Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

عرض توضيحي لمحاذاة التسلسل للتنبؤ عبر الأنواع أداة الحساسية للتقييم السريع لحفظ البروتين

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/63970
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 4, 5, 5, 5, 6
1Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Scientific Computing and Data Curation Division, U.S. Environmental Protection Agency, 2Oak Ridge Institute for Science and Education, 3Swenson College of Science and Engineering, Department of Biology, University of Minnesota Duluth, 4University of Wisconsin-Madison Aquatic Sciences Center, 5General Dynamics Information Technology, Research Triangle Park, 6Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Great Lakes Toxicology and Ecology Division, U.S. Environmental Protection Agency

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لاستخدام أحدث إصدار من أداة محاذاة تسلسل وكالة حماية البيئة الأمريكية للتنبؤ عبر قابلية الأنواع (SeqAPASS). يوضح هذا البروتوكول تطبيق الأداة عبر الإنترنت لتحليل حفظ البروتين بسرعة وتوفير تنبؤات قابلة للتخصيص وقابلة للتفسير بسهولة للحساسية الكيميائية عبر الأنواع.

Abstract

أداة محاذاة التسلسل لوكالة حماية البيئة الأمريكية للتنبؤ عبر قابلية الأنواع (SeqAPASS) هي تطبيق فحص سريع ومتاح مجانا عبر الإنترنت يسمح للباحثين والمنظمين باستقراء معلومات السمية عبر الأنواع. بالنسبة للأهداف البيولوجية في الأنظمة النموذجية مثل الخلايا البشرية والفئران والجرذان وسمك الزرد ، تتوفر بيانات السمية لمجموعة متنوعة من المواد الكيميائية. من خلال تقييم حفظ البروتين المستهدف ، يمكن استخدام هذه الأداة لاستقراء البيانات الناتجة عن هذه الأنظمة النموذجية لآلاف الأنواع الأخرى التي تفتقر إلى بيانات السمية ، مما يؤدي إلى تنبؤات بالحساسية الكيميائية الجوهرية النسبية. تضمنت أحدث إصدارات الأداة (الإصدارات 2.0-6.1) ميزات جديدة تسمح بالتوليف السريع وتفسير واستخدام البيانات للنشر بالإضافة إلى رسومات بجودة العرض.

من بين هذه الميزات تصورات البيانات القابلة للتخصيص وتقرير موجز شامل مصمم لتلخيص بيانات SeqAPASS لسهولة التفسير. تصف هذه الورقة البروتوكول لتوجيه المستخدمين من خلال تقديم الوظائف ، والتنقل في المستويات المختلفة لمقارنات تسلسل البروتين ، وتفسير وعرض البيانات الناتجة. يتم تسليط الضوء على الميزات الجديدة ل SeqAPASS v2.0-6.0. علاوة على ذلك ، تم وصف حالتي استخدام تركزان على الحفاظ على بروتين ترانسثيريتين ومستقبلات المواد الأفيونية باستخدام هذه الأداة. أخيرا ، تمت مناقشة نقاط القوة والقيود في SeqAPAS لتحديد مجال قابلية التطبيق للأداة وتسليط الضوء على التطبيقات المختلفة للاستقراء عبر الأنواع.

Introduction

تقليديا ، اعتمد مجال علم السموم بشكل كبير على استخدام الاختبارات الحيوانية الكاملة لتوفير البيانات اللازمة لتقييم السلامة الكيميائية. وعادة ما تكون هذه الأساليب مكلفة وكثيفة الاستخدام للموارد. ومع ذلك ، نظرا للعدد الكبير من المواد الكيميائية المستخدمة حاليا والوتيرة السريعة التي يتم بها تطوير مواد كيميائية جديدة ، هناك حاجة معترف بها على مستوى العالم لطرق أكثر كفاءة للفحص الكيميائي 1,2. أدت هذه الحاجة والتحول النموذجي الناتج عن التجارب على الحيوانات إلى تطوير العديد من طرق النهج الجديدة ، بما في ذلك فحوصات الفحص عالية الإنتاجية ، والنسخ عالي الإنتاجية ، وتسلسل الجيل التالي ، والنمذجة الحسابية ، والتي تعد استراتيجيات اختبار بديلة واعدة 3,4.

كان تقييم السلامة الكيميائية عبر تنوع الأنواع التي يحتمل أن تتأثر بالتعرض للمواد الكيميائية تحديا دائما ، ليس فقط مع اختبار السمية التقليدية ولكن أيضا مع طرق النهج الجديدة. وقد وفر التقدم في علم السموم المقارن والتنبؤي أطرا لفهم الحساسية النسبية للأنواع المختلفة، ولا يزال التقدم التكنولوجي في الأساليب الحسابية يزيد من إمكانية تطبيق هذه الأساليب. تمت مناقشة العديد من الاستراتيجيات على مدار العقد الماضي والتي تستفيد من قواعد بيانات تسلسل الجينات والبروتينات الحالية ، إلى جانب معرفة أهداف جزيئية كيميائية محددة ، لدعم النهج التنبؤية للاستقراء عبر الأنواع وتعزيز تقييمات السلامة الكيميائية بما يتجاوز الكائنات النموذجيةالنموذجية 5،6،7،8.

لدفع العلم إلى العمل ، والبناء على هذه الدراسات التأسيسية في علم السموم التنبؤي ، وتحديد أولويات جهود الاختبارات الكيميائية ، ودعم صنع القرار ، تم إنشاء أداة محاذاة تسلسل وكالة حماية البيئة الأمريكية للتنبؤ عبر قابلية الأنواع (SeqAPASS). هذه الأداة هي تطبيق عام ومتاح مجانا على شبكة الإنترنت يستخدم مستودعات عامة لمعلومات تسلسل البروتين الآخذة في التوسع باستمرار للتنبؤ بالقابلية الكيميائية عبر تنوع الأنواع9. استنادا إلى المبدأ القائل بأن الحساسية الجوهرية النسبية للأنواع لمادة كيميائية معينة يمكن تحديدها من خلال تقييم الحفاظ على أهداف البروتين المعروفة لتلك المادة الكيميائية ، تقارن هذه الأداة بسرعة تسلسلات الأحماض الأمينية البروتينية من نوع ذي حساسية معروفة لجميع الأنواع مع بيانات تسلسل البروتين الموجودة. يتم الانتهاء من هذا التقييم من خلال ثلاثة مستويات من التحليل ، بما في ذلك (1) تسلسل الأحماض الأمينية الأولية ، (2) المجال الوظيفي ، و (3) مقارنات بقايا الأحماض الأمينية الحرجة ، كل منها يتطلب معرفة أكثر تعمقا بالتفاعل الكيميائي والبروتين وتوفير دقة تصنيفية أكبر في التنبؤ بالحساسية. تتمثل إحدى نقاط القوة الرئيسية ل SeqAPASS في أنه يمكن للمستخدمين تخصيص تقييمهم وتحسينه عن طريق إضافة خطوط إضافية من الأدلة نحو الحفظ المستهدف بناء على مقدار المعلومات المتاحة فيما يتعلق بتفاعل البروتين الكيميائي أو البروتين والبروتين محل الاهتمام.

تم إصدار الإصدار الأول في عام 2016 ، والذي سمح للمستخدمين بتقييم تسلسل الأحماض الأمينية الأولية والمجالات الوظيفية بطريقة مبسطة للتنبؤ بالحساسية الكيميائية واحتوى على الحد الأدنى من قدرات تصور البيانات (الجدول 1). وقد تبين أن الاختلافات الفردية في الأحماض الأمينية هي محددات مهمة للاختلافات بين الأنواع في تفاعلات البروتين الكيميائي ، والتي يمكن أن تؤثر على الحساسية الكيميائية للأنواع10،11،12. لذلك ، تم تطوير الإصدارات اللاحقة للنظر في الأحماض الأمينية الحرجة المهمة للتفاعل الكيميائي المباشر13. استجابة لتعليقات أصحاب المصلحة والمستخدمين ، خضعت هذه الأداة لإصدارات سنوية مع ميزات جديدة إضافية مصممة لتلبية احتياجات كل من الباحثين والمجتمعات التنظيمية لمواجهة التحديات في الاستقراء عبر الأنواع (الجدول 1). أدى إطلاق الإصدار 5.0 من SeqAPASS في عام 2020 إلى ظهور ميزات تركز على المستخدم تتضمن خيارات تصور البيانات وتوليف البيانات والروابط الخارجية وخيارات جدول الملخص والتقرير والميزات الرسومية. وبشكل عام، أدت السمات والقدرات الجديدة لهذا الإصدار إلى تحسين توليف البيانات، وقابلية التشغيل البيني بين قواعد البيانات الخارجية، وسهولة تفسير البيانات للتنبؤ بالحساسية عبر الأنواع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الشروع في العمل

ملاحظة: يركز البروتوكول المعروض هنا على الأداة المساعدة والميزات الرئيسية. يمكن العثور على أوصاف مفصلة للطرق والميزات والمكونات على موقع الويب في دليل مستخدم شامل (الجدول 1).

الجدول 1: تطور أداة SeqAPASS. قائمة بالميزات والتحديثات المضافة إلى أداة SeqAPASS من نشرها الأولي. الاختصارات: SeqAPASS = محاذاة التسلسل للتنبؤ عبر قابلية الأنواع ؛ ECOTOX = قاعدة معارف علم السموم البيئية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

  1. انتقل إلى https://seqapass.epa.gov/seqapass باستخدام Chrome. حدد إما تسجيل الدخول لاستخدام حساب موجود أو اتبع التعليمات لإنشاء حساب SeqAPASS ، والذي سيسمح للمستخدمين بتشغيل وظائفهم المكتملة وتخزينها والوصول إليها وتخصيصها.
  2. قبل إجراء التحليل ، حدد أولا بروتينا مهما ونوعا مستهدفا أو حساسا من خلال مراجعة الأدبيات الموجودة أو البيانات الموجودة مسبقا (الشكل 1). نظرا لأن SeqAPASS يحتوي على روابط لموارد خارجية للمساعدة في تحديد بروتين الاستعلام ، انقر فوق الأزرار المنسدلة ضمن تحديد هدف البروتين للوصول إلى الموارد ذات الصلة.

Figure 1
الشكل 1: صياغة مشكلة SeqAPASS: رسم تخطيطي للمعلومات الأولية اللازمة لتحليل ناجح. الاختصارات: SeqAPASS = محاذاة التسلسل للتنبؤ عبر قابلية الأنواع ؛ LBD = مجال ربط الرباط. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: قابلية التشغيل البيني SeqAPASS عبر قواعد البيانات. رسم تخطيطي للأدوات الخارجية وقواعد البيانات والموارد المدمجة في SeqAPASS. الاختصارات: SeqAPASS = محاذاة التسلسل للتنبؤ عبر قابلية الأنواع ؛ AOP = مسار النتائج السلبية ؛ NCBI = المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية ؛ ECOTOX = قاعدة معارف علم السموم البيئية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 2: الروابط والموارد والأدوات المدمجة في أداة SeqAPASS. قائمة بمصادر البيانات المختلفة والروابط والموارد التي تم الاستفادة منها في أداة SeqAPASS. اختصار: SeqAPASS = محاذاة التسلسل للتنبؤ عبر قابلية الأنواع. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

2. تطوير وتشغيل استعلام SeqAPASS: Level 1

ملاحظة: في تحليل المستوى 1 ، تتم مقارنة تسلسل الأحماض الأمينية الأولية بالكامل لبروتين الاستعلام بتسلسل الأحماض الأمينية الأولية لجميع الأنواع مع معلومات التسلسل المتاحة. تستخدم هذه الأداة خوارزميات لاستخراج البيانات المتاحة للجمهور وجمعها وتجميعها لمحاذاة ومقارنة تسلسل الأحماض الأمينية بسرعة عبر الأنواع. تخزن الواجهة الخلفية المعلومات من قواعد بيانات المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) وتستخدم بشكل استراتيجي الإصدارات المستقلة من أداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية للبروتين (BLASTp)54 وأداة المحاذاة المتعددة القائمة على القيود (COBALT)55.

