Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Демонстрация выравнивания последовательностей для прогнозирования восприимчивости различных видов для быстрой оценки сохранения белка

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/63970
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 4, 5, 5, 5, 6
1Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Scientific Computing and Data Curation Division, U.S. Environmental Protection Agency, 2Oak Ridge Institute for Science and Education, 3Swenson College of Science and Engineering, Department of Biology, University of Minnesota Duluth, 4University of Wisconsin-Madison Aquatic Sciences Center, 5General Dynamics Information Technology, Research Triangle Park, 6Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Great Lakes Toxicology and Ecology Division, U.S. Environmental Protection Agency

Summary

Здесь мы представляем протокол для использования последней версии инструмента Агентства по охране окружающей среды США По согласованию последовательностей для прогнозирования восприимчивости к видам (SeqAPASS). Этот протокол демонстрирует применение онлайн-инструмента для быстрого анализа сохранения белка и предоставления настраиваемых и легко интерпретируемых прогнозов химической восприимчивости у разных видов.

Abstract

Инструмент Агентства по охране окружающей среды США по согласованию последовательностей для прогнозирования восприимчивости видов (SeqAPASS) - это быстрое, свободно доступное онлайн-приложение для скрининга, которое позволяет исследователям и регулирующим органам экстраполировать информацию о токсичности между видами. Для биологических мишеней в модельных системах, таких как клетки человека, мыши, крысы и рыбки данио, данные о токсичности доступны для различных химических веществ. Благодаря оценке сохранения белковых мишеней этот инструмент может быть использован для экстраполяции данных, полученных из таких модельных систем, на тысячи других видов, не имеющих данных о токсичности, что дает прогнозы относительной внутренней химической восприимчивости. Последние выпуски инструмента (версии 2.0-6.1) включали новые функции, которые позволяют быстро синтезировать, интерпретировать и использовать данные для публикации, а также графику качества презентации.

Среди этих функций - настраиваемые визуализации данных и всеобъемлющий сводный отчет, предназначенный для обобщения данных SeqAPASS для удобства интерпретации. В этом документе описывается протокол, который поможет пользователям при отправке заданий, навигации по различным уровням сравнения последовательностей белков, а также интерпретации и отображении полученных данных. Выделены новые возможности SeqAPASS v2.0-6.0. Кроме того, описаны два варианта использования, ориентированные на сохранение транстиретина и белка опиоидных рецепторов с использованием этого инструмента. Наконец, обсуждаются сильные и слабые стороны SeqAPASS, чтобы определить область применимости инструмента и выделить различные приложения для межвидовой экстраполяции.

Introduction

Традиционно область токсикологии в значительной степени полагалась на использование испытаний на животных для предоставления данных, необходимых для оценки химической безопасности. Такие методы, как правило, являются дорогостоящими и ресурсоемкими. Однако в связи с большим количеством используемых в настоящее время химических веществ и быстрыми темпами разработки новых химических веществ во всем мире существует признанная потребность в более эффективных методах химического скрининга 1,2. Эта потребность и вытекающий из этого сдвиг парадигмы от испытаний на животных привели к разработке многих новых методов подхода, включая высокопроизводительные скрининговые анализы, высокопроизводительную транскриптомику, секвенирование следующего поколения и вычислительное моделирование, которые являются многообещающими альтернативными стратегиями тестирования 3,4.

Оценка химической безопасности во всем разнообразии видов, потенциально подверженных воздействию химических веществ, является постоянной проблемой не только с традиционными испытаниями на токсичность, но и с новыми методами подхода. Достижения в сравнительной и прогностической токсикологии обеспечили основу для понимания относительной чувствительности различных видов, а технологические достижения в вычислительных методах продолжают повышать применимость этих методов. За последнее десятилетие обсуждалось несколько стратегий, которые используют существующие базы данных генов и белковых последовательностей, а также знания конкретных химических молекулярных мишеней для поддержки прогностических подходов к межвидовой экстраполяции и улучшения оценок химической безопасности за пределами типичных модельных организмов 5,6,7,8.

Чтобы продвинуть науку в действие, опираясь на эти фундаментальные исследования в области прогностической токсикологии, приоритизировать усилия по химическому тестированию и поддерживать принятие решений, был создан инструмент Агентства по охране окружающей среды США по согласованию последовательностей для прогнозирования восприимчивости к видам (SeqAPASS). Этот инструмент представляет собой общедоступное и свободно доступное веб-приложение, которое использует общедоступные репозитории постоянно расширяющейся информации о последовательностях белков для прогнозирования химической восприимчивости в разнообразии видов9. Основываясь на принципе, что относительная внутренняя восприимчивость вида к конкретному химическому веществу может быть определена путем оценки сохранения известных белковых мишеней этого химического вещества, этот инструмент быстро сравнивает последовательности белковых аминокислот от вида с известной чувствительностью ко всем видам с существующими данными о последовательностях белков. Эта оценка завершается с помощью трех уровней анализа, включая (1) последовательность первичных аминокислот, (2) функциональную область и (3) сравнение критических аминокислотных остатков, каждое из которых требует более глубоких знаний о химическо-белковом взаимодействии и обеспечивает большее таксономическое разрешение в прогнозировании восприимчивости. Основной сильной стороной SeqAPASS является то, что пользователи могут настраивать и уточнять свою оценку, добавляя дополнительные строки доказательств для сохранения цели на основе того, сколько информации доступно относительно интересующего взаимодействия химического белка или белка-белка.

Первая версия была выпущена в 2016 году, которая позволила пользователям оценивать последовательности первичных аминокислот и функциональные домены оптимизированным образом для прогнозирования химической восприимчивости и содержала минимальные возможности визуализации данных (таблица 1). Было показано, что индивидуальные аминокислотные различия являются важными детерминантами межвидовых различий в химических и белковых взаимодействиях, которые могут влиять на химическую восприимчивость видов 10,11,12. Поэтому последующие версии были разработаны для рассмотрения критических аминокислот, которые важны для прямого химического взаимодействия13. Реагируя на отзывы заинтересованных сторон и пользователей, этот инструмент претерпел ежегодные выпуски версий с дополнительными новыми функциями, предназначенными для удовлетворения потребностей как исследователей, так и регулирующих сообществ для решения проблем межвидовой экстраполяции (таблица 1). Запуск SeqAPASS версии 5.0 в 2020 году принес ориентированные на пользователя функции, которые включают в себя параметры визуализации и синтеза данных, внешние ссылки, сводные таблицы и параметры отчетов, а также графические функции. В целом, новые атрибуты и возможности этой версии улучшили синтез данных, функциональную совместимость между внешними базами данных и простоту интерпретации данных для прогнозирования межвидовой восприимчивости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Начало работы

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, представленный здесь, ориентирован на полезность инструмента и ключевые функции. Подробное описание методов, функций и компонентов можно найти на веб-сайте во всеобъемлющем руководстве пользователя (таблица 1).

Таблица 1: Эволюция инструмента SeqAPASS. Список функций и обновлений, добавленных в инструмент SeqAPASS с момента его первоначального развертывания. Сокращения: SeqAPASS = выравнивание последовательностей для прогнозирования восприимчивости различных видов; ECOTOX = база знаний ECOTOXicology. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

  1. Перейдите в раздел https://seqapass.epa.gov/seqapass с помощью Chrome. Выберите Войти, чтобы использовать существующую учетную запись, или следуйте инструкциям по созданию учетной записи SeqAPASS, которая позволит пользователям запускать, хранить, получать доступ и настраивать свои завершенные задания.
  2. Перед проведением анализа сначала определите интересующий белок и целевой или чувствительный вид, просмотрев существующую литературу или ранее существовавшие данные (рисунок 1). Поскольку SeqAPASS содержит ссылки на внешние ресурсы, помогающие идентифицировать белок запроса, нажмите кнопки раскрывающегося списка в разделе Определение целевого объекта белка для доступа к соответствующим ресурсам.

Figure 1
Рисунок 1: Постановка задачи SeqAPASS: принципиальная схема предварительной информации, необходимой для успешного анализа. Сокращения: SeqAPASS = выравнивание последовательностей для прогнозирования восприимчивости различных видов; LBD = лигандсвязывающий домен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Взаимодействие SeqAPASS между базами данных. Принципиальная схема внешних инструментов, баз данных и ресурсов, интегрированных в SeqAPASS. Сокращения: SeqAPASS = выравнивание последовательностей для прогнозирования восприимчивости различных видов; AOP = путь неблагоприятных исходов; NCBI = Национальный центр биотехнологической информации; ECOTOX = база знаний ECOTOXicology. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 2: Ссылки, ресурсы и инструменты, интегрированные в инструмент SeqAPASS. Список различных источников данных, ссылок и ресурсов, используемых в инструменте SeqAPASS. Аббревиатура: SeqAPASS = выравнивание последовательностей для прогнозирования восприимчивости различных видов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

2. Разработка и выполнение запроса SeqAPASS: Уровень 1

ПРИМЕЧАНИЕ: В анализе уровня 1 вся первичная аминокислотная последовательность белка запроса сравнивается с последовательностями первичных аминокислот всех видов с доступной информацией о последовательностях. Этот инструмент использует алгоритмы для добычи, сбора и компиляции общедоступных данных для быстрого выравнивания и сравнения аминокислотных последовательностей между видами. Серверная часть хранит информацию из баз данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) и стратегически использует автономные версии инструмента поиска базового локального выравнивания белка (BLASTp)54 и инструмента множественного выравнивания на основе ограничений (COBALT)55.

