Summary
O protocolo mostra um método para examinar a correlação espacial entre os terminais pré-sinápticos, receptores pós-sinápticos e células schwann peri-sinápticas no músculo gastrocnemius medial de ratos usando imunohistoquímica fluorescente com diferentes biomarcadores, ou seja, neurofilamento 200, transporte de acetilcholina vesicular, alfa-bungarotoxina e S100.
Abstract
A junção neuromuscular (NMJ) é uma estrutura complexa que serve para a comunicação do sinal do neurônio motor ao músculo esquelético e consiste em três componentes histológicos essenciais: os terminais de axônio motor pré-sináptico, receptores de acetrico nicotípico pós-sináptico (AchRs) e células schwann peri-sinápticas (PSCs). Para demonstrar as características morfológicas do NMJ, o músculo gastrocnemius medial de ratos foi selecionado como o tecido-alvo e examinado pelo uso de múltiplas manchas fluorescentes com vários tipos de biomarcadores, incluindo neurofilamento 200 (NF200) e transporte de acetilcolina vesicular (VAChT) para as fibras nervosas motoras e seus terminais pré-sinápticos, alfa-bungarotoxina (α-BTX) para os AchRs nicotípicos pós-sinápticos, e S100 para os PSCs. Neste estudo, a coloração foi realizada em dois grupos: no primeiro grupo, as amostras foram manchadas com NF200, VAChT e α-BTX, e no segundo grupo, as amostras foram manchadas com NF200, α-BTX e S100. Foi demonstrado que ambos os protocolos podem demonstrar efetivamente a estrutura detalhada do NMJ. Utilizando o microscópio confocal, características morfológicas dos terminais pré-sinápticos, receptores pós-sinápticos e PSC foram vistos, e suas imagens de pilhas Z foram reconstruídas em um padrão tridimensional para analisar melhor a correlação espacial entre as diferentes rotulagens. Na perspectiva da metodologia, esses protocolos fornecem uma referência valiosa para a investigação das características morfológicas do NMJ em condições fisiológicas, que também podem ser adequadas para avaliar a alteração patológica do NMJ, como lesão nervosa periférica e regeneração.
Introduction
Como três componentes estruturais essenciais da junção neuromuscular (NMJ)1,2,3,4, aspectos morfológicos dos terminais de axônio motor pré-sináptico, membrana pós-sináptica contendo receptores de acetilcolina nicotínica (AchRs) e células schwann peri-sinápticas (PSCs) têm sido amplamente investigadas. Seções finas e espécimes de montagem inteira dos músculos esqueléticos foram examinados com diferentes técnicas histológicas, como microscopia eletrônica 5,6, microscopia confocal 7,8 e microscopia de folha de luz 9,10. Embora as características morfológicas do NMJ tenham sido demonstradas por essas técnicas de diferentes aspectos, como comparação, a microscopia confocal ainda é uma escolha ideal para a imagem da morfologia detalhada do NMJ.
Recentemente, muitas novas tecnologias foram desenvolvidas para mostrar os componentes estruturais do NMJ. Por exemplo, camundongos fluorescentes transgênicos thy1-YFP têm sido diretamente usados para observar axônios motores e placas finais motoras in vivo e in vitro 10,11. Além disso, a injeção intravenosa de α-BTX fluorescente foi aplicada para revelar a distribuição espacial de placas finais motoras em músculos esqueléticos de tipo selvagem e fluorescentes transgênicos, utilizando tratamento de limpeza óptica de tecido para exame com microscopia de folha de luz 9,12. No entanto, além dos elementos pré e pós-sinápticos que podem ser vistos por esses métodos avançados, os PSCs não podem ser demonstrados ao mesmo tempo.
O acúmulo de evidências indica que os PSCs, como as células gliais periféricas, estão intimamente associados aos terminais pré-sinápticos que contribuem para o desenvolvimento e estabilidade do NMJ, a modulação da atividade sináptica do NMJ sob a condição fisiológica e a regeneração do NMJ após lesão nervosa 13,14,15 . Considerando a arquitetura celular do NMJ, este protocolo é um candidato adequado para rotular simultaneamente os PSCs, elementos pré e pós-sinápticos, e é potencialmente usado para avaliar a integridade e plasticidade do NMJ em condições normais e patológicas. Por exemplo, compare a intensidade do NMJ, morfologia e volume de placas finais motoras pós-sinápticas, inervação e denervação do NMJ, e número de PSCs em músculos de estado fisiológico e patológico.
O músculo gastrocnemius é o maior músculo formando a protuberância na panturrilha, que é facilmente dissecada pela remoção da pele e do músculo bíceps femoral do membro. O músculo é frequentemente escolhido para avaliar atrofia muscular, degeneração neuromuscular, desempenho muscular e força da unidade motora ex vivo ou in vivo 16,17,18. No entanto, a técnica também é adequada para revelar as características morfológicas do NMJ de vários músculos esqueléticos. Ao mesmo tempo, as seções musculares grossas podem revelar morfologia mais completa e quantidade de NMJ em comparação com as seções finas 7,8 e as fibras muscularesprovocadas 19.
De acordo com esses estudos, o músculo gastrocnemius medial de rato foi selecionado como o tecido-alvo neste estudo e foi fatiado com uma espessura de 80 μm para múltiplas manchas fluorescentes com vários tipos de biomarcadores de acordo com os componentes estruturais do NMJ. Aqui, neurofilamento 200 (NF200)20,21, transporte de acetilcolina vesicular (VAChT)22, alfa-bungarotoxina (α-BTX)23,24 e S10025,26 foram usados para rotular fibras nervosas, terminais pré-sinápticos, AchRs pós-sinápticos e PSCs, respectivamente. Além disso, o fundo do tecido muscular e núcleos celulares foram ainda mais neutralizados com fálica e DAPI.
Neste estudo, esperamos desenvolver um protocolo refinado para coloração simultânea da arquitetura celular do NMJ com seus biomarcadores correspondentes em espécimes fixos mais espessos, o que é mais conveniente para uso em microscopia confocal e ajuda a obter muito mais informações sobre a estrutura detalhada dos PSCs, elementos pré e pós-sinápticos, bem como sua correlação espacial entre si. Na perspectiva da metodologia, esse protocolo pode beneficiar-se da avaliação das características morfológicas do NMJ em condições normais e patológicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Acupuntura e Moxibustion, Academia Chinesa de Ciências Médicas (aprovação nº 2021-04-15-1). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Foram utilizados três ratos machos adultos (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Os ratos foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 horas com temperatura e umidade controladas e com livre acesso a alimentos e água. Os instrumentos e materiais deste estudo são mostrados na Figura 1.
1. Perfusão
- Injete 250 mg/kg de solução de tribromoetanol intraperitoneal para induzir a eutanásia dos ratos.
- Uma vez que a respiração pare, abra a cavidade torácica para acessar o coração usando tesouras e fórceps. Insira um cateter intravenoso do ventrículo cardíaco esquerdo em direção à aorta, e depois corte a aurícula direita.
- Perfundam os ratos experimentais no capô. Comece perfumando com 100 mL de soro fisiológico normal de 0,9% até que o sangue que sai da aurícula direita esteja claro, depois continue perfumando com 250-300 mL de 4% de paraformaldeído em tampão fosfato de 0,1 M (PB, pH 7,4) por cerca de 10 min até que a cauda seja dura de dobrar.
2. Anatomia regional
- Após a perfusão, remova a pele do membro traseiro bilateral usando uma lâmina cirúrgica (Figura 2A) e exponha o nervo ciático bilateral e o músculo gastrocnemius medial (Figura 2B).
- Disseque o músculo gastrocnemius medial bilateral cuidadosamente do membro traseiro usando uma lâmina (Figura 2C) e pós-fixar todo o músculo em 10 mL de 4% de paraformaldeído em 0,1 M PB por 2 h.
- Retire o músculo da solução e crioproteta o músculo em 10 mL de 25% de sacarose em 0,1 M PB por 1 dia a 4 °C até que o músculo esteja completamente imerso na solução.
3. Criosectioning do músculo
- Uma vez que o tecido muscular esteja imerso na solução, fixe-o em um estágio de congelamento de um sistema de microtome deslizante usando meio de seção congelada. Corte o músculo horizontalmente ao longo do longo eixo do músculo na espessura de 80 μm.
- Coloque sete crio-seções por poço de forma ordenada em uma placa de cultura de seis poços com 10 mL de 0,1 M PB (pH 7.4) usando um pincel.
NOTA: As seções são colocadas em ordem para que as seções em diferentes poços sejam adjacentes, o que torna as seções usadas para diferentes manchas mais consistentes.
4. Coloração fluorescente múltipla com NF200, VAChT, α-BTX e Pha
NOTA: Foram aplicadas múltiplas manchas fluorescentes com NF200, VAChT, α-BTX e Pha para revelar as fibras nervosas, terminais pré-sinápticos, receptores de acetilcolina nicotípica pós-sináptica e fibras musculares, respectivamente.
- Incubar quatro seções por poço com 1,5 mL de 0,1 M PB contendo 75 μL de 10% Triton X-100 (0,5%) e 45 μL de soro normal de burro (3%) em um agitador orbital a 20 rpm por 30 min.
- Transfira as seções para 1,5 mL de solução mista de anticorpos primários contendo coelhinho anti-NF200 (1:1.000), anti-VAChT de cabra (1.500) em 0,1 M PB (pH 7.4) com soro de burro 1% normal, e 0,5% Triton X-100, e incubar durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, lave as seções 3x por 5 min cada em 0,1 M PB (pH 7.4) em um agitador orbital a 20 rpm.
- Incubar as seções em 1,5 mL de solução mista de anticorpos secundários contendo anti-coelho burro AF488 (1:500) e anti-cabra de burro AF546 (1:500), bem como os biomarcadores de α-BTX, AF647 (1:500) e faloidein 350 (1:500) em 0,1 M PB (pH 7.4) contendo 1% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 para 1h em temperatura ambiente. Proteja-se contra a luz.
- Depois de lavar 3x por 5 min cada em 0,1 M PB (pH 7.4), monte as seções em slides de microscópio. Aplique vidro de cobertura nas seções usando 50% de glicerina em água destilada para observação.
5. Coloração fluorescente múltipla com NF200, S100, α-BTX e DAPI
NOTA: Os procedimentos são semelhantes aos da etapa 4; a principal diferença é entre os anticorpos primários e seus anticorpos secundários correspondentes.
- Use os seguintes anticorpos primários: frango anti-NF200 (1:6.000), coelhinho anti-S100 (1:2.500) na etapa 4.2 e seus anticorpos secundários correspondentes: anti-frango burro AF488 (1:2.500) na etapa 4.2 e seus anticorpos secundários correspondentes: anti-frango burro AF488 (1:1:2500) e anti-coelho burro AF546 (1:500), bem como os biomarcadores de α-BTX AF647 (1:500) e DAPI (1:50000) na etapa 4.3.
6. Observação e análises
- Observe a amostra e tire imagens utilizando um sistema de imagem confocal equipado com as seguintes lentes objetivas: lente 20x com na de lente de 0,75 e 40x com NA de 0,95.
- Use comprimentos de onda de excitação e emissão de 350 nm (Pha), 488 nm (NF200), 546 nm (VAChT e S100), 647 nm (α-BTX) ou DAPI correspondente à coloração fluorescente múltipla. Defina a resolução da captura de imagem para 640 x 640 pixels.
NOTA: A resolução de 640 x 640 pixels é escolhida porque as imagens foram capturadas em pilhas Z. Uma resolução de 1024 x 1024 pixels resulta em imagens lentas e fotobleaching em pilhas Z. - Defina o plano focal de partida e o plano focal final. Defina o tamanho do passo para 1 μm ou 2 μm. Escolha padrão de profundidade, captura de imagem e série Z.
- Para as imagens de ampliação inferior tiradas em 20x, capture 40 imagens (Z-stacks) em tamanho de passo de 2 μm de cada seção de 80 μm de espessura usando um pinhole de 105 μm. Escolha o modo de projeção/topografia e a projeção de intensidade sobre o eixo Z para integrar todas as imagens em um único foco.
- Para as imagens de ampliação mais altas tiradas em 40x, capture 80 imagens (Z-stacks) em tamanho de passo de 1 μm de cada seção de 80 μm de espessura com zoom definido para 2 e um pinhole de 105 μm. Integre todas as imagens em um único foco.
- Reconstrua as imagens no padrão tridimensional com o sistema de processamento de imagens como descrito anteriormente em27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Após múltiplas manchas fluorescentes, a rotulagem correspondente foi demonstrada ordenadamente nas seções de 80 μm de espessura do músculo gastrocnemius medial do rato com fibras nervosas NF200-positivas, Terminais pré-sinápticos positivos do VAChT, α-BTX-positivos AchRs pós-sinápticos, PSCs S100 positivos, fibras musculares phalloidina-positivas e núcleos celulares rotulados por DAPI (Figura 3 e Figura 4).
Mostrou-se que as fibras nervosas nf200 positivas funcionavam em feixe e distribuíam ramificações para os terminais pré-sinápticos VAChT positivos que formavam uma relação espelhada com os AchRs pós-sínpticos α-BTX positivo (Figura 3). Além disso, PSCs S100 positivos foram detectados em torno das fibras nervosas NF200 positivas perto dos terminais pré-sinápticos (Figura 4).
Aproveitando-se da reconstrução da imagem, a correlação espacial das fibras nervosas, terminais pré-sinápticos, PSCs e AchRs pós-sinápticos foi ainda exibida em um padrão tridimensional mostrando as características morfológicas detalhadas do NMJ de diferentes perspectivas (Figura 3C,C1 e Figura 4C,C1).
Figura 1. Imagens dos vários passos do protocolo. (A) Perfuse o rato no capô. (B) Disseque o músculo gastrocnemius medial do rato. (C) Corte o tecido muscular em um estágio de congelamento do sistema de microtome deslizante. (D) Coletar seções de tecido ordenadamente em um prato de seis poços. (E) Mancha fluorescente no agitador. (F) Monte as seções em slides de microscópio. (G) Aplique deslizamentos de cobertura nas seções com 50% de glicerina. (H) Observe as amostras com um sistema de imagem confocal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Procedimento de anatomia regional para dissecar o músculo gastrocnemius medial do rato. (A) Visão externa dos músculos do membro traseiro do rato. (B) Visão interna do músculo gastrocnemius medial e sua inervação. (C) Dissecando o músculo gastrocnemius medial do rato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Correlação espacial das fibras nervosas, terminais pré-sinápticos, receptores de acetilcolina nicotínica pós-sináptica, e fibras musculares no músculo gastrocnemius medial do rato. (A) Imagem representativa do músculo gastrocnemius medial de ratos mostrando a coloração fluorescente múltipla com neurofilamento 200 (NF200), transporte de acetilcolina vesicular (VAChT), alfa-bungarotoxina (α-BTX) e fhalloidina (Pha). (B) A imagem ampliada do painel A (ponta de seta) mostrando as várias rotulagem em detalhes. B1-B4: painel B mostrado separadamente com NF200 (B1), VAChT (B2), α-BTX (B3) e Pha (B4). (C) As imagens ajustadas do painel B com o quadro mostrando a visão frontal do padrão 3D em (C) e a visão traseira em (C1). Mesma barra de escala para B1-B4 como em B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Correlação espacial das fibras nervosas, células schwann peri-sinápticas, receptores de acetilcolina nicotípica pós-sináptica, e núcleos celulares no músculo gastrocnemius medial do rato. (A) Imagem representativa do músculo gastrocnemius medial de ratos mostrando a coloração fluorescente múltipla com neurofilamento 200 (NF200), marcador de célula schwann (S100), alfa-bungarotoxina (α-BTX) e núcleo celular marcador 4',6-diamidino-2-fenillindole dihidrocloreto (DAPI). (B) A imagem ampliada do painel A (ponta de seta) mostrando as várias rotulagem em detalhes. B1-B4: mostrar o painel B separadamente com NF200 (B1), S100 (B2), α-BTX (B3) e DAPI (B4). (C) As imagens ajustadas do painel B com o quadro em um padrão 3D em (C) e a visualização sem rotulagem S100 em (C1). Mesma barra de escala para B1-B4 como em B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Descrevemos os detalhes técnicos necessários para a realização de uma coloração múltipla bem sucedida de fatias musculares e o uso de imunohistoquímica fluorescente para revelar as características morfológicas do NMJ nas seções grossas do músculo gastrocnemius medial de ratos. Usando esta abordagem, os detalhes finos e correlação espacial dos PSCs e elementos pré e pós-sinápticos podem ser analisados e apreciados sob microscopia confocal, e reconstruídos em um padrão tridimensional. Aqui, vários tipos de biomarcadores foram usados para revelar as características morfológicas do NMJ, em que, NF200 é altamente expresso nos axônios mieliados20,21, VAChT acumulado nos terminais pré-sinápticos22, α-BTX é exibido nas AchRs pós-sináptica23,24, e S100 é mostrado nos PSCs25,26 . A realização de nossos resultados e os de estudos anteriores indicam que esses biomarcadores podem ser combinados livremente para rotular os elementos estruturais do NMJ de acordo com o projeto experimental para avaliar sua relação espacial entre si 1,28,29.
Para obter imagens ideais com essa técnica, o tempo pós-correção é uma questão importante a ser dada atenção, pois a super-fixação pode causar alto plano de fundo. Portanto, recomenda-se que o tempo pós-correção não seja superior a 2h na solução de correção. Além disso, para observar mais NMJ em seções musculares, é fundamental cortar o músculo horizontalmente ao longo do eixo longo a uma espessura de 80 μm, o que pode demonstrar de forma abrangente a correlação espacial dos terminais pré-sinápticos, AchRs pós-sinápticos e PSCs no NMJ. Aqui, deve-se enfatizar que um microtome deslizante é uma ferramenta conveniente para cortar o tecido muscular. Da mesma forma, um criostat e vibratome também podem ser usados para obter seções grossas.
Em resumo, as características morfológicas do NMJ têm sido amplamente estudadas desde seções histológicas bidimensionais até tecido de montagem integral tridimensional usando diferentes técnicas. Considerando os tratamentos de tecido trabalhosos e demorados para exame com microscopia eletrônica e microscopia de folha de luz, a coloração fluorescente múltipla na seção de tecido mais grosso ainda é uma abordagem conveniente para explorar efetivamente a arquitetura esterológica do NMJ usando microscopia confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado pelo CacmS Innovation Fund (Nº. CI2021A03407), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 82004299) e fundos fundamentais de pesquisa para os Institutos Centrais de Pesquisa em Bem-Estar Público (Nº. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
References
- Kawabuchi, M., et al. The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats. TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).
- Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
- Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).
- Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).
- Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).
- Desaki, J., Uehara, Y. Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study. Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).
- Marques, M., Santo Neto, H. Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals. Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).
- Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice. Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).
- Yin, X., et al. Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle. Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Chen, W. T., et al. In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling. Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).
- Sugiura, Y., Lin, W. Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function. Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).
- Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. Perisynaptic schwann cells - The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).
- Walker, C. L. Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research. Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).
- Michaud, M., et al. Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy. Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).
- Sharma, S., et al. Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats. Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).
- Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).
- Marinello, M., et al. Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).
- Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).
- Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).
- Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E.
- Karlin, A. Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors. Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).
- Rudolf, R., Straka, T. Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation. Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
- Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries. Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J.
- Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).