  1. ضمن مقارنة تسلسلات الأحماض الأمينية الأولية، انقر فوق إما حسب الأنواع أو حسب الانضمام. استخدم التحديد حسب الأنواع للكتابة أو الاختيار من قائمة الأنواع لاختيار هدف البروتين محل الاهتمام.
  2. أرسل مدخلات البروتين (أي معرف بروتين NCBI) مباشرة عن طريق إدخال الانضمام (الانضمامات) في مربع النص حسب الانضمام .
  3. حدد طلب تشغيل لإرسال الاستعلام. بمجرد الإرسال ، انتظر حتى يظهر إشعار في الزاوية العلوية اليمنى من نافذة المتصفح يشير إلى إرسال ناجح.
  4. حدد علامة التبويب حالة تشغيل SeqAPASS في أعلى الصفحة لعرض قائمة بجميع عمليات تشغيل SeqAPASS التي تم إجراؤها ضمن حساب المستخدم هذا والتحقق من النسبة المئوية للإكمال.
    1. انقر فوق تحديث البيانات أثناء تحديد زر الاختيار المناسب للتحقق من حالة تشغيل المستوى 2 والمستوى 3.
  5. حدد علامة التبويب عرض تقارير SeqAPASS في أعلى الصفحة للوصول إلى قائمة بجميع التقارير المكتملة ضمن هذا الحساب.
  6. في علامة التبويب عرض تقارير SeqAPASS ، حدد بروتين الاستعلام محل الاهتمام. انقر فوق طلب تقرير محدد لفتح صفحة معلومات بروتين الاستعلام من المستوى 1 وعرض النتائج وخيارات تخصيص البيانات والمرئيات والتقارير الموجزة.
  7. بشكل افتراضي، حدد عرض التقرير لعرض البيانات في مستعرض الويب. بدلا من ذلك، حدد حفظ التقرير لتنزيل البيانات الأولية كملف .zip.
    ملاحظة: سيختلف الوقت اللازم لتحليل المستوى 1 (متوسط 23 دقيقة للإصدار 5.1) اعتمادا على طلب المستخدم العالمي في ذلك الوقت وعدد الوظائف المقدمة إلى قائمة الانتظار وكمية معلومات البروتين الموجودة للوظيفة المقدمة. إذا تم الانتهاء من هدف البروتين مسبقا ، فستكون البيانات متاحة في ثوان عند التقديم.

3. تطوير وتشغيل استعلام SeqAPASS: Level 2

ملاحظة: نظرا لأن تسلسل البروتين بأكمله لا يشارك بشكل مباشر في تفاعل كيميائي ، فإن تحليل المستوى 2 يقارن فقط تسلسل الأحماض الأمينية للمجال الوظيفي لعمل تنبؤات الحساسية في الرتب التصنيفية الدنيا (على سبيل المثال ، الفئة ، الترتيب ، العائلة).

  1. من صفحة معلومات بروتين استعلام المستوى 1، انقر فوق علامة الجمع + بجوار رأس المستوى 2 لملء قائمة استعلام المستوى 2 .
  2. تحديد المجال (المجالات) المناسب في البروتين محل الاهتمام (بروتين الاستعلام).
    1. إذا لم يتم تحديد نطاق ، فانقر فوق الارتباط المتكامل إلى قاعدة بيانات المجالات المحفوظة NCBI (CDD) (الجدول 1) ، والتي يمكن أن تساعد في تحديد اختيار النطاق المناسب.
      ملاحظة: عادة ما يتم تحديد نطاقات نتائج محددة فقط كاستعلامات في المستوى 2.
  3. انقر فوق المربع تحديد مجال لتعبئة قائمة المجالات الوظيفية لبروتين الاستعلام تلقائيا.
  4. حدد الانضمام (الانضمامات) إلى المجال من القائمة المنسدلة وابدأ استعلام المستوى 2 بالنقر فوق الزر طلب تشغيل المجال . بمجرد الإرسال ، انتظر حتى يظهر إشعار يشير إلى إرسال ناجح.
  5. انقر فوق تحديث تشغيل المستوى 2 و 3 لملء بيانات المستوى 2، والتي ستكون متاحة في غضون ثوان من الإرسال.
  6. ضمن عرض بيانات المستوى 2، حدد انضمام (انضمامات) المجال المكتمل من القائمة المنسدلة وانقر فوق الزر عرض بيانات المستوى 2 لفتح النتائج في صفحة جديدة.

4. الوصول إلى البيانات وفهمها: SeqAPASS المستوى 1 والمستوى 2

  1. قم بالتمرير إلى أسفل صفحة معلومات بروتين الاستعلام لعرض تقرير النتائج - يتم توفير تقرير أساسي مع تحليلات المستوى 1 و 2 افتراضيا. حدد زر الاختيار التقرير الكامل لعرض تقرير أكثر تفصيلا يوفر جميع نتائج التسلسل ومقاييس المحاذاة. انقر فوق الانضمام / المعرف / الاسم المناسب في كلا التقريرين للوصول إلى محاذاة البروتين الشفافة ومعلومات التصنيف في قاعدة بيانات NCBI.
  2. قم بالتمرير إلى الجانب الأيسر من جدول النتائج لعرض عمود ECOTOX . انقر فوق الروابط إلى قاعدة معارف علم السموم البيئية (ECOTOX) لجمع بيانات السمية المقابلة بسرعة للأنواع ذات تنبؤات الحساسية.
    ملاحظة: ECOTOX هي قاعدة معارف شاملة ومتاحة للجمهور توفر بيانات سمية كيميائية واحدة للنباتات المائية والبرية والحياة البرية. يتضمن SeqAPASS v6.0 عنصر واجهة مستخدم ECOTOX للاتصال ببيانات ECOTOX ذات الصلة بسرعة أكبر حسب المواد الكيميائية والأنواع ذات الأهمية.
  3. انقر على تنزيل الجدول لحفظ الجدول كملف جدول بيانات. انقر فوق الزر عرض تقرير ملخص لعرض وتنزيل جدول تقرير ملخص يعرض البيانات التي تم فرزها حسب مجموعة التصنيف.
    ملاحظة: تتوفر جداول ملخص البيانات لكل من التقارير الأولية والكاملة وتقدم نظرة عامة على التنبؤات لهدف معين.

5. معالجة إعدادات البيانات: SeqAPASS المستوى 1 والمستوى 2

ملاحظة: في كل من تحليلات المستوى 1 والمستوى 2 ، يفترض أنه كلما زاد تشابه البروتين ، زاد احتمال تفاعل مادة كيميائية مع البروتين بطريقة مماثلة لأنواع / بروتين الاستعلام ، مما يجعلها عرضة للتأثيرات المحتملة للمواد الكيميائية مع هذا الهدف الجزيئي. نظرا لتشابه هذه البيانات ، يتم تحديد خطوات فهم بيانات المستوى 1 و 2 معا في بروتوكول واحد.

  1. ارجع إلى القوائم الفرعية في الجزء العلوي من معلومات بروتين الاستعلام للوصول إلى إعدادات التقرير ومعالجتها واستخدام الإعدادات الافتراضية لجميع خيارات التقرير لمعظم التحليلات. إذا كان هناك مبرر علمي لتغيير الإعداد الافتراضي، اتبع هذه الخطوات الاختيارية:
    1. (اختياري) انقر فوق علامة الجمع + بجوار قطع الحساسية لعرض إعدادات قطع الحساسية وضبطها في علامة تبويب جديدة. حدد إما قيمة قطع جديدة من قائمة منسدلة أو أدخل قيمة قطع معرفة من قبل المستخدم.
    2. (اختياري) قم بتغيير الرقم في حقل E-Value (عدد المحاذاة المختلفة المتوقع حدوثها عن طريق الصدفة) إذا كان هناك شيء آخر غير الافتراضي مطلوب.
      ملاحظة: سيتم استبعاد أي بروتين له قيمة E أكبر من الرقم الموجود في المربع من التقرير الأساسي.
    3. (اختياري) استخدم الخيار فرز حسب المجموعة التصنيفية لاختيار مستوى التسلسل الهرمي للتصنيف لعرضه في عمود المجموعة التصنيفية المصفاة في جدول النتائج.
      ملاحظة: سيؤدي تغيير التسلسل الهرمي للتصنيف أيضا إلى تغيير التنبؤ بالقابلية للتأثر بناء على الأنواع من كل مجموعة تمت تصفيتها والتي توجد فوق الحد الأقصى.
    4. (اختياري) قم بتغيير الحقل المجال المشترك (عدد المجالات الشائعة التي يجب أن يشاركها البروتين مع بروتين الاستعلام ليتم تضمينه في النتائج) إذا كان هناك شيء آخر غير الافتراضي مطلوب.
      ملاحظة: نظرا لأن الإعداد الافتراضي هو 1، سيتم استبعاد أي تسلسل لا يشترك في مجال مشترك واحد على الأقل مع بروتين الاستعلام.
    5. (اختياري) حدد لا ضمن الأنواع اقرأ عبر لاستعادة تنبؤات الحساسية ل Y فقط إذا كانت النسبة المئوية للتشابه أكبر من أو تساوي الحد الفاصل أو إذا تم تحديد الضربة كمرشح تقويم العظام.
      ملاحظة: يتم تعيين هذا الإعداد افتراضيا إلى نعم، مما يعني أنه سيتم الإبلاغ عن تنبؤ الحساسية ل Y لجميع المرشحين ل ortholog، وجميع الأنواع المدرجة فوق حد الحساسية، وجميع الأنواع الموجودة أسفل الحد الفاصل من نفس المجموعة التصنيفية مع نوع واحد أو أكثر فوق الحد الأقصى.
  2. انقر فوق الزر تنزيل إعدادات التقرير الحالي لتنزيل ملف يلتقط الإعدادات الحالية المطبقة.
    ملاحظة: سيحدد مستوى التقييم المحدد (1 أو 2 أو 3) الإعدادات المعروضة في التقرير.