  1. В разделе Сравнение последовательностей первичных аминокислот щелкните По видам или По присоединению. Используйте выбор по видам для ввода или выбора из списка видов, чтобы выбрать интересующую белковую мишень.
  2. Представьте присоединение к белку (т.е. идентификатор белка NCBI) непосредственно путем ввода присоединения (присоединения) в текстовом поле «При присоединении ».
  3. Выберите Запуск запроса , чтобы отправить запрос. После отправки дождитесь появления уведомления в правом верхнем углу окна браузера, указывающего на успешную отправку.
  4. Выберите вкладку Состояние выполнения SeqAPASS в верхней части страницы, чтобы отобразить список всех запусков SeqAPASS, выполненных под этой учетной записью пользователя, и проверить процент завершения.
    1. Нажмите кнопку Обновить данные , когда будет выбран соответствующий переключатель, чтобы проверить состояние запусков уровня 2 и уровня 3.
  5. Выберите вкладку Просмотр отчетов SeqAPASS в верхней части страницы, чтобы получить доступ к списку всех отчетов, завершенных под этой учетной записью.
  6. На вкладке Просмотр отчетов SeqAPASS выберите интересующий белок запроса. Щелкните Запросить выбранный отчет, чтобы открыть страницу Сведения о белке запроса уровня 1 и просмотреть результаты, параметры настройки данных, визуализации и сводные отчеты.
  7. По умолчанию выберите Просмотреть отчет , чтобы просмотреть данные в веб-браузере. Кроме того, можно выбрать Сохранить отчет , чтобы загрузить необработанные данные в виде файла .zip.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для анализа уровня 1, будет варьироваться (в среднем 23 минуты для версии 5.1) в зависимости от глобального спроса пользователей на данный момент времени, количества заданий, отправленных в очередь, и количества информации о белке, которая существует для отправленного задания. Если белковая мишень была ранее завершена, данные будут доступны через несколько секунд после отправки.

3. Разработка и выполнение запроса SeqAPASS: уровень 2

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку вся последовательность белка непосредственно не участвует в химическом взаимодействии, анализ уровня 2 сравнивает только аминокислотную последовательность функционального домена, чтобы сделать прогнозы восприимчивости при более низких таксономических рангах (например, класс, порядок, семейство).

  1. На странице Сведения о белке запроса уровня 1 щелкните знак плюс + рядом с заголовком уровня 2 , чтобы заполнить меню Запрос уровня 2.
  2. Определите соответствующий домен (домены) в интересующем белке (протеин запроса).
    1. Если домен не был идентифицирован, щелкните интегрированную ссылку на базу данных NCBI Conserved Domains Database (CDD) (таблица 1), которая может помочь в определении соответствующего выбора домена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, в качестве запросов на уровне 2 выбираются только определенные домены попадания.
  3. Щелкните поле Выбрать домен , чтобы автоматически заполнить список функциональных доменов для белка запроса.
  4. Выберите присоединение к домену из раскрывающегося списка и инициируйте запрос уровня 2, нажав кнопку Запросить запуск домена . После отправки дождитесь появления уведомления об успешной отправке.
  5. Щелкните Обновить уровень 2, и запустится 3 , чтобы заполнить данные уровня 2, которые будут доступны в течение нескольких секунд после отправки.
  6. В разделе Просмотр данных уровня 2 выберите завершенное присоединение к домену из раскрывающегося списка и нажмите кнопку Просмотреть данные уровня 2 , чтобы открыть результаты на новой странице.

4. Доступ и понимание данных: SeqAPASS Уровень 1 и Уровень 2

  1. Прокрутите страницу Запрос информации о белке вниз, чтобы просмотреть отчет о результатах - первичный отчет по умолчанию предоставляется с анализами уровня 1 и 2. Установите переключатель Полный отчет , чтобы просмотреть более подробный отчет, содержащий все метрики совпадений последовательностей и выравнивания. Нажмите на соответствующее присоединение / идентификатор / имя в обоих отчетах, чтобы получить доступ к прозрачной информации о выравнивании белков и таксономии в базе данных NCBI.
  2. Прокрутите таблицу результатов вправо, чтобы просмотреть столбец ECOTOX . Нажмите на ссылки на базу знаний ECOTOXicology (ECOTOX), чтобы быстро собрать соответствующие данные о токсичности для видов с прогнозами восприимчивости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ECOTOX представляет собой всеобъемлющую, общедоступную базу знаний, содержащую единые данные о химической токсичности для водных и наземных растений и дикой природы. SeqAPASS v6.0 включает в себя виджет ECOTOX для более быстрого подключения к соответствующим данным ECOTOX по химическим веществам и видам, представляющим интерес.
  3. Нажмите кнопку Загрузить таблицу , чтобы сохранить таблицу в виде файла электронной таблицы. Нажмите кнопку Просмотреть сводный отчет , чтобы просмотреть и загрузить сводную таблицу отчета, содержащую данные, отсортированные по таксономическим группам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сводные таблицы данных доступны как для первичных, так и для полных отчетов и содержат обзор прогнозов для данного целевого объекта.

5. Управление настройками данных: SeqAPASS Level 1 и Level 2

ПРИМЕЧАНИЕ: В анализах уровня 1 и уровня 2 предполагается, что чем больше сходство белков, тем больше вероятность того, что химическое вещество будет взаимодействовать с белком аналогично запрашиваемому виду / белку, что делает их восприимчивыми к потенциальному воздействию химических веществ с этой молекулярной мишенью. Из-за сходства этих данных шаги для понимания данных уровня 1 и 2 изложены вместе в одном протоколе.

  1. Обратитесь к подменю в верхней части Query Protein Information для доступа к параметрам отчета и управления ими, а также для использования параметров по умолчанию для всех параметров отчета для большинства анализов. Если изменение параметра по умолчанию имеется научное обоснование, выполните следующие необязательные действия.
    1. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Щелкните знак плюс + рядом с пунктом Отсечение восприимчивости , чтобы просмотреть и настроить параметры отключения восприимчивости в новой вкладке. Выберите новое значение отсечки из раскрывающегося списка или введите определяемое пользователем значение отсечки.
    2. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Измените число в поле E-Value (количество различных выравниваний, которые, как ожидается, произойдут случайно), если требуется что-то отличное от значения по умолчанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любой белок со значением Е, превышающим число в коробке, будет исключен из первичного отчета.
    3. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Используйте параметр Сортировать по таксономической группе , чтобы выбрать уровень таксономической иерархии для отображения в столбце Отфильтрованная таксономическая группа в таблице результатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение таксономической иерархии также изменит прогноз восприимчивости на основе видов из каждой отфильтрованной группы, которые находятся выше отсечения.
    4. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Измените поле Общий домен (сколько общих доменов белок должен разделять с белком запроса для включения в результаты), если требуется что-то иное, чем по умолчанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку по умолчанию установлено значение 1, любая последовательность, которая не разделяет хотя бы один общий домен с белком запроса, будет исключена.
    5. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Выберите Нет в разделе Виды, прочитанные поперек , чтобы вернуть прогнозы восприимчивости Y только в том случае, если процент сходства больше или равен отсечке или если попадание идентифицировано как кандидат в ортологи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот параметр по умолчанию имеет значение Да, что означает, что прогноз восприимчивости Y будет сообщен для всех кандидатов в ортологи, всех видов, перечисленных выше отсечки восприимчивости, и всех видов ниже отсечки из одной и той же таксономической группы с одним или несколькими видами выше отсечки.
  2. Нажмите кнопку Загрузить параметры текущего отчета, чтобы загрузить файл, фиксирующий примененные текущие параметры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранный конкретный уровень оценки (1, 2 или 3) будет диктовать параметры, представленные в отчете.

6. Визуализация данных: SeqAPASS Уровень 1 и Уровень 2

  1. Щелкните знак плюс + рядом с пунктом Визуализация и нажмите кнопку Визуализировать данные , чтобы открыть отдельную вкладку, отображающую пользовательскую информацию и возможность выбора интерактивного графика результатов.
  2. Щелкните Boxplot , чтобы открыть интерактивные элементы управления boxplot и plot и разрешить активное обновление визуализации boxplot для отражения изменений в таблице данных и предоставления графики качества публикации и представления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Boxplot по умолчанию отображает группы видов по оси X и процентное сходство по оси Y. Boxplots отображают отсечение восприимчивости (пунктирная линия), процентное сходство между видами по сравнению с запрашиваемыми видами, а также средние и медианные значения для каждой таксономической группы, а также 25-й и 75-й процентиля и межквартильный диапазон. В зависимости от цели анализа и потребностей пользователя многие функции boxplot могут быть изменены с помощью следующих дополнительных шагов.
    1. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Чтобы настроить отображаемые таксономические группы, обратитесь к полю Таксономические группы в разделе Элементы управления . Удалите группы, прокрутив имена и выбрав x или с помощью раскрывающегося меню Таксономические группы .
    2. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Чтобы добавить легенду, которая точно определит интересующий вид или конкретные предопределенные группы (например, исчезающие или находящиеся под угрозой исчезновения виды), наведите курсор на название таксономической группы на оси X, чтобы активировать всплывающее окно, в котором перечислены три лучших вида, упорядоченных по наибольшему процентному подобию. Наведите указатель мыши на виды в легенде, чтобы создать всплывающее окно с соответствующей информацией о видах. Нажмите на поле для конкретной таксономической группы, чтобы создать загружаемую сводную таблицу со списком видов и прогнозов.
  3. Нажмите кнопку Загрузить Boxplot , чтобы выбрать тип файла, настроить разрешение ширины/высоты и сохранить визуализацию.

7. Разработка и проведение анализа SeqAPASS: Уровень 3

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ уровня 3 оценивает идентифицированные пользователем аминокислотные остатки в исследуемом белке и быстро сравнивает сохранение этих остатков по видам. Предполагается, что виды, у которых эти остатки сохраняются, с большей вероятностью взаимодействуют с химическим веществом аналогично типовому/белку шаблона. Поскольку уровень 3 фокусируется на отдельных аминокислотах, анализ может быть выполнен только тогда, когда доступны подробные знания аминокислотных остатков, критически важных для взаимодействия химико-белка или белка-белка.

  1. Щелкните знак плюс + рядом с заголовком уровня 3 на странице Сведения о белке запроса уровня 1 , чтобы заполнить меню Запрос уровня 3.
  2. Щелкните знак плюс + рядом с обозревателем ссылок , чтобы открыть инструмент обозревателя ссылок, который генерирует предопределенную логическую строку для запроса доступной литературы и помогает пользователям определить соответствующую литературу для поддержки идентификации критических аминокислот, которые будут использоваться в оценке уровня 3 (таблица 2 и рисунок 2).
    1. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) После автоматического заполнения белка запроса используйте функцию Add Protein Name (Добавить имя белка ) для добавления дополнительных белков.
  3. Нажмите создать ссылку Академии Google , чтобы открыть всплывающее окно, содержащее автоматически сгенерированную строку поиска, содержащую соответствующие условия поиска.
  4. Нажмите Поиск в Академии Google , чтобы запросить базу данных литературы с помощью строки поиска.
    1. Также можно нажать кнопку Копировать в буфер обмена и настроить строку поиска, добавив или удалив термины с помощью функций обозревателя ссылок.

8. Идентификация критических аминокислотных остатков с использованием идентифицированной литературы

  1. Выберите шаблонную последовательность , по которой выбранные пользователем виды будут выровнены, в меню Запрос уровня 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта шаблонная последовательность обычно выбирается на основе литературы, для которой были идентифицированы критические аминокислоты, и может быть тем же или другим видом, чем те, которые запрашиваются на уровне 1 и уровне 2.
    1. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Поле Дополнительные сравнения используется для сравнения всех присоединений/последовательностей, которые не отображаются в таблицах Основной/Полный отчет .
  2. Введите определяемое пользователем имя запуска уровня 3 в текстовом поле Введите имя выполнения уровня 3 , чтобы определить завершенный запуск уровня 3. Выберите уникальное имя для каждой оценки.
  3. Выберите интересующую таксономическую группу в поле Выбрать таксономическую группу (группы ). Выберите таксономическую группу для автоматической фильтрации таблицы по этой таксономической группе.
  4. В таблице результатов вручную установите флажок рядом с любыми видами , которые необходимо выровнять по последовательности шаблона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения надлежащего выравнивания следует сравнивать одну таксономическую группу за раз с шаблоном. Выбирайте только аналогично аннотированные белки для интересующих видов. При выборе последовательностей для сравнения важно обращать внимание на определенные последовательности (например, гипотетические, НИЗКОКАЧЕСТВЕННЫЕ или частичные). Если нет прозрачного обоснования для включения, лучше всего исключить эти последовательности, поскольку они могут искажать прогнозы из-за неполной или ненадлежащей информации о последовательностях.
  5. Повторите шаги, чтобы выровнять все интересующие таксономические группы.
  6. Щелкните Обновить уровни 2 и 3 после того, как все виды будут выровнены, чтобы заполнить меню «Выбрать имя запуска уровня 3 » завершенными заданиями уровня 3 и немедленно получить данные из выравнивания уровня 3.
  7. Щелкните Объединить данные уровня 3 , чтобы объединить выравнивания из нескольких таксономических групп.
    1. Кроме того, чтобы просмотреть один отчет, выберите определяемое пользователем имя в разделе Выбрать запрос для просмотра и щелкните Просмотр данных уровня 3.
  8. Выберите шаблон уровня 3, который будет использоваться в качестве основы для сравнения аминокислотных остатков, в меню «Объединить отчеты уровня 3» и нажмите кнопку «Далее».
  9. В разделе Задания уровня 3 выберите завершенные задания для сравнения и нажмите кнопку Далее. При необходимости используйте функцию Задания уровня 3 для изменения порядка таксономических групп. Щелкните Просмотр данных уровня 3 , чтобы создать страницу отчета уровня 3 с объединенными таксономическими группами.
  10. Выберите ранее определенные позиции аминокислот для типов шаблонов , введя позиции аминокислот, разделенные запятыми, в поле Введите позиции аминокислотных остатков , а затем выбрав Копировать в список остатков . Непосредственно выберите остатки в последовательности шаблона из коробки шаттла.
  11. Щелкните Обновить отчет , чтобы обновить страницу и отобразить прогнозы восприимчивости уровня 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень 3 использует простой набор правил, полученных из основных дескрипторов функциональных свойств боковой цепи (например, алифатических, ароматических) и молекулярных измерений (различия молекулярной массы >30 г/моль), чтобы определить, могут ли различия в ключевых позициях влиять на белковые взаимодействия13.

9. Визуализация данных SeqAPASS уровня 3

ПРИМЕЧАНИЕ: Как и на предыдущих уровнях, доступны первичные и полные отчеты. В дополнение к данным, идентичным данным уровня 1 и 2, первичный отчет отображает аминокислотные позиции, аббревиатуры и «да/нет» (Y/N), аналогичную восприимчивости к шаблону прогноза. Аналогичным образом, полный отчет содержит информацию о классификации боковых цепей аминокислот и молекулярной массе.

  1. На странице отчета уровня 3 прокрутите вниз, чтобы просмотреть отчет о результатах. Нажмите кнопку Загрузить таблицу в нижней части отчета, чтобы сохранить таблицу.
  2. Щелкните Просмотр сводного отчета уровня 3 , чтобы просмотреть и загрузить сводную таблицу отчета, содержащую данные, отсортированные по таксономическим группам. Щелкните знак плюс + рядом с пунктом Визуализация на странице Отчета уровня 3, чтобы открыть отдельную вкладку браузера, отображающую пользовательскую информацию и возможность просмотра результатов в виде интерактивной тепловой карты.
  3. Щелкните Тепловая карта на странице Сведения о визуализации , чтобы открыть интерактивный рисунок и элементы управления и разрешить активное обновление визуализации тепловой карты для отражения изменений в таблице данных. Выполните следующие дополнительные действия для настройки тепловой карты.
    1. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Выберите Параметры отчета, чтобы перейти между простым отчетом, в котором отображается положение аминокислот, однобуквенная аббревиатура и сходство аминокислот, или полным отчетом, в котором отображаются подробные сведения о каждой выбранной аминокислоте.
    2. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Выберите Параметры отчета, чтобы изменить способ отображения видов по общему имени или научному названию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В простом отчете аминокислоты классифицируются как Полное соответствие (темно-синий), Частичное совпадение (светло-синий, замены, отвечающие только одному критерию) или Не соответствует (желтый, замены, не отвечающие ни одному из критериев) аминокислоте шаблона. В полном отчете отображаются сравнения как «Итоговое совпадение» (темно-синий) или «Не совпадение» (желтый).
    3. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Выберите «Дополнительные выборки», чтобы выделить полезную информацию, такую как кандидаты в ортологи, виды, находящиеся под угрозой исчезновения, виды, находящиеся под угрозой исчезновения, или общие модельные организмы.
    4. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Выберите Параметры тепловой карты , чтобы выбрать дополнительные параметры настройки, включая добавление или удаление столбцов, легенд и текста.
  4. Нажмите кнопку Загрузить Boxplot , чтобы выбрать тип файла и сохранить визуализацию.

10. Интерпретация результатов SeqAPASS: строки доказательств сохранения белка

ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства интерпретации этот инструмент включает в себя отчет о принятии резюме решений (DS Report), предназначенный для интеграции данных между уровнями. Отчет DS содержит результаты (т.е. таблицы данных и/или визуализации), выбранные пользователем, и позволяет быстро оценить прогнозы восприимчивости на нескольких уровнях для нескольких видов одновременно.

