Summary
상기 프로토콜은 상이한 바이오마커, 즉, 뉴로필라멘트 200, 수포성 아세틸콜린 수송체, 알파-분가로톡신 및 S100을 갖는 형광 면역조직화학을 사용하여 래트 내측 위장관근에서 시냅스 전 말단, 시냅스 후 수용체, 및 시냅스 주변 슈완 세포 사이의 공간적 상관관계를 조사하는 방법을 나타낸다.
Abstract
신경근 접합부 (NMJ)는 운동 뉴런에서 골격근으로의 신호 전달을 담당하는 복잡한 구조이며 시냅스 전 운동 축삭 말단, 시냅스 후 니코틴 아세틸 콜린 수용체 (AchRs) 및 시냅스 주위 슈완 세포 (PSCs)의 세 가지 필수 조직 학적 구성 요소로 구성됩니다. NMJ의 형태학적 특성을 입증하기 위하여, 래트 내측 위장관근을 표적 조직으로 선정하고, 운동 신경 섬유 및 이들의 시냅스 전 말단에 대한 뉴로필라멘트 200(NF200) 및 수포성 아세틸콜린 수송체(VAChT)를 포함하는 다양한 종류의 바이오마커와 함께 다중 형광 염색을 사용하여 시냅스 후 니코틴 AchRs에 대한 알파-분가로톡신(α-BTX)을 조사하고, 및 PSC에 대한 S100. 이 연구에서, 염색은 두 그룹으로 수행되었다: 첫 번째 그룹에서, 샘플은 NF200, VAChT, 및 α-BTX로 염색되었고, 두 번째 그룹에서는 샘플을 NF200, α-BTX 및 S100으로 염색하였다. 두 프로토콜 모두 NMJ의 상세한 구조를 효과적으로 입증할 수 있음을 보여주었다. 공초점 현미경을 사용하여 시냅스 전 말단, 시냅스 후 수용체 및 PSC의 형태 학적 특성을 관찰하고 Z 스택 이미지를 입체 패턴으로 재구성하여 다른 라벨링 간의 공간 상관 관계를 추가로 분석했습니다. 방법론의 관점에서, 이들 프로토콜은 생리학적 조건 하에서 NMJ의 형태학적 특성을 조사하기 위한 유용한 참고문헌을 제공하며, 이는 또한 말초 신경 손상 및 재생과 같은 NMJ의 병리학적 변경을 평가하는데 적합할 수 있다.
Introduction
신경 근 접합부(NMJ)1,2,3,4의 3가지 필수 구조적 성분으로서, 시냅스 전 운동 축삭 말단의 형태학적 측면, 니코틴성 아세틸콜린 수용체(AchRs)를 함유하는 시냅스 후 막, 및 시냅스 주위 슈완 세포(PSCs)가 광범위하게 조사되었다. 골격근의 얇은 절편 및 전체 탑재 표본은 전자 현미경 5,6, 공초점 현미경 7,8 및 광 시트 현미경 9,10과 같은 다른 조직학적 기술로 검사되었습니다. NMJ의 형태학적 특성이 상이한 측면에서의 이들 기술에 의해 입증되었지만, 비교로서, 공초점 현미경은 여전히 NMJ의 상세한 형태학의 이미징을 위한 이상적인 선택이다.
최근에는 NMJ의 구조적 성분을 보여주기 위한 많은 신기술이 개발되고 있다. 예를 들어, thy1-YFP 트랜스제닉 형광 마우스는 생체내 및 시험관내10,11에서 운동 축삭 및 운동 말단 플레이트를 관찰하는데 직접 사용되어 왔다. 추가적으로, 형광 α-BTX의 정맥내 주사는 광시트 현미경 9,12로 검사하기 위해 조직 광학 클리어링 치료를 사용하여 야생형 및 트랜스제닉 형광 마우스의 전체 탑재 골격근에서 모터 엔드 플레이트의 공간적 분포를 밝히기 위해 적용되었다. 그러나 이러한 고급 방법으로 볼 수있는 시냅스 전후 요소 외에도 PSC를 동시에 시연 할 수 없습니다.
