Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Automatic Translation
Cite This Article
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Demonstratie van de sequentie-uitlijning om te voorspellen tussen soorten gevoeligheidsinstrument voor snelle beoordeling van eiwitbehoud

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/63970
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 4, 5, 5, 5, 6
1Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Scientific Computing and Data Curation Division, U.S. Environmental Protection Agency, 2Oak Ridge Institute for Science and Education, 3Swenson College of Science and Engineering, Department of Biology, University of Minnesota Duluth, 4University of Wisconsin-Madison Aquatic Sciences Center, 5General Dynamics Information Technology, Research Triangle Park, 6Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Great Lakes Toxicology and Ecology Division, U.S. Environmental Protection Agency

Summary

Hier presenteren we een protocol om de nieuwste versie van de Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) -tool van het Amerikaanse Environmental Protection Agency te gebruiken. Dit protocol demonstreert de toepassing van de online tool om snel eiwitbehoud te analyseren en aanpasbare en gemakkelijk interpreteerbare voorspellingen van chemische gevoeligheid tussen soorten te bieden.

Abstract

De SeqAPASS-tool (Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility) van het Amerikaanse Environmental Protection Agency is een snelle, vrij beschikbare, online screeningstoepassing waarmee onderzoekers en regelgevers toxiciteitsinformatie over soorten kunnen extrapoleren. Voor biologische doelen in modelsystemen zoals menselijke cellen, muizen, ratten en zebravissen zijn toxiciteitsgegevens beschikbaar voor een verscheidenheid aan chemicaliën. Door de evaluatie van het behoud van eiwitdoelen kan dit instrument worden gebruikt om gegevens die zijn gegenereerd uit dergelijke modelsystemen te extrapoleren naar duizenden andere soorten zonder toxiciteitsgegevens, wat voorspellingen oplevert van relatieve intrinsieke chemische gevoeligheid. De nieuwste releases van de tool (versies 2.0-6.1) hebben nieuwe functies opgenomen die de snelle synthese, interpretatie en het gebruik van de gegevens voor publicatie plus afbeeldingen van presentatiekwaliteit mogelijk maken.

Tot deze functies behoren aanpasbare gegevensvisualisaties en een uitgebreid samenvattend rapport dat is ontworpen om SeqAPASS-gegevens samen te vatten voor eenvoudige interpretatie. Dit artikel beschrijft het protocol om gebruikers te begeleiden bij het indienen van taken, het navigeren door de verschillende niveaus van eiwitsequentievergelijkingen en het interpreteren en weergeven van de resulterende gegevens. Nieuwe functies van SeqAPASS v2.0-6.0 worden gemarkeerd. Verder worden twee use-cases beschreven die gericht zijn op transthyretine en opioïde receptor eiwitbehoud met behulp van deze tool. Ten slotte worden de sterke punten en beperkingen van SeqAPASS besproken om het domein van toepasbaarheid voor de tool te definiëren en verschillende toepassingen voor cross-species extrapolatie te benadrukken.

Introduction

Van oudsher is het gebied van toxicologie sterk afhankelijk van het gebruik van dierproeven om de gegevens te verstrekken die nodig zijn voor chemische veiligheidsevaluaties. Dergelijke methoden zijn doorgaans kostbaar en arbeidsintensief. Vanwege het grote aantal chemicaliën dat momenteel wordt gebruikt en het snelle tempo waarin nieuwe chemicaliën worden ontwikkeld, is er wereldwijd echter een erkende behoefte aan efficiëntere methoden voor chemische screening 1,2. Deze behoefte en de daaruit voortvloeiende paradigmaverschuiving weg van dierproeven heeft geleid tot de ontwikkeling van veel nieuwe benaderingsmethoden, waaronder high-throughput screening assays, high-throughput transcriptomics, next-generation sequencing en computationele modellering, die veelbelovende alternatieve teststrategieën zijn 3,4.

Het evalueren van de chemische veiligheid in de diversiteit van soorten die mogelijk worden beïnvloed door blootstelling aan chemische stoffen is een blijvende uitdaging geweest, niet alleen met traditionele toxiciteitstests, maar ook met nieuwe benaderingsmethoden. Vooruitgang in vergelijkende en voorspellende toxicologie heeft kaders geboden voor het begrijpen van de relatieve gevoeligheid van verschillende soorten, en technologische vooruitgang in computationele methoden blijft de toepasbaarheid van deze methoden vergroten. In het afgelopen decennium zijn verschillende strategieën besproken die gebruikmaken van bestaande gen- en eiwitsequentiedatabases, samen met kennis van specifieke chemische moleculaire doelen, om voorspellende benaderingen voor extrapolatie tussen soorten te ondersteunen en chemische veiligheidsevaluaties te verbeteren die verder gaan dan de typische modelorganismen 5,6,7,8.

Om de wetenschap in actie te brengen, voort te bouwen op deze fundamentele studies in voorspellende toxicologie, prioriteit te geven aan chemische testinspanningen en de besluitvorming te ondersteunen, werd de Us Environmental Protection Agency Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) -tool gemaakt. Deze tool is een openbare en vrij beschikbare webgebaseerde applicatie die openbare opslagplaatsen van voortdurend uitbreidende eiwitsequentie-informatie gebruikt om chemische gevoeligheid te voorspellen voor de diversiteit van soorten9. Op basis van het principe dat de relatieve intrinsieke gevoeligheid van een soort voor een bepaalde chemische stof kan worden bepaald door de instandhouding van de bekende eiwitdoelen van die chemische stof te evalueren, vergelijkt deze tool snel eiwitaminozuursequenties van een soort met bekende gevoeligheid voor alle soorten met bestaande eiwitsequentiegegevens. Deze evaluatie wordt voltooid door middel van drie analyseniveaus, waaronder (1) primaire aminozuursequentie, (2) functioneel domein en (3) kritische aminozuurresiduvergelijkingen, die elk meer diepgaande kennis van de chemisch-eiwitinteractie vereisen en een grotere taxonomische resolutie bieden in de gevoeligheidsvoorspelling. Een belangrijke kracht van SeqAPASS is dat gebruikers hun evaluatie kunnen aanpassen en verfijnen door extra bewijslijnen toe te voegen voor het behoud van doelen op basis van hoeveel informatie beschikbaar is met betrekking tot de interactie tussen chemicaliën en eiwitten of eiwitten en eiwitten van belang.

De eerste versie werd uitgebracht in 2016, waarmee gebruikers primaire aminozuursequenties en functionele domeinen op een gestroomlijnde manier konden evalueren om chemische gevoeligheid te voorspellen en minimale datavisualisatiemogelijkheden bevatten (tabel 1). Van individuele aminozuurverschillen is aangetoond dat ze belangrijke determinanten zijn van verschillen tussen soorten in chemisch-eiwitinteracties, die de chemische gevoeligheid van soorten kunnen beïnvloeden 10,11,12. Daarom werden latere versies ontwikkeld om rekening te houden met de kritieke aminozuren die belangrijk zijn voor directe chemische interactie13. In reactie op feedback van belanghebbenden en gebruikers heeft deze tool jaarlijkse versieversies ondergaan met aanvullende nieuwe functies die zijn ontworpen om te voldoen aan de behoeften van zowel onderzoekers als regelgevende gemeenschappen voor het aanpakken van uitdagingen bij extrapolatie tussen soorten (tabel 1). De lancering van SeqAPASS versie 5.0 in 2020 bracht gebruikersgerichte functies naar voren die opties voor gegevensvisualisatie en gegevenssynthese, externe links, overzichtstabel- en rapportopties en grafische functies bevatten. Over het algemeen verbeterden de nieuwe kenmerken en mogelijkheden van deze versie de gegevenssynthese, interoperabiliteit tussen externe databases en het gemak van gegevensinterpretatie voor voorspellingen van de gevoeligheid voor verschillende soorten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Aan de slag

OPMERKING: Het hier gepresenteerde protocol is gericht op het hulpprogramma en de belangrijkste functies van het gereedschap. Gedetailleerde beschrijvingen van methoden, functies en componenten zijn te vinden op de website in een uitgebreide gebruikershandleiding (tabel 1).

Tabel 1: Evolutie van de SeqAPASS tool. Een lijst met functies en updates die vanaf de eerste implementatie aan het SeqAPASS-hulpprogramma zijn toegevoegd. Afkortingen: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility; ECOTOX = ECOTOXicologie kennisbank. Klik hier om deze tabel te downloaden.

  1. Ga naar https://seqapass.epa.gov/seqapass met Chrome. Selecteer Inloggen om een bestaand account te gebruiken of volg de instructies om een SeqAPASS-account te maken, waarmee gebruikers hun voltooide taken kunnen uitvoeren, opslaan, openen en aanpassen.
  2. Voordat u een analyse uitvoert, moet u eerst een eiwit van belang en een gerichte of gevoelige soort identificeren door de bestaande literatuur of reeds bestaande gegevens te bekijken (figuur 1). Aangezien SeqAPASS koppelingen bevat naar externe bronnen om het query-eiwit te helpen identificeren, klikt u op de vervolgkeuzeknoppen onder Een eiwitdoel identificeren om toegang te krijgen tot relevante bronnen.

Figure 1
Figuur 1: SeqAPASS probleemformulering: schematisch diagram van de voorlopige informatie die nodig is voor een succesvolle analyse. Afkortingen: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility; LBD = ligandbindend domein. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: SeqAPASS-interoperabiliteit tussen databases. Schematisch diagram van externe tools, databases en bronnen geïntegreerd in SeqAPASS. Afkortingen: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility; AOP = ongunstige uitkomstroute; NCBI = Nationaal Centrum voor Biotechnologische Informatie; ECOTOX = ECOTOXicologie kennisbank. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 2: Koppelingen, bronnen en tools die zijn geïntegreerd in de SeqAPASS-tool. Een lijst met de verschillende gegevensbronnen, koppelingen en bronnen die worden gebruikt in de SeqAPASS-tool. Afkorting: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility. Klik hier om deze tabel te downloaden.

2. Een SeqAPASS-query ontwikkelen en uitvoeren: niveau 1

OPMERKING: In een niveau 1-analyse wordt de volledige primaire aminozuursequentie van een query-eiwit vergeleken met de primaire aminozuursequenties van alle soorten met beschikbare sequentie-informatie. Deze tool gebruikt algoritmen om openbaar beschikbare gegevens te ontginnen, verzamelen en compileren om aminozuursequenties tussen soorten snel uit te lijnen en te vergelijken. De backend slaat informatie op uit databases van het National Center for Biotechnology Information (NCBI) en maakt strategisch gebruik van de standalone versies van de Protein Basic Local Alignment Search Tool (BLASTp)54 en de Constraint-based Multiple Alignment Tool (COBALT)55.

  1. Klik onder Primaire aminozuursequenties vergelijken op soort of op toetreding. Gebruik de selectie op soort om te typen of selecteer uit een lijst met soorten om het eiwitdoel van interesse te kiezen.
  2. Dien eiwittoetredingen (d.w.z. NCBI-eiwit-ID) rechtstreeks in door de toetreding(en) in het tekstvak Toetreding in te voeren.
  3. Selecteer Aanvraag uitvoeren om de query in te dienen. Zodra het is verzonden, wacht u tot er een melding in de rechterbovenhoek van het browservenster verschijnt die aangeeft dat de inzending is geslaagd.
  4. Selecteer het tabblad SeqAPASS-uitvoeringsstatus boven aan de pagina om een lijst weer te geven van alle SeqAPASS-runs die onder dat gebruikersaccount zijn uitgevoerd en controleer het percentage voltooiing.
    1. Klik op Gegevens vernieuwen terwijl het juiste keuzerondje is geselecteerd om de status van uitvoeringen van niveau 2 en niveau 3 te controleren.
  5. Selecteer het tabblad SeqAPASS-rapporten weergeven boven aan de pagina om toegang te krijgen tot een lijst met alle rapporten die onder dat account zijn voltooid.
  6. Selecteer op het tabblad SeqAPASS-rapporten weergeven het gewenste query-eiwit. Klik op Geselecteerd rapport aanvragen om de pagina Niveau 1-query-eiwitinformatie te openen en resultaten, opties voor gegevensaanpassing, visualisaties en overzichtsrapporten weer te geven.
  7. Selecteer standaard Rapport weergeven om gegevens in de webbrowser weer te geven. U kunt ook Rapport opslaan selecteren om onbewerkte gegevens te downloaden als een .zip bestand.
    OPMERKING: De tijd die nodig is voor een niveau 1-analyse varieert (gemiddeld 23 minuten voor versie 5.1), afhankelijk van de wereldwijde gebruikersvraag op dat moment, het aantal taken dat in de wachtrij is ingediend en de hoeveelheid eiwitinformatie die bestaat voor een ingediende taak. Als een eiwitdoel eerder is voltooid, zijn de gegevens binnen enkele seconden na indiening beschikbaar.

3. Een SeqAPASS-query ontwikkelen en uitvoeren: niveau 2

OPMERKING: Aangezien de gehele eiwitsequentie niet direct betrokken is bij een chemische interactie, vergelijkt een niveau 2-analyse alleen de aminozuursequentie van het functionele domein om gevoeligheidsvoorspellingen te doen op lagere taxonomische rangen (bijv. Klasse, orde, familie).

  1. Klik op de pagina Level 1 Query Protein Information op het plusteken + naast de level 2 header om het menu Level 2 Query te vullen.
  2. Identificeer de juiste domein(en) in het eiwit van belang (query-eiwit).
    1. Als een domein niet is geïdentificeerd, klikt u op de geïntegreerde link naar de NCBI Conserved Domains Database (CDD) (tabel 1), die kan helpen bij het identificeren van de juiste domeinselectie.
      OPMERKING: Meestal worden alleen specifieke hitdomeinen geselecteerd als query's in niveau 2.
  3. Klik op het vak Domein selecteren om automatisch een lijst met functionele domeinen voor het query-eiwit in te vullen.
  4. Selecteer de domeintoetreding(en) in de vervolgkeuzelijst en start de level 2-query door op de knop Domein uitvoeren aanvragen te klikken. Zodra het is ingediend, wacht u tot er een melding verschijnt die aangeeft dat de inzending is geslaagd.
  5. Klik op Niveau 2 vernieuwen en 3 wordt uitgevoerd om gegevens van niveau 2 in te vullen, die binnen enkele seconden na indiening beschikbaar zijn.
  6. Selecteer onder Gegevens van niveau 2 weergeven de voltooide domeintoetreding(en) in de vervolgkeuzelijst en klik op de knop Gegevens van niveau 2 weergeven om de resultaten op een nieuwe pagina te openen.

4. Toegang tot en begrip van de gegevens: SeqAPASS niveau 1 en niveau 2

  1. Scrol naar de onderkant van de pagina Query Protein Information om een rapport met de resultaten weer te geven - een primair rapport wordt standaard geleverd met niveau 1- en 2-analyses. Selecteer het keuzerondje Volledig rapport om een gedetailleerder rapport weer te geven met alle reekstreffers en uitlijningsstatistieken. Klik op de juiste toetreding/ID/naam in beide rapporten om toegang te krijgen tot de transparante eiwituitlijning en taxonomie-informatie in de NCBI-database.
  2. Scrol naar de rechterkant van de resultatentabel om de kolom ECOTOX weer te geven. Klik op links naar de ECOTOXicology knowledgebase (ECOTOX) om snel overeenkomstige toxiciteitsgegevens te verzamelen voor soorten met gevoeligheidsvoorspellingen.
    OPMERKING: ECOTOX is een uitgebreide, openbaar beschikbare kennisbank met gegevens over enkelvoudige chemische toxiciteit voor waterplanten en terrestrische planten en dieren in het wild. SeqAPASS v6.0 bevat een ECOTOX-widget om sneller verbinding te maken met relevante ECOTOX-gegevens per chemische stof en interessante soort.
  3. Klik op Tabel downloaden om de tabel op te slaan als een spreadsheetbestand. Klik op de knop Overzichtsrapport weergeven om een overzichtsrapporttabel met gegevens gesorteerd op taxonomische groep weer te geven en te downloaden.
    OPMERKING: Gegevensoverzichtstabellen zijn beschikbaar voor zowel primaire als volledige rapporten en bieden een overzicht van voorspellingen voor een bepaald doel.

5. Gegevensinstellingen manipuleren: SeqAPASS Niveau 1 en Niveau 2

OPMERKING: In zowel niveau 1- als niveau 2-analyses wordt aangenomen dat hoe groter de eiwitovereenkomst, hoe groter de kans dat een chemische stof op dezelfde manier met het eiwit zal interageren als de querysoort / eiwit, waardoor ze vatbaar zijn voor potentiële effecten van chemicaliën met dit moleculaire doelwit. Vanwege de gelijkenis van deze gegevens worden stappen voor het begrijpen van niveau 1- en 2-gegevens samen in één protocol beschreven.

  1. Raadpleeg de submenu's boven aan Query Protein Information om de rapportinstellingen te openen en te manipuleren en standaardinstellingen te gebruiken voor alle rapportopties voor de meeste analyses. Als er een wetenschappelijke rechtvaardiging is voor het wijzigen van de standaardinstelling, volgt u deze optionele stappen:
    1. (OPTIONEEL) Klik op het plusteken + naast Susceptibility Cut-off om de instellingen voor gevoeligheidsafsnijding in een nieuw tabblad weer te geven en aan te passen. Selecteer een nieuwe afkapwaarde in een vervolgkeuzelijst of voer een door de gebruiker gedefinieerde afkapwaarde in.
    2. (OPTIONEEL) Wijzig het getal in het veld E-Waarde (het aantal verschillende uitlijningen dat naar verwachting toevallig zal optreden) als iets anders dan standaard gewenst is.
      OPMERKING: Elk eiwit met een E-waarde die groter is dan het getal in het vak, wordt uit het primaire rapport verwijderd.
    3. (OPTIONEEL) Gebruik de optie Sorteren op taxonomische groep om het niveau van taxonomische hiërarchie te kiezen dat moet worden weergegeven in de kolom Gefilterde taxonomische groep in de resultatentabel.
      OPMERKING: Het wijzigen van de taxonomische hiërarchie zal ook de voorspelling van de gevoeligheid veranderen op basis van de soorten uit elke gefilterde groep die boven de cutoff worden gevonden.
    4. (OPTIONEEL) Wijzig het veld Gemeenschappelijk domein (hoeveel gemeenschappelijke domeinen een eiwit moet delen met het query-eiwit om in de resultaten te worden opgenomen) als iets anders dan standaard gewenst is.
      OPMERKING: Aangezien de standaardinstelling 1 is, wordt elke reeks die niet ten minste één gemeenschappelijk domein deelt met het query-eiwit uitgesloten.
    5. (OPTIONEEL) Selecteer Nee onder Soort overgelezen om de gevoeligheidsvoorspellingen van Y alleen terug te krijgen als de procentuele gelijkenis groter is dan of gelijk is aan de cutoff of als de hit wordt geïdentificeerd als een orthologe kandidaat.
      OPMERKING: Deze instelling is standaard ingesteld op Ja, wat betekent dat een gevoeligheidsvoorspelling van Y wordt gerapporteerd voor alle orthologe kandidaten, alle soorten die boven de gevoeligheidsgrens worden vermeld en alle soorten onder de afsnijding van dezelfde taxonomische groep met een of meer soorten boven de cutoff.
  2. Klik op de knop Huidige rapportinstellingen downloaden om een bestand te downloaden waarin de huidige toegepaste instellingen worden vastgelegd.
    OPMERKING: Het specifieke evaluatieniveau (1, 2 of 3) dat is geselecteerd, bepaalt de instellingen die in het rapport worden gepresenteerd.

6. Visualiseren van de gegevens: SeqAPASS Niveau 1 en Niveau 2

  1. Klik op het plusteken + naast Visualisatie en klik op de knop Gegevens visualiseren om een apart tabblad te openen met de door de gebruiker gedefinieerde informatie en de optie om een interactieve grafiek met resultaten te selecteren.
  2. Klik op Boxplot om de interactieve boxplot- en plotbesturingselementen te openen en de boxplotvisualisatie actief te laten bijwerken om wijzigingen in de gegevenstabel weer te geven en afbeeldingen van publicatie- en presentatiekwaliteit te bieden.
    OPMERKING: De standaard boxplot geeft soortengroepen weer op de x-as en procentuele gelijkenis op de y-as. Boxplots tonen de gevoeligheidsafsnijding (stippellijn), procentuele gelijkenis tussen soorten in vergelijking met de querysoort en gemiddelde en mediane waarden voor elke taxonomische groep, samen met het 25e en 75e percentiel en interkwartielbereik. Afhankelijk van het doel van de analyse en de behoeften van de gebruiker, kunnen veel boxplot-functies worden gewijzigd via de volgende optionele stappen.
    1. (OPTIONEEL) Als u de weergegeven taxonomische groepen wilt aanpassen, raadpleegt u het vak Taxonomische groepen onder de sectie Besturingselementen . Verwijder groepen door over de namen te scrollen en x te selecteren of door het vervolgkeuzemenu Taxonomische groepen te gebruiken.
    2. (OPTIONEEL) Als u een legenda wilt toevoegen die een interessante soort of specifieke vooraf gedefinieerde groepen (bijvoorbeeld bedreigde of bedreigde soorten) aanwijst, plaatst u de muisaanwijzer op een taxonomische groepsnaam op de x-as om een pop-upvenster te activeren met de top drie soorten die zijn gerangschikt op basis van de hoogste procentuele gelijkenis. Plaats de muisaanwijzer op soorten in de legenda om een pop-upvenster te genereren met de bijbehorende soortinformatie. Klik op het vakje voor een specifieke taxonomische groep om een downloadbare overzichtstabel met soorten en voorspellingen te genereren.
  3. Klik op Boxplot downloaden om een bestandstype te kiezen, de breedte/hoogteresolutie aan te passen en de visualisatie op te slaan.

7. Ontwikkelen en uitvoeren van een SeqAPASS analyse: Niveau 3

OPMERKING: Een niveau 3-analyse beoordeelt door de gebruiker geïdentificeerde aminozuurresiduen binnen het query-eiwit en vergelijkt snel het behoud van deze residuen tussen soorten. Van soorten waarbij deze residuen worden geconserveerd, wordt aangenomen dat ze meer kans hebben om op een vergelijkbare manier met een chemische stof te interageren als de sjabloonsoort /eiwit. Aangezien niveau 3 zich richt op individuele aminozuren, kan een analyse alleen worden uitgevoerd wanneer gedetailleerde kennis van de aminozuurresiduen die cruciaal zijn voor de interactie tussen chemicaliën en eiwitten of eiwitten en eiwitten beschikbaar is.

  1. Klik op het plusteken + naast de koptekst niveau 3 op de pagina Niveau 1 Query-eiwitinformatie om het menu Query van niveau 3 te vullen.
  2. Klik op het plusteken + naast de Referentieverkenner om de referentieverkenner te openen, die een vooraf gedefinieerde Booleaanse tekenreeks genereert om de beschikbare literatuur op te vragen en gebruikers helpt bij het identificeren van geschikte literatuur ter ondersteuning van de identificatie van kritieke aminozuren die moeten worden gebruikt in de niveau 3-evaluatie (tabel 2 en figuur 2).
    1. (OPTIONEEL) Zodra het query-eiwit automatisch is ingevuld, gebruikt u de functie Eiwitnaam toevoegen om extra eiwitten toe te voegen.
  3. Klik op de link Google Scholar genereren om een pop-up te openen met een automatisch gegenereerde zoekreeks met relevante zoektermen.
  4. Klik op Zoeken in Google Scholar om de literatuurdatabase te doorzoeken met behulp van de zoekreeks.
    1. U kunt ook op Kopiëren naar klembord klikken en de zoekreeks aanpassen door termen toe te voegen of te verwijderen met behulp van de functies in Reference Explorer.

8. Identificeer kritische aminozuurresiduen met behulp van geïdentificeerde literatuur

  1. Selecteer de sjabloonvolgorde waarop door de gebruiker geselecteerde soorten worden uitgelijnd in het menu Query van niveau 3.
    OPMERKING: Deze sjabloonvolgorde wordt vaak gekozen op basis van de literatuur waarvoor de kritieke aminozuren zijn geïdentificeerd en kan dezelfde of een andere soort zijn dan die in niveau 1 en niveau 2.
    1. (OPTIONEEL) Gebruik het vak Aanvullende vergelijkingen om toetredingen/reeksen te vergelijken die niet in de tabellen Primair/Volledig rapport voorkomen.
  2. Voer een door de gebruiker gedefinieerde naam in voor de level 3-run in het tekstvak Enter Level 3 Run Name om de voltooide Level 3-run te identificeren. Kies een unieke naam voor elke evaluatie.
  3. Selecteer de taxonomische groep van belang in het veld Taxonomische groep(en) kiezen . Selecteer een taxonomische groep om de tabel automatisch te filteren op die taxonomische groep.
  4. Klik in de resultatentabel handmatig op het selectievakje naast een soort die moet worden uitgelijnd met de sjabloonreeks.
    OPMERKING: Om de juiste uitlijning te garanderen, moet één taxonomische groep tegelijk worden vergeleken met de sjabloon. Selecteer alleen vergelijkbare geannoteerde eiwitten voor de soort van belang. Bij het selecteren van sequenties voor vergelijking is het belangrijk om aandacht te besteden aan bepaalde sequenties (bijvoorbeeld hypothetisch, LAGE KWALITEIT of gedeeltelijk). Tenzij er een transparante rechtvaardiging is voor opname, is het het beste om deze sequenties uit te sluiten, omdat ze voorspellingen kunnen vervormen als gevolg van onvolledige of ongepaste sequentie-informatie.
  5. Herhaal de stappen om alle taxonomische groepen van belang uit te lijnen.
  6. Klik op Niveau 2 en 3 vernieuwen zodra alle soorten zijn uitgelijnd om het menu Run Name selecteren te vullen met de voltooide Level 3-taken en de gegevens onmiddellijk uit een level 3-uitlijning te halen.
  7. Klik op Gegevens van niveau 3 combineren om uitlijningen van meerdere taxonomische groepen te combineren.
    1. Als u één rapport wilt weergeven, selecteert u de door de gebruiker gedefinieerde naam onder Query kiezen om weer te geven en klikt u op Gegevens van niveau 3 weergeven.
  8. Selecteer de sjabloon Niveau 3 die moet worden gebruikt als basis voor de vergelijking van aminozuurresiduen in het menu Rapporten combineren van niveau 3 en klik op Volgende.
  9. Selecteer in taken van niveau 3 voltooide taken ter vergelijking en klik op Volgende. Gebruik de functie Order level 3 Jobs om de volgorde van de taxonomische groepen indien gewenst te wijzigen. Klik op Gegevens van niveau 3 weergeven om een rapportpagina van niveau 3 te maken met de gecombineerde taxonomische groepen uitgelijnd.
  10. Selecteer eerder geïdentificeerde aminozuurposities voor de sjabloonsoort door de aminozuurpositie(s), gescheiden door komma's, in het vak Aminozuurresiduposities invoeren in te voeren en vervolgens Kopiëren naar residulijst te selecteren. Selecteer direct residuen in de sjabloonvolgorde uit de shuttlebox.
  11. Klik op Rapport bijwerken om de pagina te vernieuwen en de gevoeligheidsvoorspellingen van niveau 3 weer te geven.
    OPMERKING: Niveau 3 gebruikt een eenvoudige reeks regels die zijn afgeleid van basisdescriptoren van functionele eigenschappen van de zijketen (bijv. Alifatisch, aromatisch) en moleculaire dimensies (moleculaire gewichtsverschillen >30 g / mol) om te bepalen of verschillen op sleutelposities waarschijnlijk van invloed zijn op eiwitinteracties13.

9. Visualisatie van Level 3 SeqAPASS-gegevens

OPMERKING: Net als in eerdere niveaus zijn primaire en volledige rapporten beschikbaar. Naast gegevens die identiek zijn aan de gegevens in niveau 1 en 2, geeft het primaire rapport aminozuurposities, afkortingen en een ja / nee (J / N) vergelijkbare gevoeligheid weer als de sjabloonvoorspelling. Evenzo bevat het volledige rapport informatie over de classificatie van aminozuurzijdeketens en het molecuulgewicht.

  1. Blader op de pagina Niveau 3-rapport naar beneden om een rapport met de resultaten weer te geven. Klik op Tabel downloaden onder aan het rapport om de tabel op te slaan.
  2. Klik op Overzichtsrapport van niveau 3 weergeven om een overzichtsrapporttabel met gegevens gesorteerd op taxonomische groep weer te geven en te downloaden. Klik op het plusteken + naast Visualisatie op de pagina Niveau 3-rapport om een apart browsertabblad te openen met de door de gebruiker gedefinieerde informatie en de optie om resultaten te bekijken in de vorm van een interactieve heatmap.
  3. Klik op Heat Map op de pagina Visualisatie-informatie om de interactieve afbeelding en besturingselementen te openen en de heatmapvisualisatie actief bij te werken om wijzigingen in de gegevenstabel weer te geven. Voer de volgende optionele stappen uit om de heatmap aan te passen.
    1. (OPTIONEEL) Selecteer Rapportopties om te schakelen tussen een eenvoudig rapport, waarin de aminozuurpositie, afkorting van één letter en aminozuurovereenkomst worden weergegeven, of een volledig rapport, waarin gedetailleerde informatie over elk geselecteerd aminozuur wordt weergegeven.
    2. (OPTIONEEL) Selecteer Rapportopties om te wijzigen hoe soorten worden weergegeven, op algemene naam of wetenschappelijke naam.
      OPMERKING: In het simple report worden aminozuren gecategoriseerd als een Total Match (donkerblauw), Partial Match (lichtblauw, substituties die aan slechts één criterium voldoen) of Not a Match (geel, substituties die aan geen van beide criteria voldoen) op het sjabloonaminozuur. In het volledige rapport worden vergelijkingen weergegeven als een totale overeenkomst (donkerblauw) of geen overeenkomst (geel).
    3. (OPTIONEEL) Selecteer Optionele selecties om nuttige informatie te markeren, zoals orthologe kandidaten, bedreigde soorten, bedreigde diersoorten of gemeenschappelijke modelorganismen.
    4. (OPTIONEEL) Selecteer Heat Map-instellingen om extra aanpassingsopties te selecteren, waaronder het toevoegen of verwijderen van kolommen, legenda's en tekst.
  4. Klik op Download Boxplot om een bestandstype te kiezen en de visualisatie op te slaan.