  1. Щелкните Push Level # to DS Report на страницах результатов или визуализации данных и подождите, пока данные будут «отправлены» и вкладка DS Report станет активной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если результаты или какие-либо изменения не были отправлены в отчет DS, Push Level # to DS Report будет оставаться активным до тех пор, пока не будет выбран. Если параметр был изменен, текст Щелкните, чтобы отправить новые изменения , будет отображаться до тех пор, пока изменения не будут отправлены в отчет. Визуализации могут быть отправлены в отчет DS в любое время во время оценки.
  2. Выберите вкладку Отчет DS в любое время, чтобы получить доступ к странице DS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех видов, выровненных на уровне 1, таблица сводного отчета об окончательном решении содержит важные данные и прогнозы восприимчивости для каждого анализа. Если вид в таблице DS не был включен в отчет уровня 3, но был обнаружен в заданиях уровня 1 и/или уровня 2, ячейка в таблице получит неприменимое обозначение (NA) для прогноза восприимчивости уровня 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы продемонстрировать применение инструмента SeqAPASS и подчеркнуть новые особенности, описаны два тематических исследования, представляющих случаи, в которых сохранение белка предсказывает, что существуют различия в химической восприимчивости между видами (транстиретин человека) и что нет различий (μ опиоидным рецептором [MOR]). Первый из этих примеров касается белковых последовательностей/структурных сравнений для прогнозирования области применимости для путей неблагоприятного исхода (AOP, см. Таблицу 2 для определения), в то время как второй направлен на разработку исследовательских гипотез, относящихся к межвидовой восприимчивости к опиоидам, присутствующим в сточных водах. Основные подходы, описанные в этих тематических исследованиях, могут быть применены к любому химическому веществу и продемонстрировать широкую полезность этого инструмента для принятия решений и исследований.

Гормоны щитовидной железы необходимы для нормального роста и развития. Они синтезируются в щитовидной железе и секретируются в кровоток, где связываются с белками распределения и циркулируют по всему организму 14,15,16,17,18. Недавние исследования показали, что загрязнители окружающей среды, такие как полихлорированные дифенилы (ПХД), полибромированные дифениловые эфиры (ПБДЭ), пер- и полифторалкильные вещества (PFAS), могут конкурентно связываться с распределительным белком транстиретином (TTR) и нарушать нормальные процессы щитовидной железы 19,20,21,22,23,24,25 . Был разработан AOP, описывающий конкурентное связывание с TTR, приводящее к токсичности для развития нервной системы человека (https://aopwiki.org/aops/152). Хотя есть доказательства того, что этот AOP также применим к грызунам, применимость к другим таксономическим группам еще не определена. Поскольку TTR-связывающие химические вещества присутствуют в окружающей среде, важно понимать таксономическую значимость этого AOP, проблему, которая может быть частично решена с помощью анализа SeqAPASS. Используя стратегию постановки проблемы инструмента, цель анализа может быть сформулирована следующим образом: зная, что TTR-связывающие соединения приводят к неблагоприятным исходам у людей, какие таксономические группы, по прогнозам, будут иметь аналогичную восприимчивость?

Человеческий транстиретиновый белок хорошо охарактеризован, и есть несколько хорошо изученных лигандов, которые, как известно, связываются на сайте связывания TTR (hTTR) человека, что делает его оптимальной мишенью для анализа SeqAPASS 8,9,13. Используя присоединение NCBI для человеческого транстиретина, P02766.1, был проведен анализ уровня 1 с настройками по умолчанию. Результаты анализа уровня 1 установили процент отсечения сходства на уровне 49%, причем млекопитающие (Mammalia), птицы (Aves), рептилии (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), амфибии (Amphibia) и большинство видов рыб (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) упали выше этого отсечения (рисунок 3). Таким образом, все виды из этих таксономических групп привели к прогнозированию восприимчивости «Y» (т.е. да) и, вероятно, восприимчивы к химическим веществам, которые, как известно, взаимодействуют с hTTR (рисунок 3 и дополнительный файл 1).

Для оценки функционального домена (доменов) уровня 2 база данных NCBI Conserved Domain Database использовалась для идентификации TR_THY (присоединение smart00095) в качестве законсервированного домена, включающего зрелую цепочку белка субъединицы TTR из остатков 27 до 147. Поскольку белковая последовательность TTR, о которой сообщается в NCBI, включает 20 аминокислот пресегмент, не относящийся к текущему анализу, сосредоточение сравнения на зрелой цепи обеспечивает дополнительную, более конкретную линию доказательств для сохранения этого белка у разных видов. Из оценки уровня 2 было сообщено о процентном отсечении сходства в 58%, при этом млекопитающие, птицы, рептилии, амфибии и большинство видов рыб снова упали выше этого отсечения (рисунок 4). Следовательно, SeqAPASS заключил прогноз восприимчивости «Y» (т.е. да) для видов из этих таксономических групп, указав, что они, вероятно, восприимчивы к химическим веществам, которые взаимодействуют с белком hTTR (рисунок 4 и дополнительный файл 1). В целом, результаты анализа уровня 1 и уровня 2 показывают, что большинство видов позвоночных разделяют сохранение hTTR и, вероятно, восприимчивы к химическим веществам, которые, как известно, взаимодействуют с этим белком.

Figure 3
Рисунок 3: SeqAPASS Level 1 анализ сохранения транстиретина в таксономических группах с доступной информацией о последовательностях относительно белка человека. Процентное сходство последовательности аминокислот белка отображается на оси Y; таксономическая группа отображается на оси X. Открытые круги (○) указывают на последовательность запроса, а замкнутые круги (●) указывают на вид в таксономической группе с наибольшим процентным сходством. На графике верхняя и нижняя части каждой коробки представляют75-й и25-й процентили, усы простираются в 1,5 раза в межквартильный диапазон, а средние и медианные значения представлены горизонтальными черными линиями на коробке. Пунктирная линия указывает на отсечение для прогнозов восприимчивости. Сокращения: TTR = транстиретин; SeqAPASS = выравнивание последовательностей для прогнозирования восприимчивости различных видов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: SeqAPASS Level 2 анализ сохранения лигандсвязывающего домена транстиретиновых рецепторов по таксономическим группам с доступной информацией о последовательностях относительно белка человека LBD. Процентное сходство аминокислотной последовательности лигандсвязывающего домена отображается на оси Y; таксономическая группа отображается на оси X. Открытые круги (○) указывают на последовательность запроса, а замкнутые круги (●) указывают на вид в таксономической группе с наибольшим процентным сходством. На графике верхняя и нижняя части каждой коробки представляют75-й и25-й процентили, усы простираются в 1,5 раза в межквартильный диапазон, а средние и медианные значения представлены горизонтальными черными линиями на коробке. Пунктирная линия указывает на отсечение для прогнозов восприимчивости. Сокращения: TTR = транстиретин; SeqAPASS = выравнивание последовательностей для прогнозирования восприимчивости различных видов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Посредством анализа молекулярного моделирования и исследований кристаллографии белка в области связывания TTR были идентифицированы аминокислоты, которые, по прогнозам, будут взаимодействовать с эндогенным лигандом 3,3',5,5'-тетрайод-L-тиронином (T4, PDB 2ROX), а также тремя химическими веществами окружающей среды: перфтороктановым сульфонатом (PFOS, PDB 5JIM), тетрабромбисфенолом A (TBBPA, PDB 5HJG) и диэтилстильбестролом (DES, PDB 1TZ8)19, 21,22,26. Аминокислотные остатки Lys35, Ser137, Leu130, Ala128, Ala129 и Thr139 были идентифицированы как играющие ключевую роль во взаимодействиях белок-лиганд, либо через прямые взаимодействия водородных связей, либо через взаимодействия Ван-дер-Ваальса. Эти шесть аминокислотных остатков были оценены в анализе уровня 3 по видам с использованием hTTR в качестве шаблонной последовательности и исключая негомологичные, гипотетические, частичные и низкокачественные последовательности (Дополнительный файл 1). Поскольку ранее было установлено, что TTR сохраняется только для всех видов позвоночных, виды беспозвоночных были исключены из этого анализа (рисунок 3 и рисунок 4). Кроме того, важно отметить, что позиции аминокислот, представленные в литературе, исключают 20 аминокислот пресегмент, который отсутствует в зрелом белке hTTR, и по этой причине позиции, представленные на уровне 3, были скорректированы по сравнению с теми, о которых сообщалось в литературе, чтобы обеспечить точное выравнивание с выбранным шаблонным белком15 (Дополнительный файл 1).

В анализе уровня 3 TTR было отобрано 294 вида позвоночных для выравнивания (млекопитающие, птицы, амфибии, рептилии и рыбы). Из оцениваемых видов 18 показали различия в ключевых аминокислотах, что привело к прогнозированию восприимчивости «N» (то есть нет). Интересно, что пять видов морских млекопитающих представлены с заменой аминокислот в позиции 2 (128A), в то время как четыре вида рыб продемонстрировали замены либо в позиции 2 (128A), либо в позиции 6 (139T) (рисунок 5). Поскольку эти аминокислоты играют важную роль во взаимодействиях белка и лиганда в канале связывания TTR, эти данные свидетельствуют о том, что лиганды TTR могут по-разному взаимодействовать у этих видов и приведут к различной химической восприимчивости по сравнению с людьми.

Figure 5
Рисунок 5: SeqAPASS Уровень 3 анализ сохранения аминокислотных остатков, важных для TTR-химического связывания. (A) Сводная таблица уровня 3, отображающая количество видов с доступными данными о последовательностях во всех таксономических группах, число видов, которые, по прогнозам, будут одинаково восприимчивыми (Y), и число видов, которые, по прогнозам, не будут одинаково восприимчивыми (N). (B) Тепловая карта уровня 3, отображающая отдельные виды, которые, по прогнозам, не будут одинаково восприимчивы по сравнению с транстиретиновым белком TTR человека, демонстрируя полные, частичные и несоответствующие аминокислоты. Сокращения: TTR = транстиретин; SeqAPASS = выравнивание последовательностей для прогнозирования восприимчивости различных видов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В ответ на отзывы заинтересованных сторон и пользователей были разработаны и включены в инструмент SeqAPASS новые функции, включая возможность подключения к эмпирическим данным для различных приложений. Функциональная совместимость этого инструмента с базой знаний ECOTOX (таблица 1) была достигнута как путем включения внешних ссылок в таблицы данных уровня 1 и уровня 2 для присоединения, присутствующих в ECOTOX, так и путем создания виджета ECOTOX в инструменте для непосредственной фильтрации наиболее релевантных данных о токсичности в ECOTOX. Через ссылки и виджет пользователи могут быстро запрашивать ECOTOX и собирать соответствующие данные о токсичности для видов с прогнозами восприимчивости SeqAPASS. В настоящее время прогнозы SeqAPASS связаны с ECOTOX через химический стрессор и виды; однако данные о токсичности еще не связаны с конкретными генами/белками, что позволило бы установить прямые связи с конкретными конечными точками/молекулярными мишенями, представляющими интерес для SeqAPASS. Хотя связывание прогнозов с данными о токсичности, основанными на химическом стрессоре, не является идеальным, поскольку данные могут не быть специфичными для данного пути, установление связи для объединения результатов является первым шагом. В качестве первой итерации интеграции SeqAPASS-ECOTOX нынешний подход предоставляет пользователям все доступные данные о токсичности для химического стрессора (ов) и видов на широком уровне. Эти данные в сочетании с прогнозами SeqAPASS могут обеспечить контекст на широких уровнях (позвоночные против беспозвоночных) и могут быть рассмотрены в контексте структуры AOP.

TTR представляет собой хороший пример для изучения этого соединения, поскольку существующий AOP (AOP 152) обеспечивает контекст для интерпретации потенциально релевантных данных о токсичности ECOTOX. Начиная с лигандов, исследованных на уровне 3 SeqAPASS, данные о токсичности окружающей среды были собраны по видам для четырех химических веществ, которые, как известно, взаимодействуют с доменом связывания лигандов TTR (диэтилстильбестрол [DES], перфторгексановая кислота [PFHxA], перфтороктановый сульфонат [PFOS] и тетрабромбисфенол A [TBBPA])19,21,23,24 . По каждому химическому веществу ЭКОТОКС был запрошен для получения данных о водных и наземных объектах по номеру Службы рефератов по химическим веществам (CAS) с использованием пользовательских параметров поиска (Дополнительный файл 1). Данные были отфильтрованы по группам видов, представляющим интерес (амфибии, птицы, рыбы, беспозвоночные, млекопитающие, рептилии). В результатах отфильтрованного запроса среднее значение минимальных и максимальных концентраций эффекта в исследовании было рассчитано и реализовано в качестве приближения к среднему значению для любых обращений, которые не сообщали о среднем значении концентрации эффекта (рисунок 6A и дополнительный файл 1). В контексте одного химического вещества были проведены тесты Крускаля-Уоллиса для сравнения средних концентраций эффекта различных таксономических групп, поскольку данные не соответствовали предположениям теста ANOVA. Затем были проведены попарные сравнительные тесты с использованием теста Данна для всех химических веществ, поскольку таксономические группы состояли из неравных размеров выборки. Результаты в водной и наземной областях были проанализированы отдельно, поскольку данные между двумя типами воздействий напрямую не сопоставимы. В рамках ЭКОТОКС имеются данные о токсичности в водной среде для отдельных химических веществ для амфибий, птиц, беспозвоночных и видов рыб (рисунок 6А). Данные о токсичности на суше для отдельных химических веществ были доступны только для млекопитающих и DES (Дополнительный файл 1).

Figure 6
Рисунок 6: Связывание результатов SeqAPASS с эмпирическими данными. (A) Средние концентрации эффекта в таксономических группах с данными, доступными в базе знаний ECOTOXicology для отдельных химических веществ, которые, как известно, связываются с белком TTR человека. B) совпадение числа видов, включенных в каждый анализ SeqAPASS, с видами, по которым имеются данные ECOTOX. На панели A скобки вдоль оси X указывают количество обращений к запросу, для которых были агрегированы данные. Звездочки указывают на пары значительно различающихся концентраций воздействия между группами видов в контексте одного химического вещества (тест Данна, p < 0,05), где более высокие числа звездочек указывают на более высокие уровни значимости (*: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001; ****: p < 0,0001). Центральные линии внутри каждого прямоугольника представляют медиану, а края поля демонстрируют межквартильный диапазон. Усы простираются в 1,5 раза от межквартильного диапазона. Выбросы, выходящие за пределы этого диапазона, отображаются в виде отдельных точек. Сокращения: TTR = транстиретин; SeqAPASS = выравнивание последовательностей для прогнозирования восприимчивости различных видов; ECOTOX = база знаний ECOTOXicology. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В целом, эти данные свидетельствуют о том, что биологическая активность оцениваемых химических веществ встречается у видов позвоночных, но не встречается у беспозвоночных. Хотя отсутствие информации о биологических целях и путях распространения в ECOTOX делает невозможным прямую связь этих эмпирических данных с TTR, эти результаты подтверждают прогнозы SeqAPASS о том, что виды беспозвоночных не разделяют восприимчивость. Все виды позвоночных, по которым имеются данные, продемонстрировали восприимчивость как к ПФОС, так и к ТББПА, хотя средние концентрации воздействия были значительно выше у рыб и птиц, чем у амфибий. Эти данные свидетельствуют о потенциальных различиях в чувствительности между таксономическими группами, которые могут быть отнесены к различиям в биологических путях (включая TTR). Примечательно, что другие переменные, такие как метаболизм и экскреция, также могут играть роль в различиях в чувствительности. Было установлено, что в отношении PFHxA и ПФОС рыба значительно более чувствительна, чем беспозвоночные и птицы, а в случае DES амфибии имеют значительно более высокие средние концентрации воздействия, чем беспозвоночные. Опять же, эти данные подтверждают наш прогноз SeqAPASS о том, что беспозвоночные не разделяют восприимчивость с видами позвоночных. Из всех видов, оцененных с использованием этого инструмента, по которым имелись данные о последовательностях TTR, лишь небольшое число имело соответствующие данные ECOTOX по четырем химическим веществам, представляющим интерес (рисунок 6B, дополнительная таблица S1 и дополнительная таблица S2). Для тех видов, которым не хватает апикальных данных, прогнозы восприимчивости SeqAPASS добавляют дополнительные доказательства того, что родственные виды могут вести себя аналогично тем, которые имеют апикальные данные. Данные по всем анализам SeqAPASS и ECOTOX доступны в дополнительном файле 1.

По данным Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC), в 2017 году опиоиды способствовали примерно 47 600 смертям от передозировки в Соединенных Штатах, число которых продолжает расти на27. Установки по очистке сточных вод в США регулируются на национальном уровне Национальной системой ликвидации выбросов загрязняющих веществ Агентства по охране окружающей среды США, которая не требует тестирования на опиоиды или другие фармацевтические препараты в ихсбросе 28. В последние годы были предприняты усилия по использованию эпидемиологии на основе сточных вод в качестве инструмента для картирования употребления опиоидов в общинах. В рамках мониторинга опиоидов были выявлены концентрации до 1,27 мкг/л в сточных водах и 0,7 мкг/л в поверхностных водах29,30. Недавние исследования токсичности, оценивающие влияние воздействия опиоидов на рыбу, сообщили о развитии аддиктивного поведения и неблагоприятных иммунологических эффектов (например, более высокие показатели инфицирования, снижение регуляции иммунных генов)31,32,33. В целом, эти исследования показывают, что существует потенциал для неблагоприятного воздействия опиоидов в окружающей среде и подчеркивают важность понимания риска, который эти химические вещества представляют для водных видов. Учитывая диапазон видов, которые могут сталкиваться с этими соединениями в окружающей среде, выявление потенциально восприимчивых видов с использованием SeqAPASS может иметь важное значение для приоритизации усилий по тестированию или мониторингу.

MOR представляет собой основную опиоидную мишень для лечения боли и отвечает за мощные обезболивающие и аддиктивные свойства опиатных алкалоидов у людей 34,35. Из-за важности этого рецептора для здоровья человека, лиганды MOR хорошо известны, и доступны высококачественные рентгеновские кристаллографические исследования, что делает эту цель идеальной для анализа SeqAPASS 8,9,13. Используя присоединение NCBI для μ опиоидного рецептора человека, ACM90349.1, был проведен анализ уровня 1 с использованием настроек по умолчанию. Отсечение восприимчивости было установлено на уровне 55% для уровня 1, с процентным сходством для млекопитающих (Mammalia), птиц (Aves), рептилий (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), амфибий (Amphibia) и большинства видов рыб (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes), попадающих выше этого отсечения; таким образом, виды из этих таксономических групп привели к прогнозированию восприимчивости «Y» (т.е. да), указывая, что они, вероятно, будут восприимчивы к химическим веществам, которые, как известно, взаимодействуют с человеческим MOR (рисунок 7 и дополнительный файл 1). Используя базу данных NCBI Conserved Domain Database, 7tmA_Mu_opioid_R был идентифицирован (присоединение cd15090) как функциональный домен, включающий все семь спиралей белка MOR от 133 до 411, включая предполагаемый сайт связывания лигандов. По сравнению с уровнем 1, результаты уровня 2 выявили более высокую отсечку восприимчивости на 88% сходства с млекопитающими, птицами, рептилиями, амфибиями и большинством видов рыб, обнаруженных выше этого отсечения, что привело к прогнозированию восприимчивости «Y» для да (рисунок 8). В целом, результаты анализа уровня 1 и уровня 2 показывают, что большинство видов позвоночных разделяют сохранение MOR и, вероятно, восприимчивы к химическим веществам, которые, как известно, взаимодействуют с MOR человека.

Figure 7
Рисунок 7: Анализ SeqAPASS Level 1 сохранения опиоидных рецепторов μ таксономических групп с доступной информацией о последовательностях относительно белка человека. Процентное сходство последовательности аминокислот белка отображается на оси Y; таксономическая группа отображается на оси X. Открытые круги (○) указывают на последовательность запроса, а замкнутые круги (●) указывают на вид в таксономической группе с наибольшим процентным сходством. На графике верхняя и нижняя части каждой коробки представляют собой 75-й и 25-й процентили, усы простираются в 1,5 раза от межквартильного диапазона, а средние и медианные значения представлены горизонтальными черными линиями на коробке. Пунктирная линия указывает на отсечение для прогнозов восприимчивости. Сокращения: MOR = мю-опиоидный рецептор; SeqAPASS = выравнивание последовательностей для прогнозирования восприимчивости различных видов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: SeqAPASS Level 2 анализ μ сохранения лигандсвязывающего домена опиоидных рецепторов относительно домена в белке человека. Процентное сходство аминокислотной последовательности лигандсвязывающего домена отображается на оси Y; таксономическая группа отображается на оси X. Открытые круги (○) указывают на последовательность запроса, а замкнутые круги (●) указывают на вид в таксономической группе с наибольшим процентным сходством. На графике верхняя и нижняя части каждой коробки представляют собой 75-й и 25-й процентили, усы простираются в 1,5 раза от межквартильного диапазона, а средние и медианные значения представлены горизонтальными черными линиями на коробке. Пунктирная линия указывает на отсечение для прогнозов восприимчивости. Сокращения: MOR = мю-опиоидный рецептор; SeqAPASS = выравнивание последовательностей для прогнозирования восприимчивости различных видов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Благодаря анализу молекулярного моделирования и кристаллографических исследований белка в области связывания MOR были идентифицированы аминокислоты, которые, по прогнозам, будут взаимодействовать с известными лигандами. Хотя разнообразный набор лигандов, которые хорошо связываются с опиоидными рецепторами, приводит к сложной фармакологии, некоторые последовательные лиганд-белковые взаимодействия наблюдаются36,37. Основываясь на молекулярной стыковке с различными кристаллическими структурами MOR, как морфин, так и фентанил, высокоаффинные агонисты MOR взаимодействуют с D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322 и Y32636,38. Остатки D147, Y148, M151 и H297 также участвуют в кристаллических структурах MOR, связанных с агонистом морфина BU72, в то время как D147, M151, H297 и Y326 также имеют решающее значение для связывания с необратимым антагонистом морфина β-фуналтрексамин37. Учитывая эти линии доказательств, было отобрано девять остатков (D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322, Y326) для оценки уровня 3 с использованием ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО MOR в качестве шаблонной последовательности и исключая частичные, предсказанные, гипотетические и низкокачественные последовательности. Важно отметить, что позиции аминокислот, представленные в литературе, исключают 64-аминокислотный сегмент относительно присоединения белка NCBI, и по этой причине позиции на уровне 3 были выбраны для представления тех, которые выровнены с шаблонной последовательностью для правильных последовательностей выравнивания.

В анализе уровня 3 человеческого MOR было оценено 284 вида по видам позвоночных (млекопитающие, птицы, амфибии, рептилии и рыбы). Во всех оцениваемых видах девять аминокислот были либо полным, либо частичным соответствием на основе классификации боковых цепей и молекулярной массы; следовательно, все оцененные виды привели к прогнозированию восприимчивости "Y" для да (таблица 3 и дополнительный файл 1). Поскольку эти аминокислоты важны для связывания как сильных агонистов MOR, так и сильных антагонистов, эти данные свидетельствуют о том, что опиоидные соединения, нацеленные на μ опиоидные рецепторы человека, могут аналогичным образом взаимодействовать с рецепторами у всех видов позвоночных. Хотя на сегодняшний день в базе знаний ECOTOX имеется мало эмпирических данных по опиоидным соединениям, несколько исследований показывают, что рыба, вероятно, восприимчива к 31,32,33. В целом, результаты SeqAPASS указывают на потенциал более широкого воздействия на окружающую среду химических веществ, модулирующих MOR, по видам, что указывает на то, что дополнительные исследования и, возможно, мониторинг могут быть ценными. Данные по всем анализам доступны в дополнительном файле 1.

Таблица 3: SeqAPASS Level 3 анализ сохранения аминокислотных остатков, важных для химического связывания с μ опиоидным рецептором. Сводная таблица, показывающая количество видов с доступными данными о последовательностях во всех таксономических группах, число видов, которые, по прогнозам, будут одинаково восприимчивыми (Y), и количество видов, которые, по прогнозам, не будут одинаково восприимчивыми, а также полные, частичные и несоответствующие аминокислоты. Аббревиатура: SeqAPASS = выравнивание последовательностей для прогнозирования восприимчивости различных видов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица S1: Виды, имеющиеся данные ECOTOX по четырем химическим веществам, представляющим интерес, которые, как известно, связываются с транстиретиновым белком человека. Данные, доступные для каждого химического вещества, согласованы с прогнозами SeqAPASS об аналогичной восприимчивости на уровнях 1, 2 и 3. Все прогнозы SeqAPASS относительно последовательности транстиретина человека. Сокращения: SeqAPASS = выравнивание последовательностей для прогнозирования восприимчивости различных видов; DES = диэтилстильбестрол; PFHxA = перфторгексановая кислота; ПФОС = перфтороктановая сульфоновая кислота; TBBPA = тетрабромбисфенол А. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица S2: Общее число видов с имеющимися данными по оценкам SeqAPASS и ECOTOX для отдельных химических веществ, которые, как известно, связываются с транстиретиновым белком человека. SeqAPASS предоставляет средства для прогнозирования восприимчивости видов по многим видам, для которых эмпирические данные о токсичности недоступны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Данные SeqAPASS и ECOTOX для всех репрезентативных результатов. Файл содержит ToC, за которым следуют следующие технические описания: Tab 1-hTTR SeqAPASS Results Level 1, Tab 2-hTTR SeqAPASS Results Level 2, Tab 3-hTTR SeqAPASS Results Level 3, Tab 4-EcoTox data for DES, Tab 5-EcoTox data for PFOS, Tab 6-EcoTox data for PFHxA, Tab 7-EcoTox Data for TBBPA, Tab 8-EcoTox Group Average Calculations, Вкладка 9-Сравнение данных SeqAPASS EcoTox, Вкладка 10-hMOR Результаты SeqAPASS Уровень 1, Вкладка 11-hMOR Результаты SeqAPASS Уровень 2 и Вкладка 12-μ-hMOR Результаты SeqAPASS Уровень 3. Сокращения: SeqAPASS = выравнивание последовательностей для прогнозирования восприимчивости различных видов; ToC = Оглавление; hTTR = транстиретин человека; ECOTOX = база знаний в области экотоксикологии; DES = диэтилстильбестрол; ПФОС = перфтороктановая сульфоновая кислота; PFHxA = перфторгексановая кислота; TBBPA = тетрабромбисфенол А; hMOR = человеческий му-опиоидный рецептор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Широко признано, что невозможно эмпирически проверить достаточное количество видов, чтобы охватить геномное, фенотипическое, физиологическое и поведенческое разнообразие живых организмов, которые могут подвергаться воздействию химических веществ, представляющих токсикологический интерес. Цель SeqAPASS состоит в том, чтобы максимально использовать существующие и постоянно расширяющиеся последовательности белков и структурные данные для содействия и информирования экстраполяции данных / знаний о химической токсичности от протестированных организмов к сотням или тысячам других видов посредством сравнений на молекулярном уровне. Инструмент SeqAPASS был разработан для снижения сложности сравнения последовательностей белков для ученых, оценщиков риска и регуляторов посредством упрощенного и быстрого анализа, который включает в себя прозрачно генерируемые и загружаемые сводные таблицы, интерактивные визуализации данных и легкую идентификацию угрожаемых и исчезающих видов, а также общих модельных организмов. Здесь описаны протоколы для запуска уровней SeqAPASS 1, 2 и 3 для оценки сходства последовательностей первичных аминокислот, сохранения функциональных доменов и критических аминокислот, участвующих в химически-белковых и белково-белковых взаимодействиях. Строки доказательств, собранных из каждого уровня анализа SeqAPASS, предсказывают химическую восприимчивость между видами, предоставляя последовательные и легко интерпретируемые данные. На сегодняшний день этот инструмент используется в широком спектре применений, включая идентификацию химических веществ, которые связываются с определенными рецепторами, и оценку потенциала считывания экологических рецепторов позвоночных с системами млекопитающих. Кроме того, здесь описаны два тематических исследования, посвященных белку распределения гормонов щитовидной железы, TTR и MOR, чтобы продемонстрировать новые функции и функциональность SeqAPASS v2 до v6.

Как и при любом вычислительном подходе, способность генерировать прогнозы восприимчивости видов в инструменте SeqAPASS сильно зависит от ввода соответствующих параметров 8,9,13. Поэтому крайне важно, чтобы до проведения анализа был проведен этап постановки проблемы для изучения существующих данных и литературы для намеченной цели. Начало анализа со знанием белковой мишени позволяет пользователю определить соответствующие числа присоединения белка и высококачественные последовательности. Аналогичным образом, знание чувствительных или целевых видов или модельных организмов, используемых в анализах или разработке AOP, обеспечивает выбор соответствующего вида запроса, с которым сравниваются все другие виды. Выбор функциональных доменов для уровня 2 и критических аминокислотных остатков для уровня 3 также является критическим этапом, который требует от пользователя определения соответствующих входных параметров для создания прогнозов. Из-за этой потребности в ранее существовавших знаниях о химическо-белковом взаимодействии в последних версиях инструмента SeqAPASS интегрируются удобные для пользователя ресурсы, предназначенные для того, чтобы помочь пользователям получить соответствующую информацию для инициирования запроса (например, ссылки на другие инструменты) (таблица 2 и рисунок 2). Кроме того, всплывающие информационные сообщения и оповещения были интегрированы в инструмент, чтобы направлять пользователя через анализ и информировать пользователя о любых ошибках, которые необходимо устранить.

Сложность химико-биологических взаимодействий представляет собой ограничение инструмента SeqAPASS. При экстраполяции данных о токсичности между видами сохранение молекулярной мишени является одним из многих факторов, которые следует учитывать. Адсорбция, распределение, метаболизм и экскреция (ADME) химического вещества имеют решающее значение при рассмотрении химической токсичности, поскольку химические вещества могут быть либо активированы, либо детоксифицированы этими процессами39,40. Другие факторы, такие как путь химического воздействия, стадия жизни организма и история жизни, а также диета, также могут играть важную роль в определении химической чувствительности у всех видов, а также41,42. Чтобы устранить это ограничение, важно понять основной вопрос, который SeqAPASS задает при прогнозировании химической восприимчивости: может ли белковая мишень химического вещества присутствовать у другого вида, на который химическое вещество может воздействовать? Этот вопрос решается путем выявления кандидатов в ортологии и рассмотрения сохранения этой цели по всем видам относительно известных чувствительных или целевых видов. Эта информация может быть использована в качестве линии доказательств для межвидовой экстраполяции и интегрирована в другие потоки доказательств (например, потенциал воздействия), чтобы лучше понять восприимчивость видов к химическим стрессорам. Обновления SeqAPASS включают интегрированные ссылки на внешние инструменты, включая базу знаний ECOTOX43 Агентства по охране окружающей среды США и Онлайновую систему охраны окружающей среды Службы охраны окружающей среды США (ECOS)44. Подключение к этим базам данных обеспечивает пользователям SeqAPASS легкий доступ к эмпирическим данным о химической токсичности для сравнения с прогнозами на основе последовательностей и средством идентификации видов, которые могут иметь охраняемый статус.

Инструмент SeqAPASS предоставляет научно обоснованную платформу для вычислительных прогнозов внутренней восприимчивости, которые поддерживаются концепциями в эволюционной биологии и примерами случаев, которые сравнивают прогнозы с доступными эмпирическими результатами. Кроме того, SeqAPASS является бесплатным и общедоступным на хорошо поддерживаемой веб-платформе, которая широко доступна (https://seqapass.epa.gov/seqapass/). Поскольку этот инструмент использует данные о последовательностях и информацию о белках из существующих баз данных, его способность прогнозировать химическую восприимчивость в более широком разнообразии видов постоянно улучшается по мере развития технологий секвенирования и секвенирования и аннотирования геномов новых видов. Хотя это дает явные преимущества в отношении доступности данных, это также представляет собой ограничение в том, что общедоступная информация о последовательностях может быть подвержена непоследовательному качеству, плохой аннотации и неполноте белковых последовательностей для некоторых видов. Тем не менее, многообещающе то, что технологии и методы омики в биоинформатике быстро развиваются, и, следовательно, курирование и качество последовательностей, вероятно, будут продолжать улучшаться с течением времени.

Одной из основных целей инструмента SeqAPASS является прозрачность, обеспечивающая доступ в виде ссылок на все источники данных и инструменты, которые интегрированы в бэкэнд. Такая прозрачность позволяет пользователю быстро получить доступ к исходным источникам последовательности или таксономической информации из NCBI. Область применимости этого инструмента определяется информацией, необходимой для проведения содержательного анализа. Поскольку знания о химическом взаимодействии между белком или белком и белком у известных чувствительных или целевых видов являются ключевыми элементами для начала запроса, следует признать, что запросы, выполненные без этой информации, не имеют смысла. Кроме того, химические вещества, которые имеют несколько неопределенных биологических целей или взаимодействуют с различными мишенями с разной степенью эффективности, также представляют собой проблему и ограничение инструмента в его нынешнем виде. Ожидается, что с улучшением биоинформатики, вычислительного моделирования и клеточного высокопроизводительного скрининга и транскриптомики будет по-прежнему выясняться больше знаний о разнообразии химического пространства в отношении взаимодействий с конкретными белками. Ожидается, что способность применять SeqAPASS к более широким задачам экстраполяции видов по сравнению с пониманием потенциала неблагоприятных химических воздействий на разнообразие видов будет продолжать улучшаться.

В заключение, инструмент SeqAPASS является доступной платформой, которая легко применяет молекулярную информацию для решения значительной проблемы межвидовой экстраполяции в оценках химической безопасности. Хотя примеры, приведенные здесь, сосредоточены на создании прогнозов химической восприимчивости, результаты также могут помочь в понимании общего сохранения биологических путей. Объединяя различные линии доказательств и облегчая доступ к нескольким платформам и базам данных, этот инструмент помогает создавать прозрачные кейсы для приоритизации химических испытаний и распределения ресурсов. С дальнейшим развитием научного и биоинформационного потенциала мощность и полезность инструмента будут продолжать расти и совершенствоваться для удовлетворения потребностей исследовательских и регулирующих сообществ при одновременном сокращении ресурсов, необходимых для межвидовых оценок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Авторы благодарят д-ра Даниэля Л. Вильнёва (Агентство по охране окружающей среды США, Центр вычислительной токсикологии и воздействия) и доктора Джона А. Дёринга (Департамент наук об окружающей среде, Университет штата Луизиана) за комментарии к более раннему проекту рукописи. Эта работа была поддержана Агентством по охране окружающей среды США. Мнения, выраженные в настоящем документе, являются мнениями авторов и не обязательно отражают взгляды или политику Агентства по охране окружающей среды США, а упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов не указывает на одобрение со стороны федерального правительства.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spreadsheet program N/A N/A Any program that can be used to view and work with csv files (e.g. Microsoft Excel, OpenOffice Calc, Google Docs) can be used to access data export files.
Basic computing setup and internet access N/A N/A SeqAPASS is a free, online tool that can be easily used via an internet connection. No software downloads are required.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krewski, D., et al. Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13 (2-4), 51-138 (2010).
  2. Wang, Z., Walker, G. W., Muir, D. C. G., Nagatani-Yoshida, K. Toward a global understanding of chemical pollution: A first comprehensive analysis of national and regional chemical inventories. Environmental Science & Technology. 54 (5), 2575-2584 (2020).
  3. Brooks, B. W., et al. Toxicology advances for 21st century chemical pollution. One Earth. 2 (4), 312-316 (2020).
  4. Kostal, J., Voutchkova-Kostal, A. Going all in: A strategic investment in in silico toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (4), 880-888 (2020).
  5. Cheng, W., Doering, J. A., LaLone, C., Ng, C. Integrative computational approaches to inform relative bioaccumulation potential of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS) across species. Toxicology Sciences. 180 (2), 212-223 (2021).
  6. Kostich, M. S., Lazorchak, J. M. Risks to aquatic organisms posed by human pharmaceutical use. Science of the Total Environment. 389 (2-3), 329-339 (2008).
  7. Gunnarsson, L., Jauhiainen, A., Kristiansson, E., Nerman, O., Larsson, D. G. Evolutionary conservation of human drug targets in organisms used for environmental risk assessments. Environmental Science & Technology. 42 (15), 5807-5813 (2008).
  8. LaLone, C. A., et al. Evidence for cross species extrapolation of mammalian-based high-throughput screening assay results. Environmental Science & Technology. 52 (23), 13960-13971 (2018).
  9. LaLone, C. A., et al. Editor's highlight: Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS): A web-based tool for addressing the challenges of cross-species extrapolation of chemical toxicity. Toxicology Sciences. 153 (2), 228-245 (2016).
  10. Head, J. A., Hahn, M. E., Kennedy, S. W. Key amino acids in the aryl hydrocarbon receptor predict dioxin sensitivity in avian species. Environmental Science & Technology. 42 (19), 7535-7541 (2008).
  11. Bass, C., et al. Mutation of a nicotinic acetylcholine receptor β subunit is associated with resistance to neonicotinoid insecticides in the aphid Myzus persicae. BMC Neuroscience. 12, 51-51 (2011).
  12. Erdmanis, L., et al. Association of neonicotinoid insensitivity with a conserved residue in the loop d binding region of the tick nicotinic acetylcholine receptor. Biochemistry. 51 (23), 4627-4629 (2012).
  13. Doering, J. A., et al. et al. In silico site-directed mutagenesis informs species-specific predictions of chemical susceptibility derived from the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) tool. Toxicology Sciences. 166 (1), 131-145 (2018).
  14. Noyes, P. D., et al. Evaluating chemicals for thyroid disruption: Opportunities and challenges with in vitro testing and adverse outcome pathway approaches. Environmental Health Perspectives. 127 (9), 95001 (2019).
  15. Park, G. Y., Jamerlan, A., Shim, K. H., An, S. S. A. Diagnostic and treatment approaches involving transthyretin in amyloidogenic diseases. Int J Mol Sci. 20 (12), 2982 (2019).
  16. Rabah, S. A., Gowan, I. L., Pagnin, M., Osman, N., Richardson, S. J. Thyroid hormone distributor proteins during development in vertebrates. Front Endocrinol (Lausane). 10, 506 (2019).
  17. Richardson, S. J. Cell and molecular biology of transthyretin and thyroid hormones. International Review of Cytology. 258, 137-193 (2007).
  18. Yamauchi, K., Ishihara, A. Transthyretin and Endocrine Disruptors. Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure and Biological Functions. Richardson, S. J., Cody, V. , Springer. Berlin Heidelberg, Germany. 159-171 (2009).
  19. Iakovleva, I., et al. Tetrabromobisphenol A is an efficient stabilizer of the transthyretin tetramer. PLoS One. 11 (4), 0153529 (2016).
  20. Ishihara, A., Sawatsubashi, S., Yamauchi, K. Endocrine disrupting chemicals: Interference of thyroid hormone binding to transthyretins and to thyroid hormone receptors. Molecular and Cellular Endocrinology. 199 (1), 105-117 (2003).
  21. Kar, S., Sepúlveda, M. S., Roy, K., Leszczynski, J. Endocrine-disrupting activity of per- and polyfluoroalkyl substances: Exploring combined approaches of ligand and structure based modeling. Chemosphere. 184, 514-523 (2017).
  22. Morais-de-Sa, E., Pereira, P. J., Saraiva, M. J., Damas, A. M. The crystal structure of transthyretin in complex with diethylstilbestrol: A promising template for the design of amyloid inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 279 (51), 53483-53490 (2004).
  23. Morgado, I., Campinho, M. A., Costa, R., Jacinto, R., Power, D. M. Disruption of the thyroid system by diethylstilbestrol and ioxynil in the sea bream (Sparus aurata). Aquatic Toxicology. 92 (4), 271-280 (2009).
  24. Yamauchi, K., Prapunpoj, P., Richardson, S. J. Effect of diethylstilbestrol on thyroid hormone binding to amphibian transthyretins. General and Comparative Endocrinology. 119 (3), 329-339 (2000).
  25. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  26. Ren, X. M., et al. Binding interactions of perfluoroalkyl substances with thyroid hormone transport proteins and potential toxicological implications. Toxicology. 366-367, 32-42 (2016).
  27. Wilson, N., Mbabazi, K., Seth, P., Smith, H., Davis, N. L. Drug and opioid-involved overdose deaths - United States, 2017-2018. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (11), 290-297 (2020).
  28. EPA. National Pollutant Discharge Elimination System (NPDES). United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/npdes/npdes-resources (2018).
  29. Duvallet, C., Hayes, B. D., Erickson, T. B., Chai, P. R., Matus, M. Mapping community opioid exposure through wastewater-based epidemiology as a means to engage pharmacies in harm reduction efforts. Preventing Chronic Disease. 17, 200053 (2020).
  30. Gushgari, A. J., Venkatesan, A. K., Chen, J., Steele, J. C., Halden, R. U. Long-term tracking of opioid consumption in two United States cities using wastewater-based epidemiology approach. Water Research. 161, 171-180 (2019).
  31. Lau, B., Bretaud, S., Huang, Y., Lin, E., Guo, S. Dissociation of food and opiate preference by a genetic mutation in zebrafish. Genes Brain Behave. 5 (7), 497-505 (2006).
  32. Bossé, G. D., Peterson, R. T. Development of an opioid self-administration assay to study drug seeking in zebrafish. Behavioural Brain Research. 335, 158-166 (2017).
  33. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  34. Manglik, A., et al. Crystal structure of the µ-opioid receptor bound to a morphinan antagonist. Nature. 485 (7398), 321-326 (2012).
  35. Comer, S. D., Cahill, C. M. Fentanyl: Receptor pharmacology, abuse potential, and implications for treatment. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 106, 49-57 (2019).
  36. Podlewska, S., Bugno, R., Kudla, L., Bojarski, A. J., Przewlocki, R. Molecular modeling of µ opioid receptor ligands with various functional properties: PZM21, SR-17018, morphine, and fentanyl-simulated interaction patterns confronted with experimental data. Molecules. 25 (20), 4636 (2020).
  37. Huang, W., et al. Structural insights into µ-opioid receptor activation. Nature. 524 (7565), 315-321 (2015).
  38. Lipiński, P. F. J., et al. Fentanyl family at the mu-opioid receptor: Uniform assessment of binding and computational analysis. Molecules. 24 (4), 740 (2019).
  39. Boland, L. A., Angles, J. M. Feline permethrin toxicity: Retrospective study of 42 cases. Journal of Feline Medicine and Surgery. 12 (2), 61-71 (2010).
  40. Stevenson, B. J., Pignatelli, P., Nikou, D., Paine, M. J. Pinpointing P450s associated with pyrethroid metabolism in the dengue vector, Aedes aegypti: developing new tools to combat insecticide resistance. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1595 (2012).
  41. Ankley, G. T., Gray, L. E. Cross-species conservation of endocrine pathways: A critical analysis of tier 1 fish and rat screening assays with 12 model chemicals. Environmental Toxicology and Chemistry. 32 (5), 1084-1087 (2013).
  42. Meteyer, C. U., Rideout, B. A., Gilbert, M., Shivaprasad, H. L., Oaks, J. L. Pathology and proposed pathophysiology of diclofenac poisoning in free-living and experimentally exposed oriental white-backed vultures (Gyps bengalensis). Journal of Wildlife Diseases. 41 (4), 707-716 (2005).
  43. EPA. ECOTOX User Guide: ECOTOXicology Knowledgebase System. EPA, United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://cfpub.epa.gov/ecotox/index.cfm (2021).
  44. ECOS Environmental Conservation Online System. U.S. Fish & Wildlife Service. , Available from: https://ecos.fws.gov/ecp/ (2021).

Tags

Генетика выпуск 192 Межвидовая экстраполяция экотоксикология прогностическая токсикология методология нового подхода опиоидные рецепторы транстиретин
Демонстрация выравнивания последовательностей для прогнозирования восприимчивости различных видов для быстрой оценки сохранения белка
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vliet, S. M. F., Hazemi, M., Blatz,… More

Vliet, S. M. F., Hazemi, M., Blatz, D., Jensen, M., Mayasich, S., Transue, T. R., Simmons, C., Wilkinson, A., LaLone, C. A. Demonstration of the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility Tool for Rapid Assessment of Protein Conservation. J. Vis. Exp. (192), e63970, doi:10.3791/63970 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter