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Genetics

단백질 보존의 신속한 평가를 위한 종 간 감수성 도구를 예측하기 위한 서열 정렬 입증

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/63970
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 4, 5, 5, 5, 6
1Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Scientific Computing and Data Curation Division, U.S. Environmental Protection Agency, 2Oak Ridge Institute for Science and Education, 3Swenson College of Science and Engineering, Department of Biology, University of Minnesota Duluth, 4University of Wisconsin-Madison Aquatic Sciences Center, 5General Dynamics Information Technology, Research Triangle Park, 6Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Great Lakes Toxicology and Ecology Division, U.S. Environmental Protection Agency

Summary

여기에서는 미국 환경 보호국 서열 정렬을 활용하여 종 감수성 (SeqAPASS) 도구를 예측하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 단백질 보존을 신속하게 분석하고 종 전반에 걸쳐 화학적 감수성에 대한 사용자 정의 가능하고 쉽게 해석 가능한 예측을 제공하는 온라인 도구의 적용을 보여줍니다.

Abstract

미국 환경 보호국 서열 정렬을 통해 종 감수성 예측(SeqAPASS) 도구는 연구자와 규제 기관이 종 전반에 걸쳐 독성 정보를 외삽할 수 있는 빠르고 무료로 제공되는 온라인 스크리닝 애플리케이션입니다. 인간 세포, 생쥐, 쥐 및 제브라 피쉬와 같은 모델 시스템의 생물학적 표적의 경우 다양한 화학 물질에 대한 독성 데이터를 사용할 수 있습니다. 단백질 표적 보존의 평가를 통해이 도구는 이러한 모델 시스템에서 생성 된 데이터를 독성 데이터가없는 수천 종의 다른 종으로 외삽하여 상대적 고유 화학적 감수성을 예측하는 데 사용할 수 있습니다. 도구의 최신 릴리스(버전 2.0-6.1)에는 출판을 위한 데이터의 빠른 합성, 해석 및 사용과 프레젠테이션 품질의 그래픽이 가능한 새로운 기능이 통합되어 있습니다.

이러한 기능 중에는 사용자 정의 가능한 데이터 시각화와 해석의 용이성을 위해 SeqAPASS 데이터를 요약하도록 설계된 포괄적인 요약 보고서가 있습니다. 이 백서에서는 사용자가 작업을 제출하고, 다양한 수준의 단백질 서열 비교를 탐색하고, 결과 데이터를 해석 및 표시하는 과정을 안내하는 프로토콜에 대해 설명합니다. SeqAPASS v2.0-6.0의 새로운 기능이 강조됩니다. 또한이 도구를 사용하여 트랜스 티레틴 및 오피오이드 수용체 단백질 보존에 초점을 맞춘 두 가지 사용 사례가 설명됩니다. 마지막으로 SeqAPASS의 강점과 한계에 대해 논의하여 도구에 대한 적용 가능성 영역을 정의하고 종 간 외삽을 위한 다양한 응용 분야를 강조합니다.

Introduction

전통적으로 독성학 분야는 화학 안전성 평가에 필요한 데이터를 제공하기 위해 전체 동물 실험의 사용에 크게 의존해 왔습니다. 이러한 방법은 일반적으로 비용이 많이 들고 리소스 집약적입니다. 그러나 현재 사용되는 화학 물질의 수가 많고 새로운 화학 물질이 개발되는 속도가 빠르기 때문에 전 세계적으로 보다 효율적인화학 스크리닝 방법에 대한 필요성이 인식되고 있습니다1,2. 이러한 필요성과 그에 따른 동물 실험으로부터의 패러다임 전환은 유망한 대체 검사 전략3,4인 고처리량 스크리닝 분석, 고처리량 전사체학, 차세대 시퀀싱 및 컴퓨터 모델링을 포함한 많은 새로운 접근 방법의 개발로 이어졌습니다.

화학 물질 노출의 영향을 받을 수 있는 다양한 종에 대한 화학적 안전성을 평가하는 것은 기존의 독성 테스트뿐만 아니라 새로운 접근 방법으로도 지속적인 과제였습니다. 비교 및 예측 독성학의 발전은 다양한 종의 상대적 민감도를 이해하기 위한 프레임워크를 제공했으며 계산 방법의 기술 발전은 이러한 방법의 적용 가능성을 계속 높이고 있습니다. 지난 10년 동안 특정 화학 분자 표적에 대한 지식과 함께 기존 유전자 및 단백질 서열 데이터베이스를 활용하여 종 간 외삽에 대한 예측 접근 방식을 지원하고 일반적인 모델 유기체 5,6,7,8을 넘어 화학적 안전성 평가를 향상시키는 몇 가지 전략이 논의되었습니다.

과학을 행동으로 옮기고, 예측 독성학에 대한 이러한 기초 연구를 기반으로 화학 테스트 노력의 우선 순위를 지정하고, 의사 결정을 지원하기 위해 미국 환경 보호국 서열 정렬을 통해 종 감수성을 예측하는 서열 정렬(SeqAPASS) 도구가 만들어졌습니다. 이 도구는 지속적으로 확장되는 단백질 서열 정보의 공개 저장소를 사용하여 종의 다양성에 걸쳐 화학적 감수성을 예측하는 공개 및 무료 웹 기반 응용 프로그램입니다9. 특정 화학 물질에 대한 종의 상대적 고유 감수성은 해당 화학 물질의 알려진 단백질 표적의 보존을 평가하여 결정할 수 있다는 원칙에 따라 이 도구는 모든 종에 대해 알려진 민감성을 가진 종의 단백질 아미노산 서열을 기존 단백질 서열 데이터와 신속하게 비교합니다. 이 평가는 (1) 1차 아미노산 서열, (2) 기능 도메인 및 (3) 중요한 아미노산 잔기 비교를 포함한 세 가지 수준의 분석을 통해 완료되며, 각각은 화학-단백질 상호 작용에 대한 보다 심층적인 지식이 필요하고 감수성 예측에서 더 큰 분류학적 분해능을 제공합니다. SeqAPASS의 주요 강점은 사용자가 관심 있는 화학-단백질 또는 단백질-단백질 상호 작용과 관련하여 사용 가능한 정보의 양을 기반으로 표적 보존에 대한 추가 증거를 추가하여 평가를 맞춤화하고 개선할 수 있다는 것입니다.

첫 번째 버전은 2016년에 출시되었으며, 이를 통해 사용자는 1차 아미노산 서열과 기능 도메인을 간소화된 방식으로 평가하여 화학적 감수성을 예측할 수 있었고 최소한의 데이터 시각화 기능을 포함했습니다(표 1). 개별 아미노산 차이는 종의 화학적 감수성에 영향을 미칠 수 있는 화학-단백질 상호 작용에서 종 간 차이의 중요한 결정 요인으로 나타났습니다10,11,12. 따라서, 후속 버전은 직접적인 화학적 상호작용에 중요한 중요한 아미노산을 고려하기 위해 개발되었다13. 이해 관계자 및 사용자 피드백에 응답하여이 도구는 종 간 외삽의 문제를 해결하기 위해 연구자와 규제 커뮤니티 모두의 요구를 충족하도록 설계된 추가 새로운 기능과 함께 연간 버전 릴리스를 거쳤습니다 (표 1). 2020년 SeqAPASS 버전 5.0의 출시는 데이터 시각화 및 데이터 합성 옵션, 외부 링크, 요약 테이블 및 보고서 옵션, 그래픽 기능을 통합하는 사용자 중심 기능을 선보였습니다. 전반적으로 이 버전의 새로운 속성과 기능은 데이터 합성, 외부 데이터베이스 간의 상호 운용성 및 종 간 감수성 예측을 위한 데이터 해석의 용이성을 개선했습니다.

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Protocol

1. 시작하기

참고: 여기에 제시된 프로토콜은 도구 유틸리티 및 주요 기능에 중점을 둡니다. 방법, 기능 및 구성 요소에 대한 자세한 설명은 웹 사이트의 포괄적인 사용자 가이드(표 1)에서 찾을 수 있습니다.

표 1: SeqAPASS 도구의 진화. 초기 배포에서 SeqAPASS 도구에 추가된 기능 및 업데이트 목록입니다. 약어: SeqAPASS = 종 감수성을 예측하기 위한 서열 정렬; 에코톡스 = 에코톡시콜로지 지식 기반. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 크롬을 사용하여 https://seqapass.epa.gov/seqapass 로 이동합니다. 로그인을 선택하여 기존 계정을 사용하거나 지침에 따라 SeqAPASS 계정을 만들면 사용자가 완료된 작업을 실행, 저장, 액세스 및 사용자 지정할 수 있습니다.
  2. 분석을 수행하기 전에 먼저 기존 문헌 또는 기존 데이터를 검토하여 관심 단백질과 표적 또는 민감한 종을 식별합니다(그림 1). SeqAPASS에는 쿼리 단백질을 식별하는 데 도움이 되는 외부 리소스에 대한 링크가 포함되어 있으므로 단백질 표적 식별 아래의 드롭다운 버튼을 클릭하여 관련 리소스에 액세스합니다.

Figure 1
그림 1: SeqAPASS 문제 공식화: 성공적인 분석에 필요한 예비 정보의 개략도. 약어: SeqAPASS = 종 감수성을 예측하기 위한 서열 정렬; LBD = 리간드-결합 도메인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 데이터베이스 간 SeqAPASS 상호 운용성. SeqAPASS에 통합된 외부 도구, 데이터베이스 및 리소스의 회로도입니다. 약어: SeqAPASS = 종 감수성을 예측하기 위한 서열 정렬; AOP = 불리한 결과 경로; NCBI = 국립 생명 공학 정보 센터; 에코톡스 = 에코톡시콜로지 지식 기반. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: SeqAPASS 도구에 통합된 링크, 리소스 및 도구. SeqAPASS 도구에 활용되는 다양한 데이터 소스, 링크 및 리소스 목록입니다. 약어: SeqAPASS = 종 감수성을 예측하기 위한 서열 정렬. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

2. SeqAPASS 쿼리 개발 및 실행: 수준 1

참고: 레벨 1 분석에서, 질의 단백질의 전체 1차 아미노산 서열은 사용 가능한 서열 정보를 사용하여 모든 종의 1차 아미노산 서열과 비교됩니다. 이 도구는 알고리즘을 사용하여 공개적으로 사용 가능한 데이터를 마이닝, 수집 및 컴파일하여 종 간의 아미노산 서열을 신속하게 정렬하고 비교합니다. 백엔드는 국립 생명 공학 정보 센터 (NCBI) 데이터베이스의 정보를 저장하고 단백질 기본 로컬 정렬 검색 도구 (BLASTp) 54 및 제약 조건 기반 다중 정렬 도구 (COBALT) 55의 독립형 버전을 전략적으로 사용합니다.

  1. 1차 아미노산 서열 비교에서 종별 또는 수탁별을 클릭합니다. 종별 선택을 사용하여 종 목록을 입력하거나 선택하여 관심 있는 단백질 표적을 선택합니다.
  2. 수탁 텍스트 상자에 수탁을 입력하여 단백질 수탁(즉, NCBI 단백질 ID)을 직접 제출합니다.
  3. 요청 실행을 선택하여 쿼리를 제출합니다. 제출되면 브라우저 창의 오른쪽 상단 모서리에 성공적인 제출을 나타내는 알림이 나타날 때까지 기다립니다.
  4. 페이지 맨 위에 있는 SeqAPASS 실행 상태 탭을 선택하여 해당 사용자 계정으로 수행된 모든 SeqAPASS 실행 목록을 표시하고 완료율을 확인합니다.
    1. 적절한 라디오 단추가 선택된 상태에서 데이터 새로 고침을 클릭하여 수준 2 및 수준 3 실행 상태를 확인합니다.
  5. 페이지 맨 위에 있는 SeqAPASS 보고서 보기 탭을 선택하여 해당 계정에서 완료된 모든 보고서 목록에 액세스합니다.
  6. SeqAPASS 보고서 보기 탭에서 관심 있는 쿼리 단백질을 선택합니다. 선택한 보고서 요청을 클릭하여 수준 1 쿼리 단백질 정보 페이지를 열고 결과, 데이터 사용자 지정 옵션, 시각화 및 요약 보고서를 봅니다.
  7. 기본적으로 보고서 보기를 선택하여 웹 브라우저에서 데이터를 봅니다. 또는 보고서 저장을 선택하여 원시 데이터를 .zip 파일로 다운로드합니다.
    참고: 레벨 1 분석에 필요한 시간은 해당 시점의 글로벌 사용자 요구, 대기열에 제출된 작업 수 및 제출된 작업에 대해 존재하는 단백질 정보의 양에 따라 달라집니다(버전 5.1의 경우 평균 23분). 단백질 표적이 이전에 완료된 경우 제출 즉시 몇 초 안에 데이터를 사용할 수 있습니다.

3. SeqAPASS 쿼리 개발 및 실행: 레벨 2

참고: 전체 단백질 서열이 화학적 상호 작용에 직접 관여하지 않기 때문에 레벨 2 분석은 기능 도메인의 아미노산 서열만 비교하여 더 낮은 분류학적 순위(예: 클래스, 순서, 패밀리)에서 감수성 예측을 수행합니다.

  1. 수준 1 쿼리 단백질 정보 페이지에서 수준 2 머리글 옆에 있는 더하기 기호 + 를 클릭하여 수준 2 쿼리 메뉴를 채웁니다.
  2. 관심 단백질(쿼리 단백질)에서 적절한 도메인을 식별합니다.
    1. 도메인이 식별되지 않은 경우 NCBI CDD(보존된 도메인 데이터베이스)(표 1)에 대한 통합 링크를 클릭하면 적절한 도메인 선택을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
      참고: 일반적으로 특정 히트 도메인만 수준 2에서 쿼리로 선택됩니다.
  3. 도메인 선택 상자를 클릭하여 쿼리 단백질에 대한 기능 도메인 목록을 자동으로 채웁니다.
  4. 드롭다운 목록에서 도메인 가입 을 선택하고 도메인 실행 요청 버튼을 클릭하여 수준 2 쿼리를 시작합니다. 제출이 완료되면 제출 성공을 나타내는 알림이 나타날 때까지 기다립니다.
  5. 수준 2 및 3 실행 새로 고침 을 클릭하여 제출 후 몇 초 이내에 사용할 수 있는 수준 2 데이터를 채웁니다.
  6. 수준 2 데이터 보기의 드롭다운 목록에서 완료된 도메인 가입을 선택하고 수준 2 데이터 보기 단추를 클릭하여 결과를 새 페이지에서 엽니다.

4. 데이터 접근 및 이해: SeqAPASS 레벨 1 및 레벨 2

  1. 쿼리 단백질 정보 페이지의 맨 아래로 스크롤하여 결과 보고서를 봅니다 - 기본 보고서는 기본적으로 레벨 1 및 2 분석과 함께 제공됩니다. 전체 보고서 라디오 단추를 선택하여 모든 시퀀스 적중 및 정렬 메트릭을 제공하는 보다 자세한 보고서를 봅니다. 두 보고서에서 적절한 수탁/ID/이름을 클릭하여 NCBI 데이터베이스의 투명한 단백질 정렬 및 분류 정보에 액세스합니다.
  2. 결과 표의 오른쪽으로 스크롤하여 ECOTOX 열을 봅니다. ECOTOXicology 지식 베이스(ECOTOX)에 대한 링크를 클릭하여 감수성 예측이 있는 종에 대한 해당 독성 데이터를 신속하게 수집합니다.
    참고: ECOTOX는 수생 및 육상 식물과 야생 동물에 대한 단일 화학 독성 데이터를 제공하는 포괄적이고 공개적으로 사용 가능한 지식 기반입니다. SeqAPASS v6.0에는 화학 물질 및 관심 종별로 관련 ECOTOX 데이터와 보다 신속하게 연결할 수 있는 ECOTOX 위젯이 포함되어 있습니다.
  3. 테이블 다운로드를 클릭하여 테이블을 스프레드시트 파일로 저장합니다. 요약 보고서 보기 버튼을 클릭하여 분류 그룹별로 정렬된 데이터를 표시하는 요약 보고서 테이블을 보고 다운로드합니다.
    참고: 데이터 요약 테이블은 기본 보고서와 전체 보고서 모두에 사용할 수 있으며 지정된 대상에 대한 예측에 대한 개요를 제공합니다.

5. 데이터 설정 조작: SeqAPASS 레벨 1 및 레벨 2

참고: 레벨 1 및 레벨 2 분석 모두에서 단백질 유사성이 클수록 화학 물질이 쿼리 종/단백질과 유사한 방식으로 단백질과 상호 작용할 가능성이 커져 이 분자 표적을 가진 화학 물질의 잠재적 영향에 취약하다고 가정합니다. 이러한 데이터의 유사성으로 인해 레벨 1 및 2 데이터를 이해하기 위한 단계가 단일 프로토콜에 함께 요약되어 있습니다.

  1. 단백질 정보 쿼리 상단의 하위 메뉴를 참조하여 보고서 설정에 액세스하고 조작하며 대부분의 분석에 대한 모든 보고서 옵션에 대해 기본 설정을 사용합니다. 기본 설정을 변경하는 과학적 근거가 있는 경우 다음 선택적 단계를 수행합니다.
    1. (선택 사항) 감수성 컷오프 옆에 있는 더하기 기호 + 를 클릭하여 새 탭에서 감수 성 컷오프 설정을 보고 조정합니다. 드롭다운 리스트에서 새 컷오프 값을 선택하거나 사용자정의 컷오프 값을 입력합니다.
    2. (선택 사항) 기본값 이외의 다른 것이 필요한 경우 E-Value (우연히 발생할 것으로 예상되는 다른 선형의 수) 필드의 숫자를 변경합니다.
      참고: 상자 안의 숫자보다 큰 E 값을 가진 단백질은 기본 보고서에서 제거됩니다.
    3. (선택 사항) 분류 그룹 별 정렬 옵션을 사용하여 결과 테이블의 필터링된 분류 그룹 열에 표시할 분류 계층 수준을 선택합니다.
      참고: 분류학적 계층 구조를 변경하면 컷오프 위에서 발견된 각 필터링된 그룹의 종을 기반으로 한 감수성 예측도 변경됩니다.
    4. (선택 사항) Common Domain (단백질이 결과에 포함되기 위해 쿼리 단백질과 공유해야 하는 공통 도메인 수) 필드를 기본값 이외의 다른 것이 필요한 경우 변경합니다.
      참고: 기본 설정은 1이므로 쿼리 단백질과 하나 이상의 공통 도메인을 공유하지 않는 시퀀스는 제외됩니다.
    5. (선택 사항) Species Read Across 아래에서 아니요를 선택하여 유사성 백분율이 컷오프보다 크거나 같거나 히트가 ortholog 후보로 식별되는 경우에만 Y의 감수성 예측을 다시 가져옵니다.
      참고: 이 설정은 기본적으로 예로 설정되며, 이는 모든 ortholog 후보, 감수성 컷오프 위에 나열된 모든 종 및 컷오프 위에 하나 이상의 종이 있는 동일한 분류학적 그룹의 컷오프 아래의 모든 종에 대해 Y의 감수성 예측이 보고됨을 의미합니다.
  2. 현재 보고서 설정 다운로드 버튼을 클릭하여 적용된 현재 설정을 캡처하는 파일을 다운로드합니다.
    참고: 선택한 특정 평가 수준(1, 2 또는 3)에 따라 보고서에 표시되는 설정이 결정됩니다.

6. 데이터 시각화: SeqAPASS 레벨 1 및 레벨 2

  1. 시각화 옆에 있는 더하기 기호 +를 클릭하고 데이터 시각화 버튼을 클릭하여 사용자 정의 정보와 대화형 결과 그래프를 선택하는 옵션을 표시하는 별도의 탭을 엽니다.
  2. Boxplot을 클릭하여 대화형 상자 그림 및 그림 컨트롤을 열고 상자 그림 시각화가 능동적으로 업데이트되어 데이터 테이블의 변경 사항을 반영하고 출판 및 프레젠테이션 품질의 그래픽을 제공할 수 있도록 합니다.
    참고: 기본 상자 그림은 x-축에 종 그룹을 표시하고 y-축에 백분율 유사성을 표시합니다. 상자 그림은 민감도 컷오프(점선), 쿼리 종과 비교한 종 간 유사성 백분율, 각 분류 그룹의 평균 및 중앙값과 함께 25번째 및 75번째 백분위수 및 사분위수 범위를 표시합니다. 분석의 목적과 사용자의 요구에 따라 다음과 같은 선택적 단계를 통해 많은 상자 그림 특징을 수정할 수 있습니다.
    1. (선택 사항) 표시된 분류 그룹을 사용자 지정하려면 컨트롤 섹션 아래의 분류 그룹 상자를 참조하십시오. 이름 위로 스크롤하고 x를 선택하거나 분류 그룹 드롭다운 메뉴를 사용하여 그룹을 제거합니다.
    2. (선택 사항) 관심 종 또는 미리 정의된 특정 그룹(예: 멸종 위기에 처하거나 멸종 위기에 처한 종)을 정확히 찾아내는 범례를 추가하려면 x축의 분류 그룹 이름 위로 마우스를 가져가면 가장 높은 유사성 백분율로 정렬된 상위 3개 종을 나열하는 팝업 상자가 활성화됩니다. 범례에서 종 위로 마우스를 가져가면 해당 종 정보가 포함된 팝업 상자가 생성됩니다. 특정 분류 그룹에 대한 상자를 클릭하여 종과 예측을 나열하는 다운로드 가능한 요약 테이블을 생성합니다.
  3. Boxplot 다운로드를 클릭하여 파일 유형을 선택하고, 너비/높이 해상도를 사용자 지정하고, 시각화를 저장합니다.

7. SeqAPASS 분석 개발 및 실행: 레벨 3

참고: 레벨 3 분석은 쿼리 단백질 내에서 사용자가 식별한 아미노산 잔기를 평가하고 종 간에 이러한 잔기의 보존을 신속하게 비교합니다. 이러한 잔기가 보존되는 종은 주형 종/단백질과 유사한 방식으로 화학 물질과 상호 작용할 가능성이 더 높은 것으로 가정합니다. 레벨 3은 개별 아미노산에 초점을 맞추기 때문에 화학-단백질 또는 단백질-단백질 상호 작용에 중요한 아미노산 잔기에 대한 자세한 지식이 있는 경우에만 분석을 수행할 수 있습니다.

  1. 수준 1 쿼리 단백질 정보 페이지에서 수준 3 머리글 옆에 있는 더하기 기호 +를 클릭하여 수준 3 쿼리 메뉴를 채웁니다.
  2. 참조 탐색기 옆에 있는 더하기 기호 + 를 클릭하여 참조 탐색기 도구를 열면 사전 정의된 부울 문자열을 생성하여 사용 가능한 문헌을 쿼리하고 사용자가 레벨 3 평가에 사용할 중요한 아미노산 식별을 지원하는 적절한 문헌을 식별하는 데 도움이 됩니다(표 2 및 그림 2).
    1. (선택 사항) 쿼리 단백질이 자동으로 채워지면 단백질 이름 추가 기능을 사용하여 단백질을 추가합니다.
  3. Google 학술 검색 링크 생성을 클릭하여 관련 검색어가 포함된 자동 생성된 검색어가 포함된 팝업을 엽니다.
  4. Google 학술검색 검색을 클릭하여 검색 문자열을 사용하여 문헌 데이터베이스를 쿼리합니다.
    1. 또는 클립보드에 복사 를 클릭하고 참조 탐색기의 함수를 사용하여 용어를 추가하거나 제거하여 검색 문자열을 사용자 지정합니다.

8. 확인된 문헌을 사용하여 중요한 아미노산 잔기 식별

  1. 사용자가 선택한 종을 Level 3 쿼리 메뉴에서 정렬할 템플릿 시퀀스 를 선택합니다.
    참고: 이 주형 서열은 일반적으로 중요 아미노산이 확인된 문헌을 기반으로 선택되며 수준 1 및 수준 2에서 쿼리된 것과 동일하거나 다른 종일 수 있습니다.
    1. (선택 사항) 추가 비교 상자를 사용하여 기본/전체 보고서 테이블에 나타나지 않는 가입/시퀀스를 비교할 수 있습니다.
  2. 수준 3 실행 이름 입력 텍스트 상자에 수준 3 실행에 대한 사용자 정의 이름을 입력하여 완료된 수준 3 실행을 식별합니다. 각 평가에 대해 고유한 이름을 선택합니다.
  3. 분류 그룹 선택 필드에서 관심 있는 분류 그룹을 선택합니다. 분류 그룹을 선택하여 해당 분류 그룹을 기준으로 테이블을 자동 필터링합니다.
  4. 결과 테이블에서 템플릿 시퀀스에 정렬할 종 옆에 있는 확인란을 수동으로 클릭합니다.
    참고: 적절한 정렬을 보장하려면 한 번에 하나의 분류 그룹을 템플릿과 비교해야 합니다. 관심 종에 대해 유사하게 주석이 달린 단백질만 선택하십시오. 비교를 위해 시퀀스를 선택할 때 특정 시퀀스(예: 가설, LOW QUALITY 또는 부분)에 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 포함에 대한 투명한 근거가 없는 한, 불완전하거나 부적절한 시퀀스 정보로 인해 예측을 왜곡할 수 있으므로 이러한 시퀀스를 제외하는 것이 가장 좋습니다.
  5. 단계를 반복하여 관심 있는 모든 분류 그룹을 정렬합니다.
  6. 모든 종이 정렬되면 수준 2 및 3 실행 새로 고침 을 클릭하여 수준 3 실행 이름 선택 메뉴를 완료된 수준 3 작업으로 채우고 수준 3 맞춤에서 데이터를 즉시 가져옵니다.
  7. 레벨 3 데이터 결합을 클릭하여 여러 분류 그룹의 정렬을 결합합니다.
    1. 또는 단일 보고서를 보려면 조회할 쿼리 선택 에서 사용자 정의 이름을 선택하고 수준 3 데이터 보기를 클릭합니다.
  8. 레벨 3 보고서 결합 메뉴에서 아미노산 잔기 비교의 기초로 사용할 레벨 3 템플릿을 선택하고 다음을 클릭합니다.
  9. 레벨 3 작업에서 비교를 위해 완료된 작업을 선택하고 다음을 클릭합니다. 원하는 경우 주문 레벨 3 작업 함수를 사용하여 분류 그룹을 재정렬합니다. 수준 3 데이터 보기를 클릭하여 결합된 분류 그룹이 정렬된 수준 3 보고서 페이지를 생성합니다.
  10. Entry Amino Residue Positions 입력 상자에 쉼표로 구분된 아미노산 위치를 입력한 다음 잔차 목록에 복사를 선택하여 템플릿 종에 대해 이전에 식별된 아미노산 위치를 선택합니다. 셔틀 박스에서 템플릿 시퀀스의 잔류물을 직접 선택합니다.
  11. 보고서 업데이트를 클릭하여 페이지를 새로 고치고 수준 3 민감도 예측을 표시합니다.
    참고: 레벨 3은 측쇄 기능적 특성(예: 지방족, 방향족) 및 분자 치수(분자량 차이>30g/mol)의 기본 설명자에서 파생된 간단한 규칙 세트를 사용하여 주요 위치의 차이가 단백질 상호 작용에 영향을 미칠 가능성이 있는지 여부를 결정합니다13.

9. 레벨 3 시퀀스 데이터 시각화

참고: 이전 레벨과 마찬가지로 기본 및 전체 보고서를 사용할 수 있습니다. 수준 1 및 2의 데이터와 동일한 데이터 외에도 기본 보고서에는 아미노산 위치, 약어 및 예/아니요(Y/N) 유사한 감수성이 템플릿 예측과 표시됩니다. 유사하게, 전체 보고서에는 아미노산 측쇄 분류 및 분자량에 대한 정보가 포함되어 있습니다.

  1. 수준 3 보고서 페이지에서 아래쪽으로 스크롤하여 결과 보고서를 봅니다. 보고서 아래쪽에 있는 테이블 다운로드를 클릭하여 테이블을 저장합니다.
  2. 수준 3 요약 보고서 보기를 클릭하여 분류 그룹별로 정렬된 데이터를 표시하는 요약 보고서 테이블을 보고 다운로드합니다. 수준 3 보고서 페이지에서 시각화 옆에 있는 더하기 기호 +를 클릭하여 사용자 정의 정보와 대화형 히트 맵 형식으로 결과를 볼 수 있는 옵션을 표시하는 별도의 브라우저 탭을 엽니다.
  3. 시각화 정보 페이지에서 히트 맵을 클릭하여 대화형 그래픽 및 컨트롤을 열고 히트 맵 시각화가 데이터 테이블의 변경 내용을 반영하도록 적극적으로 업데이트되도록 합니다. 다음 선택적 단계를 수행하여 히트 맵을 사용자 지정합니다.
    1. (선택 사항) 보고서 옵션을 선택하여 아미노산 위치, 한 글자 약어 및 아미노산 유사성을 표시하는 단순 보고서 또는 선택한 각 아미노산에 대한 자세한 정보를 표시하는 전체 보고서 간에 변경합니다.
    2. (선택 사항) 보고서 옵션을 선택하여 종이 표시되는 방식( 일반 이름 또는 학명)을 변경합니다.
      참고: 단순 보고서 내에서 아미노산은 템플릿 아미노산에 대한 총 일치(진한 파란색), 부분 일치(연한 파란색, 한 가지 기준만 충족하는 대체) 또는 일치하지 않음(노란색, 두 기준을 모두 충족하는 대체)으로 분류됩니다. 전체 보고서 에는 비교가 총 일치(진한 파란색) 또는 일치하지 않음(노란색)으로 표시됩니다.
    3. (선택 사항) 선택적 선택을 선택하여 Ortholog 후보, 멸종 위기 종, 멸종 위기 종 또는 공통 모델 유기체와 같은 유용한 정보를 강조 표시합니다.
    4. (선택 사항) 히트 맵 설정을 선택하여 열, 범례 및 텍스트 추가 또는 제거를 포함한 추가 사용자 지정 옵션을 선택합니다.
  4. Boxplot 다운로드를 클릭하여 파일 유형을 선택하고 시각화를 저장합니다.

10. SeqAPASS 결과의 해석: 단백질 보존을 위한 증거 라인

참고: 해석의 편의를 위해 이 도구에는 레벨 간 데이터를 통합하도록 설계된 결정 요약 보고서(DS 보고서)가 포함되어 있습니다. DS 보고서에는 사용자가 선택한 결과(즉, 데이터 테이블 및/또는 시각화)가 포함되어 있으며 여러 종에 대한 여러 레벨에서 동시에 감수성 예측을 빠르게 평가할 수 있습니다.

  1. 결과 또는 데이터 시각화 페이지에서 수준 #을 DS Report로 푸시를 클릭하고 데이터가 "푸시"되고 DS 보고서 탭이 활성화될 때까지 기다립니다.
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    참고: 레벨 1에 정렬된 모든 종의 경우 최종 결정 요약 보고서 테이블에는 각 분석에 대한 중요한 데이터와 감수성 예측이 포함되어 있습니다. DS 테이블의 종이 수준 3 보고서에 포함되지 않았지만 수준 1 및/또는 수준 2 작업에서 발견된 경우 표의 셀은 수준 3 감수성 예측에 대해 해당 없음(NA) 지정을 받게 됩니다.

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Representative Results

SeqAPASS 도구의 적용을 시연하고 새로운 기능을 강조하기 위해 단백질 보존이 종(인간 트랜스티레틴) 간에 화학적 감수성에 차이가 있고 차이가 없다고 예측하는 사례(μ 오피오이드 수용체[MOR])를 나타내는 두 가지 사례 연구가 설명됩니다. 이 중 첫 번째 예는 부작용 경로(AOP, 정의는 표 2 참조)에 대한 적용 가능성 영역을 예측하기 위한 단백질 서열/구조 비교를 다루는 반면, 두 번째는 폐수에 존재하는 아편유사제에 대한 종 간 감수성과 관련된 연구 가설을 개발하는 데 중점을 둡니다. 이 사례 연구에 설명 된 기본 접근법은 모든 화학 물질에 적용될 수 있으며 의사 결정 및 연구를위한이 도구의 광범위한 유용성을 보여줍니다.

갑상선 호르몬은 정상적인 성장과 발달에 필수적입니다. 그들은 갑상선에서 합성되어 혈류로 분비되어 분포 단백질에 결합하여 몸 전체로 순환됩니다 14,15,16,17,18. 최근 연구에 따르면 폴리 염화 비 페닐 (PCB), 폴리 브롬화 디 페닐 에테르 (PBDE) 및 퍼 및 폴리 플루오로 알킬 물질 (PFAS)과 같은 환경 오염 물질은 분포 단백질 트랜스 티레틴 (TTR)에 경쟁적으로 결합하여 정상적인 갑상선 과정을 방해 할 수 있습니다 19,20,21,22,23,24,25 . 인간 신경 발달 독성 (https://aopwiki.org/aops/152)으로 이어지는 TTR에 대한 경쟁적 결합을 설명하는 AOP가 개발되었습니다. 이 AOP가 설치류에도 적용 가능하다는 증거가 있지만 다른 분류 그룹에 대한 적용 가능성은 아직 정의되지 않았습니다. TTR 결합 화학 물질이 환경에 존재하기 때문에 SeqAPASS 분석을 통해 부분적으로 해결할 수 있는 과제인 이 AOP의 분류학적 관련성을 이해하는 것이 중요합니다. 도구의 문제 공식화 전략을 사용하여 분석의 목적은 다음과 같이 명시 될 수 있습니다 : TTR 결합 화합물이 인간에게 불리한 결과를 초래한다는 사실을 알고 있다면, 어떤 분류 학적 그룹이 유사한 감수성을 공유 할 것으로 예측 될 수 있습니까?

인간 트랜스티레틴 단백질은 잘 특성화되어 있으며, 인간 TTR(hTTR) 결합 부위에 결합하는 것으로 알려진 몇 가지 잘 연구된 리간드가 있어 SeqAPASS 분석 8,9,13을 위한 최적의 표적이 됩니다. 인간 트랜스티레틴에 대한 NCBI 가입, P02766.1을 사용하여, 레벨 1 분석을 기본 설정으로 수행하였다. 레벨 1 분석의 결과는 유사성 컷오프를 49%로 설정했으며, 포유류(포유류), 조류(에이브), 파충류(고환류, 레피도사우리아, 악어), 양서류(양서류) 및 대부분의 어종(악티놉테리, 실러칸티모르파, 클라디스타, 콘드리히티예)이 이 컷오프 위에 있습니다(그림 3). 따라서 이러한 분류학적 그룹의 모든 종은 "Y"(즉, 예)의 감수성 예측을 초래했으며 hTTR과 상호 작용하는 것으로 알려진 화학 물질에 취약할 가능성이 높습니다(그림 3 및 보충 파일 1).

기능적 도메인(들)의 레벨 2 평가를 위해, NCBI 보존된 도메인 데이터베이스를 사용하여 잔기 27 내지 147로부터 TTR 서브유닛 단백질의 성숙 사슬을 포함하는 보존된 도메인으로서 TR_THY(가입 스마트00095)를 확인하였다. NCBI에 보고된 TTR의 단백질 서열에는 현재 분석과 관련이 없는 20개의 아미노산 사전 세그먼트가 포함되어 있으므로 성숙 사슬에 대한 비교에 초점을 맞추면 종에 걸쳐 이 단백질의 보존을 위한 추가적이고 보다 구체적인 증거가 제공됩니다. 레벨 2 평가에서 58%의 유사성 컷오프가 보고되었으며 포유류, 조류, 파충류, 양서류 및 대부분의 어종이 다시 이 컷오프 이상으로 떨어졌습니다(그림 4). 결과적으로 SeqAPASS는 이러한 분류학적 그룹의 종에 대해 "Y"(즉, 예)의 감수성 예측을 결론지었으며, 이는 hTTR 단백질과 상호 작용하는 화학 물질에 취약할 가능성이 있음을 나타냅니다(그림 4 및 보충 파일 1). 전반적으로 레벨 1 및 레벨 2 분석 결과는 대부분의 척추 동물 종이 hTTR의 보존을 공유하고이 단백질과 상호 작용하는 것으로 알려진 화학 물질에 취약 할 가능성이 있음을 시사합니다.

Figure 3
그림 3: 인간 단백질과 관련하여 사용 가능한 서열 정보를 사용하여 분류학적 그룹 전반에 걸친 트랜스티레틴 보존에 대한 SeqAPASS 레벨 1 분석. 단백질 아미노산 서열의 유사성 퍼센트는 Y축에 표시되고; 분류 그룹은 X축에 표시됩니다. 열린 원(○)은 쿼리 순서를 나타내고 닫힌 원(●)은 분류 그룹 내에서 유사성이 가장 높은 종을 나타냅니다. 그림 내에서 각 상자의 상단과 하단은 75번째 및 25번째 백분위수를 나타내고, 수염은 사분위수 범위의 1.5배까지 확장되며, 평균값과 중앙값은 상자에서 검은색 수평선으로 표시됩니다. 파선은 민감도 예측에 대한 컷오프를 나타냅니다. 약어 : TTR = 트랜스 티레틴; SeqAPASS = 종 감수성을 예측하기 위한 서열 정렬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 인간 단백질 LBD와 관련하여 사용 가능한 서열 정보를 사용하여 분류학적 그룹에 걸친 트랜스티레틴 수용체 리간드 결합 도메인 보존에 대한 SeqAPASS 레벨 2 분석. 리간드 결합 도메인 아미노산 서열의 유사성 퍼센트는 Y축에 표시되고; 분류 그룹은 X축에 표시됩니다. 열린 원(○)은 쿼리 순서를 나타내고 닫힌 원(●)은 분류 그룹 내에서 유사성이 가장 높은 종을 나타냅니다. 그림 내에서 각 상자의 상단과 하단은 75번째 및 25번째 백분위수를 나타내고, 수염은 사분위수 범위의 1.5배까지 확장되며, 평균값과 중앙값은 상자에서 검은색 수평선으로 표시됩니다. 파선은 민감도 예측에 대한 컷오프를 나타냅니다. 약어 : TTR = 트랜스 티레틴; SeqAPASS = 종 감수성을 예측하기 위한 서열 정렬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

분자 모델링 및 단백질 결정학 연구의 분석을 통해 내인성 리간드 3,3',5,5'- 테트라 요오도 -L- 티로 닌 (T4, PDB 2ROX)과 상호 작용할 것으로 예상되는 TTR의 결합 영역에서 아미노산이 확인되었으며, 퍼플 루오로 옥탄 설포 네이트 (PFOS, PDB 5JIM), 테트라 브로 모비스 페놀 A (TBBPA, PDB 5HJG) 및 디 에틸 스틸 베스트롤 (DES, PDB 1TZ8) 19, 21,22,26. 아미노산 잔기 Lys35, Ser137, Leu130, Ala128, Ala129 및 Thr139는 모두 직접적인 수소 결합 상호 작용 또는 반 데르 발스 상호 작용을 통해 단백질-리간드 상호 작용에서 중요한 역할을하는 것으로 확인되었습니다. 이들 6개의 아미노산 잔기는 hTTR을 주형 서열로 사용하고 비상동성, 가설적, 부분적 및 저품질 서열을 제외한 종에 걸친 레벨 3 분석에서 평가되었다(보충 파일 1). TTR이 척추 동물 종에 걸쳐 만 보존된다는 것이 이전에 결정되었으므로 무척추 동물 종은이 분석에서 제외되었습니다 (그림 3 및 그림 4). 추가적으로, 문헌에 보고된 아미노산 위치는 성숙한 hTTR 단백질에 없는 20개의 아미노산 예비-세그먼트를 제외하고, 이러한 이유로 레벨 3에 제출된 위치는 선택된 주형 단백질15에 대한 정확한 정렬을 보장하기 위해 문헌에 보고된 위치로부터 조정되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다(보충 파일 1).

TTR의 레벨 3 분석에서 294 개의 척추 동물 종 (포유류, 조류, 양서류, 파충류 및 어류)이 정렬을 위해 선택되었습니다. 평가 된 종 중 18 종은 주요 아미노산의 차이를 보여 "N"(즉, 아니오)의 감수성 예측을 초래했습니다. 흥미롭게도 5종의 해양 포유류는 위치 2(128A)에서 아미노산 치환을 나타냈고, 4종의 물고기는 위치 2(128A) 또는 위치 6(139T)에서 치환을 보였습니다(그림 5). 이러한 아미노산은 TTR의 결합 채널에서 단백질-리간드 상호 작용에 중요한 역할을 하기 때문에 이러한 데이터는 TTR 리간드가 이러한 종에서 다르게 상호 작용할 수 있고 인간에 비해 다른 화학적 감수성을 초래할 수 있음을 시사합니다.

Figure 5
그림 5: TTR-화학적 결합에 중요한 아미노산 잔기의 보존에 대한 SeqAPASS 레벨 3 분석. (A) 모든 분류학적 그룹에서 사용 가능한 서열 데이터가 있는 종의 수, 유사하게 감수성이 있을 것으로 예상되는 종의 수(Y) 및 유사하게 감수성이 없을 것으로 예측되는 종의 수(N)를 표시하는 레벨 3 요약표. (B) 인간 트랜스 티 레틴 TTR 단백질에 비해 유사하게 민감하지 않을 것으로 예상되는 선택된 종을 보여주는 레벨 3 히트 맵은 완전한, 부분 및 일치하지 않는 아미노산을 보여줍니다. 약어 : TTR = 트랜스 티레틴; SeqAPASS = 종 감수성을 예측하기 위한 서열 정렬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이해 관계자 및 사용자 피드백에 따라 다양한 애플리케이션의 경험적 데이터에 연결하는 기능을 포함하여 새로운 기능이 설계되어 SeqAPASS 도구에 통합되었습니다. 이 도구와 ECOTOX 지식 기반(표 1)의 상호 운용성은 ECOTOX에 있는 가입에 대한 레벨 1 및 레벨 2 데이터 테이블에 외부 링크를 포함하고 도구 내에 ECOTOX 위젯을 생성하여 ECOTOX에서 가장 관련성이 높은 독성 데이터로 직접 필터링함으로써 달성되었습니다. 링크와 위젯을 통해 사용자는 ECOPTOX를 신속하게 쿼리하고 SeqAPASS 감수성 예측을 통해 종에 대한 해당 독성 데이터를 수집할 수 있습니다. 현재 SeqAPASS 예측은 화학적 스트레스 요인 및 종을 통해 ECOTOX와 연결되어 있습니다. 그러나 독성 데이터는 아직 특정 유전자/단백질과 연결되어 있지 않으므로 SeqAPASS에서 관심 있는 특정 종말점/분자 표적에 직접 연결할 수 있습니다. 화학적 스트레스 요인을 기반으로 예측을 독성 데이터에 연결하는 것은 이상적이지 않지만 데이터가 주어진 경로에 특정되지 않을 수 있으므로 결과를 통합하기 위한 연결을 설정하는 것이 첫 번째 단계입니다. SeqAPASS-ECOTOX 통합의 첫 번째 반복인 현재 접근 방식은 사용자에게 광범위한 수준에서 화학적 스트레스 요인 및 종에 대해 사용 가능한 모든 독성 데이터를 제공합니다. 이러한 데이터는 SeqAPASS 예측과 결합될 때 광범위한 수준(척추동물 대 무척추동물)에서 컨텍스트를 제공할 수 있으며 AOP 프레임워크의 컨텍스트 내에서 고려할 수 있습니다.

TTR은 기존 AOP(AOP 152)가 잠재적으로 관련된 ECOTOX 독성 데이터를 해석하기 위한 컨텍스트를 제공하므로 이러한 연결을 검사하기 위한 좋은 사례 예를 제시합니다. SeqAPASS 레벨 3에서 조사된 리간드를 시작으로, TTR 리간드 결합 도메인과 상호작용하는 것으로 알려진 4가지 화학물질(디에틸스틸베스트롤[DES], 퍼플루오로헥산산[PFHxA], 퍼플루오로옥탄 설포네이트[PFOS] 및 테트라브로모비스페놀 A[TBBPA])19,21,23,24에 대한 환경 독성 데이터를 수집했습니다. . 각 화학 물질에 대해 ECOTOX는 사용자 지정 검색 매개 변수 (보충 파일 1)를 사용하여 화학 초록 서비스 (CAS) 번호로 수생 및 육상 데이터를 쿼리했습니다. 데이터는 관심 종 그룹 (양서류, 조류, 물고기, 무척추 동물, 포유류, 파충류)으로 필터링되었습니다. 필터링된 쿼리 결과 내에서 연구의 최소 및 최대 효과 농도의 평균이 계산되어 평균 효과 농도 값을 보고하지 않은 모든 히트에 대한 평균에 대한 근사치로 구현되었습니다(그림 6A 및 보충 파일 1). 단일 화학 물질의 맥락에서 Kruskal-Wallis 테스트는 데이터가 ANOVA 테스트 가정을 충족하지 않기 때문에 다른 분류 학적 그룹의 평균 효과 농도를 비교하기 위해 수행되었습니다. 그런 다음 분류 학적 그룹이 동일하지 않은 표본 크기로 구성되기 때문에 모든 화학 물질에 대해 Dunn 's Test를 사용하여 사후 쌍별 비교 테스트를 수행했습니다. 수생 및 육상 결과는 두 가지 유형의 노출 간의 데이터를 직접 비교할 수 없기 때문에 별도로 분석되었습니다. ECOTOX 내에서 선택된 화학 물질에 대한 수생 독성 데이터는 양서류, 조류, 무척추 동물 및 어종에 대해 사용할 수있었습니다 (그림 6A). 선택된 화학 물질에 대한 육상 독성 데이터는 포유류 및 DES에 대해서만 이용 가능했습니다 (보충 파일 1).

Figure 6
그림 6: SeqAPASS 결과를 경험적 데이터와 연결 . (A) 인간 TTR 단백질에 결합하는 것으로 알려진 선택된 화학 물질에 대한 ECOTOXicology 지식 기반에서 사용할 수 있는 데이터와 함께 분류학적 그룹 전체의 평균 효과 농도. (B) 각 SeqAPASS 분석에 포함된 종의 수와 ECOTOX 데이터를 사용할 수 있는 종의 수가 겹칩니다. 패널 A에서 x축을 따라 있는 괄호는 데이터가 집계된 조회 적중 횟수를 나타냅니다. 별표는 단일 화학 물질의 맥락 내에서 종 그룹 간에 유의하게 다른 효과 농도의 쌍을 나타내며(Dunn's test, p < 0.05), 별표의 수가 많을수록 더 높은 수준의 유의성을 나타냅니다(*: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001; ****: p < 0.0001). 각 상자 내의 중심선은 중앙값을 나타내며 상자 모서리는 사분위수 범위를 나타냅니다. 수염은 사분위수 범위의 최대 1.5 배까지 확장됩니다. 해당 범위를 벗어나는 이상값은 개별 점으로 표시됩니다. 약어 : TTR = 트랜스 티레틴; SeqAPASS = 종 감수성을 예측하기위한 서열 정렬; 에코톡스 = 에코톡시콜로지 지식 기반. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

전반적으로, 이러한 데이터는 평가 된 화학 물질에 대한 생체 활성이 척추 동물 종에서 발생하지만 무척추 동물에서는 발생하지 않음을 시사합니다. ECOCOX에 생물학적 표적 및 경로 정보가 없기 때문에 이러한 경험적 데이터를 TTR에 직접 연결하는 것은 불가능하지만 이러한 결과는 무척추 동물 종이 감수성을 공유하지 않는다는 SeqAPASS 예측을 뒷받침합니다. 이용 가능한 데이터가 있는 모든 척추동물 종은 PFOS와 TBBPA 모두에 대한 감수성을 입증했지만 평균 효과 농도는 양서류보다 어류와 조류에서 유의하게 높았습니다. 이러한 데이터는 생물학적 경로 차이(TTR 포함)에 기인할 수 있는 분류학적 그룹 간의 민감도의 잠재적인 차이를 시사합니다. 신진 대사 및 배설과 같은 다른 변수도 민감도의 차이에 중요한 역할을 할 수 있다는 점은 주목할 만합니다. PFHxA 및 PFOS의 경우 물고기는 무척추 동물과 조류보다 훨씬 더 민감한 것으로 나타 났으며 DES의 경우 양서류는 무척추 동물보다 평균 효과 농도가 유의하게 높았습니다. 다시 말하지만, 이러한 데이터는 무척추 동물이 척추 동물 종과 감수성을 공유하지 않는다는 SeqAPASS 예측을 뒷받침합니다. 사용 가능한 TTR 서열 데이터가 있는 이 도구를 사용하여 평가된 모든 종 중 관심 있는 4가지 화학 물질에 대해 해당하는 ECOTOX 데이터를 가진 종은 소수에 불과했습니다(그림 6B, 보충 표 S1 및 보충 표 S2). 정점 데이터가 없는 종의 경우 감수성에 대한 SeqAPASS 예측은 관련 종이 정점 데이터가 있는 종과 유사하게 행동할 수 있다는 추가 증거를 추가합니다. 모든 SeqAPASS 및 ECOTOX 분석에 대한 데이터는 보충 파일 1에서 확인할 수 있습니다.

질병 통제 예방 센터 (CDC) 에 따르면 2017 년 미국에서 오피오이드는 과다 복용으로 약 47,600 명이 사망했으며 그 숫자는 계속 증가하고 있습니다27. 미국의 폐수 처리장은 미국 환경 보호국의 국가 오염 물질 배출 제거 시스템에 의해 전국적으로 규제되며, 이는 배출 시 아편유사제 또는 기타 의약품에 대한 테스트가 필요하지 않습니다28. 최근 몇 년 동안 폐수 기반 역학을 지역 사회 오피오이드 사용을 매핑하는 도구로 사용하려는 노력이 이루어졌습니다. 오피오이드 모니터링 노력은 폐수 유출 물에서 1.27μg/L, 지표수29,30에서 0.7μg/L의 높은 농도를 감지했습니다. 물고기에 대한 오피오이드 노출의 영향을 평가하는 최근의 독성 연구에서는 중독성 행동의 발달과 불리한 면역 학적 효과 (예 : 높은 감염률, 면역 유전자의 하향 조절)를보고했습니다 31,32,33. 전반적으로, 이러한 연구는 불리한 환경 오피오이드 노출 가능성이 있음을 시사하고 이러한 화학 물질이 수생 종에 미치는 위험을 이해하는 것의 중요성을 강조합니다. 환경에서 이러한 화합물을 접할 수 있는 종의 범위를 감안할 때 SeqAPASS를 사용하여 잠재적으로 취약한 종을 식별하는 것이 테스트 또는 모니터링 노력의 우선 순위를 지정하는 데 중요할 수 있습니다.

MOR은 통증 관리를위한 주요 오피오이드 표적을 구성하며 인간34,35에서 아편 알칼로이드의 강력한 진통 및 중독성을 담당합니다. 인체 건강에 대한 이 수용체의 중요성으로 인해 MOR 리간드가 잘 알려져 있으며 고품질 X선 결정학 연구가 가능하므로 이 표적은 SeqAPASS 분석 8,9,13에 이상적입니다. 인간 μ 오피오이드 수용체 ACM90349.1에 대한 NCBI 수탁을 사용하여, 디폴트 설정을 사용하여 레벨 1 분석을 수행하였다. 감수성 컷오프는 레벨 55의 경우 1%로 설정되었으며, 포유류(포유류), 조류(아베스), 파충류(고환, 레피도사우리아, 악어), 양서류(양서류) 및 대부분의 어종(악티놉테리, 실러칸티모르파, 클라디스타, 콘드리히티에스)에 대한 백분율 유사성이 이 컷오프 이상으로 떨어졌습니다. 따라서 이러한 분류학적 그룹의 종은 "Y"(즉, 예)의 감수성 예측을 초래했으며, 이는 인간 MOR과 상호 작용하는 것으로 알려진 화학 물질에 취약할 가능성이 있음을 나타냅니다(그림 7 및 보충 파일 1). NCBI 보존된 도메인 데이터베이스를 사용하여, 추정 리간드 결합 부위를 포함하는, 133 내지 411의 MOR 단백질의 7개의 나선 모두를 포함하는 기능적 도메인으로서 7tmA_Mu_opioid_R 확인되었다(기탁 cd15090). 레벨 1과 비교하여 레벨 2 결과는 포유류, 조류, 파충류, 양서류 및 대부분의 어종이 이 컷오프 위에서 발견되어 예에 대한 "Y"의 감수성 예측을 초래하는 88% 유사성의 더 높은 감수성 컷오프를 식별했습니다(그림 8). 전반적으로 레벨 1 및 레벨 2 분석 결과는 대부분의 척추 동물 종이 MOR의 보존을 공유하고 인간 MOR과 상호 작용하는 것으로 알려진 화학 물질에 취약 할 가능성이 있음을 시사합니다.

Figure 7
그림 7: 인간 단백질과 관련하여 사용 가능한 서열 정보를 사용하여 분류학적 그룹 전반에 걸친 μ 오피오이드 수용체 보존에 대한 SeqAPASS 레벨 1 분석. 단백질 아미노산 서열의 유사성 퍼센트는 Y축에 표시되고; 분류 그룹은 X축에 표시됩니다. 열린 원(○)은 쿼리 순서를 나타내고 닫힌 원(●)은 분류 그룹 내에서 유사성이 가장 높은 종을 나타냅니다. 그림 내에서 각 상자의 상단과 하단은 75번째 및 25번째 백분위수를 나타내고, 수염은 사분위수 범위의 1.5배까지 확장되며, 평균값과 중앙값은 상자에서 검은색 수평선으로 표시됩니다. 파선은 민감도 예측에 대한 컷오프를 나타냅니다. 약어: MOR = 뮤-오피오이드 수용체; SeqAPASS = 종 감수성을 예측하기 위한 서열 정렬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8: 인간 단백질의 도메인에 대한 μ 오피오이드 수용체 리간드 결합 도메인 보존의 SeqAPASS 레벨 2 분석. 리간드-결합 도메인 아미노산 서열의 유사성 퍼센트는 Y축에 표시되고; 분류 그룹은 X축에 표시됩니다. 열린 원(○)은 쿼리 순서를 나타내고 닫힌 원(●)은 분류 그룹 내에서 유사성이 가장 높은 종을 나타냅니다. 그림 내에서 각 상자의 상단과 하단은 75번째 및 25번째 백분위수를 나타내고, 수염은 사분위수 범위의 1.5배까지 확장되며, 평균값과 중앙값은 상자에서 검은색 수평선으로 표시됩니다. 파선은 민감도 예측에 대한 컷오프를 나타냅니다. 약어: MOR = 뮤-오피오이드 수용체; SeqAPASS = 종 감수성을 예측하기 위한 서열 정렬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

분자 모델링 및 단백질 결정학 연구의 분석을 통해 알려진 리간드와 상호 작용할 것으로 예상되는 MOR의 결합 영역에서 아미노산을 확인했습니다. 오피오이드 수용체에 잘 결합하는 다양한 리간드 세트가 복잡한 약리학을 초래하지만, 일부 일관된 리간드-단백질 상호 작용이 관찰됩니다36,37. 다양한 MOR 결정 구조, 모르핀 및 펜타닐 모두에 대한 분자 도킹에 기초하여, 고친화성 MOR 작용제는 D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322, 및 Y32636,38과 상호작용한다. 잔기 D147, Y148, M151 및 H297은 또한 모르핀 작용제 BU72에 결합된 MOR의 결정 구조에 관여하는 반면, D147, M151, H297 및 Y326은 또한 비가역적 모르핀 길항제 β-funaltrexamine37에 결합하는 데 중요합니다. 이러한 증거 라인을 고려하여 인간 MOR을 템플릿 서열로 사용하고 부분적, 예측적, 가설적 및 저품질 서열을 제외한 레벨 3 평가를 위해 9개의 잔기(D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322, Y326)를 선택했습니다. 중요하게는, 문헌에 보고된 아미노산 위치는 NCBI 단백질 가입에 대한 64-아미노산 세그먼트를 배제하고, 이러한 이유로, 레벨 3의 위치는 올바른 정렬 서열을 위해 주형 서열과 정렬된 것을 나타내도록 선택되었다.

인간 MOR의 레벨 3 분석에서 척추 동물 종 (포유류, 조류, 양서류, 파충류 및 어류)에 걸쳐 284 종을 평가했습니다. 평가된 모든 종에 걸쳐, 9개의 아미노산은 측쇄 분류 및 분자량에 기초한 전체 일치 또는 부분 일치였다; 결과적으로, 평가 된 모든 종은 예에 대한 "Y"의 감수성 예측을 초래했다 (표 3 및 보충 파일 1). 이러한 아미노산은 강력한 MOR 작용제와 강력한 길항제 모두의 결합에 중요하기 때문에 이러한 데이터는 인간 μ 오피오이드 수용체를 표적으로 하는 오피오이드 화합물이 척추동물 종의 수용체와 유사하게 상호 작용할 수 있음을 시사합니다. 오피오이드 화합물에 대한 ECOTOX 지식 기반 내에서 현재까지 사용할 수 있는 경험적 데이터는 거의 없지만 여러 연구에 따르면 물고기는 31,32,33에 취약할 가능성이 있습니다. 전반적으로 SeqAPASS의 결과는 종 전반에 걸쳐 MOR 조절 화학 물질의 광범위한 환경 영향 가능성을 지적하며, 이는 더 많은 연구와 모니터링이 가치가 있을 수 있음을 나타냅니다. 모든 분석에 대한 데이터는 보충 파일 1에서 확인할 수 있습니다.

표 3: μ 오피오이드 수용체에 대한 화학적 결합에 중요한 아미노산 잔기의 보존에 대한 SeqAPASS 레벨 3 분석. 모든 분류학적 그룹에서 사용 가능한 서열 데이터가 있는 종의 수, 유사하게 감수성이 있을 것으로 예측되는 종의 수(Y), 유사하게 감수성이 없을 것으로 예측되는 종의 수, 완전, 부분 및 일치하지 않는 아미노산을 표시하는 요약 테이블. 약어: SeqAPASS = 종 감수성을 예측하기 위한 서열 정렬. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S1: 인간 트랜스티레틴 단백질에 결합하는 것으로 알려진 4가지 관심 화학물질에 대한 이용 가능한 ECOTOX 데이터가 있는 종. 각 화학 물질에 대해 사용할 수 있는 데이터는 레벨 1, 2 및 3에 걸쳐 유사한 감수성에 대한 SeqAPASS 예측과 일치합니다. 인간 트랜스티레틴 서열에 상대적인 모든 SeqAPASS 예측. 약어: SeqAPASS = 종 감수성을 예측하기 위한 서열 정렬; DES = 디에틸스틸베스트롤; PFHxA = 퍼플루오로헥산산; PFOS = 퍼플루오로옥탄 술폰산; TBBPA = 테트라브로모비스페놀 A. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S2: 인간 트랜스티레틴 단백질에 결합하는 것으로 알려진 선택된 화학 물질에 대한 SeqAPASS 및 ECOTOX 평가에서 사용 가능한 데이터가 있는 총 종 수. SeqAPASS는 경험적 독성 데이터를 사용할 수 없는 많은 종에 대한 종 감수성을 예측하는 수단을 제공합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 모든 대표 결과에 대한 SeqAPASS 및 ECOTOX 데이터. 파일에는 ToC와 다음 데이터 시트가 포함되어 있습니다: 탭 1-hTTR 시퀀스 결과 레벨 1, 탭 2-hTTR 시퀀스 A패스 결과 레벨 2, 탭 3-hTTR 시퀀스 통과 결과 레벨 3, DES에 대한 탭 4-EcoTox 데이터, PFOS에 대한 탭 5-EcoTox 데이터, PFHxA에 대한 탭 6-EcoTox 데이터, TBBPA에 대한 탭 7-EcoTox 데이터, 탭 8-EcoTox 그룹 평균 계산, 탭 9-시크아패스 에코톡스 데이터 비교, 탭 10-hMOR 시퀀스 결과 레벨 1, 탭 11-hMOR 시퀀스패스 결과 레벨 2, 탭 12-μ-hMOR 시큐패스 결과 레벨 3. 약어: SeqAPASS = 종 감수성을 예측하기 위한 서열 정렬; 목차 = 목차; hTTR = 인간 트랜스티레틴; ECOTOX = 생태 독성학 지식 기반; DES = 디에틸스틸베스트롤; PFOS = 퍼플루오로옥탄 술폰산; PFHxA = 퍼플루오로헥산산; TBBPA = 테트라브로모비스페놀 A; hMOR = 인간 뮤-오피오이드 수용체. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

독성 학적 관심의 화학 물질에 노출 될 수있는 살아있는 유기체의 게놈, 표현형, 생리 학적 및 행동 적 다양성을 포착하기에 충분한 종을 경험적으로 테스트하는 것이 불가능하다는 인식이 널리 퍼져 있습니다. SeqAPASS의 목표는 분자 수준 비교를 통해 테스트된 유기체에서 수백 또는 수천 종의 다른 종으로 화학 독성 데이터/지식을 외삽하는 데 도움이 되고 정보를 제공하기 위해 기존의 지속적으로 확장되는 단백질 서열 및 구조 데이터의 사용을 극대화하는 것입니다. SeqAPASS 도구는 투명하게 생성되고 다운로드 가능한 요약 테이블, 대화형 데이터 시각화, 위협 및 멸종 위기에 처한 종과 일반적인 모델 유기체의 쉬운 식별을 포함하는 능률적이고 신속한 분석을 통해 과학자, 위험 평가자 및 규제 기관의 단백질 서열 비교의 복잡성을 줄이도록 설계되었습니다. 프로토콜은 1차 아미노산 서열 유사성, 기능적 도메인 보존 및 화학-단백질 및 단백질-단백질 상호 작용에 관여하는 중요 아미노산의 평가를 위해 SeqAPASS 레벨 1, 2 및 3을 실행하기 위해 여기에 설명되어 있습니다. 각 SeqAPASS 분석에서 수집된 증거 라인은 종 전반에 걸친 화학적 감수성을 예측하여 일관되고 쉽게 해석할 수 있는 데이터를 제공합니다. 현재까지이 도구는 특정 수용체에 결합하는 화학 물질의 식별 및 포유류 시스템을 가진 척추 동물 생태 수용체에 대한 판독 가능성을 평가하는 등 광범위한 응용 분야에서 사용되었습니다. 또한 갑상선 호르몬 분포 단백질, TTR 및 MOR에 초점을 맞춘 두 가지 사례 연구를 설명하여 SeqAPASS v2에서 v6까지의 새로운 기능을 보여줍니다.

임의의 계산 접근법과 마찬가지로, SeqAPASS 도구 내에서 종 감수성의 예측을 생성하는 능력은 적절한 파라미터 8,9,13의 입력에 크게 의존한다. 따라서 분석을 수행하기 전에 의도 된 대상에 대한 기존 데이터 및 문헌을 조사하기 위해 문제 공식화 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 단백질 표적에 대한 지식을 바탕으로 분석을 시작하면 사용자가 적절한 단백질 수탁 번호와 고품질 서열을 식별할 수 있습니다. 유사하게, 민감하거나 표적화된 종 또는 분석 또는 AOP 개발에 사용되는 모델 유기체에 대한 지식은 다른 모든 종과 비교되는 적절한 질의 종의 선택을 보장한다. 레벨 2의 기능 도메인과 레벨 3의 중요한 아미노산 잔기를 선택하는 것도 사용자가 예측을 생성하기 위해 적절한 입력 파라미터를 식별해야 하는 중요한 단계입니다. 화학-단백질 상호 작용에 대한 기존 지식에 대한 이러한 필요성으로 인해 SeqAPASS 도구의 최신 버전 릴리스는 쿼리 시작을 위한 관련 정보(예: 다른 도구에 대한 링크)로 사용자를 안내하는 데 도움이 되도록 설계된 사용자 친화적인 리소스를 통합합니다(표 2 및 그림 2). 또한 팝업 정보 메시지 및 경고가 도구에 통합되어 사용자에게 분석 과정을 안내하고 해결해야 할 오류를 사용자에게 알리는 데 도움이 됩니다.

화학-생물학적 상호 작용의 복잡성은 SeqAPASS 도구의 한계를 나타냅니다. 종 전반에 걸쳐 독성 데이터를 외삽할 때 분자 표적의 보존은 고려해야 할 많은 요소 중 하나입니다. 화학 물질의 흡착, 분포, 대사 및 배설 (ADME)은 화학 독성을 고려할 때 중요하며, 화학 물질은 이러한 과정39,40에 의해 활성화되거나 해독 될 수 있기 때문입니다. 화학 물질 노출 경로, 유기체 수명 단계 및 생활사,식이 요법과 같은 다른 요인도 종 간의 화학적 민감도를 결정하는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다41,42. 이러한 한계를 해결하기 위해 SeqAPASS가 화학적 감수성을 예측할 때 묻는 주요 질문을 이해하는 것이 중요합니다: 화학 물질의 단백질 표적이 화학 물질이 작용하기 위해 다른 종에 존재할 가능성이 있습니까? 이 질문은 ortholog 후보를 식별하고 알려진 민감하거나 표적화된 종과 관련하여 종에 걸쳐 해당 표적의 보존을 고려함으로써 해결됩니다. 이 정보는 종 간 외삽에 대한 증거 라인으로 사용될 수 있으며 화학적 스트레스 요인에 대한 종의 감수성을 더 잘 이해하기 위해 다른 증거 스트림 (예 : 노출 가능성)에 통합 될 수 있습니다. SeqAPASS에 대한 업데이트에는 US EPA ECOTOX 지식 베이스43 및 미국 어류 및 야생동물 서비스 환경 보존 온라인 시스템(ECOS)44을 포함한 외부 도구에 대한 통합 링크가 통합되었습니다. 이러한 데이터베이스에 연결하면 SeqAPASS 사용자는 경험적 화학 독성 데이터에 쉽게 액세스하여 시퀀스 기반 예측과 비교하고 보호 상태를 가질 수 있는 종을 식별할 수 있습니다.

SeqAPASS 도구는 진화 생물학의 개념과 예측을 사용 가능한 경험적 결과와 비교하는 사례 사례에 의해 뒷받침되는 내재적 감수성의 계산 예측을 위한 과학적 기반 플랫폼을 제공합니다. 또한 SeqAPAPIS는 무료이며 널리 액세스 할 수있는 잘 지원되는 웹 기반 플랫폼에서 공개적으로 사용할 수 있습니다 (https://seqapass.epa.gov/seqapass/). 이 도구는 기존 데이터베이스의 서열 데이터와 단백질 정보를 활용하기 때문에 시퀀싱 기술이 발전하고 새로운 종의 게놈에 시퀀싱과 주석이 달림에 따라 더 광범위한 종에서 화학적 감수성을 예측하는 능력이 지속적으로 향상되고 있습니다. 이는 데이터 가용성과 관련하여 뚜렷한 이점을 제공하지만 공개적으로 사용 가능한 서열 정보가 일부 종에 대한 단백질 서열의 일관성 없는 품질, 불량한 주석 및 불완전성의 영향을 받을 수 있다는 점에서 한계를 제시합니다. 그러나 생물정보학의 오믹스 기술과 방법이 빠르게 발전하고 있으므로 서열 큐레이션과 품질은 시간이 지남에 따라 계속 개선될 가능성이 높습니다.

SeqAPASS 도구의 주요 목표 중 하나는 백엔드에 통합된 모든 데이터 소스 및 도구에 대한 링크 형태로 액세스를 제공하는 투명성입니다. 이러한 투명성은 사용자가 NCBI로부터의 서열 또는 분류학적 정보의 원래 소스에 신속하게 액세스할 수 있게 한다. 이 도구의 적용 가능성 영역은 의미 있는 분석을 수행하는 데 필요한 정보로 정의됩니다. 알려진 민감성 또는 표적 종에서 화학-단백질 또는 단백질-단백질 상호작용에 대한 지식은 질의를 시작하는 핵심 요소이므로, 이 정보 없이 수행된 질의는 의미가 없다는 것을 인정해야 한다. 또한 정의되지 않은 여러 생물학적 표적이 있거나 효능 정도가 다른 다른 표적과 상호 작용하는 화학 물질도 현재 형태의 도구에 대한 도전과 한계를 제시합니다. 향상된 생물 정보학, 컴퓨터 모델링, 세포 기반의 고 처리량 스크리닝 및 전사체학을 통해 특정 단백질과의 상호 작용에 관한 화학 공간의 다양성에 대한 더 많은 지식이 계속 밝혀 질 것으로 예상됩니다. 종의 다양성에 걸친 부작용의 가능성을 이해하는 것과 관련하여 종 외삽의 광범위한 문제에 SeqAPASS를 적용하는 능력은 계속 향상 될 것으로 예상됩니다.

결론적으로, SeqAPASS 도구는 화학 안전성 평가에서 종 간 외삽의 상당한 문제를 해결하기 위해 분자 정보를 쉽게 적용하는 접근 가능한 플랫폼입니다. 여기에 강조 표시된 예는 화학적 감수성에 대한 예측을 생성하는 데 초점을 맞추고 있지만 결과는 생물학적 경로의 전반적인 보존을 이해하는 데 도움이 될 수도 있습니다. 다양한 증거 라인을 통합하고 여러 플랫폼 및 데이터베이스에 대한 액세스를 용이하게 하는 이 도구는 화학 테스트의 우선 순위 지정 및 리소스 할당을 위한 투명한 사례를 구축하는 데 도움이 됩니다. 과학 및 생물 정보학 기능의 지속적인 개발로 인해 도구의 힘과 유용성은 연구 및 규제 커뮤니티의 요구를 충족시키면서 종 간 평가에 필요한 자원을 줄이기 위해 계속 성장하고 개선 될 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 Daniel L. Villeneuve 박사 (미국 EPA, 전산 독성학 및 노출 센터)와 Jon A. Doering 박사 (루이지애나 주립 대학 환경 과학과)에게 원고의 초기 초안에 대한 의견을 제공 한 것에 대해 감사드립니다. 이 작업은 미국 환경 보호국의 지원을 받았습니다. 이 논문에 표현 된 견해는 저자의 견해이며 반드시 미국 환경 보호국의 견해 나 정책을 반영하는 것은 아니며 상표명 또는 상업용 제품에 대한 언급이 연방 정부의 보증을 나타내는 것도 아닙니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spreadsheet program N/A N/A Any program that can be used to view and work with csv files (e.g. Microsoft Excel, OpenOffice Calc, Google Docs) can be used to access data export files.
Basic computing setup and internet access N/A N/A SeqAPASS is a free, online tool that can be easily used via an internet connection. No software downloads are required.

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