축적 증거는 말초 신경교 세포로서 PSCs가 NMJ의 발달 및 안정성, 생리적 조건 하에서 NMJ의 시냅스 활성의 조절, 신경 손상 후 NMJ의 재생에 기여하는 시냅스 전 말단과 밀접하게 관련되어 있음을 나타냅니다13,14,15 . NMJ의 세포 구조를 고려할 때, 이 프로토콜은 PSC, 시냅스 전후 및 사후 요소를 동시에 표지하는 적절한 후보이며, 정상 및 병리학적 조건 하에서 NMJ의 완전성 및 가소성을 평가하는데 잠재적으로 사용된다. 예를 들어, NMJ의 강도, 시냅스 후 운동 말단판의 형태학 및 부피, NMJ의 신경과민 및 탈핵, 생리적 및 병리학적 상태의 근육에서의 PSC의 수를 비교한다.
위장관 근육은 종아리에서 부풀어 오르는 가장 큰 근육으로, 사지에서 피부와 이두박근 대퇴골 근육을 제거하여 쉽게 해부됩니다. 근육은 종종 근육 위축, 신경근 변성, 근육 성능 및 운동 유닛 힘을 생체외 또는 생체내 16,17,18에서 평가하기 위해 선택된다. 그러나, 상기 기술은 또한 다양한 골격근으로부터 NMJ의 형태학적 특성을 드러내는데 적합하다. 동시에, 두꺼운 근육 절편은 얇은 절편(7,8) 및 놀린 근섬유(19)에 비해 NMJ의 더 완전한 형태학 및 양을 나타낼 수 있다.
이들 연구에 따라, 래트 내측 위장관 근육을 본 연구에서 표적 조직으로 선택하였고, NMJ의 구조적 성분에 따라 다양한 종류의 바이오마커로 다중 형광 염색을 위해 80 μm의 두께로 슬라이스하였다. 여기서, 뉴로필라멘트 200(NF200)20,21, 수포아세틸콜린 수송체(VAChT)22, 알파-분가로톡신(α-BTX)23,24, 및 S10025,26을 각각 신경섬유, 시냅스 전 말단, 시냅스 후 AchRs, 및 PSCs를 표지하는데 사용하였다. 또한, 근육 조직 및 세포 핵의 배경은 팔로이드인 및 DAPI로 추가로 역염색되었다.
이 연구에서, 우리는 NMJ의 세포 구조를 더 두꺼운 고정 표본에 상응하는 바이오마커와 동시에 염색하기위한 정제 된 프로토콜을 개발할 것으로 기대하며, 이는 공초점 현미경 검사에 사용하기에 더 편리하며 PSC의 상세한 구조, 시냅스 전후 요소의 세부 구조 및 서로에 대한 공간적 상관 관계에 대한 훨씬 더 많은 정보를 얻는 데 도움이됩니다. 방법론의 관점에서, 이 프로토콜은 정상 및 병리학적 조건 하에서 NMJ의 형태학적 특성을 평가하는 데 도움이 될 수 있다.
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Protocol
이 연구는 중국 의학 아카데미 침술 및 Moxibustion 연구소의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (승인 번호 2021-04-15-1). 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 가이드 (National Academy Press, Washington, D.C., 1996)에 따라 수행되었습니다. 세 마리의 성인 수컷 래트(Sprague-Dawley, 체중 230 ± 15 g)를 사용하였다. 쥐는 온도와 습도가 조절되고 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있는 12 시간의 빛 / 어두운주기에 보관되었습니다. 이 연구를 위한 장비 및 재료는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 관류
- 쥐의 안락사를 유도하기 위해 250 mg / kg 트리브로모 에탄올 용액을 복강내 주입하십시오.
- 호흡이 멈추면 흉강을 열어 가위와 포셉을 사용하여 심장에 접근하십시오. 왼쪽 심장 심실에서 대동맥쪽으로 정맥 내 카테터를 삽입 한 다음 오른쪽 귀를 자릅니다.
- 실험용 쥐를 후드에 퍼퓨즈하십시오. 우측 귀에서 빠져 나오는 혈액이 맑을 때까지 0.9% 정상 식염수 100mL로 관류한 다음, 꼬리가 구부러지기 어려울 때까지 약 10분 동안 0.1M 인산염 완충액(PB, pH 7.4) 중의 4% 파라포름알데히드 250-300mL로 계속 관류시킨다.
2. 지역 해부학
- 관류 후, 수술용 블레이드(도 2A)를 이용하여 양측 뒷다리의 피부를 제거하고 양측 좌골 신경과 내측 위장관근을 노출시킨다(도 2B).
- 블레이드 (그림 2C)를 사용하여 뒷다리에서 양측 내측 위장관 근육을 조심스럽게 해부하고 2 시간 동안 0.1 M PB 중의 4 % 파라포름 알데히드 10 mL에 전체 근육을 고정시킨 후 고정시킨다.
- 용액으로부터 근육을 제거하고 근육이 용액에 완전히 침지될 때까지 4°C에서 1일 동안 0.1 M PB 중의 25% 수크로오스 10 mL에서 근육을 냉동보호한다.
3. 근육의 주름 절제술
- 근육 조직이 용액에 침지되면 냉동 부분 배지를 사용하여 슬라이딩 마이크로톰 시스템의 동결 단계에 고정하십시오. 80 μm 두께로 근육의 긴 축을 따라 근육을 수평으로 슬라이스하십시오.
- 브러시를 사용하여 10 mL의 0.1 M PB (pH 7.4)가 있는 6-웰 배양 플레이트에 웰 당 7개의 냉동 절편을 질서 정연한 방식으로 배치한다.
참고: 섹션은 서로 다른 웰의 섹션이 인접하도록 순서대로 배치되므로 다른 얼룩에 사용되는 섹션을보다 일관되게 만듭니다.
4. NF200, VAChT, α-BTX 및 Pha를 사용한 다중 형광 염색
참고: NF200, VAChT, α-BTX 및 Pha를 사용한 다중 형광 염색을 적용하여 신경 섬유, 시냅스 전 말단, 시냅스 후 니코틴성 아세틸콜린 수용체 및 근육 섬유를 각각 밝혀냈습니다.
- 웰당 4개의 절편을 10% 트리톤 X-100(0.5%)과 45μL의 정상 당나귀 혈청(3%)의 75μL를 함유하는 0.1 M PB 1.5mL와 함께 20 rpm의 오비탈 진탕기 상에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 절편을 토끼 항-NF200 (1:1,000), 염소 항-VAChT (1:500)를 함유하는 1차 항체의 혼합 용액 1.5 mL를 1% 정상 당나귀 혈청, 및 0.5% 트리톤 X-100과 함께 0.1 M PB (pH 7.4) 중의 전사하고, 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 다음날, 절편을 20 rpm에서 오비탈 진탕기 상에서 각각 0.1 M PB (pH 7.4) 중에서 5분 동안 3x 세척한다.
- 절편을 당나귀 항-토끼 AF488 (1:500) 및 당나귀 항-염소 AF546 (1:500)을 함유하는 이차 항체의 혼합 용액 1.5 mL에서 실온에서 1시간 동안 1시간 동안 인큐베이션하고, α-BTX, AF647 (1:500) 및 남표로이드 350 (1:500)의 바이오마커를 1% 정상 당나귀 혈청 및 0.5% 트리톤 X-100을 함유하는 0.1 M PB (pH 7.4) 중의 바이오마커를 인큐베이션한다. 빛으로부터 보호하십시오.
- 0.1 M PB (pH 7.4)로 각각 5분 동안 3x 세척한 후, 절편을 현미경 슬라이드에 장착하였다. 관찰을 위해 증류수에 50 % 글리세린을 사용하여 커버 글라스를 섹션에 바르십시오.
5. NF200, S100, α-BTX 및 DAPI를 사용한 다중 형광 염색
참고: 절차는 단계 4의 절차와 유사합니다. 주요 차이점은 일차 항체와 상응하는 이차 항체 사이입니다.
- 단계 4.2에서 닭 항-NF200 (1:6,000), 토끼 항-S100 (1:2,500) 및 이들의 상응하는 2차 항체: 당나귀 항-닭 AF488 (1:500) 및 당나귀 항토끼 AF546 (1:500), 뿐만 아니라 단계 4.3에서 α-BTX AF647 (1:500) 및 DAPI (1:50000)의 바이오마커를 사용한다.
6. 관찰 및 분석
- 시편을 관찰하고 다음과 같은 대물 렌즈가 장착 된 공초점 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 촬영하십시오 : 0.75의 NA가있는 20x 렌즈와 0.95의 NA가있는 40x 렌즈.
- 다중 형광 염색에 상응하는 350 nm (Pha), 488 nm (NF200), 546 nm (VAChT 및 S100), 647 nm (α-BTX) 또는 DAPI의 여기 및 방출 파장을 사용한다. 이미지 캡처 해상도를 640 x 640 픽셀로 설정합니다.
참고: 640 x 640 픽셀 해상도는 이미지가 Z 스택으로 캡처되었기 때문에 선택됩니다. 1024 x 1024 픽셀 해상도로 Z 스택에서 이미징 및 광표백이 느려집니다. - 시작 초점 평면과 끝 초점 평면을 설정합니다. 스텝 크기를 1μm 또는 2μm로 설정합니다. 깊이 패턴, 이미지 캡처 및 Z 시리즈를 선택합니다.
- 20x에서 촬영된 하부 배율 이미지의 경우, 105 μm 핀홀을 사용하여 각 80 μm 두께의 섹션으로부터 2 μm 스텝 크기로 40개의 이미지(Z-스택)를 캡처한다. Z축을 통한 프로젝션/지형 모드와 강도 투영을 선택하여 모든 이미지를 단일 초점으로 통합합니다.
- 40x에서 촬영된 더 높은 배율 이미지의 경우, 줌을 2로 설정하고 105μm 핀홀을 사용하여 각 80μm 두께의 섹션에서 1μm 스텝 크기로 80개의 이미지(Z-스택)를 캡처합니다. 모든 이미지를 단일 초점으로 통합합니다.
- 도27에서 앞서 설명된 바와 같이 이미지 처리 시스템을 이용하여 입체 패턴의 이미지를 재구성한다.
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Representative Results
다중 형광 염색 후, 상응하는 표지는 NF200 양성 신경 섬유, VAChT 양성 시냅스 전 시냅스 말단, α-BTX 양성 시냅스 후 AchRs, S100 양성 PSCs, 팔로이드 양성 근육 섬유, 및 DAPI 표지된 세포 핵을 갖는 래트 내측 위장관 근육의 80 μm 두께 절편에서 질서 정연하게 입증되었다 (도 3 및 도 4).
NF200 양성 신경 섬유가 다발로 달리고 VAChT 양성 사전 시냅스 말단에 분기하여 α-BTX 양성 후 시냅스 후 AchRs와 미러 관계를 형성하는 것으로 나타났습니다 (그림 3). 또한, S100 양성 PSCs는 시냅스 전 말단에 가까운 NF200 양성 신경 섬유 주위에서 검출되었다(도 4).
영상 재구성을 이용함으로써, 신경 섬유, 시냅스 전 말단, PSC 및 시냅스 후 AchRs의 공간적 상관관계를 상이한 관점에서 NMJ의 상세한 형태학적 특성을 나타내는 3차원 패턴으로 더 나타내었다(도 3C, C1 및 도 4C, C1).
그림 1. 다양한 프로토콜 단계의 이미지. (A) 후드에 쥐를 정독시킨다. (B) 쥐 내측 위장관 근육을 해부한다. (C) 슬라이딩 마이크로톰 시스템의 동결 단계에서 근육 조직을 절단한다. (D) 여섯 웰 접시에 질서 정연하게 조직 절편을 수집한다. (e) 진탕기 상의 형광 염색. (F) 현미경 슬라이드에 섹션을 장착합니다. (G) 커버 슬립을 50 % 글리세린이있는 부분에 적용하십시오. (H) 공초점 이미징 시스템으로 샘플을 관찰한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 쥐 내측 위장관 근육을 해부하기위한 국소 해부학 절차. (A) 쥐 뒷다리의 근육의 외부보기. (B) 내측 위장관 근육과 그 신경질의 내부보기. (c) 쥐 내측 위장관 근육을 해부한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 신경 섬유의 공간적 상관관계, 시냅스 전 말단, 시냅스 후 니코틴성 아세틸콜린 수용체, 및 쥐 내측 위장관내 근육상의 근육 섬유. (a ) 뉴로필라멘트 200(NF200), 수포성 아세틸콜린 수송체(VAChT), 알파-분가로톡신(α-BTX), 및 팔로이딘(Pha)으로 다중 형광 염색을 나타내는 래트 내측 위장관 근육으로부터의 대표적인 이미지. (b ) 패널 A(화살촉)로부터 확대된 영상이 다양한 라벨링을 상세하게 나타낸 것이다. B1-B4: 패널 B는 NF200(B1), VAChT(B2), α-BTX(B3) 및 Pha(B4)와 별도로 표시됨. (C) (C)에서 3D 패턴의 정면도를 보여주는 프레임과 함께 패널 B로부터의 조정된 이미지 및 (C1)에서의 후면도. B1-B4의 배율 막대는 B에서와 동일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 신경 섬유의 공간적 상관관계, 시냅스 주위 슈완 세포, 시냅스 후 니코틴성 아세틸콜린 수용체, 및 래트 내측 위장관근 상의 세포 핵. (a) 뉴로필라멘트 200(NF200), 슈완 세포 마커(S100), 알파-분가로톡신(α-BTX), 및 세포핵 마커 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드(DAPI)로 다중 형광 염색을 나타내는 래트 내측 위장관 근육으로부터의 대표적인 이미지. (b) 패널 A(화살촉)로부터 확대된 영상이 다양한 라벨링을 상세하게 나타낸 것이다. B1-B4: NF200(B1), S100(B2), α-BTX(B3) 및 DAPI(B4)와 패널 B를 별도로 표시합니다. (c) (C)에서 3D 패턴으로 프레임이 있는 패널 B로부터의 영상과 (C1)에서 S100 라벨링이 없는 뷰로 조정된 영상. B1-B4의 배율 막대는 B에서와 동일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 근육 절편의 성공적인 다중 염색을 수행하고 쥐 내측 위장관 근육의 두꺼운 절편에서 NMJ의 형태학적 특성을 드러내기 위한 형광 면역조직화학의 사용에 필요한 기술적 세부사항을 기술하였다. 이 접근법을 사용함으로써, PSCs와 사전 및 사후 시냅스 요소의 미세한 세부 사항 및 공간 상관관계가 공초점 현미경 하에서 분석되고 평가될 수 있고, 입체 패턴으로 추가로 재구성될 수 있다. 여기서, NMJ의 형태학적 특성을 밝히기 위해 다양한 종류의 바이오마커가 사용되었는데, 여기서, NF200은 수초화된 축삭 20,21 상에서 고도로 발현되고, 시냅스 전 말단(22)에서 축적된 VAChT는 α시냅스 후 AchRs 23,24, 및 S100은 PSCs 25,26에 도시되어 있다. . 우리의 결과와 이전 연구의 결과를 종합하면 이러한 바이오마커가 자유롭게 결합되어 서로에 대한 공간 관계를 평가하기위한 실험 설계에 따라 NMJ의 구조 요소를 라벨링 할 수 있음을 나타냅니다 1,28,29.
이 기술로 이상적인 이미징을 얻으려면 과도한 고정으로 인해 높은 배경이 발생할 수 있으므로 사후 수정 시간에주의를 기울여야하는 중요한 문제입니다. 따라서 수정 후 해결 시간은 수정 솔루션에서 2 시간을 넘지 않는 것이 좋습니다. 또한, 근육 절편에서 더 많은 NMJ를 관찰하기 위해서는 80 μm의 두께로 장축을 따라 수평으로 근육을 슬라이스하는 것이 중요하며, 이는 NMJ에서 시냅스 전 말단, 시냅스 후 AchRs 및 PSC의 공간적 상관 관계를 종합적으로 입증 할 수 있습니다. 여기서, 슬라이딩 마이크로톰은 근육 조직을 슬라이싱하기위한 편리한 도구라는 것을 강조해야합니다. 마찬가지로, 냉동 및 비브라 톰은 두꺼운 섹션을 얻는 데 사용될 수도 있습니다.
요약하면, NMJ의 형태학적 특성은 상이한 기술을 사용하여 이차원 조직학적 절편으로부터 입체 전체 탑재 조직까지 널리 연구되어 왔다. 전자 현미경 및 광 시트 현미경으로 검사하기위한 힘들고 시간이 많이 걸리는 조직 치료를 고려할 때, 두꺼운 조직 부분에 대한 다중 형광 염색은 공초점 현미경을 사용하여 NMJ의 입체 구조를 효과적으로 탐구하는 편리한 접근 방식입니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 CACMS 혁신 기금 (아니오. CI2021A03407), 중국 국립자연과학재단(제82004299호), 중앙공공복지연구소 기초연구기금(제호. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
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