli AchR post-sinaptici α-BTX-positivi (Figura 3). Inoltre, le PSC S100-positive sono state rilevate intorno alle fibre nervose NF200-positive vicino ai terminali pre-sinaptici (Figura 4).
Sfruttando la ricostruzione dell'immagine, la correlazione spaziale delle fibre nervose, dei terminali pre-sinaptici, delle PSC e degli AchR post-sinaptici è stata ulteriormente esposta in un modello tridimensionale che mostra le caratteristiche morfologiche dettagliate di NMJ da diverse prospettive (Figura 3C, C1 e Figura 4C, C1).
Figura 1. Immagini dei vari passaggi del protocollo. (A) Perfondere il ratto nel cappuccio. (B) Sezionare il muscolo gastrocnemio mediale di ratto. (C) Tagliare il tessuto muscolare su uno stadio di congelamento del sistema a microtomo scorrevole. (D) Raccogliere le sezioni di tessuto in modo ordinato in un piatto a sei pozzetti. (E) Colorazione fluorescente sullo shaker. (F) Montare le sezioni su vetrini per microscopio. (G) Applicare coverslips alle sezioni con glicerina al 50%. (H) Osservare i campioni con un sistema di imaging confocale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Procedura di anatomia regionale per la dissezione del muscolo gastrocnemio mediale del ratto. (A) Vista esterna dei muscoli dell'arto posteriore del ratto. (B) Vista interna del muscolo gastrocnemio mediale e della sua innervazione. (C) Dissezione del muscolo gastrocnemio mediale del ratto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Correlazione spaziale delle fibre nervose, dei terminali pre-sinaptici, dei recettori nicotinici dell'acetilcolina post-sinaptica e delle fibre muscolari sul muscolo gastrocnemio mediale del ratto. (A) Immagine rappresentativa del muscolo gastrocnemio mediale di ratto che mostra la colorazione fluorescente multipla con neurofilamento 200 (NF200), trasportatore vescicolare dell'acetilcolina (VAChT), alfa-bungarotossina (α-BTX) e falloidina (Pha). (B) L'immagine ingrandita dal pannello A (punta di freccia) che mostra le varie etichette in dettaglio. B1-B4: pannello B mostrato separatamente con NF200 (B1), VAChT (B2), α-BTX (B3) e Pha (B4). (C) Le immagini regolate dal pannello B con la cornice che mostra la vista frontale del modello 3D in (C) e la vista posteriore in (C1). Stessa barra di scala per B1-B4 come in B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Correlazione spaziale delle fibre nervose, delle cellule di Schwann peri-sinaptiche, dei recettori nicotinici dell'acetilcolina post-sinaptica e dei nuclei cellulari sul muscolo gastrocnemio mediale del ratto. (A) Immagine rappresentativa del muscolo gastrocnemio mediale del ratto che mostra la colorazione fluorescente multipla con neurofilamento 200 (NF200), marcatore cellulare di Schwann (S100), alfa-bungarotossina (α-BTX) e marcatore del nucleo cellulare 4',6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI). (B) L'immagine ingrandita dal pannello A (punta di freccia) che mostra le varie etichette in dettaglio. B1-B4: mostra il pannello B separatamente con NF200 (B1), S100 (B2), α-BTX (B3) e DAPI (B4). (C) Le immagini regolate dal pannello B con la cornice in un modello 3D in (C) e la vista senza etichettatura S100 in (C1). Stessa barra di scala per B1-B4 come in B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo descritto i dettagli tecnici necessari per eseguire con successo la colorazione multipla di fette muscolari e l'uso di immunoistochimica fluorescente per rivelare le caratteristiche morfologiche di NMJ sulle sezioni spesse del muscolo gastrocnemio mediale di ratto. Utilizzando questo approccio, i dettagli fini e la correlazione spaziale delle PSC e degli elementi pre e post-sinaptici possono essere analizzati e apprezzati sotto microscopia confocale e ulteriormente ricostruiti in un modello tridimensionale. Qui, sono stati utilizzati vari tipi di biomarcatori per rivelare le caratteristiche morfologiche di NMJ, in cui NF200 è altamente espresso sugli assoni mielinizzati20,21, VAChT accumulato ai terminali pre-sinaptici22, α-BTX è esposto sugli AchR post-sinaptici23,24 e S100 è mostrato sui PSC25,26 . Prendendo insieme i nostri risultati e quelli di studi precedenti indica che questi biomarcatori possono essere combinati liberamente per etichettare gli elementi strutturali di NMJ secondo il disegno sperimentale per valutare la loro relazione spaziale tra loro 1,28,29.
Per ottenere l'imaging ideale con questa tecnica, il tempo post-correzione è un problema importante a cui prestare attenzione perché l'eccessiva fissazione può causare uno sfondo elevato. Pertanto, si consiglia di non superare le 2 ore di tempo nella soluzione di correzione. Inoltre, al fine di osservare più NMJ nelle sezioni muscolari, è fondamentale tagliare il muscolo orizzontalmente lungo l'asse lungo ad uno spessore di 80 μm, che può dimostrare in modo completo la correlazione spaziale dei terminali pre-sinaptici, degli AchR post-sinaptici e dei PSC nel NMJ. Qui, va sottolineato che un microtome scorrevole è uno strumento conveniente per affettare il tessuto muscolare. Allo stesso modo, un criostato e un vibratoma possono anche essere utilizzati per ottenere sezioni spesse.
In sintesi, le caratteristiche morfologiche di NMJ sono state ampiamente studiate da sezioni istologiche bidimensionali a tessuto tridimensionale a montaggio intero utilizzando tecniche diverse. Considerando i trattamenti tissutali laboriosi e dispendiosi in termini di tempo per l'esame con microscopia elettronica e microscopia a foglio luminoso, la colorazione fluorescente multipla sulla sezione del tessuto più spesso è ancora un approccio conveniente per esplorare efficacemente l'architettura stereologica di NMJ utilizzando la microscopia confocale.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato dal CACMS Innovation Fund (No. CI2021A03407), National Natural Science Foundation of China (n. 82004299) e i fondi di ricerca fondamentale per gli istituti centrali di ricerca sul benessere pubblico (n. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
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