6. تصور البيانات: SeqAPASS المستوى 1 والمستوى 2

  1. انقر فوق علامة الجمع + بجوار المرئيات وانقر فوق الزر تصور البيانات لفتح علامة تبويب منفصلة تعرض المعلومات المعرفة من قبل المستخدم وخيار تحديد رسم بياني تفاعلي للنتائج.
  2. انقر فوق Boxplot لفتح عناصر تحكم boxplot و plot التفاعلية والسماح لمرئيات boxplot بالتحديث بنشاط لتعكس التغييرات التي تطرأ على جدول البيانات وتوفر رسومات بجودة النشر والعرض التقديمي.
    ملاحظة: يعرض مخطط المربع الافتراضي مجموعات الأنواع على المحور السيني والنسبة المئوية للتشابه على المحور ص. تعرض Boxplots قطع الحساسية (الخط المتقطع) ، والنسبة المئوية للتشابه عبر الأنواع مقارنة بأنواع الاستعلام ، والقيم المتوسطة والمتوسطة لكل مجموعة تصنيفية جنبا إلى جنب مع النسب المئوية 25 و 75 والنطاق الربيعي. اعتمادا على الهدف من التحليل واحتياجات المستخدم ، يمكن تعديل العديد من ميزات boxplot من خلال الخطوات الاختيارية التالية.
    1. (اختياري) لتخصيص المجموعات التصنيفية المعروضة، راجع المربع المجموعات التصنيفية ضمن قسم عناصر التحكم . قم بإزالة المجموعات عن طريق التمرير فوق الأسماء وتحديد x أو باستخدام القائمة المنسدلة المجموعات التصنيفية .
    2. (اختياري) لإضافة وسيلة إيضاح تحدد نوعا مثيرا للاهتمام أو مجموعات محددة مسبقا (على سبيل المثال ، الأنواع المهددة بالانقراض أو المهددة) ، مرر مؤشر الماوس فوق اسم مجموعة تصنيفية على المحور السيني لتنشيط مربع منبثق يسرد الأنواع الثلاثة الأولى مرتبة حسب أعلى نسبة تشابه. مرر مؤشر الماوس فوق الأنواع في وسيلة الإيضاح لإنشاء مربع منبثق يحتوي على معلومات الأنواع المقابلة. انقر فوق المربع الخاص بمجموعة تصنيفية محددة لإنشاء جدول ملخص قابل للتنزيل يسرد الأنواع والتنبؤات.
  3. انقر فوق تنزيل Boxplot لاختيار نوع ملف ، وتخصيص دقة العرض / الارتفاع ، وحفظ المرئيات.

7. تطوير وتشغيل تحليل SeqAPASS: Level 3

ملاحظة: يقوم تحليل المستوى 3 بتقييم بقايا الأحماض الأمينية التي يحددها المستخدم داخل بروتين الاستعلام ويقارن بسرعة حفظ هذه المخلفات عبر الأنواع. يفترض أن الأنواع التي يتم فيها حفظ هذه المخلفات من المرجح أن تتفاعل مع مادة كيميائية بطريقة مماثلة لنوع / بروتين النموذج. نظرا لأن المستوى 3 يركز على الأحماض الأمينية الفردية ، فلا يمكن إجراء التحليل إلا عند توفر معرفة تفصيلية ببقايا الأحماض الأمينية المهمة للتفاعل بين البروتين الكيميائي أو البروتين والبروتين.

  1. انقر فوق علامة الجمع + بجوار رأس المستوى 3 في صفحة معلومات بروتين استعلام المستوى 1 لتعبئة قائمة استعلام المستوى 3.
  2. انقر فوق علامة الجمع + بجوار مستكشف المراجع لفتح أداة مستكشف المراجع ، والتي تنشئ سلسلة منطقية محددة مسبقا للاستعلام عن الأدبيات المتاحة وتساعد المستخدمين في تحديد الأدبيات المناسبة لدعم تحديد الأحماض الأمينية الحرجة لاستخدامها في تقييم المستوى 3 (الجدول 2 والشكل 2).
    1. (اختياري) بمجرد ملء بروتين الاستعلام تلقائيا، استخدم الدالة إضافة اسم البروتين لإضافة بروتينات إضافية.
  3. انقر على الرابط إنشاء الباحث العلمي من Google لفتح نافذة منبثقة تحتوي على سلسلة بحث تم إنشاؤها تلقائيا تتضمن عبارات بحث ذات صلة.
  4. انقر على البحث في الباحث العلمي من Google للاستعلام عن قاعدة بيانات الأدبيات باستخدام سلسلة البحث.
    1. بدلا من ذلك، انقر فوق نسخ إلى الحافظة وقم بتخصيص سلسلة البحث عن طريق إضافة المصطلحات أو إزالتها باستخدام الدالات الموجودة في مستكشف المراجع.

8. تحديد بقايا الأحماض الأمينية الحرجة باستخدام الأدبيات المحددة

  1. حدد تسلسل القالب الذي ستتم محاذاة الأنواع المحددة من قبل المستخدم إليه في قائمة استعلام المستوى 3.
    ملاحظة: يتم اختيار تسلسل القالب هذا بشكل شائع بناء على الأدبيات التي تم تحديد الأحماض الأمينية الحرجة لها ويمكن أن تكون هي نفسها أو نوع مختلف عن تلك التي تم الاستعلام عنها في المستوى 1 والمستوى 2.
    1. (اختياري) استخدم المربع مقارنات إضافية لمقارنة أي مدخلات/تسلسلات لا تظهر في جداول التقرير الأساسي/الكامل .
  2. أدخل اسما معرفا من قبل المستخدم لتشغيل المستوى 3 في مربع النص إدخال اسم تشغيل المستوى 3 لتحديد تشغيل المستوى 3 المكتمل. اختر اسما فريدا لكل تقييم.
  3. حدد المجموعة التصنيفية محل الاهتمام في الحقل اختيار مجموعة (مجموعات) تصنيفية . حدد مجموعة تصنيفية لتصفية الجدول تلقائيا حسب هذه المجموعة التصنيفية.
  4. في جدول النتائج، انقر يدويا فوق خانة الاختيار بجانب أي نوع لتتم محاذاته مع تسلسل القالب.
    ملاحظة: لضمان المحاذاة المناسبة، ينبغي مقارنة مجموعة تصنيفية واحدة في كل مرة بالقالب. حدد فقط البروتينات المشروحة بالمثل للأنواع ذات الاهتمام. عند اختيار تسلسلات للمقارنة ، من المهم الانتباه إلى تسلسلات معينة (على سبيل المثال ، افتراضية أو منخفضة الجودة أو جزئية). ما لم يكن هناك مبرر شفاف للإدراج ، فمن الأفضل استبعاد هذه التسلسلات لأنها قد تشوه التنبؤات بسبب معلومات التسلسل غير الكاملة أو غير المناسبة.
  5. كرر الخطوات لمحاذاة جميع المجموعات التصنيفية ذات الأهمية.
  6. انقر فوق تحديث تشغيل المستوى 2 و3 بمجرد محاذاة جميع الأنواع لملء قائمة تحديد اسم تشغيل المستوى 3 بمهام المستوى 3 المكتملة والحصول على البيانات من محاذاة المستوى 3 على الفور.
  7. انقر فوق دمج بيانات المستوى 3 لدمج المحاذاة من مجموعات تصنيفية متعددة.
    1. بدلا من ذلك، لعرض تقرير واحد، حدد الاسم المعرف من قبل المستخدم ضمن اختيار استعلام للعرض وانقر فوق عرض بيانات المستوى 3.
  8. حدد قالب المستوى 3 لاستخدامه كأساس لمقارنة بقايا الأحماض الأمينية ضمن قائمة دمج تقارير المستوى 3 وانقر فوق التالي.
  9. في وظائف المستوى 3، حدد الوظائف المكتملة للمقارنة وانقر فوق التالي. استخدم وظيفة مهام مستوى الطلب 3 لإعادة ترتيب المجموعات التصنيفية إذا رغبت في ذلك. انقر فوق عرض بيانات المستوى 3 لإنتاج صفحة تقرير المستوى 3 مع محاذاة مجموعات التصنيف المدمجة.
  10. حدد مواضع الأحماض الأمينية المحددة مسبقا لأنواع القالب عن طريق كتابة موضع ( مواضع ) الأحماض الأمينية، مفصولة بفواصل، في المربع إدخال مواضع بقايا الأحماض الأمينية ثم تحديد نسخ إلى قائمة البقايا . حدد المخلفات مباشرة في تسلسل القالب من صندوق المكوك.
  11. انقر فوق تحديث التقرير لتحديث الصفحة وعرض توقعات قابلية التعرض للمستوى 3.
    ملاحظة: يستخدم المستوى 3 مجموعة بسيطة من القواعد المشتقة من الواصفات الأساسية للخصائص الوظيفية للسلسلة الجانبية (على سبيل المثال ، الأليفاتية والعطرية) والأبعاد الجزيئية (اختلافات الوزن الجزيئي >30 جم / مول) لتحديد ما إذا كانت الاختلافات في المواضع الرئيسية من المحتمل أن تؤثر على تفاعلات البروتين13.

9. تصور بيانات المستوى 3 SeqAPASS

ملاحظة: كما هو الحال في المستويات السابقة ، تتوفر التقارير الأولية والكاملة. بالإضافة إلى البيانات المطابقة للبيانات الموجودة في المستوى 1 و 2 ، يعرض التقرير الأساسي مواضع الأحماض الأمينية والاختصارات وحساسية نعم / لا (Y / N) مماثلة لتوقع القالب. وبالمثل ، يحتوي التقرير الكامل على معلومات حول تصنيف السلسلة الجانبية للأحماض الأمينية والوزن الجزيئي.

  1. في صفحة تقرير المستوى 3، مرر إلى أسفل لعرض تقرير بالنتائج. انقر على تنزيل الجدول في أسفل التقرير لحفظ الجدول.
  2. انقر فوق عرض تقرير ملخص المستوى 3 لعرض وتنزيل جدول تقرير ملخص يعرض البيانات التي تم فرزها حسب مجموعة التصنيف. انقر فوق علامة الجمع + بجوار المرئيات في صفحة تقرير المستوى 3 لفتح علامة تبويب متصفح منفصلة تعرض المعلومات المعرفة من قبل المستخدم وخيار عرض النتائج في شكل خريطة حرارية تفاعلية.
  3. انقر فوق خريطة حرارية في صفحة معلومات المرئيات لفتح الرسم التفاعلي وعناصر التحكم والسماح لمرئيات الخريطة الحرارية بالتحديث النشط لتعكس التغييرات التي تطرأ على جدول البيانات. قم بتنفيذ الخطوات الاختيارية التالية لتخصيص الخريطة الحرارية.
    1. (اختياري) حدد خيارات التقرير للتغيير بين تقرير بسيط، والذي يعرض موضع الأحماض الأمينية، والاختصار المكون من حرف واحد، وتشابه الأحماض الأمينية، أو التقرير الكامل، الذي يعرض معلومات تفصيلية عن كل حمض أميني محدد.
    2. (اختياري) حدد خيارات التقرير لتغيير كيفية عرض الأنواع، إما بالاسم الشائع أو الاسم العلمي.
      ملاحظة: ضمن التقرير البسيط ، يتم تصنيف الأحماض الأمينية على أنها مطابقة كاملة (أزرق غامق) ، أو مطابقة جزئية (أزرق فاتح ، بدائل تلبي معيارا واحدا فقط) ، أو غير مطابقة (أصفر ، بدائل لا تفي بأي من المعيارين) إلى قالب الأحماض الأمينية. يعرض التقرير الكامل المقارنات إما كمطابقة إجمالية (أزرق غامق) أو غير مطابقة (أصفر).
    3. (اختياري) حدد تحديدات اختيارية لإبراز معلومات مفيدة مثل مرشحي Ortholog أو الأنواع المهددة بالانقراض أو الأنواع المهددة بالانقراض أو الكائنات النموذجية الشائعة.
    4. (اختياري) حدد إعدادات الخريطة الحرارية لتحديد خيارات تخصيص إضافية، بما في ذلك إضافة أو إزالة الأعمدة ووسائل الإيضاح والنص.
  4. انقر فوق تنزيل Boxplot لاختيار نوع ملف وحفظ المرئيات.