10. Interpretatie van SeqAPASS-resultaten: bewijslijnen voor eiwitbehoud

OPMERKING: Voor eenvoudige interpretatie bevat deze tool een beslissingssamenvattingsrapport (DS-rapport) dat is ontworpen om gegevens op verschillende niveaus te integreren. Het DS-rapport bevat de resultaten (d.w.z. gegevenstabellen en/of visualisaties) die de gebruiker heeft geselecteerd en maakt de snelle evaluatie mogelijk van gevoeligheidsvoorspellingen op meerdere niveaus voor meerdere soorten tegelijk.

  1. Klik op Push Level # naar DS Report vanaf de resultaten- of gegevensvisualisatiepagina's en wacht tot de gegevens worden "gepusht" en het tabblad DS Report actief wordt.
    OPMERKING: Als resultaten of wijzigingen niet naar het DS-rapport zijn gepusht, blijft Push Level # naar DS Report actief totdat deze is geselecteerd. Als een instelling is gewijzigd, wordt de tekst Klik om nieuwe wijzigingen door te drukken weergegeven totdat de wijzigingen naar het rapport worden gepusht. Visualisaties kunnen op elk moment tijdens de evaluatie naar het DS-rapport worden gepusht.
  2. Selecteer op elk gewenst moment het tabblad DS-rapport om de DS-pagina te openen.
    OPMERKING: Voor alle soorten die zijn uitgelijnd in niveau 1, bevat de tabel van het eindbeslissingssamenvattingsrapport de belangrijke gegevens en gevoeligheidsvoorspellingen voor elke analyse. Als een soort in de DS-tabel niet is opgenomen in het niveau 3-rapport, maar wel is gevonden in taken van niveau 1 en/of niveau 2, ontvangt de cel in de tabel een niet-toepasselijke (NA) aanduiding voor de gevoeligheidsvoorspelling van niveau 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de toepassing van de SeqAPASS-tool aan te tonen en nieuwe kenmerken te benadrukken, worden twee casestudy's beschreven die gevallen vertegenwoordigen waarin eiwitconservering voorspelt dat er verschillen zijn in chemische gevoeligheid tussen soorten (menselijke transthyretine) en dat er geen verschillen zijn (μ opioïde receptor [MOR]). Het eerste van deze voorbeelden behandelt eiwitsequentie/structurele vergelijkingen om het domein van toepasbaarheid voor ongunstige uitkomstroutes te voorspellen (AOP's, zie tabel 2 voor definitie), terwijl de tweede gericht is op het ontwikkelen van onderzoekshypothesen die relevant zijn voor de gevoeligheid van verschillende soorten voor opioïden die aanwezig zijn in afvalwater. De basisbenaderingen die in deze casestudy's worden beschreven, kunnen op elke chemische stof worden toegepast en tonen het brede nut van deze tool voor besluitvorming en onderzoek aan.

Schildklierhormonen zijn essentieel voor normale groei en ontwikkeling. Ze worden gesynthetiseerd in de schildklier en uitgescheiden in de bloedbaan waar ze binden aan distributie-eiwitten en worden door het lichaam gecirculeerd 14,15,16,17,18. Recente studies hebben aangetoond dat milieuverontreinigende stoffen, zoals polychloorbifenylen (PCB's), polybroomdifenylethers (PBDE's) en per- en polyfluoralkylstoffen (PFAS), concurrerend kunnen binden aan het distributie-eiwit transthyretine (TTR) en normale schildklierprocessen kunnen verstoren 19,20,21,22,23,24,25 . Er is een AOP ontwikkeld die de competitieve binding aan TTR beschrijft, wat leidt tot menselijke neurologische ontwikkelingstoxiciteit (https://aopwiki.org/aops/152). Hoewel er aanwijzingen zijn dat deze AOP ook van toepassing is op knaagdieren, moet de toepasbaarheid op andere taxonomische groepen nog worden gedefinieerd. Aangezien TTR-bindende chemicaliën in het milieu aanwezig zijn, is het belangrijk om de taxonomische relevantie van deze AOP te begrijpen, een uitdaging die gedeeltelijk kan worden aangepakt door SeqAPASS-analyse. Met behulp van de probleemformuleringsstrategie van de tool kan het doel van de analyse als volgt worden geformuleerd: Met de wetenschap dat TTR-bindende verbindingen leiden tot nadelige uitkomsten bij mensen, welke taxonomische groepen zouden worden voorspeld om vergelijkbare gevoeligheid te delen?

Het menselijke transthyretine-eiwit is goed gekarakteriseerd en er zijn verschillende goed bestudeerde liganden waarvan bekend is dat ze binden op de menselijke TTR (hTTR) bindingsplaats, waardoor het een optimaal doelwit is voor SeqAPASS-analyse 8,9,13. Met behulp van de NCBI-toetreding voor humane transthyretine, P02766.1, werd een niveau 1-analyse uitgevoerd met standaardinstellingen. De resultaten van de niveau 1-analyse stelden de procentuele gelijkenisgrens op 49%, waarbij zoogdieren (Mammalia), vogels (Aves), reptielen (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), amfibieën (Amphibia) en de meeste vissoorten (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) boven deze cutoff vielen (figuur 3). Alle soorten uit deze taxonomische groepen resulteerden dus in een gevoeligheidsvoorspelling van "Y" (d.w.z. ja) en zijn waarschijnlijk gevoelig voor chemicaliën waarvan bekend is dat ze interageren met hTTR (figuur 3 en aanvullend bestand 1).

Voor de niveau 2-beoordeling van functionele domein(en) werd de NCBI Conserved Domain Database gebruikt om TR_THY (toetreding smart00095) te identificeren als een geconserveerd domein dat de volwassen keten van het TTR-subeenheideiwit van residuen 27 tot 147 omvat. Aangezien de eiwitsequentie van TTR gerapporteerd in NCBI een presegment van 20 aminozuren bevat dat niet relevant is voor de huidige analyse, biedt het focussen van de vergelijking op de volwassen keten een extra, meer specifieke, bewijslijn voor het behoud van dit eiwit voor alle soorten. Uit de niveau 2-evaluatie werd een procentuele gelijkenisafsluiting van 58% gemeld, waarbij zoogdieren, vogels, reptielen, amfibieën en de meeste vissoorten opnieuw boven deze afsnijding vielen (figuur 4). Bijgevolg concludeerde SeqAPASS een gevoeligheidsvoorspelling van "Y" (d.w.z. ja) voor soorten uit deze taxonomische groepen, wat aangeeft dat ze waarschijnlijk gevoelig zijn voor chemicaliën die interageren met het hTTR-eiwit (figuur 4 en aanvullend bestand 1). Over het algemeen suggereren de resultaten van niveau 1- en niveau 2-analyses dat de meeste gewervelde soorten het behoud van de hTTR delen en waarschijnlijk vatbaar zijn voor chemicaliën waarvan bekend is dat ze met dit eiwit interageren.

Figure 3
Figuur 3: SeqAPASS Niveau 1 analyse van transthyretine conservering over taxonomische groepen met beschikbare sequentie-informatie ten opzichte van het menselijk eiwit. Procentuele gelijkenis van de eiwit aminozuursequentie wordt weergegeven op de Y-as; taxonomische groep wordt weergegeven op de X-as. Open cirkels (○) geven de queryvolgorde aan en gesloten cirkels (●) geven de soort binnen de taxonomische groep aan met de hoogste procentuele gelijkenis. Binnen de plot vertegenwoordigen de boven- en onderkant van elk vak de75e en25e percentielen, de snorharen strekken zich uit tot 1,5 keer het interkwartielbereik en de gemiddelde en mediane waarden worden weergegeven door horizontale zwarte lijnen op de doos. De stippellijn geeft de cutoff aan voor gevoeligheidsvoorspellingen. Afkortingen: TTR = transthyretin; SeqAPASS = Sequentie-uitlijning om de gevoeligheid van verschillende soorten te voorspellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: SeqAPASS Niveau 2 analyse van de transthyretine receptor ligand-binding domeinbehoud over taxonomische groepen met beschikbare sequentie-informatie ten opzichte van het menselijk eiwit LBD. Procentuele gelijkenis van de ligandbindende domein aminozuursequentie wordt weergegeven op de Y-as; taxonomische groep wordt weergegeven op de X-as. Open cirkels (○) geven de queryvolgorde aan en gesloten cirkels (●) geven de soort binnen de taxonomische groep aan met de hoogste procentuele gelijkenis. Binnen de plot vertegenwoordigen de boven- en onderkant van elk vak de75e en25e percentielen, de snorharen strekken zich uit tot 1,5 keer het interkwartielbereik en de gemiddelde en mediane waarden worden weergegeven door horizontale zwarte lijnen op de doos. De stippellijn geeft de cutoff aan voor gevoeligheidsvoorspellingen. Afkortingen: TTR = transthyretin; SeqAPASS = Sequentie-uitlijning om de gevoeligheid van verschillende soorten te voorspellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Door de analyse van moleculaire modellerings- en eiwitkristallografiestudies werden aminozuren geïdentificeerd in het bindingsgebied van TTR waarvan wordt voorspeld dat ze interageren met het endogene ligand 3,3′,5,5′-tetraiodo-L-thyronine (T4, PDB 2ROX), evenals drie milieuchemicaliën: perfluoroctaansulfonaat (PFOS, PDB 5JIM), tetrabroombisfenol A (TBBPA, PDB 5HJG) en diethylstilbestrol (DES, PDB 1TZ8)19, 21,22,26. De aminozuurresiduen Lys35, Ser137, Leu130, Ala128, Ala129 en Thr139 werden allemaal geïdentificeerd als een sleutelrol in eiwit-ligandinteracties, hetzij door directe waterstofbrugverbindingen of van der Waals-interacties. Deze zes aminozuurresiduen werden geëvalueerd in een niveau 3-analyse voor verschillende soorten met hTTR als sjabloonsequentie en exclusief niet-homologe, hypothetische, partiële en lage kwaliteit sequenties (supplementair bestand 1). Omdat eerder werd vastgesteld dat TTR alleen wordt geconserveerd voor gewervelde soorten, werden ongewervelde soorten uitgesloten van deze analyse (figuur 3 en figuur 4). Bovendien is het belangrijk op te merken dat aminozuurposities die in de literatuur worden gerapporteerd, een presegment van 20 aminozuren uitsluiten dat afwezig is in het volwassen hTTR-eiwit en om deze reden werden de posities die in niveau 3 werden ingediend, aangepast aan die gerapporteerd in de literatuur om een nauwkeurige afstemming op het geselecteerde sjablooneiwit15 (aanvullend bestand 1) te garanderen.

In de niveau 3-analyse van TTR werden 294 gewervelde soorten geselecteerd voor uitlijning (zoogdieren, vogels, amfibieën, reptielen en vissen). Van de geëvalueerde soorten vertoonden 18 verschillen in belangrijke aminozuren, wat resulteerde in een gevoeligheidsvoorspelling van "N" (d.w.z. nee). Interessant is dat vijf soorten zeezoogdieren een aminozuursubstitutie vertoonden op positie 2 (128A), terwijl vier vissoorten substituties vertoonden op positie 2 (128A) of positie 6 (139T) (figuur 5). Aangezien deze aminozuren een belangrijke rol spelen in eiwit-ligandinteracties in het bindingskanaal van TTR, suggereren deze gegevens dat TTR-liganden bij deze soorten anders kunnen interageren en zouden resulteren in verschillende chemische gevoeligheid ten opzichte van mensen.

Figure 5
Figuur 5: SeqAPASS niveau 3-analyse van de instandhouding van aminozuurresiduen die belangrijk zijn voor TTR-chemische binding. (A) Overzichtstabel van niveau 3 met het aantal soorten met beschikbare sequentiegegevens voor alle taxonomische groepen, het aantal soorten waarvan wordt voorspeld dat ze op vergelijkbare wijze vatbaar zijn (Y) en het aantal soorten waarvan wordt voorspeld dat ze niet vergelijkbaar vatbaar zijn (N). (B) Heatmap van niveau 3 met geselecteerde soorten waarvan wordt voorspeld dat ze niet op dezelfde manier vatbaar zijn ten opzichte van het menselijke transthyretine TTR-eiwit, met volledige, gedeeltelijke en niet-overeenkomende aminozuren. Afkortingen: TTR = transthyretin; SeqAPASS = Sequentie-uitlijning om de gevoeligheid van verschillende soorten te voorspellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Als reactie op feedback van belanghebbenden en gebruikers zijn nieuwe functies ontworpen en opgenomen in de SeqAPASS-tool, waaronder de mogelijkheid om verbinding te maken met empirische gegevens voor verschillende toepassingen. De interoperabiliteit van deze tool met de ECOTOX-kennisbank (tabel 1) werd bereikt door zowel externe links in te bedden in de niveau 1- en niveau 2-gegevenstabellen voor toetredingen die aanwezig zijn in ECOTOX als door een ECOTOX-widget in het gereedschap te creëren om rechtstreeks te filteren op de meest relevante toxiciteitsgegevens in ECOTOX. Via de links en de widget kunnen gebruikers snel ECOTOX opvragen en overeenkomstige toxiciteitsgegevens verzamelen voor soorten met SeqAPASS-gevoeligheidsvoorspellingen. Momenteel zijn SeqAPASS-voorspellingen verbonden met ECOTOX via een chemische stressor en soorten; toxiciteitsgegevens zijn echter nog niet gekoppeld aan specifieke genen/eiwitten, wat directe verbindingen met de specifieke eindpunten/moleculaire doelwitten van belang in SeqAPASS mogelijk zou maken. Hoewel het koppelen van voorspellingen aan toxiciteitsgegevens op basis van een chemische stressor niet ideaal is, omdat gegevens mogelijk niet specifiek zijn voor een bepaalde route, is het leggen van een verband om resultaten samen te brengen de eerste stap. Als eerste iteratie van een SeqAPASS-ECOTOX-integratie biedt de huidige aanpak gebruikers alle beschikbare toxiciteitsgegevens voor de chemische stressor(s) en soorten op een breed niveau. Deze gegevens, in combinatie met SeqAPASS-voorspellingen, kunnen context bieden op brede niveaus (gewervelde dieren versus ongewervelde dieren) en kunnen worden beschouwd binnen de context van het AOP-raamwerk.

TTR presenteert een goed voorbeeld voor het onderzoeken van dit verband, aangezien de bestaande AOP (AOP 152) context biedt voor het interpreteren van potentieel relevante ECOTOX-toxiciteitsgegevens. Beginnend met de liganden onderzocht in SeqAPASS niveau 3, werden milieutoxiciteitsgegevens verzameld over soorten voor vier chemicaliën waarvan bekend is dat ze interageren met het TTR-ligandbindingsdomein (diethylstilbestrol [DES], perfluorohexaanzuur [PFHxA], perfluoroctaansulfonaat [PFOS] en tetrabroombisfenol A [TBBPA])19,21,23,24 . Voor elke chemische stof werd ECOTOX opgevraagd naar aquatische en terrestrische gegevens door het CAS-nummer (Chemical Abstracts Service) met behulp van aangepaste zoekparameters (Supplemental File 1). Gegevens werden gefilterd op soortengroepen van belang (amfibieën, vogels, vissen, ongewervelde dieren, zoogdieren, reptielen). Binnen de gefilterde queryresultaten werd een gemiddelde van de minimale en maximale effectconcentraties van het onderzoek berekend en geïmplementeerd als een benadering voor het gemiddelde voor treffers die geen gemiddelde effectconcentratiewaarde rapporteerden (figuur 6A en aanvullend bestand 1). Binnen de context van een enkele chemische stof werden Kruskal-Wallis-tests uitgevoerd om de gemiddelde effectconcentraties van verschillende taxonomische groepen te vergelijken, omdat de gegevens niet voldeden aan de aannames van de ANOVA-test. Post-hoc paarsgewijze vergelijkingstests werden vervolgens uitgevoerd met behulp van de Dunn's Test voor alle chemicaliën, omdat de taxonomische groepen bestonden uit ongelijke steekproefgroottes. Aquatische en terrestrische resultaten werden afzonderlijk geanalyseerd, omdat gegevens tussen de twee soorten blootstellingen niet direct vergelijkbaar zijn. Binnen ECOTOX waren aquatische toxiciteitsgegevens voor de geselecteerde chemicaliën beschikbaar voor amfibieën, vogels, ongewervelde dieren en vissoorten (figuur 6A). Terrestrische toxiciteitsgegevens voor de geselecteerde chemische stoffen waren alleen beschikbaar voor zoogdieren en DES (aanvullend dossier 1).

Figure 6
Figuur 6: SeqAPASS-resultaten koppelen aan empirische gegevens. (A) Gemiddelde effectconcentraties tussen taxonomische groepen met gegevens die beschikbaar zijn in de ECOTOXicology-kennisbank voor geselecteerde chemicaliën waarvan bekend is dat ze binden aan het menselijke TTR-eiwit. B) Overlapping in het aantal soorten dat in elke SeqAPASS-analyse is opgenomen met de soorten waarvoor ECOTOX-gegevens beschikbaar waren. In deelvenster A geven haakjes langs de x-as het aantal querytreffers aan waarvoor gegevens zijn samengevoegd. Asterisken duiden op paren met significant verschillende effectconcentraties tussen soortengroepen in de context van een enkele chemische stof (Dunn's test, p < 0,05), waarbij hogere aantallen sterretjes wijzen op sterkere significantieniveaus (*: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001; ****: p < 0,0001). De middellijnen in elk vak vertegenwoordigen de mediaan, met vakranden die het interkwartielbereik aangeven. De snorharen strekken zich uit tot 1,5 keer het interkwartielbereik. Uitschieters die buiten dat bereik vallen, worden weergegeven als individuele punten. Afkortingen: TTR = transthyretin; SeqAPASS = Sequentie-uitlijning om de gevoeligheid van verschillende soorten te voorspellen; ECOTOX = ECOTOXicologie kennisbank. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Over het geheel genomen suggereren deze gegevens dat bioactiviteit voor de beoordeelde chemische stoffen voorkomt bij gewervelde soorten, maar niet bij ongewervelde dieren. Hoewel het gebrek aan biologische doel- en route-informatie in ECOTOX het onmogelijk maakt om deze empirische gegevens rechtstreeks aan TTR te koppelen, ondersteunen deze resultaten de SeqAPASS-voorspellingen dat ongewervelde soorten geen gevoeligheid delen. Alle gewervelde soorten met beschikbare gegevens toonden gevoeligheid voor zowel PFOS als TBBPA, hoewel de gemiddelde effectconcentraties significant hoger waren bij vissen en vogels dan bij amfibieën. Deze gegevens suggereren potentiële verschillen in gevoeligheid tussen taxonomische groepen die kunnen worden toegeschreven aan biologische pathway-verschillen (inclusief TTR). Het is opmerkelijk dat andere variabelen zoals metabolisme en uitscheiding ook een rol kunnen spelen bij verschillen in gevoeligheid. Voor PFHxA en PFOS bleken vissen significant gevoeliger te zijn dan zowel ongewervelde dieren als vogels, en voor DES presenteerden amfibieën zich met significant hogere gemiddelde effectconcentraties dan ongewervelde dieren. Nogmaals, deze gegevens ondersteunen onze SeqAPASS-voorspelling dat ongewervelde dieren niet gevoelig zijn voor gewervelde soorten. Van alle soorten die met behulp van deze tool werden beoordeeld en waarvoor TTR-sequentiegegevens beschikbaar waren, had slechts een klein aantal overeenkomstige ECOTOX-gegevens voor de vier chemische stoffen van belang (figuur 6B, aanvullende tabel S1 en aanvullende tabel S2). Voor die soorten zonder apicale gegevens voegen SeqAPASS-voorspellingen van gevoeligheid extra bewijslijnen toe dat verwante soorten zich op dezelfde manier kunnen gedragen als die met apicale gegevens. Gegevens voor alle SeqAPASS- en ECOTOX-analyses zijn beschikbaar in aanvullend bestand 1.

Volgens de Centers for Disease Control and Prevention (CDC) droegen opioïden in 2017 bij aan ongeveer 47.600 sterfgevallen door een overdosis in de Verenigde Staten, een aantal dat blijft stijgen27. Afvalwaterinstallaties in de VS worden nationaal gereguleerd door het National Pollutant Discharge Elimination System van het Amerikaanse Environmental Protection Agency, dat geen tests vereist voor opioïden of andere geneesmiddelen bij hun lozing28. In de afgelopen jaren is er een poging gedaan om op afvalwater gebaseerde epidemiologie te gebruiken als een hulpmiddel om het gebruik van opioïden in de gemeenschap in kaart te brengen. Opioïdenmonitoringsinspanningen hebben concentraties gedetecteerd die oplopen tot 1,27 μg / L in afvalwater en 0,7 μg / L inoppervlaktewateren 29,30. Recente toxiciteitsstudies die het effect van blootstelling aan opioïden op vissen beoordelen, hebben de ontwikkeling van verslavend gedrag en nadelige immunologische effecten gemeld (bijv. Hogere infectiepercentages, downregulatie van immuungenen)31,32,33. Over het algemeen suggereren deze studies dat er potentieel is voor nadelige blootstelling aan opioïden in het milieu en benadrukken ze het belang van het begrijpen van het risico dat deze chemicaliën vormen voor aquatische soorten. Gezien het scala aan soorten dat deze verbindingen in het milieu kan tegenkomen, kan het identificeren van potentieel gevoelige soorten met behulp van SeqAPASS belangrijk zijn voor de prioritering van test- of monitoringinspanningen.

De MOR vormt het belangrijkste opioïde doelwit voor het beheer van pijn en is verantwoordelijk voor de krachtige pijnstillende en verslavende eigenschappen van opiaatalkaloïden bij mensen34,35. Vanwege het belang van deze receptor voor de menselijke gezondheid zijn MOR-liganden bekend en zijn er hoogwaardige röntgenkristallografiestudies beschikbaar, waardoor dit doelwit ideaal is voor SeqAPASS-analyse 8,9,13. Met behulp van de NCBI-toetreding voor menselijke μ opioïde receptor, ACM90349.1, werd een niveau 1-analyse uitgevoerd met behulp van standaardinstellingen. De gevoeligheidsgrens werd vastgesteld op 55% voor niveau 1, met procentuele overeenkomsten voor zoogdieren (Mammalia), vogels (Aves), reptielen (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), amfibieën (Amphibia) en de meeste vissoorten (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) die boven deze grens vallen; daarom resulteerden soorten uit deze taxonomische groepen in een gevoeligheidsvoorspelling van "Y" (d.w.z. ja), wat aangeeft dat ze waarschijnlijk gevoelig zouden zijn voor chemicaliën waarvan bekend is dat ze interageren met menselijke MOR (figuur 7 en aanvullend bestand 1). Met behulp van de NCBI Conserved Domain Database werd 7tmA_Mu_opioid_R geïdentificeerd (toetreding cd15090) als een functioneel domein dat alle zeven helices van het MOR-eiwit van 133 tot 411 omvat, inclusief een vermeende ligandbindingsplaats. Vergeleken met niveau 1 identificeerden de resultaten van niveau 2 een hogere gevoeligheidsafsnijding van 88% gelijkenis, met zoogdieren, vogels, reptielen, amfibieën en de meeste vissoorten die boven deze afsnijding werden gevonden en resulterend in een gevoeligheidsvoorspelling van "Y" voor ja (figuur 8). Over het algemeen suggereren de resultaten van niveau 1- en niveau 2-analyses dat de meeste gewervelde soorten het behoud van de MOR delen en waarschijnlijk gevoelig zijn voor chemicaliën waarvan bekend is dat ze interageren met menselijke MOR.

Figure 7
Figuur 7: SeqAPASS Niveau 1 analyse van μ opioïde receptor behoud over taxonomische groepen met beschikbare sequentie-informatie ten opzichte van het menselijk eiwit. Procentuele gelijkenis van de eiwit aminozuursequentie wordt weergegeven op de Y-as; taxonomische groep wordt weergegeven op de X-as. Open cirkels (○) geven de queryvolgorde aan en gesloten cirkels (●) geven de soort binnen de taxonomische groep aan met de hoogste procentuele gelijkenis. Binnen de plot vertegenwoordigen de boven- en onderkant van elk vak het 75e en 25e percentiel, de snorharen strekken zich uit tot 1,5 keer het interkwartielbereik en de gemiddelde en mediane waarden worden weergegeven door horizontale zwarte lijnen op de doos. De stippellijn geeft de cutoff aan voor gevoeligheidsvoorspellingen. Afkortingen: MOR = mu-opioïde receptor; SeqAPASS = Sequentie-uitlijning om de gevoeligheid van verschillende soorten te voorspellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: SeqAPASS Niveau 2 analyse van de μ opioïde receptor ligand-bindende domeinbehoud ten opzichte van het domein in het menselijk eiwit. Procentuele gelijkenis van de ligandbindende domein aminozuursequentie wordt weergegeven op de Y-as; taxonomische groep wordt weergegeven op de X-as. Open cirkels (○) geven de queryvolgorde aan en gesloten cirkels (●) geven de soort binnen de taxonomische groep aan met de hoogste procentuele gelijkenis. Binnen de plot vertegenwoordigen de boven- en onderkant van elk vak het 75e en 25e percentiel, de snorharen strekken zich uit tot 1,5 keer het interkwartielbereik en de gemiddelde en mediane waarden worden weergegeven door horizontale zwarte lijnen op de doos. De stippellijn geeft de cutoff aan voor gevoeligheidsvoorspellingen. Afkortingen: MOR = mu-opioïde receptor; SeqAPASS = Sequentie-uitlijning om de gevoeligheid van verschillende soorten te voorspellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Door analyse van moleculaire modellering en eiwitkristallografiestudies werden aminozuren geïdentificeerd in het bindingsgebied van MOR waarvan wordt voorspeld dat ze interageren met bekende liganden. Hoewel de diverse set liganden die goed binden aan opioïde receptoren resulteert in complexe farmacologie, worden enkele consistente ligand-eiwitinteracties waargenomen36,37. Op basis van moleculaire koppeling aan verschillende MOR-kristalstructuren, zowel morfine als fentanyl, interageren MOR-agonisten met hoge affiniteit met D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322 en Y32636,38. Residuen D147, Y148, M151 en H297 zijn ook betrokken bij kristalstructuren van MOR gebonden aan de morfine-agonist BU72, terwijl D147, M151, H297 en Y326 ook van cruciaal belang zijn bij de binding aan de onomkeerbare morfine-antagonist β-funaltrexamine37. Gezien deze bewijslijnen werden negen residuen geselecteerd (D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322, Y326) voor niveau 3-evaluatie met behulp van menselijke MOR als sjabloonsequentie en exclusief gedeeltelijke, voorspelde, hypothetische en sequenties van lage kwaliteit. Belangrijk is dat aminozuurposities die in de literatuur worden gerapporteerd, een 64-aminozuursegment uitsluiten ten opzichte van de NCBI-eiwittoetreding en om deze reden werden posities in niveau 3 geselecteerd om die te vertegenwoordigen die in lijn waren met de sjabloonsequentie voor correcte uitlijningssequenties.

In de niveau 3-analyse van de menselijke MOR werden 284 soorten beoordeeld op gewervelde soorten (zoogdieren, vogels, amfibieën, reptielen en vissen). Over alle geëvalueerde soorten waren de negen aminozuren een totale match of een gedeeltelijke match op basis van side-chain classificatie en molecuulgewicht; bijgevolg resulteerden alle beoordeelde soorten in een gevoeligheidsvoorspelling van "Y" voor ja (tabel 3 en aanvullend dossier 1). Omdat deze aminozuren belangrijk zijn bij de binding van zowel sterke MOR-agonisten als sterke antagonisten, suggereren deze gegevens dat opioïde verbindingen gericht op menselijke μ opioïde receptoren op dezelfde manier kunnen interageren met receptoren in gewervelde soorten. Hoewel er tot op heden weinig empirische gegevens beschikbaar zijn binnen de ECOTOX-kennisbank voor opioïde verbindingen, suggereren verschillende studies dat vissen waarschijnlijk vatbaar zijnvoor 31,32,33. Over het algemeen wijzen de resultaten van SeqAPASS op het potentieel voor bredere milieueffecten van MOR-modulerende chemicaliën voor verschillende soorten, wat aangeeft dat meer onderzoek en misschien monitoring waardevol kan zijn. Gegevens voor alle analyses zijn beschikbaar in Aanvullend Dossier 1.

Tabel 3: SeqAPASS Niveau 3 analyse van het behoud van aminozuurresiduen die belangrijk zijn voor chemische binding aan de μ opioïde receptor. Overzichtstabel met het aantal soorten met beschikbare sequentiegegevens over alle taxonomische groepen, het aantal soorten waarvan wordt voorspeld dat ze vergelijkbaar vatbaar zijn (Y) en het aantal soorten waarvan wordt voorspeld dat ze niet vergelijkbaar vatbaar zijn, evenals volledige, gedeeltelijke en niet-overeenkomende aminozuren. Afkorting: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel S1: Soorten met beschikbare ECOTOX-gegevens voor de vier chemische stoffen waarvan bekend is dat ze binden aan het menselijke transthyretine-eiwit. De beschikbare gegevens voor elke chemische stof zijn afgestemd op SeqAPASS-voorspellingen van vergelijkbare gevoeligheid op niveau 1, 2 en 3. Alle SeqAPASS voorspellingen ten opzichte van de humane transthyretine sequentie. Afkortingen: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility; DES = diethylstilbestrol; PFHxA = perfluorexaanzuur; PFOS = perfluoroctaansulfonzuur; TBBPA = tetrabroombisfenol A. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel S2: Totaal aantal soorten met beschikbare gegevens over SeqAPASS- en ECOTOX-evaluaties voor geselecteerde chemicaliën waarvan bekend is dat ze binden aan het menselijke transthyretine-eiwit. SeqAPASS biedt middelen voor het voorspellen van de gevoeligheid van soorten voor veel soorten waarvoor empirische toxiciteitsgegevens niet beschikbaar zijn. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: SeqAPASS- en ECOTOX-gegevens voor alle representatieve resultaten. Bestand bevat ToC gevolgd door de volgende gegevensbladen: Tab 1-hTTR SeqAPASS Resultaten Niveau 1, Tab 2-hTTR SeqAPASS Resultaten Niveau 2, Tab 3-hTTR SeqAPASS Resultaten Niveau 3, Tab 4-EcoTox gegevens voor DES, Tab 5-EcoTox gegevens voor PFOS, Tab 6-EcoTox gegevens voor PFHxA, Tab 7-EcoTox gegevens voor TBBPA, Tab 8-EcoTox Groep Gemiddelde Berekeningen, Tabblad 9-SeqAPASS EcoTox-gegevensvergelijkingen, tabblad 10-hMOR SeqAPASS-resultaten niveau 1, tabblad 11-hMOR SeqAPASS-resultaten niveau 2 en tabblad 12-μ-hMOR SeqAPASS-resultaten niveau 3. Afkortingen: SeqAPASS = Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility; ToC = Inhoudsopgave; hTTR = humane transthyretine; ECOTOX = Ecotoxicologie kennisbank; DES = diethylstilbestrol; PFOS = perfluoroctaansulfonzuur; PFHxA = perfluorexaanzuur; TBBPA = tetrabroombisfenol A; hMOR = menselijke mu-opioïde receptor. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er is wijdverspreide erkenning dat het niet haalbaar is om voldoende soorten empirisch te testen om de genomische, fenotypische, fysiologische en gedragsdiversiteit van levende organismen vast te leggen die kunnen worden blootgesteld aan chemicaliën van toxicologisch belang. Het doel van SeqAPASS is om het gebruik van bestaande en voortdurend uitbreidende eiwitsequentie en structurele gegevens te maximaliseren om de extrapolatie van chemische toxiciteitsgegevens / kennis van geteste organismen naar honderden of duizenden andere soorten te helpen en te informeren door vergelijkingen op moleculair niveau. De SeqAPASS-tool is ontworpen om de complexiteit van eiwitsequentievergelijkingen voor wetenschappers, risicobeoordelaars en regelgevers te verminderen door middel van een gestroomlijnde en snelle analyse die transparant gegenereerde en downloadbare overzichtstabellen, interactieve gegevensvisualisaties en de eenvoudige identificatie van bedreigde en bedreigde soorten omvat, evenals gemeenschappelijke modelorganismen. Protocollen worden hier beschreven om SeqAPASS-niveaus 1, 2 en 3 uit te voeren voor de evaluatie van de gelijkenis van primaire aminozuursequenties, functioneel domeinbehoud en kritieke aminozuren die betrokken zijn bij interacties tussen chemicaliën en eiwitten en eiwitten. Bewijslijnen verzameld uit elk niveau van SeqAPASS-analyse voorspellen chemische gevoeligheid tussen soorten, waardoor consistente en gemakkelijk interpreteerbare gegevens worden verkregen. Tot op heden is dit instrument gebruikt in een breed scala van toepassingen, waaronder de identificatie van chemicaliën die binden aan bepaalde receptoren en het beoordelen van het read-across potentieel voor gewervelde ecologische receptoren met zoogdiersystemen. Daarnaast worden hier twee casestudy's gericht op het schildklierhormoonverdelingseiwit, TTR en de MOR beschreven om de nieuwe functies en functionaliteit van SeqAPASS v2 tot en met v6 te demonstreren.

Zoals bij elke computationele benadering, is het vermogen om voorspellingen van soortgevoeligheid te genereren binnen de SeqAPASS-tool sterk afhankelijk van de invoer van geschikte parameters 8,9,13. Het is daarom van cruciaal belang dat, voorafgaand aan het uitvoeren van een analyse, een probleemformuleringsstap wordt uitgevoerd om bestaande gegevens en literatuur te onderzoeken op het beoogde doel. Door een analyse te starten met kennis van het eiwitdoel, kan de gebruiker de juiste eiwittoetredingsgetallen en hoogwaardige sequenties identificeren. Evenzo zorgt kennis van een gevoelige of doelsoort of van modelorganismen die worden gebruikt bij assays of AOP-ontwikkeling ervoor dat een geschikte querysoort wordt geselecteerd waarmee alle andere soorten worden vergeleken. Het selecteren van functionele domeinen voor niveau 2 en kritische aminozuurresiduen voor niveau 3 zijn ook kritieke stappen waarvoor de gebruiker de juiste invoerparameters moet identificeren om voorspellingen te genereren. Vanwege deze behoefte aan reeds bestaande kennis van een interactie tussen chemische en eiwit, integreren recente versieversies van de SeqAPASS-tool gebruiksvriendelijke bronnen die zijn ontworpen om gebruikers te helpen relevante informatie te vinden voor het initiëren van een zoekopdracht (bijv. links naar andere tools) (tabel 2 en figuur 2). Bovendien zijn pop-upinformatieberichten en waarschuwingen in de tool geïntegreerd om de gebruiker door de analyse te leiden en de gebruiker te informeren over eventuele fouten die moeten worden opgelost.

De complexiteit van chemisch-biologische interacties vormt een beperking van de SeqAPASS-tool. Bij het extrapoleren van toxiciteitsgegevens tussen soorten, is het behoud van het moleculaire doelwit een van de vele factoren waarmee rekening moet worden gehouden. De adsorptie, distributie, metabolisme en uitscheiding (ADME) van een chemische stof is cruciaal bij het overwegen van chemische toxiciteit, omdat chemicaliën door deze processen kunnen worden geactiveerd of ontgift39,40. Andere factoren, zoals de route van chemische blootstelling, de levensfase en de levensgeschiedenis van organismen, en het dieet, kunnen ook een belangrijke rol spelen bij het bepalen van de chemische gevoeligheid voor soortenen 41,42. Om deze beperking aan te pakken, is het belangrijk om de belangrijkste vraag te begrijpen die SeqAPASS stelt bij het voorspellen van chemische gevoeligheid: is het waarschijnlijk dat het eiwitdoel van een chemische stof aanwezig is in een andere soort voor de chemische stof om op te reageren? Deze vraag wordt beantwoord door orthologe kandidaten te identificeren en rekening te houden met het behoud van dat doel voor alle soorten ten opzichte van een bekende gevoelige of doelsoort. Deze informatie kan worden gebruikt als een bewijslijn voor extrapolatie tussen soorten en worden geïntegreerd in andere bewijsstromen (bijvoorbeeld het potentieel voor blootstelling) om de gevoeligheid van soorten voor chemische stressoren beter te begrijpen. Updates voor SeqAPASS bevatten geïntegreerde koppelingen naar externe tools, waaronder de Amerikaanse EPA ECOTOX-kennisbank43 en het US Fish & Wildlife Service Environmental Conservation Online System (ECOS)44. Verbinding met deze databases biedt SeqAPASS-gebruikers eenvoudige toegang tot empirische chemische toxiciteitsgegevens voor vergelijking met op sequentie gebaseerde voorspellingen en een middel om soorten te identificeren die mogelijk een beschermde status hebben.

De SeqAPASS-tool biedt een wetenschappelijk onderbouwd platform voor computationele voorspellingen van intrinsieke gevoeligheid die worden ondersteund door concepten in de evolutiebiologie en casusvoorbeelden die voorspellingen vergelijken met beschikbare empirische resultaten. Daarnaast is SeqAPASS gratis en openbaar beschikbaar op een goed ondersteund webgebaseerd platform dat breed toegankelijk is (https://seqapass.epa.gov/seqapass/). Omdat deze tool gebruik maakt van sequentiegegevens en eiwitinformatie uit bestaande databases, verbetert het vermogen om chemische gevoeligheid in een bredere diversiteit van soorten te voorspellen voortdurend naarmate de sequencingtechnologie vordert en de genomen van nieuwe soorten worden gesequenced en geannoteerd. Hoewel dit duidelijke voordelen biedt met betrekking tot de beschikbaarheid van gegevens, biedt het ook een beperking in die zin dat openbaar beschikbare sequentie-informatie onderhevig kan zijn aan inconsistente kwaliteit, slechte annotatie en onvolledigheid van eiwitsequenties voor sommige soorten. Het is echter veelbelovend dat omics-technologieën en -methoden in de bio-informatica snel vooruitgaan en daarom zullen sequentiecuratie en -kwaliteit waarschijnlijk in de loop van de tijd blijven verbeteren.

Een belangrijk doel van de SeqAPASS-tool is transparantie, die toegang biedt in de vorm van links naar alle gegevensbronnen en tools die in de backend zijn geïntegreerd. Deze transparantie biedt de gebruiker snelle toegang tot de oorspronkelijke bronnen van de reeks of taxonomische informatie van NCBI. Het domein van toepasbaarheid voor deze tool wordt gedefinieerd door de informatie die nodig is om een zinvolle analyse uit te voeren. Aangezien kennis van een chemisch-eiwit- of eiwit-eiwitinteractie in een bekende gevoelige of doelsoort sleutelelementen zijn om een zoekopdracht te starten, moet worden erkend dat zoekopdrachten die zonder deze informatie worden uitgevoerd, niet zinvol zijn. Bovendien vormen chemicaliën die meerdere ongedefinieerde biologische doelen hebben of interageren met verschillende doelen met verschillende potentieniveaus ook een uitdaging en beperking van het hulpmiddel in zijn huidige vorm. Verwacht wordt dat, met verbeterde bioinformatica, computationele modellering en celgebaseerde, high-throughput screening en transcriptomics, meer kennis over de diversiteit van de chemische ruimte met betrekking tot interacties met specifieke eiwitten zal blijven worden opgehelderd. Verwacht wordt dat het vermogen om SeqAPASS toe te passen op bredere uitdagingen van de extrapolatie van soorten, met betrekking tot het begrijpen van het potentieel voor nadelige chemische effecten in de diversiteit van soorten, zal blijven verbeteren.

Kortom, de SeqAPASS-tool is een toegankelijk platform dat gemakkelijk moleculaire informatie toepast om de aanzienlijke uitdaging van cross-species extrapolatie in chemische veiligheidsevaluaties aan te pakken. Hoewel de hier gemarkeerde voorbeelden gericht zijn op het genereren van voorspellingen van chemische gevoeligheid, kunnen de resultaten ook helpen bij het begrijpen van het algehele behoud van biologische routes. Door verschillende bewijslijnen samen te brengen en de toegang tot meerdere platforms en databases te vergemakkelijken, helpt deze tool transparante cases te bouwen voor de prioritering van chemische testen en toewijzing van middelen. Met de voortdurende ontwikkeling van wetenschappelijke en bioinformatische capaciteiten, zullen de kracht en het nut van de tool blijven groeien en verbeteren om te voldoen aan de behoeften van onderzoeks- en regelgevende gemeenschappen, terwijl de middelen die nodig zijn voor beoordelingen van verschillende soorten worden verminderd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Dr. Daniel L. Villeneuve (U.S. EPA, Center for Computational Toxicology and Exposure) en Dr. Jon A. Doering (Department of Environmental Sciences, Louisiana State University) voor het geven van commentaar op een eerdere versie van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Amerikaanse Environmental Protection Agency. De standpunten in dit artikel zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen of het beleid van het Amerikaanse Environmental Protection Agency, noch duidt de vermelding van handelsnamen of commerciële producten op goedkeuring door de federale overheid.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spreadsheet program N/A N/A Any program that can be used to view and work with csv files (e.g. Microsoft Excel, OpenOffice Calc, Google Docs) can be used to access data export files.
Basic computing setup and internet access N/A N/A SeqAPASS is a free, online tool that can be easily used via an internet connection. No software downloads are required.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krewski, D., et al. Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13 (2-4), 51-138 (2010).
  2. Wang, Z., Walker, G. W., Muir, D. C. G., Nagatani-Yoshida, K. Toward a global understanding of chemical pollution: A first comprehensive analysis of national and regional chemical inventories. Environmental Science & Technology. 54 (5), 2575-2584 (2020).
  3. Brooks, B. W., et al. Toxicology advances for 21st century chemical pollution. One Earth. 2 (4), 312-316 (2020).
  4. Kostal, J., Voutchkova-Kostal, A. Going all in: A strategic investment in in silico toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (4), 880-888 (2020).
  5. Cheng, W., Doering, J. A., LaLone, C., Ng, C. Integrative computational approaches to inform relative bioaccumulation potential of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS) across species. Toxicology Sciences. 180 (2), 212-223 (2021).
  6. Kostich, M. S., Lazorchak, J. M. Risks to aquatic organisms posed by human pharmaceutical use. Science of the Total Environment. 389 (2-3), 329-339 (2008).
  7. Gunnarsson, L., Jauhiainen, A., Kristiansson, E., Nerman, O., Larsson, D. G. Evolutionary conservation of human drug targets in organisms used for environmental risk assessments. Environmental Science & Technology. 42 (15), 5807-5813 (2008).
  8. LaLone, C. A., et al. Evidence for cross species extrapolation of mammalian-based high-throughput screening assay results. Environmental Science & Technology. 52 (23), 13960-13971 (2018).
  9. LaLone, C. A., et al. Editor's highlight: Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS): A web-based tool for addressing the challenges of cross-species extrapolation of chemical toxicity. Toxicology Sciences. 153 (2), 228-245 (2016).
  10. Head, J. A., Hahn, M. E., Kennedy, S. W. Key amino acids in the aryl hydrocarbon receptor predict dioxin sensitivity in avian species. Environmental Science & Technology. 42 (19), 7535-7541 (2008).
  11. Bass, C., et al. Mutation of a nicotinic acetylcholine receptor β subunit is associated with resistance to neonicotinoid insecticides in the aphid Myzus persicae. BMC Neuroscience. 12, 51-51 (2011).
  12. Erdmanis, L., et al. Association of neonicotinoid insensitivity with a conserved residue in the loop d binding region of the tick nicotinic acetylcholine receptor. Biochemistry. 51 (23), 4627-4629 (2012).
  13. Doering, J. A., et al. et al. In silico site-directed mutagenesis informs species-specific predictions of chemical susceptibility derived from the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) tool. Toxicology Sciences. 166 (1), 131-145 (2018).
  14. Noyes, P. D., et al. Evaluating chemicals for thyroid disruption: Opportunities and challenges with in vitro testing and adverse outcome pathway approaches. Environmental Health Perspectives. 127 (9), 95001 (2019).
  15. Park, G. Y., Jamerlan, A., Shim, K. H., An, S. S. A. Diagnostic and treatment approaches involving transthyretin in amyloidogenic diseases. Int J Mol Sci. 20 (12), 2982 (2019).
  16. Rabah, S. A., Gowan, I. L., Pagnin, M., Osman, N., Richardson, S. J. Thyroid hormone distributor proteins during development in vertebrates. Front Endocrinol (Lausane). 10, 506 (2019).
  17. Richardson, S. J. Cell and molecular biology of transthyretin and thyroid hormones. International Review of Cytology. 258, 137-193 (2007).
  18. Yamauchi, K., Ishihara, A. Transthyretin and Endocrine Disruptors. Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure and Biological Functions. Richardson, S. J., Cody, V. , Springer. Berlin Heidelberg, Germany. 159-171 (2009).
  19. Iakovleva, I., et al. Tetrabromobisphenol A is an efficient stabilizer of the transthyretin tetramer. PLoS One. 11 (4), 0153529 (2016).
  20. Ishihara, A., Sawatsubashi, S., Yamauchi, K. Endocrine disrupting chemicals: Interference of thyroid hormone binding to transthyretins and to thyroid hormone receptors. Molecular and Cellular Endocrinology. 199 (1), 105-117 (2003).
  21. Kar, S., Sepúlveda, M. S., Roy, K., Leszczynski, J. Endocrine-disrupting activity of per- and polyfluoroalkyl substances: Exploring combined approaches of ligand and structure based modeling. Chemosphere. 184, 514-523 (2017).
  22. Morais-de-Sa, E., Pereira, P. J., Saraiva, M. J., Damas, A. M. The crystal structure of transthyretin in complex with diethylstilbestrol: A promising template for the design of amyloid inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 279 (51), 53483-53490 (2004).
  23. Morgado, I., Campinho, M. A., Costa, R., Jacinto, R., Power, D. M. Disruption of the thyroid system by diethylstilbestrol and ioxynil in the sea bream (Sparus aurata). Aquatic Toxicology. 92 (4), 271-280 (2009).
  24. Yamauchi, K., Prapunpoj, P., Richardson, S. J. Effect of diethylstilbestrol on thyroid hormone binding to amphibian transthyretins. General and Comparative Endocrinology. 119 (3), 329-339 (2000).
  25. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  26. Ren, X. M., et al. Binding interactions of perfluoroalkyl substances with thyroid hormone transport proteins and potential toxicological implications. Toxicology. 366-367, 32-42 (2016).
  27. Wilson, N., Mbabazi, K., Seth, P., Smith, H., Davis, N. L. Drug and opioid-involved overdose deaths - United States, 2017-2018. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (11), 290-297 (2020).
  28. EPA. National Pollutant Discharge Elimination System (NPDES). United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/npdes/npdes-resources (2018).
  29. Duvallet, C., Hayes, B. D., Erickson, T. B., Chai, P. R., Matus, M. Mapping community opioid exposure through wastewater-based epidemiology as a means to engage pharmacies in harm reduction efforts. Preventing Chronic Disease. 17, 200053 (2020).
  30. Gushgari, A. J., Venkatesan, A. K., Chen, J., Steele, J. C., Halden, R. U. Long-term tracking of opioid consumption in two United States cities using wastewater-based epidemiology approach. Water Research. 161, 171-180 (2019).
  31. Lau, B., Bretaud, S., Huang, Y., Lin, E., Guo, S. Dissociation of food and opiate preference by a genetic mutation in zebrafish. Genes Brain Behave. 5 (7), 497-505 (2006).
  32. Bossé, G. D., Peterson, R. T. Development of an opioid self-administration assay to study drug seeking in zebrafish. Behavioural Brain Research. 335, 158-166 (2017).
  33. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  34. Manglik, A., et al. Crystal structure of the µ-opioid receptor bound to a morphinan antagonist. Nature. 485 (7398), 321-326 (2012).
  35. Comer, S. D., Cahill, C. M. Fentanyl: Receptor pharmacology, abuse potential, and implications for treatment. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 106, 49-57 (2019).
  36. Podlewska, S., Bugno, R., Kudla, L., Bojarski, A. J., Przewlocki, R. Molecular modeling of µ opioid receptor ligands with various functional properties: PZM21, SR-17018, morphine, and fentanyl-simulated interaction patterns confronted with experimental data. Molecules. 25 (20), 4636 (2020).
  37. Huang, W., et al. Structural insights into µ-opioid receptor activation. Nature. 524 (7565), 315-321 (2015).
  38. Lipiński, P. F. J., et al. Fentanyl family at the mu-opioid receptor: Uniform assessment of binding and computational analysis. Molecules. 24 (4), 740 (2019).
  39. Boland, L. A., Angles, J. M. Feline permethrin toxicity: Retrospective study of 42 cases. Journal of Feline Medicine and Surgery. 12 (2), 61-71 (2010).
  40. Stevenson, B. J., Pignatelli, P., Nikou, D., Paine, M. J. Pinpointing P450s associated with pyrethroid metabolism in the dengue vector, Aedes aegypti: developing new tools to combat insecticide resistance. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1595 (2012).
  41. Ankley, G. T., Gray, L. E. Cross-species conservation of endocrine pathways: A critical analysis of tier 1 fish and rat screening assays with 12 model chemicals. Environmental Toxicology and Chemistry. 32 (5), 1084-1087 (2013).
  42. Meteyer, C. U., Rideout, B. A., Gilbert, M., Shivaprasad, H. L., Oaks, J. L. Pathology and proposed pathophysiology of diclofenac poisoning in free-living and experimentally exposed oriental white-backed vultures (Gyps bengalensis). Journal of Wildlife Diseases. 41 (4), 707-716 (2005).
  43. EPA. ECOTOX User Guide: ECOTOXicology Knowledgebase System. EPA, United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://cfpub.epa.gov/ecotox/index.cfm (2021).
  44. ECOS Environmental Conservation Online System. U.S. Fish & Wildlife Service. , Available from: https://ecos.fws.gov/ecp/ (2021).
Demonstratie van de sequentie-uitlijning om te voorspellen tussen soorten gevoeligheidsinstrument voor snelle beoordeling van eiwitbehoud
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vliet, S. M. F., Hazemi, M., Blatz, D., Jensen, M., Mayasich, S., Transue, T. R., Simmons, C., Wilkinson, A., LaLone, C. A. Demonstration of the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility Tool for Rapid Assessment of Protein Conservation. J. Vis. Exp. (192), e63970, doi:10.3791/63970 (2023).… More

Vliet, S. M. F., Hazemi, M., Blatz, D., Jensen, M., Mayasich, S., Transue, T. R., Simmons, C., Wilkinson, A., LaLone, C. A. Demonstration of the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility Tool for Rapid Assessment of Protein Conservation. J. Vis. Exp. (192), e63970, doi:10.3791/63970 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter