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Genetics

Demonstration der Sequenzausrichtung zur Vorhersage über Spezies hinweg Suszeptibilitätstool zur schnellen Bewertung der Proteinkonservierung

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/63970
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 4, 5, 5, 5, 6
1Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Scientific Computing and Data Curation Division, U.S. Environmental Protection Agency, 2Oak Ridge Institute for Science and Education, 3Swenson College of Science and Engineering, Department of Biology, University of Minnesota Duluth, 4University of Wisconsin-Madison Aquatic Sciences Center, 5General Dynamics Information Technology, Research Triangle Park, 6Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Great Lakes Toxicology and Ecology Division, U.S. Environmental Protection Agency

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die neueste Version des SeqAPASS-Tools (Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility) der US Environmental Protection Agency zu verwenden. Dieses Protokoll demonstriert die Anwendung des Online-Tools zur schnellen Analyse der Proteinkonservierung und zur Bereitstellung anpassbarer und leicht interpretierbarer Vorhersagen der chemischen Empfindlichkeit über Spezies hinweg.

Abstract

Das SeqAPASS-Tool (Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility) der US-Umweltschutzbehörde ist eine schnelle, frei verfügbare Online-Screening-Anwendung, mit der Forscher und Regulierungsbehörden Toxizitätsinformationen über Spezies hinweg extrapolieren können. Für biologische Ziele in Modellsystemen wie menschlichen Zellen, Mäusen, Ratten und Zebrafischen liegen Toxizitätsdaten für eine Vielzahl von Chemikalien vor. Durch die Bewertung der Proteinzielkonservierung kann dieses Werkzeug verwendet werden, um Daten, die aus solchen Modellsystemen generiert werden, auf Tausende anderer Arten ohne Toxizitätsdaten zu extrapolieren, was Vorhersagen der relativen intrinsischen chemischen Suszeptibilität liefert. Die neuesten Versionen des Tools (Versionen 2.0-6.1) enthalten neue Funktionen, die eine schnelle Synthese, Interpretation und Verwendung der Daten für die Veröffentlichung sowie Grafiken in Präsentationsqualität ermöglichen.

Zu diesen Funktionen gehören anpassbare Datenvisualisierungen und ein umfassender zusammenfassender Bericht, der SeqAPASS-Daten zur einfachen Interpretation zusammenfasst. In diesem Dokument wird das Protokoll beschrieben, mit dem Benutzer durch das Einreichen von Aufträgen, das Navigieren durch die verschiedenen Ebenen von Proteinsequenzvergleichen sowie die Interpretation und Anzeige der resultierenden Daten geführt werden. Neue Funktionen von SeqAPASS v2.0-6.0 werden hervorgehoben. Darüber hinaus werden zwei Anwendungsfälle beschrieben, die sich auf die Konservierung von Transthyretin- und Opioidrezeptorproteinen mit diesem Werkzeug konzentrieren. Schließlich werden die Stärken und Grenzen von SeqAPASS diskutiert, um den Anwendungsbereich für das Tool zu definieren und verschiedene Anwendungen für die artenübergreifende Extrapolation hervorzuheben.

Introduction

Traditionell stützt sich die Toxikologie stark auf die Verwendung von Ganztierversuchen, um die für die Stoffsicherheitsbeurteilung erforderlichen Daten zu liefern. Solche Methoden sind typischerweise kostspielig und ressourcenintensiv. Aufgrund der großen Anzahl der derzeit verwendeten Chemikalien und des rasanten Tempos, mit dem neue Chemikalien entwickelt werden, besteht jedoch weltweit ein anerkannter Bedarf an effizienteren Methoden des chemischen Screenings 1,2. Dieser Bedarf und der daraus resultierende Paradigmenwechsel weg von Tierversuchen hat zur Entwicklung vieler neuer Ansatzmethoden geführt, darunter Hochdurchsatz-Screening-Assays, Hochdurchsatz-Transkriptomik, Next-Generation-Sequenzierung und Computermodellierung, die vielversprechende alternative Teststrategien sind 3,4.

Die Bewertung der Stoffsicherheit über die Vielfalt der Arten hinweg, die potenziell von chemischen Expositionen betroffen sind, war eine anhaltende Herausforderung, nicht nur mit traditionellen Toxizitätstests, sondern auch mit neuen Ansatzmethoden. Fortschritte in der vergleichenden und prädiktiven Toxikologie haben Rahmenbedingungen für das Verständnis der relativen Sensitivität verschiedener Arten geschaffen, und technologische Fortschritte bei Computermethoden erhöhen weiterhin die Anwendbarkeit dieser Methoden. In den letzten zehn Jahren wurden mehrere Strategien diskutiert, die bestehende Gen- und Proteinsequenzdatenbanken zusammen mit dem Wissen über spezifische chemisch-molekulare Ziele nutzen, um prädiktive Ansätze für die artenübergreifende Extrapolation zu unterstützen und die Bewertung der chemischen Sicherheit über die typischen Modellorganismen hinaus zu verbessern 5,6,7,8.

Um die Wissenschaft in die Tat umzusetzen, auf diesen grundlegenden Studien in der prädiktiven Toxikologie aufzubauen, chemische Testbemühungen zu priorisieren und die Entscheidungsfindung zu unterstützen, wurde das SeqAPASS-Tool (Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility) der US-Umweltschutzbehörde (Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility) entwickelt. Dieses Tool ist eine öffentliche und frei verfügbare webbasierte Anwendung, die öffentliche Repositorien mit ständig wachsenden Proteinsequenzinformationen verwendet, um die chemische Empfindlichkeit über die Vielfalt der Spezies vorherzusagen9. Basierend auf dem Prinzip, dass die relative intrinsische Suszeptibilität einer Spezies für eine bestimmte Chemikalie durch die Bewertung der Erhaltung der bekannten Proteinziele dieser Chemikalie bestimmt werden kann, vergleicht dieses Tool schnell Proteinaminosäuresequenzen einer Spezies mit bekannter Empfindlichkeit gegenüber allen Spezies mit vorhandenen Proteinsequenzdaten. Diese Bewertung wird durch drei Analyseebenen abgeschlossen, darunter (1) primäre Aminosäuresequenz, (2) funktionelle Domäne und (3) kritische Aminosäurerestvergleiche, die jeweils tiefere Kenntnisse der chemischen Protein-Interaktion erfordern und eine größere taxonomische Auflösung in der Suszeptibilitätsvorhersage bieten. Eine große Stärke von SeqAPASS besteht darin, dass Benutzer ihre Bewertung anpassen und verfeinern können, indem sie zusätzliche Evidenzlinien für die Zielkonservierung hinzufügen, basierend darauf, wie viele Informationen über die interessierende Chemie-Protein- oder Protein-Protein-Interaktion verfügbar sind.

Die erste Version wurde 2016 veröffentlicht, die es Benutzern ermöglichte, primäre Aminosäuresequenzen und funktionelle Domänen auf optimierte Weise zu bewerten, um die chemische Anfälligkeit vorherzusagen, und enthielt minimale Datenvisualisierungsfunktionen (Tabelle 1). Es hat sich gezeigt, dass individuelle Aminosäureunterschiede wichtige Determinanten von artenübergreifenden Unterschieden in chemischen Proteininteraktionen sind, die die chemische Suszeptibilität von Arten beeinflussen können10,11,12. Daher wurden nachfolgende Versionen entwickelt, um die kritischen Aminosäuren zu berücksichtigen, die für die direkte chemische Wechselwirkung wichtig sind13. Als Reaktion auf das Feedback von Interessengruppen und Benutzern wurde dieses Tool jährlich mit zusätzlichen neuen Funktionen veröffentlicht, die sowohl den Bedürfnissen von Forschern als auch Regulierungsbehörden bei der Bewältigung von Herausforderungen bei der artenübergreifenden Extrapolation gerecht werden (Tabelle 1). Die Einführung von SeqAPASS Version 5.0 im Jahr 2020 brachte benutzerzentrierte Funktionen hervor, die Datenvisualisierungs- und Datensyntheseoptionen, externe Links, Übersichtstabellen- und Berichtsoptionen sowie grafische Funktionen umfassen. Insgesamt verbesserten die neuen Attribute und Funktionen dieser Version die Datensynthese, die Interoperabilität zwischen externen Datenbanken und die einfache Dateninterpretation für Vorhersagen der artenübergreifenden Suszeptibilität.

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Protocol

1. Erste Schritte

HINWEIS: Das hier vorgestellte Protokoll konzentriert sich auf das Dienstprogramm und die wichtigsten Funktionen des Tools. Detaillierte Beschreibungen von Methoden, Funktionen und Komponenten finden Sie auf der Website in einem umfassenden Benutzerhandbuch (Tabelle 1).

Tabelle 1: Entwicklung des SeqAPASS-Tools. Eine Liste der Funktionen und Updates, die dem SeqASPASS-Tool seit der ersten Bereitstellung hinzugefügt wurden. Abkürzungen: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility; ECOTOX = ECOTOXicology Wissensdatenbank. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

  1. Wechseln Sie mit Chrome zu https://seqapass.epa.gov/seqapass. Wählen Sie entweder Anmelden, um ein vorhandenes Konto zu verwenden, oder folgen Sie den Anweisungen, um ein SeqAPASS-Konto zu erstellen, mit dem Benutzer ihre abgeschlossenen Jobs ausführen, speichern, darauf zugreifen und anpassen können.
  2. Bevor Sie eine Analyse durchführen, identifizieren Sie zunächst ein Protein von Interesse und eine gezielte oder empfindliche Spezies, indem Sie die vorhandene Literatur oder bereits vorhandene Daten überprüfen (Abbildung 1). Da SeqAPASS Links zu externen Ressourcen enthält, um das Abfrageprotein zu identifizieren, klicken Sie auf die Dropdown-Schaltflächen unter Proteinziel identifizieren , um auf relevante Ressourcen zuzugreifen.

Figure 1
Abbildung 1: SeqAPASS-Problemformulierung: schematische Darstellung der für eine erfolgreiche Analyse notwendigen Vorabinformationen. Abkürzungen: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility; LBD = ligandenbindende Domäne. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: SeqAPASS-Interoperabilität zwischen Datenbanken. Schematische Darstellung externer Tools, Datenbanken und Ressourcen, die in SeqAPASS integriert sind. Abkürzungen: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility; AOP = adverse outcome pathway; NCBI = National Center for Biotechnology Information; ECOTOX = ECOTOXicology Wissensdatenbank. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 2: Links, Ressourcen und Tools, die in das SeqAPASS-Tool integriert sind. Eine Liste der verschiedenen Datenquellen, Links und Ressourcen, die im SeqAPASS-Tool genutzt werden. Abkürzung: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

2. Entwicklung und Ausführung einer SeqAPASS-Abfrage: Ebene 1

HINWEIS: In einer Level-1-Analyse wird die gesamte primäre Aminosäuresequenz eines Abfrageproteins mit den primären Aminosäuresequenzen aller Spezies mit verfügbaren Sequenzinformationen verglichen. Dieses Tool verwendet Algorithmen, um öffentlich verfügbare Daten zu sammeln, zu sammeln und zusammenzustellen, um Aminosäuresequenzen über Arten hinweg schnell auszurichten und zu vergleichen. Das Backend speichert Informationen aus den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) und nutzt strategisch die eigenständigen Versionen des Protein Basic Local Alignment Search Tool (BLASTp)54 und des Constraint-based Multiple Alignment Tool (COBALT)55.

  1. Klicken Sie unter Primäre Aminosäuresequenzen vergleichen entweder auf Nach Art oder Nach Akzession. Verwenden Sie die Auswahl Nach Spezies , um das gewünschte Proteinziel auszuwählen, oder wählen Sie aus einer Liste von Arten aus.
  2. Reichen Sie Proteinakzessionen (d. h. NCBI-Protein-ID) direkt ein, indem Sie die Beitritt(e) in das Textfeld Nach Beitritt eingeben.
  3. Wählen Sie Anforderungsausführung aus, um die Abfrage zu senden. Warten Sie nach dem Absenden, bis in der oberen rechten Ecke des Browserfensters eine Benachrichtigung angezeigt wird, die eine erfolgreiche Übermittlung anzeigt.
  4. Wählen Sie die Registerkarte SeqAPASS Run Status oben auf der Seite, um eine Liste aller SeqAPASS-Läufe anzuzeigen, die unter diesem Benutzerkonto durchgeführt wurden, und überprüfen Sie den Prozentsatz des Abschlusses.
    1. Klicken Sie auf Daten aktualisieren , während das entsprechende Optionsfeld ausgewählt ist, um den Status von Läufen der Ebenen 2 und 3 zu überprüfen.
  5. Wählen Sie oben auf der Seite die Registerkarte SeqASPASS-Berichte anzeigen aus, um auf eine Liste aller unter diesem Konto erstellten Berichte zuzugreifen.
  6. Wählen Sie auf der Registerkarte SeqAPASS-Berichte anzeigen das gewünschte Abfrageprotein aus. Klicken Sie auf Ausgewählten Bericht anfordern , um die Seite Level 1 Query Protein Information zu öffnen und Ergebnisse, Datenanpassungsoptionen, Visualisierungen und Zusammenfassungsberichte anzuzeigen.
  7. Wählen Sie standardmäßig Bericht anzeigen aus, um Daten im Webbrowser anzuzeigen. Alternativ können Sie Bericht speichern auswählen, um Rohdaten als .zip Datei herunterzuladen.
    HINWEIS: Die für eine Level-1-Analyse erforderliche Zeit variiert (durchschnittlich 23 Minuten für Version 5.1), abhängig von der globalen Benutzeranforderung zu diesem Zeitpunkt, der Anzahl der an die Warteschlange übermittelten Aufträge und der Menge an Proteininformationen, die für einen übermittelten Auftrag vorhanden sind. Wenn ein Proteinziel zuvor erreicht wurde, sind die Daten innerhalb von Sekunden nach der Einreichung verfügbar.

3. Entwickeln und Ausführen einer SeqAPASS-Abfrage: Ebene 2

HINWEIS: Da die gesamte Proteinsequenz nicht direkt an einer chemischen Wechselwirkung beteiligt ist, vergleicht eine Level-2-Analyse nur die Aminosäuresequenz der funktionellen Domäne, um Empfindlichkeitsvorhersagen auf niedrigeren taxonomischen Rängen (z. B. Klasse, Ordnung, Familie) zu treffen.

  1. Klicken Sie auf der Seite Level 1 Query Protein Information (Proteininformationen der Ebene 1) auf das Pluszeichen + neben der Kopfzeile der Ebene 2, um das Menü "Level 2-Abfrage" aufzufüllen.
  2. Identifizieren Sie die geeignete(n) Domäne(n) im interessierenden Protein (Abfrageprotein).
    1. Wenn eine Domäne nicht identifiziert wurde, klicken Sie auf den integrierten Link zur NCBI Conserved Domains Database (CDD) (Tabelle 1), die bei der Identifizierung der entsprechenden Domänenauswahl helfen kann.
      HINWEIS: In der Regel werden nur bestimmte Trefferdomänen als Abfragen in Ebene 2 ausgewählt.
  3. Klicken Sie auf das Feld Domäne auswählen , um automatisch eine Liste funktionaler Domänen für das Abfrageprotein aufzufüllen.
  4. Wählen Sie die Domain-Mitgliedschaft(en) aus der Dropdown-Liste aus und initiieren Sie die Level 2-Abfrage, indem Sie auf die Schaltfläche Domain Run anfordern klicken. Warten Sie nach dem Senden, bis eine Benachrichtigung angezeigt wird, die auf eine erfolgreiche Übermittlung hinweist.
  5. Klicken Sie auf Refresh Level 2 and 3 runs, um Level 2-Daten aufzufüllen, die innerhalb von Sekunden nach der Übermittlung verfügbar sind.
  6. Wählen Sie unter Daten der Ebene 2 anzeigen die abgeschlossenen Domänenbeitritte aus der Dropdown-Liste aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Daten der Ebene 2 anzeigen, um die Ergebnisse auf einer neuen Seite zu öffnen.

4. Zugriff und Verständnis der Daten: SeqAPASS Level 1 und Level 2

  1. Scrollen Sie auf der Seite Proteininformationen abfragen nach unten, um einen Bericht über die Ergebnisse anzuzeigen - standardmäßig wird ein Primärbericht mit Analysen der Ebenen 1 und 2 bereitgestellt. Aktivieren Sie das Optionsfeld Vollständiger Bericht, um einen detaillierteren Bericht anzuzeigen, der alle Sequenztreffer und Ausrichtungsmetriken enthält. Klicken Sie in beiden Berichten auf den entsprechenden Beitritt/ID/Namen, um auf die transparenten Proteinausrichtungs- und Taxonomieinformationen in der NCBI-Datenbank zuzugreifen.
  2. Scrollen Sie zur rechten Seite der Ergebnistabelle, um die ECOTOX-Spalte anzuzeigen. Klicken Sie auf Links zur ECOTOXicology Knowledgebase (ECOTOX), um schnell entsprechende Toxizitätsdaten für Arten mit Suszeptibilitätsvorhersagen zu sammeln.
    HINWEIS: ECOTOX ist eine umfassende, öffentlich zugängliche Wissensdatenbank, die einzelne chemische Toxizitätsdaten für aquatische und terrestrische Pflanzen und Wildtiere bereitstellt. SeqAPASS v6.0 enthält ein ECOTOX-Widget, um sich schneller mit relevanten ECOTOX-Daten nach Chemikalien und Spezies von Interesse zu verbinden.
  3. Klicken Sie auf Tabelle herunterladen, um die Tabelle als Tabellenkalkulationsdatei zu speichern. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zusammenfassungsbericht anzeigen, um eine Zusammenfassungsberichtstabelle anzuzeigen und herunterzuladen, die Daten nach taxonomischer Gruppe sortiert enthält.
    HINWEIS: Datenzusammenfassungstabellen sind sowohl für primäre als auch für vollständige Berichte verfügbar und bieten einen Überblick über Vorhersagen für ein bestimmtes Ziel.

5. Bearbeiten von Dateneinstellungen: SeqAPASS Level 1 und Level 2

HINWEIS: Sowohl in Level-1- als auch in Level-2-Analysen wird davon ausgegangen, dass je größer die Proteinähnlichkeit ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine Chemikalie mit dem Protein in ähnlicher Weise wie die Abfragespezies / -protein interagiert, wodurch sie anfällig für mögliche Auswirkungen von Chemikalien mit diesem molekularen Ziel wird. Aufgrund der Ähnlichkeit dieser Daten werden Schritte zum Verständnis von Level-1- und Level-2-Daten in einem einzigen Protokoll zusammengefasst.

  1. In den Untermenüs oben unter Proteininformationen abfragen können Sie auf die Berichtseinstellungen zugreifen und diese bearbeiten und die Standardeinstellungen für alle Berichtsoptionen für die meisten Analysen verwenden. Wenn es eine wissenschaftliche Begründung für die Änderung der Standardeinstellung gibt, führen Sie die folgenden optionalen Schritte aus:
    1. (OPTIONAL) Klicken Sie auf das Pluszeichen + neben Empfindlichkeitsgrenzwert, um die Einstellungen für den Empfindlichkeitsgrenzwert auf einer neuen Registerkarte anzuzeigen und anzupassen. Wählen Sie entweder einen neuen Cutoff-Wert aus einer Dropdown-Liste aus oder geben Sie einen benutzerdefinierten Cutoff-Wert ein.
    2. (OPTIONAL) Ändern Sie die Zahl im Feld E-Wert (die Anzahl der verschiedenen Ausrichtungen, die zufällig auftreten können), wenn etwas anderes als der Standardwert gewünscht wird.
      HINWEIS: Jedes Protein mit einem E-Wert, der größer als die Zahl in der Box ist, wird aus dem primären Bericht entfernt.
    3. (OPTIONAL) Verwenden Sie die Option Nach taxonomischer Gruppe sortieren, um die Ebene der taxonomischen Hierarchie auszuwählen, die in der Spalte Gefilterte taxonomische Gruppe in der Ergebnistabelle angezeigt werden soll.
      HINWEIS: Wenn Sie die taxonomische Hierarchie ändern, ändert sich auch die Vorhersage der Anfälligkeit basierend auf den Arten aus jeder gefilterten Gruppe, die oberhalb des Grenzwerts gefunden werden.
    4. (OPTIONAL) Ändern Sie das Feld Common Domain (wie viele gemeinsame Domänen ein Protein mit dem Abfrageprotein teilen muss, um in die Ergebnisse aufgenommen zu werden), wenn etwas anderes als der Standardwert gewünscht wird.
      HINWEIS: Da die Standardeinstellung 1 ist, wird jede Sequenz, die nicht mindestens eine gemeinsame Domäne mit dem Abfrageprotein teilt, ausgeschlossen.
    5. (OPTIONAL) Wählen Sie Nein unter Spezies lesen aus, um die Suszeptibilitätsvorhersagen von Y nur dann zurückzuerhalten, wenn die prozentuale Ähnlichkeit größer oder gleich dem Cutoff ist oder wenn der Treffer als orthologischer Kandidat identifiziert wird.
      HINWEIS: Diese Einstellung ist standardmäßig auf Ja gesetzt, was bedeutet, dass eine Suszeptibilitätsvorhersage von Y für alle orthologischen Kandidaten, alle Arten, die oberhalb des Grenzwerts für die Anfälligkeit aufgeführt sind, und alle Arten unterhalb des Grenzwerts aus derselben taxonomischen Gruppe mit einer oder mehreren Arten über dem Grenzwert gemeldet wird.
  2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Aktuelle Berichtseinstellungen herunterladen , um eine Datei herunterzuladen, in der die aktuell angewendeten Einstellungen erfasst werden.
    HINWEIS: Die ausgewählte spezifische Bewertungsstufe (1, 2 oder 3) bestimmt die Einstellungen, die im Bericht angezeigt werden.

6. Visualisierung der Daten: SeqAPASS Level 1 und Level 2

  1. Klicken Sie auf das Pluszeichen + neben Visualisierung und klicken Sie auf die Schaltfläche Daten visualisieren , um eine separate Registerkarte mit den benutzerdefinierten Informationen und der Option zur Auswahl eines interaktiven Ergebnisdiagramms zu öffnen.
  2. Klicken Sie auf Boxplot, um den interaktiven Boxplot und die Plotsteuerelemente zu öffnen und die Boxplot-Visualisierung aktiv zu aktualisieren, um Änderungen an der Datentabelle widerzuspiegeln und Grafiken in Publikations- und Präsentationsqualität bereitzustellen.
    HINWEIS: Das Standard-Boxplot zeigt Artengruppen auf der x-Achse und prozentuale Ähnlichkeit auf der y-Achse an. Boxplots zeigen den Suszeptibilitätsgrenzwert (gestrichelte Linie), die prozentuale Ähnlichkeit zwischen den Arten im Vergleich zu den Abfragearten sowie Mittel- und Medianwerte für jede taxonomische Gruppe zusammen mit dem 25. und 75. Perzentil und dem Interquartilbereich an. Abhängig vom Ziel der Analyse und den Bedürfnissen des Benutzers können viele Boxplot-Funktionen durch die folgenden optionalen Schritte geändert werden.
    1. (OPTIONAL) Informationen zum Anpassen der angezeigten taxonomischen Gruppen finden Sie im Feld Taxonomische Gruppen im Abschnitt Steuerelemente . Entfernen Sie Gruppen, indem Sie über die Namen scrollen und x auswählen oder das Dropdown-Menü Taxonomische Gruppen verwenden.
    2. (OPTIONAL) Um eine Legende hinzuzufügen, die eine Art von Interesse oder bestimmte vordefinierte Gruppen (z. B. gefährdete oder bedrohte Arten) identifiziert, bewegen Sie den Mauszeiger über einen taxonomischen Gruppennamen auf der x-Achse, um ein Popup-Fenster zu aktivieren, in dem die drei wichtigsten Arten nach höchster prozentualer Ähnlichkeit sortiert sind. Bewegen Sie den Mauszeiger über die Arten in der Legende, um ein Popup-Fenster mit den entsprechenden Arteninformationen zu generieren. Klicken Sie auf das Kästchen für eine bestimmte taxonomische Gruppe, um eine herunterladbare Übersichtstabelle mit Arten und Vorhersagen zu erstellen.
  3. Klicken Sie auf Boxplot herunterladen , um einen Dateityp auszuwählen, die Auflösung in Breite/Höhe anzupassen und die Visualisierung zu speichern.

7. Entwicklung und Durchführung einer SeqAPASS-Analyse: Ebene 3

HINWEIS: Eine Level-3-Analyse bewertet vom Benutzer identifizierte Aminosäurereste innerhalb des Abfrageproteins und vergleicht schnell die Erhaltung dieser Rückstände über Arten hinweg. Es wird angenommen, dass Spezies, in denen diese Rückstände konserviert sind, eher mit einer Chemikalie in ähnlicher Weise interagieren wie die Template-Spezies/Protein. Da sich Level 3 auf einzelne Aminosäuren konzentriert, kann eine Analyse nur durchgeführt werden, wenn detaillierte Kenntnisse über die Aminosäurereste verfügbar sind, die für die chemische Protein- oder Protein-Protein-Wechselwirkung entscheidend sind.

  1. Klicken Sie auf das Pluszeichen + neben der Kopfzeile Ebene 3 auf der Seite Level 1 Query Protein Information, um das Menü Level 3 Query aufzufüllen.
  2. Klicken Sie auf das Pluszeichen + neben dem Referenz-Explorer, um das Referenz-Explorer-Tool zu öffnen, das eine vordefinierte boolesche Zeichenfolge generiert, um die verfügbare Literatur abzufragen, und Benutzer bei der Identifizierung geeigneter Literatur unterstützt, um die Identifizierung kritischer Aminosäuren zu unterstützen, die in der Bewertung der Stufe 3 verwendet werden sollen (Tabelle 2 und Abbildung 2).
    1. (OPTIONAL) Sobald das Abfrageprotein automatisch ausgefüllt wurde, verwenden Sie die Funktion Proteinnamen hinzufügen , um weitere Proteine hinzuzufügen.
  3. Klicken Sie auf Google Scholar-Link generieren , um ein Popup-Fenster mit einer automatisch generierten Suchzeichenfolge mit relevanten Suchbegriffen zu öffnen.
  4. Klicken Sie auf Google Scholar durchsuchen , um die Literaturdatenbank anhand der Suchzeichenfolge abzufragen.
    1. Alternativ können Sie auf In Zwischenablage kopieren klicken und die Suchzeichenfolge anpassen, indem Sie Begriffe mithilfe der Funktionen im Verweis-Explorer hinzufügen oder entfernen.

8. Identifizierung kritischer Aminosäurereste anhand identifizierter Literatur

  1. Wählen Sie im Menü Abfrage der Ebene 3 die Vorlagensequenz aus, an der die vom Benutzer ausgewählten Arten ausgerichtet werden sollen.
    HINWEIS: Diese Vorlagensequenz wird üblicherweise auf der Grundlage der Literatur ausgewählt, für die die kritischen Aminosäuren identifiziert wurden, und kann die gleiche oder eine andere Art sein als die in Level 1 und Level 2 abgefragten.
    1. (OPTIONAL) Verwenden Sie das Feld Zusätzliche Vergleiche , um alle Zugänge/Sequenzen zu vergleichen, die nicht in den Tabellen Primärer/Vollständiger Bericht angezeigt werden.
  2. Geben Sie einen benutzerdefinierten Namen für den Level 3-Lauf in das Textfeld Level 3-Ausführungsnamen eingeben ein, um den abgeschlossenen Level 3-Lauf zu identifizieren. Wählen Sie für jede Bewertung einen eindeutigen Namen.
  3. Wählen Sie im Feld Taxonomische Gruppe(n) auswählen die gewünschte taxonomische Gruppe aus. Wählen Sie eine taxonomische Gruppe aus, um die Tabelle automatisch nach dieser taxonomischen Gruppe zu filtern.
  4. Klicken Sie in der Ergebnistabelle manuell auf das Kontrollkästchen neben allen Arten , die an der Vorlagensequenz ausgerichtet werden sollen.
    HINWEIS: Um eine angemessene Ausrichtung zu gewährleisten, sollte jeweils eine taxonomische Gruppe mit der Vorlage verglichen werden. Wählen Sie nur ähnlich annotierte Proteine für die interessierende Spezies aus. Bei der Auswahl von Sequenzen zum Vergleich ist es wichtig, auf bestimmte Sequenzen zu achten (z. B. hypothetisch, NIEDRIGE QUALITÄT oder Teilsequenzen). Sofern es keine transparente Begründung für die Aufnahme gibt, ist es am besten, diese Sequenzen auszuschließen, da sie Vorhersagen aufgrund unvollständiger oder unangemessener Sequenzinformationen verzerren können.
  5. Wiederholen Sie die Schritte, um alle taxonomischen Interessengruppen auszurichten.
  6. Klicken Sie auf Level-2- und -3-Läufe aktualisieren, sobald alle Arten ausgerichtet wurden, um das Menü Run Name der Ebene 3 auswählen mit den abgeschlossenen Level-3-Aufträgen zu füllen und die Daten sofort von einer Level-3-Ausrichtung abzurufen.
  7. Klicken Sie auf Daten der Ebene 3 kombinieren, um Ausrichtungen aus mehreren taxonomischen Gruppen zu kombinieren.
    1. Um einen einzelnen Bericht anzuzeigen, wählen Sie alternativ den benutzerdefinierten Namen unter Zu anzeigende Abfrage auswählen aus, und klicken Sie auf Daten der Ebene 3 anzeigen.
  8. Wählen Sie im Menü "Level 3-Berichte kombinieren" die Vorlage Level 3 aus, die als Grundlage für den Vergleich der Aminosäurerückstände verwendet werden soll, und klicken Sie auf Next (Weiter).
  9. Wählen Sie unter Aufträge der Ebene 3 abgeschlossene Aufträge zum Vergleich aus und klicken Sie auf Weiter. Verwenden Sie die Funktion Aufträge der Bestellebene 3 , um die taxonomischen Gruppen bei Bedarf neu anzuordnen. Klicken Sie auf Level-3-Daten anzeigen , um eine Level-3-Berichtsseite mit den kombinierten taxonomischen Gruppen zu erstellen.
  10. Wählen Sie zuvor identifizierte Aminosäurepositionen für die Vorlagenspezies aus, indem Sie die Aminosäureposition(en), getrennt durch Kommas, in das Feld Enter Amino Acid Residue Positions (Positionen für Aminosäurereste eingeben ) eingeben und dann In Rückstandsliste kopieren auswählen. Selektieren Sie Rückstände in der Schablonensequenz direkt aus der Shuttlebox.
  11. Klicken Sie auf Bericht aktualisieren, um die Seite zu aktualisieren und die Vorhersagen zur Anfälligkeit der Stufe 3 anzuzeigen.
    HINWEIS: Level 3 verwendet ein einfaches Regelwerk, das aus grundlegenden Deskriptoren der funktionellen Eigenschaften der Seitenkette (z. B. aliphatisch, aromatisch) und der molekularen Dimensionen (Molekulargewichtsunterschiede >30 g / mol) abgeleitet wird, um zu bestimmen, ob Unterschiede an Schlüsselpositionen wahrscheinlich Proteininteraktionen beeinflussen13.

9. Visualisierung von Level 3 SeqAPASS-Daten

HINWEIS: Wie in den vorherigen Stufen sind die Berichte "Primär" und "Vollständig" verfügbar. Zusätzlich zu den Daten, die mit den Daten in Level 1 und 2 identisch sind, zeigt der primäre Bericht Aminosäurepositionen, Abkürzungen und eine Ja/Nein-ähnliche Anfälligkeit (Y/N) wie die Vorlagenvorhersage an. In ähnlicher Weise enthält der vollständige Bericht Informationen über die Klassifizierung der Aminosäureseitenkette und das Molekulargewicht.

  1. Führen Sie auf der Berichtsseite der Ebene 3 einen Bildlauf nach unten durch, um einen Bericht mit den Ergebnissen anzuzeigen. Klicken Sie unten im Bericht auf Tabelle herunterladen, um die Tabelle zu speichern.
  2. Klicken Sie auf Zusammenfassungsbericht der Ebene 3 anzeigen , um eine Zusammenfassungsberichtstabelle mit Daten nach taxonomischer Gruppe sortiert anzuzeigen und herunterzuladen. Klicken Sie auf das Pluszeichen + neben Visualisierung auf der Seite Level 3 Report, um eine separate Browserregisterkarte mit den benutzerdefinierten Informationen und der Option zum Anzeigen der Ergebnisse in Form einer interaktiven Heatmap zu öffnen.
  3. Klicken Sie auf der Seite Visualisierungsinformationen auf Heatmap, um die interaktive Grafik und die Steuerelemente zu öffnen und die Heatmap-Visualisierung aktiv zu aktualisieren, um Änderungen an der Datentabelle widerzuspiegeln. Führen Sie die folgenden optionalen Schritte aus, um die Heatmap anzupassen.
    1. (OPTIONAL) Wählen Sie Berichtsoptionen , um zwischen einem einfachen Bericht, der die Aminosäureposition, die Abkürzung aus einem Buchstaben und die Aminosäureähnlichkeit anzeigt, oder einem vollständigen Bericht, der detaillierte Informationen zu jeder ausgewählten Aminosäure anzeigt, zu wechseln.
    2. (OPTIONAL) Wählen Sie Berichtsoptionen , um die Anzeige von Arten zu ändern, entweder nach Allgemeiner Name oder Wissenschaftlicher Name.
      HINWEIS: Innerhalb des einfachen Berichts werden Aminosäuren als Gesamtübereinstimmung (dunkelblau), Teilübereinstimmung (hellblau, Substitutionen, die nur ein Kriterium erfüllen) oder Keine Übereinstimmung (gelb, Substitutionen, die keine der Kriterien erfüllen) zur Vorlagenaminosäure kategorisiert. Im vollständigen Bericht werden Vergleiche entweder als Gesamtübereinstimmung (dunkelblau) oder "Keine Übereinstimmung" (gelb) angezeigt.
    3. (OPTIONAL) Wählen Sie Optionale Auswahl , um nützliche Informationen wie Ortholog-Kandidaten, Bedrohte Arten, gefährdete Arten oder häufige Modellorganismen hervorzuheben.
    4. (OPTIONAL) Wählen Sie Heatmap-Einstellungen , um zusätzliche Anpassungsoptionen auszuwählen, einschließlich Hinzufügen oder Entfernen von Spalten, Legenden und Text.
  4. Klicken Sie auf Boxplot herunterladen , um einen Dateityp auszuwählen und die Visualisierung zu speichern.

10. Interpretation der SeqAPASS-Ergebnisse: Evidenzlinien für Proteinkonservierung

HINWEIS: Zur leichteren Interpretation enthält dieses Tool einen zusammenfassenden Entscheidungsbericht (DS-Bericht), der für die Integration von Daten über Ebenen hinweg entwickelt wurde. Der DS-Bericht enthält die Ergebnisse (d.h. Datentabellen und/oder Visualisierungen), die der Benutzer ausgewählt hat, und ermöglicht die schnelle Auswertung von Suszeptibilitätsvorhersagen über mehrere Ebenen für mehrere Arten gleichzeitig.

  1. Klicken Sie auf den Ergebnis- oder Datenvisualisierungsseiten auf Stufe # an DS-Bericht senden, und warten Sie, bis die Daten "gepusht" und die Registerkarte DS-Bericht aktiv wird.
    HINWEIS: Wenn Ergebnisse oder Änderungen nicht per Push Level # to DS Report übertragen wurden, bleibt Push Level # to DS Report aktiv, bis es ausgewählt ist. Wenn eine Einstellung geändert wurde, wird der Text Zum Pushen neuer Änderungen klicken angezeigt, bis die Änderungen per Push in den Bericht übertragen werden. Visualisierungen können jederzeit während der Auswertung in den DS Report übertragen werden.
  2. Wählen Sie jederzeit die Registerkarte DS-Bericht aus, um auf die DS-Seite zuzugreifen.
    HINWEIS: Für alle Arten, die in Stufe 1 ausgerichtet sind, enthält die Tabelle des zusammenfassenden Abschlussberichts die wichtigen Daten und Vorhersagen zur Anfälligkeit für jede Analyse. Wenn eine Art in der DS-Tabelle nicht im Level-3-Bericht enthalten war, aber in Level 1- und/oder Level 2-Jobs gefunden wurde, erhält die Zelle in der Tabelle eine nicht zutreffende (NA)-Bezeichnung für die Level-3-Suszeptibilitätsvorhersage.

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Representative Results

Um die Anwendung des SeqAPASS-Tools zu demonstrieren und neue Funktionen hervorzuheben, werden zwei Fallstudien beschrieben, die Fälle darstellen, in denen die Proteinkonservierung vorhersagt, dass es Unterschiede in der chemischen Anfälligkeit zwischen den Arten gibt (humanes Transthyretin) und dass es keine Unterschiede gibt (μ Opioidrezeptor [MOR]). Das erste dieser Beispiele befasst sich mit Proteinsequenz-/Strukturvergleichen zur Vorhersage des Anwendungsbereichs für unerwünschte Ergebnispfade (AOPs, siehe Tabelle 2 zur Definition), während sich das zweite auf die Entwicklung von Forschungshypothesen konzentriert, die für die Empfindlichkeit zwischen den Arten gegenüber Opioiden im Abwasser relevant sind. Die grundlegenden Ansätze, die in diesen Fallstudien beschrieben werden, können auf jede Chemikalie angewendet werden und zeigen den breiten Nutzen dieses Werkzeugs für die Entscheidungsfindung und Forschung.

Schilddrüsenhormone sind essentiell für normales Wachstum und Entwicklung. Sie werden in der Schilddrüse synthetisiert und in den Blutkreislauf sezerniert, wo sie an Verteilungsproteine binden und im ganzen Körper zirkulieren 14,15,16,17,18. Neuere Studien haben gezeigt, dass Umweltkontaminanten wie polychlorierte Biphenyle (PCB), polybromierte Diphenylether (PBDEs) und Per- und Polyfluoralkylsubstanzen (PFAS) kompetitiv an das Verteilungsprotein Transthyretin (TTR) binden und normale Schilddrüsenprozesse stören können 19,20,21,22,23,24,25 . Es wurde ein AOP entwickelt, das die kompetitive Bindung an TTR beschreibt, die zu humaner neurologischer Entwicklungstoxizität führt (https://aopwiki.org/aops/152). Während es Hinweise darauf gibt, dass diese AOP auch auf Nagetiere anwendbar ist, muss die Anwendbarkeit auf andere taxonomische Gruppen noch definiert werden. Da TTR-bindende Chemikalien in der Umwelt vorhanden sind, ist es wichtig, die taxonomische Relevanz dieses AOP zu verstehen, eine Herausforderung, die teilweise durch SeqAPASS-Analyse angegangen werden kann. Unter Verwendung der Problemformulierungsstrategie des Tools kann das Ziel der Analyse wie folgt formuliert werden: Mit dem Wissen, dass TTR-bindende Verbindungen zu nachteiligen Ergebnissen beim Menschen führen, welche taxonomischen Gruppen würden voraussichtlich eine ähnliche Anfälligkeit aufweisen?

Das menschliche Transthyretin-Protein ist gut charakterisiert, und es gibt mehrere gut untersuchte Liganden, von denen bekannt ist, dass sie an der menschlichen TTR (hTTR)-Bindungsstelle binden, was es zu einem optimalen Ziel für die SeqAPASS-Analyse 8,9,13 macht. Unter Verwendung des NCBI-Beitritts für humanes Transthyretin, P02766.1, wurde eine Level-1-Analyse mit Standardeinstellungen durchgeführt. Die Ergebnisse der Level-1-Analyse setzen den prozentualen Ähnlichkeitsgrenzwert auf 49%, wobei Säugetiere (Mammalia), Vögel (Aves), Reptilien (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), Amphibien (Amphibia) und die meisten Fischarten (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) über diesen Grenzwert fallen (Abbildung 3). Daher führten alle Arten aus diesen taxonomischen Gruppen zu einer Suszeptibilitätsvorhersage von "Y" (d.h. ja) und sind wahrscheinlich anfällig für Chemikalien, von denen bekannt ist, dass sie mit hTTR interagieren (Abbildung 3 und Zusatzdatei 1).

Für die Level-2-Bewertung von funktionellen Domänen wurde die NCBI Conserved Domain Database verwendet, um TR_THY (Beitritt smart00095) als konservierte Domäne zu identifizieren, die die reife Kette des TTR-Untereinheitsproteins von den Resten 27 bis 147 umfasst. Da die in NCBI berichtete Proteinsequenz von TTR ein 20-Aminosäuren-Vorsegment enthält, das für die aktuelle Analyse nicht relevant ist, bietet die Fokussierung des Vergleichs auf die reife Kette eine zusätzliche, spezifischere Beweislinie für die Erhaltung dieses Proteins über Spezies hinweg. Aus der Bewertung der Stufe 2 wurde ein prozentualer Ähnlichkeitsgrenzwert von 58% berichtet, wobei Säugetiere, Vögel, Reptilien, Amphibien und die meisten Fischarten erneut über diesen Grenzwert fielen (Abbildung 4). Folglich schloss SeqAPASS eine Suszeptibilitätsvorhersage von "Y" (d.h. ja) für Spezies aus diesen taxonomischen Gruppen, was darauf hindeutet, dass sie wahrscheinlich anfällig für Chemikalien sind, die mit dem hTTR-Protein interagieren (Abbildung 4 und ergänzende Datei 1). Insgesamt deuten die Ergebnisse von Level-1- und Level-2-Analysen darauf hin, dass die meisten Wirbeltierarten die hTTR gemeinsam erhalten und wahrscheinlich anfällig für Chemikalien sind, von denen bekannt ist, dass sie mit diesem Protein interagieren.

Figure 3
Abbildung 3: SeqAPASS Level 1 Analyse der Transthyretinkonservierung über taxonomische Gruppen hinweg mit verfügbaren Sequenzinformationen relativ zum menschlichen Protein. Die prozentuale Ähnlichkeit der Proteinaminosäuresequenz wird auf der Y-Achse angezeigt; Die taxonomische Gruppe wird auf der X-Achse angezeigt. Offene Kreise (○) geben die Abfragesequenz an, und geschlossene Kreise (●) geben die Arten innerhalb der taxonomischen Gruppe mit der höchsten prozentualen Ähnlichkeit an. Innerhalb des Diagramms repräsentieren die Ober- und Unterseite jedes Feldes das 75. und 25. Perzentil, die Schnurrhaare erstrecken sich auf das 1,5-fache des Interquartilsbereichs und die Mittel- und Medianwerte werden durch horizontale schwarze Linien auf der Box dargestellt. Die gestrichelte Linie zeigt den Grenzwert für Suszeptibilitätsvorhersagen an. Abkürzungen: TTR = Transthyretin; SeqAPASS = Sequenzausrichtung zur Vorhersage der Anfälligkeit für verschiedene Arten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: SeqAPASS Level 2 Analyse der Transthyretinrezeptor-Ligandenbindungsdomänenkonservierung über taxonomische Gruppen mit verfügbaren Sequenzinformationen relativ zum menschlichen Protein LBD. Die prozentuale Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz der Ligandenbindungsdomäne wird auf der Y-Achse angezeigt; Die taxonomische Gruppe wird auf der X-Achse angezeigt. Offene Kreise (○) geben die Abfragesequenz an, und geschlossene Kreise (●) geben die Arten innerhalb der taxonomischen Gruppe mit der höchsten prozentualen Ähnlichkeit an. Innerhalb des Diagramms repräsentieren die Ober- und Unterseite jedes Feldes das 75. und 25. Perzentil, die Schnurrhaare erstrecken sich auf das 1,5-fache des Interquartilsbereichs und die Mittel- und Medianwerte werden durch horizontale schwarze Linien auf der Box dargestellt. Die gestrichelte Linie zeigt den Grenzwert für Suszeptibilitätsvorhersagen an. Abkürzungen: TTR = Transthyretin; SeqAPASS = Sequenzausrichtung zur Vorhersage der Anfälligkeit für verschiedene Arten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Durch die Analyse molekularer Modellierung und Proteinkristallographie-Studien wurden Aminosäuren in der Bindungsregion von TTR identifiziert, die voraussichtlich mit dem endogenen Liganden 3,3′,5,5′-Tetraiod-L-thyronin (T4, PDB 2ROX) sowie drei Umweltchemikalien interagieren: Perfluoroctansulfonat (PFOS, PDB 5JIM), Tetrabrombisphenol A (TBBPA, PDB 5HJG) und Diethylstilbestrol (DES, PDB 1TZ8)19, 21,22,26. Die Aminosäurereste Lys35, Ser137, Leu130, Ala128, Ala129 und Thr139 spielten alle eine Schlüsselrolle bei Protein-Liganden-Interaktionen, entweder durch direkte Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen oder Van-der-Waals-Wechselwirkungen. Diese sechs Aminosäurereste wurden in einer Level-3-Analyse über Spezies hinweg unter Verwendung von hTTR als Vorlagensequenz und unter Ausschluss von nicht-homologen, hypothetischen, partiellen und minderwertigen Sequenzen bewertet (Supplemental File 1). Da zuvor festgestellt wurde, dass TTR nur bei Wirbeltierarten konserviert ist, wurden wirbellose Arten von dieser Analyse ausgeschlossen (Abbildung 3 und Abbildung 4). Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass die in der Literatur berichteten Aminosäurepositionen ein 20-Aminosäuren-Vorsegment ausschließen, das im reifen hTTR-Protein fehlt, und aus diesem Grund wurden die in Level 3 eingereichten Positionen von den in der Literatur berichteten angepasst, um eine genaue Ausrichtung auf das ausgewählte Vorlagenprotein15 zu gewährleisten (Zusatzdatei 1).

In der Level-3-Analyse der TTR wurden 294 Wirbeltierarten für die Ausrichtung ausgewählt (Säugetiere, Vögel, Amphibien, Reptilien und Fische). Von den ausgewerteten Arten zeigten 18 Unterschiede in Schlüsselaminosäuren, was zu einer Suszeptibilitätsvorhersage von "N" (d.h. nein) führte. Interessanterweise wiesen fünf Arten von Meeressäugern eine Aminosäuresubstitution an Position 2 (128A) auf, während vier Fischarten entweder an Position 2 (128A) oder Position 6 (139T) Substitutionen zeigten (Abbildung 5). Da diese Aminosäuren eine wichtige Rolle bei Protein-Liganden-Interaktionen im Bindungskanal von TTR spielen, deuten diese Daten darauf hin, dass TTR-Liganden in diesen Spezies unterschiedlich interagieren können und zu einer unterschiedlichen chemischen Anfälligkeit im Vergleich zum Menschen führen würden.

Figure 5
Abbildung 5: SeqAPASS Level 3 Analyse der Konservierung von Aminosäureresten, die für die TTR-chemische Bindung wichtig sind . (A) Level-3-Übersichtstabelle, die die Anzahl der Arten mit verfügbaren Sequenzdaten über alle taxonomischen Gruppen, die Anzahl der Arten, die voraussichtlich ähnlich anfällig sind (Y), und die Anzahl der Arten, die voraussichtlich nicht ähnlich anfällig sind (N), anzeigt. (B) Heatmap der Stufe 3 mit ausgewählten Arten, von denen vorhergesagt wird, dass sie im Vergleich zum menschlichen Transthyretin-TTR-Protein nicht ähnlich anfällig sind, und die vollständige, partielle und nicht übereinstimmende Aminosäuren aufweisen. Abkürzungen: TTR = Transthyretin; SeqAPASS = Sequenzausrichtung zur Vorhersage der Anfälligkeit für verschiedene Arten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Als Reaktion auf das Feedback von Interessengruppen und Benutzern wurden neue Funktionen entwickelt und in das SeqASPASS-Tool integriert, einschließlich der Möglichkeit, sich mit empirischen Daten für verschiedene Anwendungen zu verbinden. Die Interoperabilität dieses Tools mit der ECOTOX-Wissensdatenbank (Tabelle 1) wurde sowohl durch die Einbettung externer Links in die Level-1- und Level-2-Datentabellen für in ECOTOX vorhandene Akzessionen als auch durch die Erstellung eines ECOTOX-Widgets innerhalb des Tools erreicht, um direkt zu den relevantesten Toxizitätsdaten in ECOTOX zu filtern. Über die Links und das Widget können Benutzer ECOTOX schnell abfragen und entsprechende Toxizitätsdaten für Arten mit SeqAPASS-Suszeptibilitätsvorhersagen sammeln. Derzeit sind SeqAPASS-Vorhersagen durch einen chemischen Stressor und eine Spezies mit ECOTOX verbunden. Toxizitätsdaten sind jedoch noch nicht mit spezifischen Genen/Proteinen verknüpft, was direkte Verbindungen zu den spezifischen Endpunkten/molekularen Zielen von Interesse an SeqAPASS ermöglichen würde. Während die Verknüpfung von Vorhersagen mit Toxizitätsdaten, die auf einem chemischen Stressor basieren, nicht ideal ist, da die Daten möglicherweise nicht spezifisch für einen bestimmten Signalweg sind, ist die Herstellung einer Verbindung zur Zusammenführung der Ergebnisse der erste Schritt. Als erste Iteration einer SeqAPASS-ECOTOX-Integration liefert der aktuelle Ansatz den Anwendern alle verfügbaren Toxizitätsdaten für den/die chemischen Stressor(en) und Spezies auf breiter Ebene. Diese Daten können, wenn sie mit SeqAPASS-Vorhersagen kombiniert werden, Kontext auf breiter Ebene (Wirbeltiere vs. Wirbellose) liefern und im Kontext des AOP-Frameworks betrachtet werden.

TTR stellt ein gutes Fallbeispiel für die Untersuchung dieses Zusammenhangs dar, da der bestehende AOP (AOP 152) einen Kontext für die Interpretation potenziell relevanter ECOTOX-Toxizitätsdaten liefert. Beginnend mit den in SeqAPASS Level 3 untersuchten Liganden wurden Daten zur Umwelttoxizität für vier Chemikalien gesammelt, von denen bekannt ist, dass sie mit der TTR-Ligandenbindungsdomäne interagieren (Diethylstilbestrol [DES], Perfluorhexansäure [PFHxA], Perfluoroctansulfonat [PFOS] und Tetrabrombisphenol A [TBBPA])19,21,23,24 . Für jede Chemikalie wurde ECOTOX nach aquatischen und terrestrischen Daten nach CAS-Nummer (Chemical Abstracts Service) mit benutzerdefinierten Suchparametern abgefragt (Zusatzdatei 1). Die Daten wurden nach Artengruppen von Interesse gefiltert (Amphibien, Vögel, Fische, Wirbellose, Säugetiere, Reptilien). Innerhalb der gefilterten Abfrageergebnisse wurde ein Durchschnitt der minimalen und maximalen Effektkonzentrationen der Studie berechnet und als Näherung für den Mittelwert für alle Treffer implementiert, die keinen mittleren Wirkungskonzentrationswert meldeten (Abbildung 6A und Zusatzdatei 1). Im Rahmen einer einzelnen Chemikalie wurden Kruskal-Wallis-Tests durchgeführt, um die mittleren Effektkonzentrationen verschiedener taxonomischer Gruppen zu vergleichen, da die Daten nicht den ANOVA-Testannahmen entsprachen. Post-hoc-paarweise Vergleichstests wurden dann mit dem Dunn's-Test für alle Chemikalien durchgeführt, da die taxonomischen Gruppen aus ungleichen Stichprobengrößen bestanden. Aquatische und terrestrische Ergebnisse wurden getrennt analysiert, da die Daten zwischen den beiden Expositionsarten nicht direkt vergleichbar sind. Innerhalb von ECOTOX waren aquatische Toxizitätsdaten für die ausgewählten Chemikalien für Amphibien, Vögel, Wirbellose und Fischarten verfügbar (Abbildung 6A). Daten zur terrestrischen Toxizität für die ausgewählten Chemikalien lagen nur für Säugetiere und DES vor (Zusatzdossier 1).

Figure 6
Abbildung 6: Verknüpfung von SeqAPASS-Ergebnissen mit empirischen Daten. (A) Mittlere Effektkonzentrationen über taxonomische Gruppen hinweg mit Daten, die in der ECOTOXicology-Wissensdatenbank für ausgewählte Chemikalien verfügbar sind, von denen bekannt ist, dass sie an das menschliche TTR-Protein binden. (B) Überschneidung der Anzahl der in jeder SeqASPASS-Analyse enthaltenen Arten mit den Arten, für die ECOTOX-Daten verfügbar waren. In Bereich A geben Klammern entlang der x-Achse die Anzahl der Abfragetreffer an, für die Daten aggregiert wurden. Sternchen zeigen Paare signifikant unterschiedlicher Wirkungskonzentrationen zwischen Speziesgruppen im Kontext einer einzigen Chemikalie an (Dunn-Test, S. < 0,05), wobei eine höhere Anzahl von Sternchen auf ein stärkeres Signifikanzniveau hinweist (*: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001; ****: p < 0,0001). Die Mittellinien innerhalb jedes Felds stellen den Median dar, wobei die Kastenkanten den Interquartilsbereich darstellen. Die Schnurrhaare erstrecken sich bis zum 1,5-fachen des Interquartilbereichs. Ausreißer, die außerhalb dieses Bereichs liegen, werden als einzelne Punkte angezeigt. Abkürzungen: TTR = Transthyretin; SeqAPASS = Sequenzausrichtung zur Vorhersage über die Anfälligkeit der Arten hinweg; ECOTOX = ECOTOXicology Wissensdatenbank. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die Bioaktivität für die bewerteten Chemikalien bei Wirbeltierarten auftritt, aber nicht bei Wirbellosen. Während der Mangel an biologischen Ziel- und Signalweginformationen in ECOTOX es unmöglich macht, diese empirischen Daten direkt mit TTR zu verknüpfen, unterstützen diese Ergebnisse die SeqAPASS-Vorhersagen, dass wirbellose Arten keine gemeinsame Anfälligkeit haben. Alle Wirbeltierarten, für die Daten verfügbar waren, zeigten eine Anfälligkeit sowohl für PFOS als auch für TBBPA, obwohl die mittleren Effektkonzentrationen bei Fischen und Vögeln signifikant höher waren als bei Amphibien. Diese Daten deuten auf potenzielle Unterschiede in der Sensitivität zwischen taxonomischen Gruppen hin, die auf Unterschiede in biologischen Signalwegen (einschließlich TTR) zurückzuführen sein können. Es ist bemerkenswert, dass auch andere Variablen wie Stoffwechsel und Ausscheidung eine Rolle bei Unterschieden in der Empfindlichkeit spielen können. Für PFHxA und PFOS wurde festgestellt, dass Fische signifikant empfindlicher sind als Wirbellose und Vögel, und für DES wiesen Amphibien signifikant höhere mittlere Effektkonzentrationen auf als wirbellose Tiere. Auch diese Daten unterstützen unsere SeqAPASS-Vorhersage, dass wirbellose Tiere keine Anfälligkeit mit Wirbeltierarten teilen. Von allen mit diesem Tool bewerteten Arten, für die TTR-Sequenzdaten verfügbar waren, verfügte nur eine kleine Anzahl über entsprechende ECOTOX-Daten für die vier interessierenden Chemikalien (Abbildung 6B, Zusatztabelle S1 und Zusatztabelle S2). Für diejenigen Arten, denen apikale Daten fehlen, fügen SeqAPASS-Vorhersagen der Suszeptibilität zusätzliche Beweislinien hinzu, dass sich verwandte Arten ähnlich verhalten können wie solche mit apikalen Daten. Daten für alle SeqAPASS- und ECOTOX-Analysen sind in der Zusatzdatei 1 verfügbar.

Nach Angaben der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) trugen Opioide im Jahr 2017 zu etwa 47.600 Todesfällen durch Überdosierung in den Vereinigten Staaten bei, eine Zahl, die weiter steigt27. Abwasseranlagen in den USA werden national durch das National Pollutant Discharge Elimination System der US Environmental Protection Agency reguliert, das keine Tests auf Opioide oder andere Arzneimittel in ihrer Einleitung erfordert28. In den letzten Jahren wurde versucht, die abwasserbasierte Epidemiologie als Instrument zur Kartierung des Opioidkonsums in der Gemeinschaft zu verwenden. Opioid-Überwachungsbemühungen haben Konzentrationen von bis zu 1,27 μg / L im Abwasser und 0,7 μg / L in Oberflächengewässern29,30 festgestellt. Jüngste Toxizitätsstudien zur Beurteilung der Wirkung der Opioidexposition auf Fische haben über die Entwicklung von Suchtverhalten und nachteiligen immunologischen Wirkungen (z. B. höhere Infektionsraten, Herabregulierung von Immungenen) berichtet31,32,33. Insgesamt deuten diese Studien darauf hin, dass ein Potenzial für nachteilige Opioidexpositionen in der Umwelt besteht, und unterstreichen, wie wichtig es ist, das Risiko zu verstehen, das diese Chemikalien für aquatische Arten darstellen. Angesichts der Vielfalt der Arten, die diesen Verbindungen in der Umwelt begegnen können, kann die Identifizierung potenziell anfälliger Arten mit SeqAPASS für die Priorisierung von Test- oder Überwachungsbemühungen wichtig sein.

Das MOR stellt das Hauptziel für Opioide bei der Schmerzbehandlung dar und ist verantwortlich für die starken analgetischen und süchtig machenden Eigenschaften von Opiatalkaloiden beim Menschen34,35. Aufgrund der Bedeutung dieses Rezeptors für die menschliche Gesundheit sind MOR-Liganden bekannt, und es stehen qualitativ hochwertige Röntgenkristallographie-Studien zur Verfügung, was dieses Ziel ideal für die SeqAPASS-Analyse 8,9,13 macht. Unter Verwendung des NCBI-Zugangs für den menschlichen μ Opioidrezeptor, ACM90349.1, wurde eine Level-1-Analyse mit Standardeinstellungen durchgeführt. Der Empfindlichkeitsgrenzwert wurde für Stufe 1 auf 55% festgelegt, wobei die prozentualen Ähnlichkeiten für Säugetiere (Mammalia), Vögel (Aves), Reptilien (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), Amphibien (Amphibia) und die meisten Fischarten (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) über diesen Grenzwert fallen; Daher führten Spezies aus diesen taxonomischen Gruppen zu einer Suszeptibilitätsvorhersage von "Y" (d.h. ja), was darauf hindeutet, dass sie wahrscheinlich anfällig für Chemikalien sind, von denen bekannt ist, dass sie mit menschlichem MOR interagieren (Abbildung 7 und Zusatzdatei 1). Unter Verwendung der NCBI Conserved Domain Database wurde 7tmA_Mu_opioid_R identifiziert (Beitritt cd15090) als funktionelle Domäne, die alle sieben Helices des MOR-Proteins von 133 bis 411 umfasst, einschließlich einer mutmaßlichen Ligandenbindungsstelle. Im Vergleich zu Level 1 identifizierten die Level 2-Ergebnisse einen höheren Suszeptibilitätsgrenzwert von 88% Ähnlichkeit, wobei Säugetiere, Vögel, Reptilien, Amphibien und die meisten Fischarten über diesem Cutoff gefunden wurden und zu einer Suszeptibilitätsvorhersage von "Y" für ja führten (Abbildung 8). Insgesamt deuten die Ergebnisse von Level-1- und Level-2-Analysen darauf hin, dass die meisten Wirbeltierarten die Erhaltung des MOR teilen und wahrscheinlich anfällig für Chemikalien sind, von denen bekannt ist, dass sie mit menschlichem MOR interagieren.

Figure 7
Abbildung 7: SeqAPASS Level 1 Analyse der μ Opioidrezeptorkonservierung über taxonomische Gruppen hinweg mit verfügbaren Sequenzinformationen relativ zum menschlichen Protein. Die prozentuale Ähnlichkeit der Proteinaminosäuresequenz wird auf der Y-Achse angezeigt; Die taxonomische Gruppe wird auf der X-Achse angezeigt. Offene Kreise (○) geben die Abfragesequenz an, und geschlossene Kreise (●) geben die Arten innerhalb der taxonomischen Gruppe mit der höchsten prozentualen Ähnlichkeit an. Innerhalb des Diagramms repräsentieren die Ober- und Unterseite jedes Feldes das 75. und 25. Perzentil, die Schnurrhaare erstrecken sich auf das 1,5-fache des Interquartilsbereichs, und die Mittel- und Medianwerte werden durch horizontale schwarze Linien auf dem Feld dargestellt. Die gestrichelte Linie zeigt den Grenzwert für Suszeptibilitätsvorhersagen an. Abkürzungen: MOR = mu-Opioidrezeptor; SeqAPASS = Sequenzausrichtung zur Vorhersage der Anfälligkeit für verschiedene Arten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: SeqAPASS Level 2 Analyse der μ Opioidrezeptor-Ligandenbindungsdomänenkonservierung relativ zur Domäne im menschlichen Protein. Die prozentuale Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz der Ligandenbindungsdomäne wird auf der Y-Achse angezeigt; Die taxonomische Gruppe wird auf der X-Achse angezeigt. Offene Kreise (○) geben die Abfragesequenz an, und geschlossene Kreise (●) geben die Arten innerhalb der taxonomischen Gruppe mit der höchsten prozentualen Ähnlichkeit an. Innerhalb des Diagramms repräsentieren die Ober- und Unterseite jedes Feldes das 75. und 25. Perzentil, die Schnurrhaare erstrecken sich auf das 1,5-fache des Interquartilsbereichs, und die Mittel- und Medianwerte werden durch horizontale schwarze Linien auf dem Feld dargestellt. Die gestrichelte Linie zeigt den Grenzwert für Suszeptibilitätsvorhersagen an. Abkürzungen: MOR = mu-Opioidrezeptor; SeqAPASS = Sequenzausrichtung zur Vorhersage der Anfälligkeit für verschiedene Arten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Durch die Analyse molekularer Modellierung und Proteinkristallographie-Studien wurden Aminosäuren in der Bindungsregion von MOR identifiziert, von denen vorhergesagt wird, dass sie mit bekannten Liganden interagieren. Obwohl die vielfältigen Liganden, die gut an Opioidrezeptoren binden, zu einer komplexen Pharmakologie führen, werden einige konsistente Ligand-Protein-Interaktionen beobachtet36,37. Basierend auf molekularem Andocken an verschiedene MOR-Kristallstrukturen interagieren sowohl Morphin als auch Fentanyl hochaffine MOR-Agonisten mit D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322 und Y32636,38. Die Reste D147, Y148, M151 und H297 sind auch an Kristallstrukturen von MOR beteiligt, die an den Morphinagonisten BU72 gebunden sind, während D147, M151, H297 und Y326 ebenfalls entscheidend für die Bindung an den irreversiblen Morphinantagonisten β-funaltrexamine37 sind. Unter Berücksichtigung dieser Evidenzlinien wurden neun Rückstände (D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322, Y326) für die Bewertung der Stufe 3 unter Verwendung von humanem MOR als Vorlagensequenz und unter Ausschluss von partiellen, vorhergesagten, hypothetischen und minderwertigen Sequenzen ausgewählt. Wichtig ist, dass die in der Literatur berichteten Aminosäurepositionen ein 64-Aminosäuren-Segment relativ zum NCBI-Proteinzugang ausschließen, und aus diesem Grund wurden Positionen in Level 3 ausgewählt, um diejenigen darzustellen, die mit der Vorlagensequenz für korrekte Alignment-Sequenzen übereinstimmen.

In der Level-3-Analyse der menschlichen MOR wurden 284 Arten über Wirbeltierarten (Säugetiere, Vögel, Amphibien, Reptilien und Fische) bewertet. Über alle bewerteten Arten hinweg waren die neun Aminosäuren entweder eine Gesamtübereinstimmung oder eine teilweise Übereinstimmung, basierend auf Seitenkettenklassifikation und Molekulargewicht; Folglich ergaben alle untersuchten Arten eine Empfindlichkeitsvorhersage von "Y" für Ja (Tabelle 3 und Zusatzdossier 1). Da diese Aminosäuren für die Bindung sowohl starker MOR-Agonisten als auch starker Antagonisten wichtig sind, deuten diese Daten darauf hin, dass Opioidverbindungen, die auf menschliche μ Opioidrezeptoren abzielen, ähnlich mit Rezeptoren über Wirbeltierarten hinweg interagieren können. Obwohl in der ECOTOX-Wissensdatenbank bisher nur wenige empirische Daten für Opioidverbindungen verfügbar sind, deuten mehrere Studien darauf hin, dass Fische wahrscheinlich anfällig sind31,32,33. Insgesamt weisen die Ergebnisse von SeqAPASS auf das Potenzial für breitere Umweltauswirkungen von MOR-modulierenden Chemikalien über Spezies hinweg hin, was darauf hindeutet, dass mehr Forschung und möglicherweise Überwachung wertvoll sein könnten. Die Daten für alle Analysen sind in der Zusatzdatei 1 verfügbar.

Tabelle 3: SeqAPASS Level 3 Analyse der Konservierung von Aminosäureresten, die für die chemische Bindung an den μ Opioidrezeptor wichtig sind. Zusammenfassende Tabelle, die die Anzahl der Arten mit verfügbaren Sequenzdaten über alle taxonomischen Gruppen, die Anzahl der Arten, die als ähnlich anfällig (Y) vorhergesagt werden, und die Anzahl der Arten, die voraussichtlich nicht ähnlich anfällig sind, sowie vollständige, partielle und nicht übereinstimmende Aminosäuren anzeigt. Abkürzung: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Zusatztabelle S1: Spezies mit verfügbaren ECOTOX-Daten für die vier Chemikalien von Interesse, von denen bekannt ist, dass sie an das menschliche Transthyretin-Protein binden. Die für jede Chemikalie verfügbaren Daten sind mit SeqAPASS-Vorhersagen ähnlicher Suszeptibilität über die Stufen 1, 2 und 3 abgestimmt. Alle SeqAPASS-Vorhersagen relativ zur menschlichen Transthyretinsequenz. Abkürzungen: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility; DES = Diethylstilbestrol; PFHxA = Perfluorhexansäure; PFOS = Perfluoroctansulfonsäure; TBBPA = Tetrabrombisphenol A. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Zusatztabelle S2: Gesamtzahl der Arten mit verfügbaren Daten über SeqAPASS und ECOTOX Bewertungen für ausgewählte Chemikalien, von denen bekannt ist, dass sie an das menschliche Transthyretin-Protein binden. SeqAPASS bietet Mittel zur Vorhersage der Anfälligkeit von Arten für viele Arten, für die keine empirischen Toxizitätsdaten verfügbar sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Zusatzdatei 1: SeqAPASS- und ECOTOX-Daten für alle repräsentativen Ergebnisse. Datei enthält Inhaltsverzeichnis, gefolgt von den folgenden Datenblättern: Tab 1-hTTR SeqAPASS Results Level 1, Tab 2-hTTR SeqAPASS Results Level 2, Tab 3-hTTR SeqAPASS Results Level 3, Tab 4-EcoTox Daten für DES, Tab 5-EcoTox Daten für PFOS, Tab 6-EcoTox Daten für PFHxA, Tab 7-EcoTox Daten für TBBPA, Tab 8-EcoTox Group Mean Calculations, Registerkarte 9-SeqAPASS EcoTox-Datenvergleiche, Registerkarte 10-hMOR SeqAPASS-Ergebnisse Ebene 1, Registerkarte 11-hMOR SeqAPASS-Ergebnisse Stufe 2 und Registerkarte 12-μ-hMOR SeqAPASS-Ergebnisse Stufe 3. Abkürzungen: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility; Inhaltsverzeichnis = Inhaltsverzeichnis; hTTR = humanes Transthyretin; ECOTOX = Ökotoxikologische Wissensbasis; DES = Diethylstilbestrol; PFOS = Perfluoroctansulfonsäure; PFHxA = Perfluorhexansäure; TBBPA = Tetrabrombisphenol A; hMOR = humaner mu-Opioidrezeptor. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Es ist allgemein anerkannt, dass es nicht möglich ist, genügend Arten empirisch zu testen, um die genomische, phänotypische, physiologische und Verhaltensvielfalt lebender Organismen zu erfassen, die Chemikalien von toxikologischem Interesse ausgesetzt sein können. Das Ziel von SeqAPASS ist es, die Nutzung bestehender und kontinuierlich expandierender Proteinsequenz- und Strukturdaten zu maximieren, um die Extrapolation von chemischen Toxizitätsdaten / Wissen von getesteten Organismen auf Hunderte oder Tausende anderer Spezies durch Vergleiche auf molekularer Ebene zu unterstützen und zu informieren. Das SeqAPASS-Tool wurde entwickelt, um die Komplexität von Proteinsequenzvergleichen für Wissenschaftler, Risikobewerter und Regulierungsbehörden durch eine optimierte und schnelle Analyse zu reduzieren, die transparent generierte und herunterladbare Übersichtstabellen, interaktive Datenvisualisierungen und die einfache Identifizierung bedrohter und gefährdeter Arten sowie gängiger Modellorganismen umfasst. Hier werden Protokolle beschrieben, um SeqAPASS Level 1, 2 und 3 für die Bewertung der Ähnlichkeit der primären Aminosäuresequenz, der Erhaltung funktioneller Domänen und kritischer Aminosäuren auszuführen, die an chemischen Protein- und Protein-Protein-Interaktionen beteiligt sind. Evidenzlinien, die aus jeder Stufe der SeqAPASS-Analyse gesammelt wurden, prognostizieren die chemische Empfindlichkeit über Spezies hinweg und liefern konsistente und leicht interpretierbare Daten. Bisher wurde dieses Instrument in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt, darunter die Identifizierung von Chemikalien, die an bestimmte Rezeptoren binden, und die Bewertung des Analogiepotenzials für ökologische Wirbeltierrezeptoren mit Säugetiersystemen. Darüber hinaus werden hier zwei Fallstudien beschrieben, die sich auf das Schilddrüsenhormonverteilungsprotein TTR und das MOR konzentrieren, um die neuen Merkmale und Funktionen von SeqAPASS v2 bis v6 zu demonstrieren.

Wie bei jedem computergestützten Ansatz hängt die Fähigkeit, Vorhersagen über die Anfälligkeit von Arten innerhalb des SeqAPASS-Tools zu generieren, stark von der Eingabe geeigneter Parameter 8,9,13 ab. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, dass vor der Durchführung einer Analyse ein Schritt zur Problemformulierung durchgeführt wird, um vorhandene Daten und Literatur für das beabsichtigte Ziel zu untersuchen. Der Beginn einer Analyse mit Kenntnis des Proteinziels ermöglicht es dem Benutzer, geeignete Proteinzugangszahlen und qualitativ hochwertige Sequenzen zu identifizieren. Ebenso gewährleistet die Kenntnis einer empfindlichen oder Zielspezies oder von Modellorganismen, die in Assays oder AOP-Entwicklung verwendet werden, die Auswahl einer geeigneten Abfrageart, mit der alle anderen Arten verglichen werden. Die Auswahl funktioneller Domänen für Level 2 und kritischer Aminosäurereste für Level 3 sind ebenfalls kritische Schritte, bei denen der Benutzer geeignete Eingabeparameter identifizieren muss, um Vorhersagen zu generieren. Aufgrund dieses Bedarfs an bereits vorhandenem Wissen über eine chemische Protein-Interaktion integrieren neuere Versionen des SeqAPASS-Tools benutzerfreundliche Ressourcen, die Benutzer zu relevanten Informationen für die Initiierung einer Abfrage führen (z. B. Links zu anderen Tools) (Tabelle 2 und Abbildung 2). Darüber hinaus wurden Popup-Informationsmeldungen und Warnungen in das Tool integriert, um den Benutzer durch die Analyse zu führen und den Benutzer über Fehler zu informieren, die behoben werden müssen.

Die Komplexität chemisch-biologischer Wechselwirkungen stellt eine Einschränkung des SeqAPASS-Werkzeugs dar. Bei der Extrapolation von Toxizitätsdaten über Spezies hinweg ist die Erhaltung des molekularen Ziels einer von vielen Faktoren, die berücksichtigt werden müssen. Die Adsorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung (ADME) einer Chemikalie ist entscheidend für die Berücksichtigung der chemischen Toxizität, da Chemikalien durch diese Prozesse entweder aktiviert oder entgiftet werden können39,40. Andere Faktoren, wie der Weg der chemischen Exposition, das Lebensstadium und die Lebensgeschichte des Organismus sowie die Ernährung, können ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der chemischen Empfindlichkeit über Arten hinweg spielen41,42. Um diese Einschränkung zu überwinden, ist es wichtig, die Hauptfrage zu verstehen, die SeqAPASS bei der Vorhersage der chemischen Suszeptibilität stellt: Ist es wahrscheinlich, dass das Proteinziel einer Chemikalie in einer anderen Spezies vorhanden ist, auf die die Chemikalie einwirken kann? Diese Frage wird durch die Identifizierung von orthologischen Kandidaten und die Berücksichtigung der Erhaltung dieses Ziels über Arten hinweg im Vergleich zu einer bekannten empfindlichen oder Zielart angegangen. Diese Informationen können als Evidenzlinie für die artübergreifende Extrapolation verwendet und in andere Evidenzströme (z. B. das Expositionspotenzial) integriert werden, um die Anfälligkeit der Arten für chemische Stressoren besser zu verstehen. Aktualisierungen von SeqAPASS haben integrierte Links zu externen Tools integriert, darunter die US EPA ECOTOX Knowledgebase43 und das US Fish & Wildlife Service Environmental Conservation Online System (ECOS)44. Die Verbindung zu diesen Datenbanken bietet SeqAPASS-Benutzern einen einfachen Zugriff auf empirische chemische Toxizitätsdaten für den Vergleich mit sequenzbasierten Vorhersagen und die Identifizierung von Arten, die möglicherweise einen geschützten Status haben.

Das SeqAPASS-Tool bietet eine wissenschaftlich fundierte Plattform für computergestützte Vorhersagen der intrinsischen Suszeptibilität, die durch Konzepte der Evolutionsbiologie und Fallbeispiele unterstützt werden, die Vorhersagen mit verfügbaren empirischen Ergebnissen vergleichen. Darüber hinaus ist SeqAPASS kostenlos und öffentlich verfügbar auf einer gut unterstützten webbasierten Plattform, die allgemein zugänglich ist (https://seqapass.epa.gov/seqapass/). Da dieses Tool Sequenzdaten und Proteininformationen aus bestehenden Datenbanken nutzt, verbessert sich seine Fähigkeit, die chemische Suszeptibilität in einer breiteren Vielfalt von Arten vorherzusagen, ständig, da die Sequenzierungstechnologie voranschreitet und die Genome neuer Arten sequenziert und annotiert werden. Obwohl dies deutliche Vorteile in Bezug auf die Datenverfügbarkeit bietet, stellt es auch eine Einschränkung dar, da öffentlich verfügbare Sequenzinformationen für einige Spezies einer inkonsistenten Qualität, schlechten Annotation und Unvollständigkeit der Proteinsequenzen unterliegen können. Es ist jedoch vielversprechend, dass Omics-Technologien und -Methoden in der Bioinformatik schnell voranschreiten und sich daher die Sequenzkuration und -qualität im Laufe der Zeit weiter verbessern dürften.

Ein wesentliches Ziel des SeqAPASS-Tools ist die Transparenz, die den Zugriff in Form von Links zu allen Datenquellen und Tools, die im Backend integriert sind, ermöglicht. Diese Transparenz ermöglicht dem Benutzer einen schnellen Zugriff auf die ursprünglichen Quellen der Sequenz oder taxonomische Informationen von NCBI. Der Anwendungsbereich dieses Tools wird durch die Informationen definiert, die für die Durchführung einer aussagekräftigen Analyse erforderlich sind. Da die Kenntnis einer chemischen Protein- oder Protein-Protein-Interaktion in einer bekannten empfindlichen oder Zielspezies Schlüsselelemente für den Beginn einer Abfrage sind, muss anerkannt werden, dass Abfragen, die ohne diese Informationen durchgeführt werden, nicht aussagekräftig sind. Darüber hinaus stellen Chemikalien, die mehrere undefinierte biologische Ziele haben oder mit verschiedenen Zielen mit unterschiedlichen Potenzgraden interagieren, ebenfalls eine Herausforderung und Einschränkung des Werkzeugs in seiner derzeitigen Form dar. Es wird erwartet, dass mit verbesserter Bioinformatik, Computermodellierung und zellbasiertem Hochdurchsatz-Screening und Transkriptomik weiterhin ein größeres Wissen über die Vielfalt des chemischen Raums in Bezug auf Wechselwirkungen mit spezifischen Proteinen aufgeklärt wird. Es wird erwartet, dass sich die Fähigkeit, SeqAPASS auf breitere Herausforderungen der Artenextrapolation anzuwenden, in Bezug auf das Verständnis des Potenzials für nachteilige chemische Auswirkungen auf die Vielfalt der Arten, weiter verbessern wird.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das SeqAPASS-Tool eine zugängliche Plattform ist, die molekulare Informationen leicht anwendet, um die beträchtliche Herausforderung der artenübergreifenden Extrapolation bei Stoffsicherheitsbewertungen zu bewältigen. Obwohl sich die hier hervorgehobenen Beispiele auf die Erstellung von Vorhersagen der chemischen Suszeptibilität konzentrieren, können die Ergebnisse auch dazu beitragen, die allgemeine Erhaltung biologischer Signalwege zu verstehen. Durch die Zusammenführung verschiedener Beweislinien und die Erleichterung des Zugriffs auf mehrere Plattformen und Datenbanken hilft dieses Tool, transparente Fälle für die Priorisierung chemischer Tests und die Zuweisung von Ressourcen zu erstellen. Mit der kontinuierlichen Entwicklung der wissenschaftlichen und bioinformatischen Fähigkeiten werden die Leistungsfähigkeit und der Nutzen des Tools weiter wachsen und sich verbessern, um den Anforderungen von Forschungs- und Regulierungsgemeinschaften gerecht zu werden und gleichzeitig die für artübergreifende Bewertungen erforderlichen Ressourcen zu reduzieren.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Daniel L. Villeneuve (U.S. EPA, Center for Computational Toxicology and Exposure) und Dr. Jon A. Doering (Department of Environmental Sciences, Louisiana State University) für die Kommentare zu einem früheren Entwurf des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der U.S. Environmental Protection Agency unterstützt. Die in diesem Papier geäußerten Ansichten sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien der US-Umweltschutzbehörde wider, noch deutet die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten auf eine Billigung durch die Bundesregierung hin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spreadsheet program N/A N/A Any program that can be used to view and work with csv files (e.g. Microsoft Excel, OpenOffice Calc, Google Docs) can be used to access data export files.
Basic computing setup and internet access N/A N/A SeqAPASS is a free, online tool that can be easily used via an internet connection. No software downloads are required.

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Genetics Ausgabe 192 Cross-species extrapolation Ökotoxikologie prädiktive Toxikologie New Approach Methodology Opioidrezeptor Transthyretin
Demonstration der Sequenzausrichtung zur Vorhersage über Spezies hinweg Suszeptibilitätstool zur schnellen Bewertung der Proteinkonservierung
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Vliet, S. M. F., Hazemi, M., Blatz,… More

Vliet, S. M. F., Hazemi, M., Blatz, D., Jensen, M., Mayasich, S., Transue, T. R., Simmons, C., Wilkinson, A., LaLone, C. A. Demonstration of the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility Tool for Rapid Assessment of Protein Conservation. J. Vis. Exp. (192), e63970, doi:10.3791/63970 (2023).

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