10. تفسير نتائج SeqAPASS: خطوط الأدلة للحفاظ على البروتين

ملاحظة: لتسهيل التفسير، تتضمن هذه الأداة تقرير ملخص القرار (DS Report) المصمم لدمج البيانات عبر المستويات. يحتوي تقرير DS على النتائج (أي جداول البيانات و / أو التصورات) التي اختارها المستخدم ويسمح بالتقييم السريع لتنبؤات الحساسية عبر مستويات متعددة لأنواع متعددة في وقت واحد.

  1. انقر فوق دفع المستوى # إلى تقرير DS من النتائج أو صفحات تصور البيانات وانتظر حتى يتم "دفع" البيانات وعلامة التبويب تقرير DS لتصبح نشطة.
    ملاحظة: إذا لم يتم دفع النتائج أو أي تغييرات إلى تقرير DS ، فسيظل Push Level # إلى DS Report نشطا حتى يتم تحديده. إذا تم تغيير أحد الإعدادات، فسيظهر النص انقر لدفع التغييرات الجديدة حتى يتم دفع التغييرات إلى التقرير. يمكن دفع المرئيات إلى تقرير DS في أي وقت أثناء التقييم.
  2. حدد علامة التبويب تقرير DS في أي وقت للوصول إلى صفحة DS .
    ملاحظة: بالنسبة لجميع الأنواع المحاذاة في المستوى 1 ، يحتوي جدول تقرير ملخص القرار النهائي على البيانات المهمة وتنبؤات الحساسية لكل تحليل. إذا لم يتم تضمين نوع في جدول DS في تقرير المستوى 3 ولكن تم العثور عليه في وظائف المستوى 1 و / أو المستوى 2 ، فستتلقى الخلية الموجودة في الجدول تسمية غير قابلة للتطبيق (NA) للتنبؤ بحساسية المستوى 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لإثبات تطبيق أداة SeqAPASS وتسليط الضوء على الميزات الجديدة ، تم وصف دراستي حالة تمثلان الحالات التي يتنبأ فيها حفظ البروتين بوجود اختلافات في الحساسية الكيميائية عبر الأنواع (ترانسثيريتين بشري) وأنه لا توجد اختلافات (μ مستقبلات المواد الأفيونية [MOR]). يتناول أول هذه الأمثلة تسلسل البروتين / المقارنات الهيكلية للتنبؤ بمجال قابلية التطبيق لمسارات النتائج السلبية (AOPs ، انظر الجدول 2 للتعريف) ، بينما يركز الثاني على تطوير فرضيات بحثية ذات صلة بقابلية الأنواع المشتركة للمواد الأفيونية الموجودة في مياه الصرف الصحي. يمكن تطبيق النهج الأساسية الموصوفة في دراسات الحالة هذه على أي مادة كيميائية وإظهار الفائدة الواسعة لهذه الأداة لصنع القرار والبحث.

هرمونات الغدة الدرقية ضرورية للنمو والتطور الطبيعي. يتم تصنيعها في الغدة الدرقية وإفرازها في مجرى الدم حيث ترتبط ببروتينات التوزيع ويتم تداولها في جميع أنحاء الجسم14،15،16،17،18. أظهرت الدراسات الحديثة أن الملوثات البيئية ، مثل ثنائي الفينيل متعدد الكلور (PCBs) ، والإثيرات ثنائية الفينيل متعددة البروم (PBDEs) ، ومواد per- و polyfluoroalkyl (PFAS) ، يمكن أن ترتبط بشكل تنافسي بتوزيع بروتين transthyretin (TTR) وتعطل عمليات الغدة الدرقية الطبيعية19،20،21،22،23،24،25 . تم تطوير AOP يصف الارتباط التنافسي ب TTR مما يؤدي إلى سمية النمو العصبي البشري (https://aopwiki.org/aops/152). في حين أن هناك أدلة على أن AOP ينطبق أيضا على القوارض ، إلا أن قابلية التطبيق على المجموعات التصنيفية الأخرى لم يتم تحديدها بعد. نظرا لوجود مواد كيميائية ملزمة ل TTR في البيئة ، من المهم فهم الأهمية التصنيفية ل AOP ، وهو تحد يمكن معالجته جزئيا من خلال تحليل SeqAPASS. باستخدام استراتيجية صياغة مشكلة الأداة ، يمكن تحديد الهدف من التحليل على النحو التالي: مع العلم أن المركبات المرتبطة ب TTR تؤدي إلى نتائج سلبية في البشر ، ما هي المجموعات التصنيفية التي من المتوقع أن تشترك في حساسية مماثلة؟

يتميز بروتين ترانسثيريتين البشري بشكل جيد ، وهناك العديد من الروابط المدروسة جيدا والمعروفة بارتباطها في موقع ربط TTR البشري (hTTR) ، مما يجعله الهدف الأمثل لتحليل SeqAPASS8،9،13. باستخدام انضمام NCBI لترانسثيريتين الإنسان ، P02766.1 ، تم إجراء تحليل المستوى 1 مع الإعدادات الافتراضية. حددت نتائج تحليل المستوى 1 قطع النسبة المئوية للتشابه عند 49٪ ، مع الثدييات (الثدييات) والطيور (Aves) والزواحف (Testudines و Lepidosauria و Crocodylia) والبرمائيات (Amphibia) ومعظم أنواع الأسماك (Actinopteri و Coelacanthimorpha و Cladissta و Chondrichthyes) تقع فوق هذا الحد (الشكل 3). وهكذا، فإن جميع الأنواع من هذه المجموعات التصنيفية أدت إلى التنبؤ بحساسية "Y" (أي نعم) ومن المحتمل أن تكون عرضة للمواد الكيميائية المعروفة بتفاعلها مع hTTR (الشكل 3 والملف التكميلي 1).

بالنسبة لتقييم المستوى 2 للمجال (المجالات) الوظيفية ، تم استخدام قاعدة بيانات المجال المحفوظ NCBI لتحديد TR_THY (الانضمام smart00095) كمجال محفوظ يضم السلسلة الناضجة لبروتين الوحدة الفرعية TTR من المخلفات 27 إلى 147. نظرا لأن تسلسل البروتين في TTR المبلغ عنه في NCBI يتضمن 20 جزءا مسبقا من الأحماض الأمينية غير ذي صلة بالتحليل الحالي ، فإن تركيز المقارنة على السلسلة الناضجة يوفر خطا إضافيا أكثر تحديدا من الأدلة نحو الحفاظ على هذا البروتين عبر الأنواع. من تقييم المستوى 2 ، تم الإبلاغ عن قطع تشابه بنسبة 58٪ ، مع سقوط الثدييات والطيور والزواحف والبرمائيات ومعظم أنواع الأسماك مرة أخرى فوق هذا الحد (الشكل 4). ونتيجة لذلك، خلص SeqAPASS إلى تنبؤ بحساسية "Y" (أي نعم) للأنواع من هذه المجموعات التصنيفية، مما يشير إلى أنها من المحتمل أن تكون عرضة للمواد الكيميائية التي تتفاعل مع بروتين hTTR (الشكل 4 والملف التكميلي 1). وعموما، تشير نتائج تحليلات المستويين 1 و2 إلى أن معظم أنواع الفقاريات تشترك في حفظ hTTR ومن المحتمل أن تكون عرضة للمواد الكيميائية المعروفة بتفاعلها مع هذا البروتين.

Figure 3
الشكل 3: تحليل SeqAPASS المستوى 1 لحفظ الترانسثيريتين عبر المجموعات التصنيفية مع معلومات التسلسل المتاحة بالنسبة للبروتين البشري. يتم عرض النسبة المئوية للتشابه في تسلسل الأحماض الأمينية البروتينية على المحور Y ؛ يتم عرض المجموعة التصنيفية على المحور X. تشير الدوائر المفتوحة (○) إلى تسلسل الاستعلام ، وتشير الدوائر المغلقة (●) إلى الأنواع داخل المجموعة التصنيفية ذات التشابه الأعلى في المائة. داخل المخطط ، يمثل الجزء العلوي والسفلي من كل مربع النسب المئوية 75و 25 ، وتمتد الشعيرات إلى 1.5 ضعف النطاق الربيعي ، ويتم تمثيل القيم المتوسطة والمتوسطة بخطوط سوداء أفقيةعلى الصندوق . يشير الخط المتقطع إلى الحد الفاصل لتنبؤات الحساسية. الاختصارات: TTR = ترانسثيريتين ؛ SeqAPASS = محاذاة التسلسل للتنبؤ عبر قابلية الأنواع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: تحليل SeqAPASS المستوى 2 لحفظ مجال ربط مستقبلات الترانسثيريتين عبر المجموعات التصنيفية مع معلومات التسلسل المتاحة بالنسبة للبروتين البشري LBD. يتم عرض النسبة المئوية للتشابه في تسلسل الأحماض الأمينية لمجال ربط الرباط على المحور Y ؛ يتم عرض المجموعة التصنيفية على المحور X. تشير الدوائر المفتوحة (○) إلى تسلسل الاستعلام ، وتشير الدوائر المغلقة (●) إلى الأنواع داخل المجموعة التصنيفية ذات التشابه الأعلى في المائة. داخل المخطط ، يمثل الجزء العلوي والسفلي من كل مربع النسب المئوية 75و 25 ، وتمتد الشعيرات إلى 1.5 ضعف النطاق الربيعي ، ويتم تمثيل القيم المتوسطة والمتوسطة بخطوط سوداء أفقيةعلى الصندوق . يشير الخط المتقطع إلى الحد الفاصل لتنبؤات الحساسية. الاختصارات: TTR = ترانسثيريتين ؛ SeqAPASS = محاذاة التسلسل للتنبؤ عبر قابلية الأنواع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ومن خلال تحليل دراسات النمذجة الجزيئية وعلم البلورات البروتينية، تم تحديد الأحماض الأمينية في منطقة الربط من TTR التي يتوقع أن تتفاعل مع الرباط الداخلي 3,3′,5,5′-tetraiodo-L-thyronine (T4, PDB 2ROX)، فضلا عن ثلاث مواد كيميائية بيئية: سلفونات الأوكتين المشبعة بالفلور (PFOS، PDB 5JIM)، رباعي البروم ثنائي الفينول ألف (TBBPA، PDB 5HJG)، وثنائي إيثيل ستيلبوستيرول (DES, PDB 1TZ8)19، 21،22،26. تم تحديد بقايا الأحماض الأمينية Lys35 و Ser137 و Leu130 و Ala128 و Ala129 و Thr139 على أنها تلعب دورا رئيسيا في تفاعلات البروتين والرباط ، إما من خلال تفاعلات الروابط الهيدروجينية المباشرة أو تفاعلات فان دير فال. تم تقييم بقايا الأحماض الأمينية الستة هذه في تحليل المستوى 3 عبر الأنواع باستخدام hTTR كتسلسل قالب واستبعاد التسلسلات غير المتماثلة والافتراضية والجزئية ومنخفضة الجودة (الملف التكميلي 1). نظرا لأنه تم تحديد سابقا أن TTR محفوظ فقط عبر أنواع الفقاريات ، فقد تم استبعاد أنواع اللافقاريات من هذا التحليل (الشكل 3 والشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، من المهم ملاحظة أن مواضع الأحماض الأمينية المبلغ عنها في الأدبيات تستبعد 20 جزءا مسبقا من الأحماض الأمينية غير موجودة في بروتين hTTR الناضج ، ولهذا السبب ، تم تعديل المواضع المقدمة في المستوى 3 من تلك المبلغ عنها في الأدبيات لضمان المحاذاة الدقيقة لبروتين القالبالمحدد 15 (الملف التكميلي 1).

في تحليل المستوى 3 ل TTR ، تم اختيار 294 نوعا من الفقاريات للمحاذاة (الثدييات والطيور والبرمائيات والزواحف والأسماك). من بين الأنواع التي تم تقييمها ، أظهر 18 نوعا اختلافات في الأحماض الأمينية الرئيسية مما أدى إلى التنبؤ بحساسية "N" (أي لا). ومن المثير للاهتمام أن خمسة أنواع من الثدييات البحرية قدمت بديلا للأحماض الأمينية في الموضع 2 (128A) ، بينما أظهرت أربعة أنواع من الأسماك بدائل في الموضع 2 (128A) أو الموضع 6 (139T) (الشكل 5). نظرا لأن هذه الأحماض الأمينية تلعب أدوارا مهمة في تفاعلات البروتين والرباط في قناة ربط TTR ، تشير هذه البيانات إلى أن روابط TTR قد تتفاعل بشكل مختلف في هذه الأنواع وستؤدي إلى حساسية كيميائية مختلفة بالنسبة للبشر.

Figure 5
الشكل 5: تحليل SeqAPASS المستوى 3 لحفظ بقايا الأحماض الأمينية المهمة للربط الكيميائي TTR. (أ) جدول ملخص من المستوى 3 يعرض عدد الأنواع التي تتوفر عنها بيانات التسلسل عبر جميع المجموعات التصنيفية، وعدد الأنواع المتوقع أن تكون متشابهة الحساسية (Y)، وعدد الأنواع التي يتوقع ألا تكون حساسة بالمثل (N). (ب) خريطة حرارية من المستوى 3 تعرض أنواعا مختارة من المتوقع ألا تكون حساسة بالمثل بالنسبة لبروتين ترانسثيريتين TTR البشري ، مما يدل على الأحماض الأمينية الكاملة والجزئية وغير المطابقة. الاختصارات: TTR = ترانسثيريتين ؛ SeqAPASS = محاذاة التسلسل للتنبؤ عبر قابلية الأنواع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

استجابة لتعليقات أصحاب المصلحة والمستخدمين ، تم تصميم ميزات جديدة ودمجها في أداة SeqAPASS ، بما في ذلك القدرة على الاتصال بالبيانات التجريبية لتطبيقات مختلفة. تم تحقيق قابلية التشغيل البيني لهذه الأداة مع قاعدة معارف ECOTOX (الجدول 1) من خلال تضمين روابط خارجية في جداول بيانات المستوى 1 والمستوى 2 للمدخلات الموجودة في ECOTOX وإنشاء عنصر واجهة مستخدم ECOTOX داخل الأداة للتصفية مباشرة إلى بيانات السمية الأكثر صلة في ECOTOX. من خلال الروابط والأداة ، يمكن للمستخدمين الاستعلام بسرعة عن ECOTOX وجمع بيانات السمية المقابلة للأنواع مع تنبؤات حساسية SeqAPASS. حاليا ، ترتبط تنبؤات SeqAPASS ب ECOTOX من خلال الإجهاد الكيميائي والأنواع. ومع ذلك ، فإن بيانات السمية ليست مرتبطة بعد بجينات / بروتينات محددة ، مما يسمح باتصالات مباشرة بنقاط النهاية / الأهداف الجزيئية المحددة ذات الأهمية في SeqAPASS. في حين أن ربط التنبؤات ببيانات السمية بناء على الإجهاد الكيميائي ليس مثاليا ، حيث قد لا تكون البيانات خاصة بمسار معين ، فإن إنشاء اتصال لجمع النتائج معا هو الخطوة الأولى. كأول تكرار لتكامل SeqAPASS-ECOTOX ، يوفر النهج الحالي للمستخدمين جميع بيانات السمية المتاحة للإجهاد (الضغوط) الكيميائية والأنواع على مستوى واسع. يمكن أن توفر هذه البيانات ، عند دمجها مع تنبؤات SeqAPASS ، سياقا على مستويات واسعة (الفقاريات مقابل اللافقاريات) ويمكن اعتبارها في سياق إطار AOP.

يقدم TTR مثالا جيدا لفحص هذا الاتصال حيث يوفر AOP الحالي (AOP 152) سياقا لتفسير بيانات سمية ECOTOX التي يحتمل أن تكون ذات صلة. بدءا من الروابط التي تم فحصها في المستوى 3 من SeqAPASS ، تم جمع بيانات السمية البيئية عبر الأنواع لأربع مواد كيميائية معروفة بتفاعلها مع مجال ربط الربيطة TTR (ثنائي إيثيل ستيلبوستيرول [DES] ، وحمض البيرفلوروهيكسانويك [PFHxA] ، وسلفونات الأوكتين المشبع بالفلور [PFOS] ، ورباعي برومو ثنائي الفينول ألف [TBBPA])19،21،23،24 . بالنسبة لكل مادة كيميائية ، تم الاستعلام عن ECOTOX للبيانات المائية والأرضية بواسطة رقم خدمة المستخلصات الكيميائية (CAS) باستخدام معلمات البحث المخصصة (الملف التكميلي 1). تم ترشيح البيانات إلى مجموعات الأنواع ذات الأهمية (البرمائيات والطيور والأسماك واللافقاريات والثدييات والزواحف). ضمن نتائج الاستعلام المصفاة ، تم حساب متوسط تركيزات التأثير الأدنى والأقصى للدراسة وتنفيذه كتقدير تقريبي لمتوسط أي نتائج لم تبلغ عن قيمة تركيز التأثير المتوسط (الشكل 6 أ والملف التكميلي 1). في سياق مادة كيميائية واحدة ، أجريت اختبارات كروسكال واليس لمقارنة تركيزات التأثير المتوسط للمجموعات التصنيفية المختلفة حيث أن البيانات لم تستوف افتراضات اختبار ANOVA. ثم أجريت اختبارات مقارنة زوجية بعد ذلك باستخدام اختبار دان لجميع المواد الكيميائية ، حيث تتكون المجموعات التصنيفية من أحجام عينات غير متساوية. تم تحليل النتائج المائية والأرضية بشكل منفصل ، حيث أن البيانات بين نوعي التعرض غير قابلة للمقارنة بشكل مباشر. ضمن ECOTOX ، كانت بيانات السمية المائية للمواد الكيميائية المختارة متاحة للبرمائيات والطيور واللافقاريات وأنواع الأسماك (الشكل 6 أ). كانت بيانات السمية الأرضية للمواد الكيميائية المختارة متاحة فقط للثدييات و DES (الملف التكميلي 1).

Figure 6
الشكل 6: ربط نتائج SeqAPASS بالبيانات التجريبية . (أ) متوسط تركيزات التأثير عبر المجموعات التصنيفية مع البيانات المتاحة في قاعدة معارف علم السموم البيئية لمواد كيميائية مختارة معروفة بارتباطها ببروتين TTR البشري. (ب) التداخل في عدد الأنواع المدرجة في كل تحليل SeqAPASS مع الأنواع التي توفرت عنها بيانات ECOTOX. في اللوحة A، تشير الأقواس على طول المحور x إلى عدد نتائج الاستعلام التي تم تجميع البيانات لها. تشير العلامات النجمية إلى أزواج من تركيزات التأثير المختلفة اختلافا كبيرا بين مجموعات الأنواع في سياق مادة كيميائية واحدة (اختبار Dunn، p < 0.05)، حيث تشير الأعداد الأعلى من العلامات النجمية إلى مستويات أقوى من الأهمية (*: p < 0.05؛ **: p < 0.01؛ ***: p < 0.001؛ ****: p < 0.0001). تمثل الخطوط المركزية داخل كل مربع الوسيط ، مع حواف الصندوق التي توضح النطاق الربيعي. تمتد الشعيرات حتى 1.5 ضعف النطاق الربيعي. يتم عرض القيم المتطرفة التي تقع خارج هذا النطاق كنقاط فردية. الاختصارات: TTR = ترانسثيريتين ؛ SeqAPASS = محاذاة التسلسل للتنبؤ عبر قابلية الأنواع ؛ ECOTOX = قاعدة معارف علم السموم البيئية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

بشكل عام ، تشير هذه البيانات إلى أن النشاط الحيوي للمواد الكيميائية التي تم تقييمها يحدث في أنواع الفقاريات ولكنه لا يحدث في اللافقاريات. في حين أن الافتقار إلى معلومات الهدف البيولوجي والمسار في ECOTOX يجعل من المستحيل ربط هذه البيانات التجريبية مباشرة ب TTR ، فإن هذه النتائج تدعم تنبؤات SeqAPASS بأن أنواع اللافقاريات لا تشترك في القابلية للإصابة. وأظهرت جميع أنواع الفقاريات التي تتوافر عنها بيانات قابلية للإصابة بكل من السلفونات المشبع بالفلور أوكتين وTBBPA، على الرغم من أن متوسط تركيزات التأثير كان أعلى بكثير في الأسماك والطيور منه في البرمائيات. تشير هذه البيانات إلى اختلافات محتملة في الحساسية بين المجموعات التصنيفية التي يمكن أن تعزى إلى اختلافات المسار البيولوجي (بما في ذلك TTR). من الجدير بالذكر أن المتغيرات الأخرى مثل التمثيل الغذائي والإفراز قد تلعب أيضا دورا في الاختلافات في الحساسية. وبالنسبة ل PFHxA والسلفونات المشبع بالفلور أوكتين، وجد أن الأسماك أكثر حساسية بكثير من كل من اللافقاريات والطيور، وبالنسبة ل DES، قدمت البرمائيات تركيزات تأثير متوسط أعلى بكثير من اللافقاريات. مرة أخرى ، تدعم هذه البيانات تنبؤنا SeqAPASS بأن اللافقاريات لا تشترك في القابلية مع أنواع الفقاريات. ومن بين جميع الأنواع التي تم تقييمها باستخدام هذه الأداة والتي كانت هناك بيانات متاحة لها عن تسلسل TTR، لم يكن لدى سوى عدد قليل منها بيانات ECOTOX المقابلة للمواد الكيميائية الأربع ذات الأهمية (الشكل 6 باء، والجدول التكميلي S1، والجدول التكميلي S2). بالنسبة لتلك الأنواع التي تفتقر إلى البيانات القمية ، تضيف تنبؤات SeqAPASS للحساسية خطوطا إضافية من الأدلة على أن الأنواع ذات الصلة قد تتصرف بشكل مشابه لتلك التي لديها بيانات قمية. تتوفر بيانات لجميع تحليلات SeqAPASS و ECOTOX في الملف التكميلي 1.

وفقا لمراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) ، في عام 2017 ، ساهمت المواد الأفيونية في حوالي 47,600 حالة وفاة بسبب جرعة زائدة في الولايات المتحدة ، وهو رقم يستمر في الارتفاع27. يتم تنظيم محطات مياه الصرف الصحي في الولايات المتحدة على المستوى الوطني من خلال النظام الوطني للتخلص من تصريف الملوثات التابع لوكالة حماية البيئة الأمريكية ، والذي لا يتطلب اختبار المواد الأفيونية أو المستحضرات الصيدلانية الأخرى في تصريفها28. في السنوات الأخيرة ، تم بذل جهد لاستخدام علم الأوبئة القائم على مياه الصرف الصحي كأداة لرسم خريطة لاستخدام المواد الأفيونية المجتمعية. كشفت جهود رصد المواد الأفيونية عن تركيزات تصل إلى 1.27 ميكروغرام / لتر في مياه الصرف الصحي و 0.7 ميكروغرام / لتر في المياه السطحية29,30. أبلغت دراسات السمية الحديثة التي تقيم تأثير التعرض للمواد الأفيونية على الأسماك عن تطور سلوكيات الإدمان والآثار المناعية الضارة (على سبيل المثال ، ارتفاع معدلات الإصابة ، وخفض تنظيم الجينات المناعية)31،32،33. بشكل عام ، تشير هذه الدراسات إلى وجود احتمال للتعرض للمواد الأفيونية البيئية الضارة وتسلط الضوء على أهمية فهم المخاطر التي تشكلها هذه المواد الكيميائية على الأنواع المائية. بالنظر إلى مجموعة الأنواع التي قد تواجه هذه المركبات في البيئة ، قد يكون تحديد الأنواع التي يحتمل أن تكون حساسة باستخدام SeqAPASS مهما لتحديد أولويات جهود الاختبار أو الرصد.

يشكل MOR الهدف الرئيسي للمواد الأفيونية لإدارة الألم وهو مسؤول عن الخصائص القوية المسكنة والإدمانية للقلويدات الأفيونية في البشر34,35. نظرا لأهمية هذا المستقبل لصحة الإنسان ، فإن روابط MOR معروفة جيدا ، وتتوفر دراسات علم البلورات بالأشعة السينية عالية الجودة ، مما يجعل هذا الهدف مثاليا لتحليل SeqAPASS8،9،13. باستخدام انضمام NCBI لمستقبلات المواد الأفيونية μ البشرية ، ACM90349.1 ، تم إجراء تحليل المستوى 1 باستخدام الإعدادات الافتراضية. تم تحديد قطع الحساسية عند 55٪ للمستوى 1 ، مع وجود نسبة تشابه في المائة للثدييات (الثدييات) ، والطيور (Aves) ، والزواحف (Testudines ، Lepidosauria ، و Crocodylia) ، والبرمائيات (Amphibia) ، ومعظم أنواع الأسماك (Actinopteri ، Coelacanthimorpha ، Cladista ، Chondrichthyes) تقع فوق هذا القطع. لذلك ، أدت الأنواع من هذه المجموعات التصنيفية إلى تنبؤ حساسية "Y" (أي نعم) ، مما يشير إلى أنها من المحتمل أن تكون عرضة للمواد الكيميائية المعروفة بتفاعلها مع MOR البشري (الشكل 7 والملف التكميلي 1). باستخدام قاعدة بيانات المجال المحفوظ NCBI ، تم تحديد 7tmA_Mu_opioid_R (الانضمام cd15090) كمجال وظيفي يضم جميع الحلزونات السبعة لبروتين MOR من 133 إلى 411 ، بما في ذلك موقع ربط الرباط المفترض. مقارنة بالمستوى 1 ، حددت نتائج المستوى 2 قطعا أعلى للحساسية بنسبة 88٪ ، مع الثدييات والطيور والزواحف والبرمائيات ومعظم أنواع الأسماك الموجودة فوق هذا الحد الفاصل مما أدى إلى توقع قابلية "Y" ل نعم (الشكل 8). وعموما، تشير نتائج تحليلات المستويين 1 و2 إلى أن معظم أنواع الفقاريات تشترك في حفظ MOR ومن المحتمل أن تكون عرضة للمواد الكيميائية المعروفة بتفاعلها مع MOR البشري.

Figure 7
الشكل 7: تحليل SeqAPASS المستوى 1 لحفظ مستقبلات المواد الأفيونية μ عبر المجموعات التصنيفية مع معلومات التسلسل المتاحة بالنسبة للبروتين البشري. يتم عرض النسبة المئوية للتشابه في تسلسل الأحماض الأمينية البروتينية على المحور Y ؛ يتم عرض المجموعة التصنيفية على المحور X. تشير الدوائر المفتوحة (○) إلى تسلسل الاستعلام ، وتشير الدوائر المغلقة (●) إلى الأنواع داخل المجموعة التصنيفية ذات التشابه الأعلى في المائة. داخل المخطط ، يمثل الجزء العلوي والسفلي من كل مربع النسب المئوية 75 و 25 ، وتمتد الشعيرات إلى 1.5 ضعف النطاق الربيعي ، ويتم تمثيل القيم المتوسطة والمتوسطة بخطوط سوداء أفقية على الصندوق. يشير الخط المتقطع إلى الحد الفاصل لتنبؤات الحساسية. الاختصارات: MOR = مستقبلات mu-opioid ؛ SeqAPASS = محاذاة التسلسل للتنبؤ عبر قابلية الأنواع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 8
الشكل 8: تحليل SeqAPASS المستوى 2 لحفظ مجال ربط مستقبلات المواد الأفيونية μ بالنسبة للمجال في البروتين البشري. يتم عرض النسبة المئوية للتشابه في تسلسل الأحماض الأمينية لمجال ربط الليجند على المحور Y ؛ يتم عرض المجموعة التصنيفية على المحور X. تشير الدوائر المفتوحة (○) إلى تسلسل الاستعلام ، وتشير الدوائر المغلقة (●) إلى الأنواع داخل المجموعة التصنيفية ذات التشابه الأعلى في المائة. داخل المخطط ، يمثل الجزء العلوي والسفلي من كل مربع النسب المئوية 75 و 25 ، وتمتد الشعيرات إلى 1.5 ضعف النطاق الربيعي ، ويتم تمثيل القيم المتوسطة والمتوسطة بخطوط سوداء أفقية على الصندوق. يشير الخط المتقطع إلى الحد الفاصل لتنبؤات الحساسية. الاختصارات: MOR = مستقبلات mu-opioid ؛ SeqAPASS = محاذاة التسلسل للتنبؤ عبر قابلية الأنواع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

من خلال تحليل النمذجة الجزيئية ودراسات علم البلورات البروتينية ، تم تحديد الأحماض الأمينية في منطقة ربط MOR التي من المتوقع أن تتفاعل مع الروابط المعروفة. على الرغم من أن المجموعة المتنوعة من الروابط التي ترتبط جيدا بمستقبلات المواد الأفيونية تؤدي إلى علم الصيدلة المعقد ، إلا أنه لوحظ بعض تفاعلات البروتين المتسقة36,37. استنادا إلى الالتحام الجزيئي لمختلف الهياكل البلورية MOR ، يتفاعل كل من المورفين والفنتانيل ، ناهضات MOR عالية التقارب ، مع D147 و Y148 و M151 و W293 و I296 و H297 و V300 و I322 و Y32636,38. المخلفات D147 و Y148 و M151 و H297 متورطة أيضا في الهياكل البلورية ل MOR المرتبطة بناهض المورفين BU72 ، في حين أن D147 و M151 و H297 و Y326 هي أيضا حاسمة في الارتباط بمضاد المورفين الذي لا رجعة فيه β-funaltrexamine37. بالنظر إلى خطوط الأدلة هذه ، تم اختيار تسعة بقايا (D147 ، Y148 ، M151 ، W293 ، I296 ، H297 ، V300 ، I322 ، Y326) لتقييم المستوى 3 باستخدام MOR البشري كتسلسل قالب واستبعاد التسلسلات الجزئية والمتوقعة والافتراضية ومنخفضة الجودة. الأهم من ذلك ، أن مواضع الأحماض الأمينية المبلغ عنها في الأدبيات تستبعد شريحة 64-amino-acid بالنسبة إلى انضمام بروتين NCBI ، ولهذا السبب ، تم اختيار المواضع في المستوى 3 لتمثيل تلك التي تتماشى مع تسلسل القالب لتسلسل المحاذاة الصحيح.

في تحليل المستوى 3 ل MOR البشري ، تم تقييم 284 نوعا عبر أنواع الفقاريات (الثدييات والطيور والبرمائيات والزواحف والأسماك). في جميع الأنواع التي تم تقييمها ، كانت الأحماض الأمينية التسعة إما مطابقة كاملة أو مطابقة جزئية بناء على تصنيف السلسلة الجانبية والوزن الجزيئي. ونتيجة لذلك، أسفرت جميع الأنواع التي تم تقييمها عن تنبؤ بقابلية "Y" ل "نعم" (الجدول 3 والملف التكميلي 1). نظرا لأن هذه الأحماض الأمينية مهمة في ربط كل من ناهضات MOR القوية والخصوم القوية ، تشير هذه البيانات إلى أن المركبات الأفيونية التي تستهدف مستقبلات المواد الأفيونية μ البشرية قد تتفاعل بشكل مشابه مع المستقبلات عبر أنواع الفقاريات. على الرغم من وجود القليل من البيانات التجريبية المتاحة حتى الآن داخل قاعدة معارف ECOTOX للمركبات الأفيونية ، تشير العديد من الدراسات إلى أن الأسماك من المحتمل أن تكون عرضة للإصابة31،32،33. وبشكل عام، تشير النتائج المستخلصة من SeqAPASS إلى احتمال حدوث تأثيرات بيئية أوسع نطاقا للمواد الكيميائية المعدلة ل MOR عبر الأنواع، مما يشير إلى أن المزيد من البحوث وربما الرصد قد يكون ذا قيمة. تتوفر بيانات لجميع التحليلات في الملف التكميلي 1.

الجدول 3: تحليل SeqAPASS المستوى 3 لحفظ بقايا الأحماض الأمينية المهمة للارتباط الكيميائي بمستقبلات μ الأفيونية. جدول ملخص يعرض عدد الأنواع مع بيانات التسلسل المتاحة عبر جميع المجموعات التصنيفية ، وعدد الأنواع المتوقع أن تكون حساسة بالمثل (Y) ، وعدد الأنواع التي من المتوقع ألا تكون عرضة للتأثر بالمثل ، وكذلك الأحماض الأمينية الكاملة والجزئية وغير المطابقة. اختصار: SeqAPASS = محاذاة التسلسل للتنبؤ عبر قابلية الأنواع. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي S1: الأنواع التي تتوفر عنها بيانات ECOTOX للمواد الكيميائية الأربعة ذات الأهمية المعروفة بارتباطها ببروتين ترانسثيريتين البشري. تتوافق البيانات المتاحة لكل مادة كيميائية مع تنبؤات SeqAPASS ذات الحساسية المماثلة عبر المستويات 1 و 2 و 3. جميع تنبؤات SeqAPASS المتعلقة بتسلسل ترانسثيريتين البشري. الاختصارات: SeqAPASS = محاذاة التسلسل للتنبؤ عبر قابلية الأنواع ؛ DES = ثنائي إيثيل ستيلبيسترول ؛ PFHxA = حمض البيرفلوروهيكسانويك ؛ السلفونات المشبعة بالفلور أوكتين = حامض السلفونيك المشبع بالفلور أوكتين؛ TBBPA = رباعي بروموبيسفينول أ. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي S2: العدد الإجمالي للأنواع مع البيانات المتاحة عبر تقييمات SeqAPASS و ECOTOX لمواد كيميائية مختارة معروفة بارتباطها ببروتين ترانسثيريتين البشري. يوفر SeqAPASS وسائل للتنبؤ بحساسية الأنواع عبر العديد من الأنواع التي لا تتوفر عنها بيانات السمية التجريبية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: بيانات SeqAPASS و ECOTOX لجميع النتائج التمثيلية. يحتوي الملف على ToC متبوعا بأوراق البيانات التالية: علامة التبويب 1-hTTR SeqAPASS النتائج المستوى 1 ، علامة التبويب 2-hTTR SeqAPASS النتائج المستوى 2 ، علامة التبويب 3-hTTR SeqAPASS النتائج المستوى 3 ، علامة التبويب 4-بيانات EcoTox ل DES ، بيانات علامة التبويب 5-EcoTox للسلفونات المشبعة بالفلور أوكتين ، بيانات علامة التبويب 6-EcoTox ل PFHxA ، بيانات علامة التبويب 7-EcoTox ل TBBPA ، علامة التبويب 8-حسابات متوسط مجموعة EcoTox ، علامة التبويب 9-SeqAPASS مقارنات بيانات EcoTox ، ونتائج Tab 10-hMOR SeqAPASS المستوى 1 ، ونتائج Tab 11-hMOR SeqAPASS المستوى 2 ، ونتائج Tab 12-μ-hMOR SeqAPASS المستوى 3. الاختصارات: SeqAPASS = محاذاة التسلسل للتنبؤ عبر قابلية الأنواع ؛ ToC = جدول المحتويات ؛ hTTR = ترانسثيريتين الإنسان ؛ ECOTOX = قاعدة معارف علم السموم البيئية ؛ DES = ثنائي إيثيل ستيلبيسترول ؛ السلفونات المشبعة بالفلور أوكتين = حامض السلفونيك المشبع بالفلور أوكتين؛ PFHxA = حمض البيرفلوروهيكسانويك ؛ TBBPA = رباعي بروموبيسفينول أ ؛ hMOR = مستقبلات الأفيون mu-opioid البشرية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك اعتراف واسع النطاق بأنه ليس من الممكن اختبار ما يكفي من الأنواع تجريبيا لالتقاط التنوع الجيني والظاهري والفسيولوجي والسلوكي للكائنات الحية التي قد تتعرض للمواد الكيميائية ذات الأهمية السمية. الهدف من SeqAPASS هو تعظيم استخدام تسلسل البروتين الحالي والمتوسع باستمرار والبيانات الهيكلية للمساعدة وإبلاغ استقراء بيانات / معارف السمية الكيميائية من الكائنات الحية المختبرة إلى مئات أو آلاف الأنواع الأخرى من خلال مقارنات على المستوى الجزيئي. تم تصميم أداة SeqAPASS لتقليل تعقيد مقارنات تسلسل البروتين للعلماء ومقيمي المخاطر والمنظمين من خلال تحليل مبسط وسريع يتضمن جداول موجزة تم إنشاؤها وتنزيلها بشفافية ، وتصورات تفاعلية للبيانات ، وسهولة تحديد الأنواع المهددة والمهددة بالانقراض ، وكذلك الكائنات النموذجية الشائعة. يتم وصف البروتوكولات هنا لتشغيل مستويات SeqAPASS 1 و 2 و 3 لتقييم تشابه تسلسل الأحماض الأمينية الأولية ، والحفاظ على المجال الوظيفي ، والأحماض الأمينية الحرجة المشاركة في تفاعلات البروتين الكيميائي والبروتين البروتيني. تتنبأ خطوط الأدلة التي تم جمعها من كل مستوى من مستويات تحليل SeqAPASS بالحساسية الكيميائية عبر الأنواع ، مما يوفر بيانات متسقة وقابلة للتفسير بسهولة. حتى الآن ، تم استخدام هذه الأداة عبر مجموعة واسعة من التطبيقات ، بما في ذلك تحديد المواد الكيميائية التي ترتبط بمستقبلات معينة وتقييم إمكانات القراءة عبر المستقبلات البيئية للفقاريات مع أنظمة الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، تم وصف دراستي حالة تركزان على بروتين توزيع هرمون الغدة الدرقية ، TTR ، و MOR هنا لإظهار الميزات والوظائف الجديدة ل SeqAPASS v2 حتى v6.

كما هو الحال مع أي نهج حسابي ، تعتمد القدرة على توليد تنبؤات بحساسية الأنواع داخل أداة SeqAPASS بشكل كبير على إدخال المعلمات المناسبة8،9،13. ولذلك، من الأهمية بمكان، قبل إجراء التحليل، إجراء خطوة لصياغة المشكلة لمسح البيانات والأدبيات الموجودة للهدف المقصود. يسمح بدء التحليل بمعرفة هدف البروتين للمستخدم بتحديد أرقام انضمام البروتين المناسبة والتسلسلات عالية الجودة. وبالمثل ، فإن معرفة الأنواع الحساسة أو المستهدفة أو الكائنات النموذجية المستخدمة في المقايسات أو تطوير AOP تضمن اختيار أنواع استعلام مناسبة تقارن بها جميع الأنواع الأخرى. يعد اختيار المجالات الوظيفية للمستوى 2 وبقايا الأحماض الأمينية الحرجة للمستوى 3 أيضا خطوات مهمة تتطلب من المستخدم تحديد معلمات الإدخال المناسبة لإنشاء تنبؤات. نظرا لهذه الحاجة إلى المعرفة الموجودة مسبقا بالتفاعل بين المواد الكيميائية والبروتين ، فإن إصدارات الإصدارات الحديثة من أداة SeqAPASS تدمج موارد سهلة الاستخدام مصممة للمساعدة في توجيه المستخدمين إلى المعلومات ذات الصلة لبدء استعلام (على سبيل المثال ، روابط لأدوات أخرى) (الجدول 2 والشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، تم دمج رسائل المعلومات المنبثقة والتنبيهات في الأداة لتوجيه المستخدم خلال التحليل والمساعدة في إبلاغ المستخدم بأي أخطاء تحتاج إلى حل.

يمثل تعقيد التفاعلات الكيميائية البيولوجية قيودا على أداة SeqAPASS. عند استقراء بيانات السمية عبر الأنواع ، يعد الحفاظ على الهدف الجزيئي أحد العوامل العديدة التي يجب مراعاتها. يعد الامتزاز والتوزيع والتمثيل الغذائي والإفراز (ADME) للمادة الكيميائية أمرا بالغ الأهمية عند التفكير في السمية الكيميائية ، حيث يمكن تنشيط المواد الكيميائية أو إزالة السموم من خلال هذه العمليات39,40. عوامل أخرى ، مثل طريق التعرض للمواد الكيميائية ، ومرحلة حياة الكائن الحي وتاريخ الحياة ، والنظام الغذائي ، يمكن أن تلعب أيضا أدوارا مهمة في تحديد الحساسية الكيميائية عبر الأنواع أيضا41,42. لمعالجة هذا القيد ، من المهم فهم السؤال الرئيسي الذي يطرحه SeqAPASS عند التنبؤ بالقابلية للمواد الكيميائية: هل من المحتمل أن يكون هدف البروتين الكيميائي موجودا في نوع آخر حتى تعمل المادة الكيميائية عليه؟ يتم تناول هذه المسألة من خلال تحديد المرشحين لتقويم العظام والنظر في حفظ هذا الهدف عبر الأنواع بالنسبة إلى الأنواع الحساسة أو المستهدفة المعروفة. يمكن استخدام هذه المعلومات كخط أدلة للاستقراء عبر الأنواع ودمجها في تدفقات الأدلة الأخرى (على سبيل المثال ، إمكانية التعرض) لفهم قابلية الأنواع للضغوط الكيميائية بشكل أفضل. تضمنت تحديثات SeqAPASS روابط متكاملة للأدوات الخارجية ، بما في ذلك قاعدة معارف EPA ECOTOXالأمريكية 43 ونظام الحفاظ على البيئة عبر الإنترنت (ECOS)44 لخدمة الأسماك والحياة البرية الأمريكية. يوفر الاتصال بقواعد البيانات هذه لمستخدمي SeqAPASS وصولا سهلا إلى بيانات السمية الكيميائية التجريبية لمقارنتها بالتنبؤات القائمة على التسلسل ووسيلة لتحديد الأنواع التي قد تكون محمية في حالة محمية.

توفر أداة SeqAPASS منصة قائمة على أساس علمي للتنبؤات الحسابية للحساسية الجوهرية التي تدعمها مفاهيم في علم الأحياء التطوري وأمثلة الحالة التي تقارن التنبؤات بالنتائج التجريبية المتاحة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن SeqAPASS مجاني ومتاح للجمهور على منصة قائمة على الويب مدعومة جيدا ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع (https://seqapass.epa.gov/seqapass/). نظرا لأن هذه الأداة تستفيد من بيانات التسلسل ومعلومات البروتين من قواعد البيانات الحالية ، فإن قدرتها على التنبؤ بالحساسية الكيميائية في تنوع أوسع من الأنواع تتحسن باستمرار مع تقدم تكنولوجيا التسلسل وتسلسل جينومات الأنواع الجديدة وشرحها. على الرغم من أن هذا يوفر مزايا واضحة فيما يتعلق بتوافر البيانات ، إلا أنه يمثل أيضا قيدا في أن معلومات التسلسل المتاحة للجمهور يمكن أن تخضع لجودة غير متسقة ، وتعليقات توضيحية سيئة ، وعدم اكتمال تسلسل البروتين لبعض الأنواع. ومع ذلك ، فمن الواعد أن تقنيات وأساليب omics في المعلوماتية الحيوية تتقدم بسرعة ، وبالتالي ، من المرجح أن يستمر تنظيم التسلسل والجودة في التحسن بمرور الوقت.

أحد الأهداف الرئيسية لأداة SeqAPASS هو الشفافية ، وتوفير الوصول في شكل روابط لجميع مصادر البيانات والأدوات المدمجة في الواجهة الخلفية. وتتيح هذه الشفافية للمستخدم الوصول السريع إلى المصادر الأصلية للتسلسل أو المعلومات التصنيفية من المركز الوطني للذكاء البيولوجي. يتم تحديد مجال قابلية تطبيق هذه الأداة من خلال المعلومات اللازمة لإجراء تحليل ذي معنى. نظرا لأن معرفة تفاعل البروتين الكيميائي أو البروتين والبروتين في الأنواع الحساسة أو المستهدفة المعروفة هي عناصر أساسية لبدء الاستعلام ، يجب الاعتراف بأن الاستعلامات التي يتم إجراؤها بدون هذه المعلومات ليست ذات معنى. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المواد الكيميائية التي لها أهداف بيولوجية متعددة غير محددة أو تتفاعل مع أهداف مختلفة بدرجات مختلفة من الفعالية تمثل أيضا تحديا وقيودا على الأداة في شكلها الحالي. ومن المتوقع أنه مع تحسين المعلوماتية الأحيائية، والنمذجة الحاسوبية، والفحص والنسخ القائم على الخلايا والإنتاجية العالية، سيستمر توضيح المزيد من المعرفة عبر تنوع الفضاء الكيميائي فيما يتعلق بالتفاعلات مع بروتينات معينة. ومن المتوقع أن تستمر القدرة على تطبيق SeqAPASS على التحديات الأوسع نطاقا لاستقراء الأنواع ، فيما يتعلق بفهم الآثار الكيميائية الضارة المحتملة عبر تنوع الأنواع ، في التحسن.

في الختام ، تعد أداة SeqAPASS منصة يمكن الوصول إليها تطبق بسهولة المعلومات الجزيئية لمواجهة التحدي الكبير المتمثل في الاستقراء عبر الأنواع في تقييمات السلامة الكيميائية. على الرغم من أن الأمثلة الموضحة هنا تركز على توليد تنبؤات بالحساسية الكيميائية ، إلا أن النتائج يمكن أن تساعد أيضا في فهم الحفظ الشامل للمسارات البيولوجية. من خلال الجمع بين خطوط مختلفة من الأدلة وتسهيل الوصول إلى منصات وقواعد بيانات متعددة ، تساعد هذه الأداة على بناء حالات شفافة لتحديد أولويات الاختبارات الكيميائية وتخصيص الموارد. مع التطوير المستمر للقدرات العلمية والمعلوماتية الحيوية ، ستستمر قوة الأداة وفائدتها في النمو والتحسين لتلبية احتياجات المجتمعات البحثية والتنظيمية مع تقليل الموارد اللازمة للتقييمات عبر الأنواع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الدكتور دانيال ل. فيلنوف (وكالة حماية البيئة الأمريكية ، مركز علم السموم الحسابي والتعرض) والدكتور جون أ. دورينغ (قسم العلوم البيئية ، جامعة ولاية لويزيانا) على تقديم تعليقات على مسودة سابقة للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل وكالة حماية البيئة الأمريكية. الآراء الواردة في هذه الورقة هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة آراء أو سياسات وكالة حماية البيئة الأمريكية ، ولا يشير ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية إلى تأييد الحكومة الفيدرالية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spreadsheet program N/A N/A Any program that can be used to view and work with csv files (e.g. Microsoft Excel, OpenOffice Calc, Google Docs) can be used to access data export files.
Basic computing setup and internet access N/A N/A SeqAPASS is a free, online tool that can be easily used via an internet connection. No software downloads are required.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krewski, D., et al. Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13 (2-4), 51-138 (2010).
  2. Wang, Z., Walker, G. W., Muir, D. C. G., Nagatani-Yoshida, K. Toward a global understanding of chemical pollution: A first comprehensive analysis of national and regional chemical inventories. Environmental Science & Technology. 54 (5), 2575-2584 (2020).
  3. Brooks, B. W., et al. Toxicology advances for 21st century chemical pollution. One Earth. 2 (4), 312-316 (2020).
  4. Kostal, J., Voutchkova-Kostal, A. Going all in: A strategic investment in in silico toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (4), 880-888 (2020).
  5. Cheng, W., Doering, J. A., LaLone, C., Ng, C. Integrative computational approaches to inform relative bioaccumulation potential of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS) across species. Toxicology Sciences. 180 (2), 212-223 (2021).
  6. Kostich, M. S., Lazorchak, J. M. Risks to aquatic organisms posed by human pharmaceutical use. Science of the Total Environment. 389 (2-3), 329-339 (2008).
  7. Gunnarsson, L., Jauhiainen, A., Kristiansson, E., Nerman, O., Larsson, D. G. Evolutionary conservation of human drug targets in organisms used for environmental risk assessments. Environmental Science & Technology. 42 (15), 5807-5813 (2008).
  8. LaLone, C. A., et al. Evidence for cross species extrapolation of mammalian-based high-throughput screening assay results. Environmental Science & Technology. 52 (23), 13960-13971 (2018).
  9. LaLone, C. A., et al. Editor's highlight: Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS): A web-based tool for addressing the challenges of cross-species extrapolation of chemical toxicity. Toxicology Sciences. 153 (2), 228-245 (2016).
  10. Head, J. A., Hahn, M. E., Kennedy, S. W. Key amino acids in the aryl hydrocarbon receptor predict dioxin sensitivity in avian species. Environmental Science & Technology. 42 (19), 7535-7541 (2008).
  11. Bass, C., et al. Mutation of a nicotinic acetylcholine receptor β subunit is associated with resistance to neonicotinoid insecticides in the aphid Myzus persicae. BMC Neuroscience. 12, 51-51 (2011).
  12. Erdmanis, L., et al. Association of neonicotinoid insensitivity with a conserved residue in the loop d binding region of the tick nicotinic acetylcholine receptor. Biochemistry. 51 (23), 4627-4629 (2012).
  13. Doering, J. A., et al. et al. In silico site-directed mutagenesis informs species-specific predictions of chemical susceptibility derived from the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) tool. Toxicology Sciences. 166 (1), 131-145 (2018).
  14. Noyes, P. D., et al. Evaluating chemicals for thyroid disruption: Opportunities and challenges with in vitro testing and adverse outcome pathway approaches. Environmental Health Perspectives. 127 (9), 95001 (2019).
  15. Park, G. Y., Jamerlan, A., Shim, K. H., An, S. S. A. Diagnostic and treatment approaches involving transthyretin in amyloidogenic diseases. Int J Mol Sci. 20 (12), 2982 (2019).
  16. Rabah, S. A., Gowan, I. L., Pagnin, M., Osman, N., Richardson, S. J. Thyroid hormone distributor proteins during development in vertebrates. Front Endocrinol (Lausane). 10, 506 (2019).
  17. Richardson, S. J. Cell and molecular biology of transthyretin and thyroid hormones. International Review of Cytology. 258, 137-193 (2007).
  18. Yamauchi, K., Ishihara, A. Transthyretin and Endocrine Disruptors. Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure and Biological Functions. Richardson, S. J., Cody, V. , Springer. Berlin Heidelberg, Germany. 159-171 (2009).
  19. Iakovleva, I., et al. Tetrabromobisphenol A is an efficient stabilizer of the transthyretin tetramer. PLoS One. 11 (4), 0153529 (2016).
  20. Ishihara, A., Sawatsubashi, S., Yamauchi, K. Endocrine disrupting chemicals: Interference of thyroid hormone binding to transthyretins and to thyroid hormone receptors. Molecular and Cellular Endocrinology. 199 (1), 105-117 (2003).
  21. Kar, S., Sepúlveda, M. S., Roy, K., Leszczynski, J. Endocrine-disrupting activity of per- and polyfluoroalkyl substances: Exploring combined approaches of ligand and structure based modeling. Chemosphere. 184, 514-523 (2017).
  22. Morais-de-Sa, E., Pereira, P. J., Saraiva, M. J., Damas, A. M. The crystal structure of transthyretin in complex with diethylstilbestrol: A promising template for the design of amyloid inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 279 (51), 53483-53490 (2004).
  23. Morgado, I., Campinho, M. A., Costa, R., Jacinto, R., Power, D. M. Disruption of the thyroid system by diethylstilbestrol and ioxynil in the sea bream (Sparus aurata). Aquatic Toxicology. 92 (4), 271-280 (2009).
  24. Yamauchi, K., Prapunpoj, P., Richardson, S. J. Effect of diethylstilbestrol on thyroid hormone binding to amphibian transthyretins. General and Comparative Endocrinology. 119 (3), 329-339 (2000).
  25. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  26. Ren, X. M., et al. Binding interactions of perfluoroalkyl substances with thyroid hormone transport proteins and potential toxicological implications. Toxicology. 366-367, 32-42 (2016).
  27. Wilson, N., Mbabazi, K., Seth, P., Smith, H., Davis, N. L. Drug and opioid-involved overdose deaths - United States, 2017-2018. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (11), 290-297 (2020).
  28. EPA. National Pollutant Discharge Elimination System (NPDES). United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/npdes/npdes-resources (2018).
  29. Duvallet, C., Hayes, B. D., Erickson, T. B., Chai, P. R., Matus, M. Mapping community opioid exposure through wastewater-based epidemiology as a means to engage pharmacies in harm reduction efforts. Preventing Chronic Disease. 17, 200053 (2020).
  30. Gushgari, A. J., Venkatesan, A. K., Chen, J., Steele, J. C., Halden, R. U. Long-term tracking of opioid consumption in two United States cities using wastewater-based epidemiology approach. Water Research. 161, 171-180 (2019).
  31. Lau, B., Bretaud, S., Huang, Y., Lin, E., Guo, S. Dissociation of food and opiate preference by a genetic mutation in zebrafish. Genes Brain Behave. 5 (7), 497-505 (2006).
  32. Bossé, G. D., Peterson, R. T. Development of an opioid self-administration assay to study drug seeking in zebrafish. Behavioural Brain Research. 335, 158-166 (2017).
  33. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  34. Manglik, A., et al. Crystal structure of the µ-opioid receptor bound to a morphinan antagonist. Nature. 485 (7398), 321-326 (2012).
  35. Comer, S. D., Cahill, C. M. Fentanyl: Receptor pharmacology, abuse potential, and implications for treatment. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 106, 49-57 (2019).
  36. Podlewska, S., Bugno, R., Kudla, L., Bojarski, A. J., Przewlocki, R. Molecular modeling of µ opioid receptor ligands with various functional properties: PZM21, SR-17018, morphine, and fentanyl-simulated interaction patterns confronted with experimental data. Molecules. 25 (20), 4636 (2020).
  37. Huang, W., et al. Structural insights into µ-opioid receptor activation. Nature. 524 (7565), 315-321 (2015).
  38. Lipiński, P. F. J., et al. Fentanyl family at the mu-opioid receptor: Uniform assessment of binding and computational analysis. Molecules. 24 (4), 740 (2019).
  39. Boland, L. A., Angles, J. M. Feline permethrin toxicity: Retrospective study of 42 cases. Journal of Feline Medicine and Surgery. 12 (2), 61-71 (2010).
  40. Stevenson, B. J., Pignatelli, P., Nikou, D., Paine, M. J. Pinpointing P450s associated with pyrethroid metabolism in the dengue vector, Aedes aegypti: developing new tools to combat insecticide resistance. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1595 (2012).
  41. Ankley, G. T., Gray, L. E. Cross-species conservation of endocrine pathways: A critical analysis of tier 1 fish and rat screening assays with 12 model chemicals. Environmental Toxicology and Chemistry. 32 (5), 1084-1087 (2013).
  42. Meteyer, C. U., Rideout, B. A., Gilbert, M., Shivaprasad, H. L., Oaks, J. L. Pathology and proposed pathophysiology of diclofenac poisoning in free-living and experimentally exposed oriental white-backed vultures (Gyps bengalensis). Journal of Wildlife Diseases. 41 (4), 707-716 (2005).
  43. EPA. ECOTOX User Guide: ECOTOXicology Knowledgebase System. EPA, United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://cfpub.epa.gov/ecotox/index.cfm (2021).
  44. ECOS Environmental Conservation Online System. U.S. Fish & Wildlife Service. , Available from: https://ecos.fws.gov/ecp/ (2021).

Tags

علم الوراثة ، العدد 192 ، الاستقراء عبر الأنواع ، علم السموم البيئية ، علم السموم التنبؤي ، منهجية النهج الجديد ، مستقبلات المواد الأفيونية ، ترانسثيريتين
عرض توضيحي لمحاذاة التسلسل للتنبؤ عبر الأنواع أداة الحساسية للتقييم السريع لحفظ البروتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vliet, S. M. F., Hazemi, M., Blatz,… More

Vliet, S. M. F., Hazemi, M., Blatz, D., Jensen, M., Mayasich, S., Transue, T. R., Simmons, C., Wilkinson, A., LaLone, C. A. Demonstration of the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility Tool for Rapid Assessment of Protein Conservation. J. Vis. Exp. (192), e63970, doi:10.3791/63970 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter