Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Demonstrasjon av sekvensjusteringen for å forutsi på tvers av arter følsomhetsverktøy for rask vurdering av proteinbevaring

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/63970
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 4, 5, 5, 5, 6
1Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Scientific Computing and Data Curation Division, U.S. Environmental Protection Agency, 2Oak Ridge Institute for Science and Education, 3Swenson College of Science and Engineering, Department of Biology, University of Minnesota Duluth, 4University of Wisconsin-Madison Aquatic Sciences Center, 5General Dynamics Information Technology, Research Triangle Park, 6Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Great Lakes Toxicology and Ecology Division, U.S. Environmental Protection Agency

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å bruke den nyeste versjonen av US Environmental Protection Agency Sequence Alignment for å forutsi på tvers av arterfølsomhet (SeqAPASS) verktøy. Denne protokollen demonstrerer anvendelsen av det elektroniske verktøyet for raskt å analysere proteinbesparelse og gi tilpassbare og lett tolkbare spådommer om kjemisk følsomhet på tvers av arter.

Abstract

Det amerikanske miljøvernbyrået Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) -verktøyet er et raskt, fritt tilgjengelig, online screeningsprogram som gjør det mulig for forskere og regulatorer å ekstrapolere giftighetsinformasjon på tvers av arter. For biologiske mål i modellsystemer som humane celler, mus, rotter og sebrafisk, er toksisitetsdata tilgjengelig for en rekke kjemikalier. Gjennom evaluering av proteinmålbevaring kan dette verktøyet brukes til å ekstrapolere data generert fra slike modellsystemer til tusenvis av andre arter som mangler toksisitetsdata, noe som gir spådommer om relativ iboende kjemisk følsomhet. De nyeste utgivelsene av verktøyet (versjon 2.0-6.1) har innarbeidet nye funksjoner som muliggjør rask syntese, tolkning og bruk av dataene for publisering pluss grafikk i presentasjonskvalitet.

Blant disse funksjonene er tilpassbare datavisualiseringer og en omfattende sammendragsrapport designet for å oppsummere SeqAPASS-data for enkel tolkning. Dette papiret beskriver protokollen for å veilede brukere gjennom å sende inn jobber, navigere i de ulike nivåene av proteinsekvenssammenligninger og tolke og vise de resulterende dataene. Nye funksjoner i SeqAPASS v2.0-6.0 er uthevet. Videre beskrives to brukstilfeller fokusert på transtyretin og opioidreseptorproteinbevaring ved hjelp av dette verktøyet. Til slutt diskuteres SeqAPASS' styrker og begrensninger for å definere anvendelsesområdet for verktøyet og fremheve ulike anvendelser for ekstrapolering på tvers av arter.

Introduction

Tradisjonelt har toksikologifeltet stolt sterkt på bruk av hele dyreforsøk for å gi de dataene som er nødvendige for kjemiske sikkerhetsevalueringer. Slike metoder er typisk kostbare og ressurskrevende. På grunn av det store antallet kjemikalier som brukes i dag og det raske tempoet som nye kjemikalier utvikles i, er det imidlertid globalt et anerkjent behov for mer effektive metoder for kjemisk screening 1,2. Dette behovet og det resulterende paradigmeskiftet bort fra dyreforsøk har ført til utvikling av mange nye tilnærmingsmetoder, inkludert screeninganalyser med høy gjennomstrømning, transkripsjon med høy gjennomstrømning, neste generasjons sekvensering og beregningsmodellering, som lover alternative teststrategier 3,4.

Evaluering av kjemisk sikkerhet på tvers av mangfoldet av arter som potensielt påvirkes av kjemiske eksponeringer, har vært en varig utfordring, ikke bare med tradisjonell toksisitetstesting, men også med nye tilnærmingsmetoder. Fremskritt i komparativ og prediktiv toksikologi har gitt rammer for å forstå den relative følsomheten til forskjellige arter, og teknologiske fremskritt innen beregningsmetoder fortsetter å øke anvendeligheten av disse metodene. Flere strategier har blitt diskutert i løpet av det siste tiåret som utnytter eksisterende gen- og proteinsekvensdatabaser, sammen med kunnskap om spesifikke kjemiske molekylære mål, for å støtte prediktive tilnærminger for ekstrapolering på tvers av arter og forbedre kjemiske sikkerhetsevalueringer utover de typiske modellorganismene 5,6,7,8.

For å fremme vitenskapen til handling, bygge videre på disse grunnleggende studiene i prediktiv toksikologi, prioritere kjemisk testinnsats og støtte beslutningstaking, ble US Environmental Protection Agency Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) verktøyet opprettet. Dette verktøyet er en offentlig og fritt tilgjengelig nettbasert applikasjon som bruker offentlige lagre av stadig voksende proteinsekvensinformasjon for å forutsi kjemisk følsomhet på tvers av mangfoldet av arter9. Basert på prinsippet om at en arts relative iboende følsomhet for et bestemt kjemikalie kan bestemmes ved å evaluere bevaringen av de kjente proteinmålene for kjemikaliet, sammenligner dette verktøyet raskt proteinaminosyresekvenser fra en art med kjent følsomhet for alle arter med eksisterende proteinsekvensdata. Denne evalueringen fullføres gjennom tre analysenivåer, inkludert (1) primær aminosyresekvens, (2) funksjonelt domene og (3) kritiske aminosyrerestsammenligninger, som hver krever mer inngående kunnskap om kjemisk-proteininteraksjonen og gir større taksonomisk oppløsning i følsomhetsprediksjonen. En stor styrke ved SeqAPASS er at brukerne kan tilpasse og avgrense evalueringen ved å legge til flere bevislinjer mot målbevaring basert på hvor mye informasjon som er tilgjengelig om kjemisk protein eller protein-protein-interaksjon av interesse.

Den første versjonen ble utgitt i 2016, som tillot brukere å evaluere primære aminosyresekvenser og funksjonelle domener på en strømlinjeformet måte for å forutsi kjemisk følsomhet og inneholdt minimal datavisualiseringskapasitet (tabell 1). Individuelle aminosyreforskjeller har vist seg å være viktige determinanter for forskjeller på tvers av arter i kjemiske proteininteraksjoner, noe som kan påvirke artens kjemiske følsomhet10,11,12. Derfor ble etterfølgende versjoner utviklet for å vurdere de kritiske aminosyrene som er viktige for direkte kjemisk interaksjon13. Som svar på tilbakemeldinger fra interessenter og brukere har dette verktøyet gjennomgått årlige versjonsutgivelser med flere nye funksjoner designet for å møte behovene til både forskere og reguleringsmiljøer for å takle utfordringer i ekstrapolering på tvers av arter (tabell 1). Lanseringen av SeqAPASS versjon 5.0 i 2020 brakte frem brukersentrerte funksjoner som inkluderer datavisualisering og datasyntesealternativer, eksterne lenker, sammendragstabell og rapportalternativer og grafiske funksjoner. Samlet sett forbedret de nye egenskapene og egenskapene til denne versjonen datasyntese, interoperabilitet blant eksterne databaser og enkel datatolkning for spådommer om følsomhet på tvers av arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Komme i gang

MERK: Protokollen som presenteres her er fokusert på verktøyverktøy og nøkkelfunksjoner. Detaljerte beskrivelser av metoder, funksjoner og komponenter finnes på nettstedet i en omfattende brukerhåndbok (tabell 1).

Tabell 1: Utviklingen av SeqAPASS-verktøyet. En liste over funksjoner og oppdateringer som ble lagt til SeqAPASS-verktøyet fra den første distribusjonen. Forkortelser: SeqAPASS = sekvensjustering for å forutsi følsomhet på tvers av arter; ECOTOX = ECOTOXicology kunnskapsbase. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

  1. Gå til https://seqapass.epa.gov/seqapass ved hjelp av Chrome. Velg enten Logg inn for å bruke en eksisterende konto eller følg instruksjonene for å opprette en SeqAPASS-konto, som lar brukere kjøre, lagre, få tilgang til og tilpasse sine fullførte jobber.
  2. Før du utfører en analyse, må du først identifisere et protein av interesse og en målrettet eller sensitiv art ved å gjennomgå eksisterende litteratur eller eksisterende data (figur 1). Siden SeqAPASS inneholder koblinger til eksterne ressurser for å identifisere spørringsproteinet, klikker du rullegardinknappene under Identifiser et proteinmål for å få tilgang til relevante ressurser.

Figure 1
Figur 1: SeqAPASS problemformulering: skjematisk diagram over den foreløpige informasjonen som er nødvendig for en vellykket analyse. Forkortelser: SeqAPASS = sekvensjustering for å forutsi følsomhet på tvers av arter; LBD = ligandbindende domene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: SeqAPASS-interoperabilitet på tvers av databaser. Skjematisk diagram over eksterne verktøy, databaser og ressurser integrert i SeqAPASS. Forkortelser: SeqAPASS = sekvensjustering for å forutsi følsomhet på tvers av arter; AOP = ugunstig utfallsvei; NCBI = Nasjonalt senter for bioteknologisk informasjon; ECOTOX = ECOTOXicology kunnskapsbase. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 2: Koblinger, ressurser og verktøy integrert i SeqAPASS-verktøyet. En liste over de ulike datakildene, koblingene og ressursene som er utnyttet i SeqAPASS-verktøyet. Forkortelse: SeqAPASS = Sekvensjustering for å forutsi følsomhet på tvers av arter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

2. Utvikle og kjøre en SeqAPASS-spørring: Nivå 1

MERK: I en nivå 1-analyse sammenlignes hele den primære aminosyresekvensen til et spørringsprotein med de primære aminosyresekvensene av alle arter med tilgjengelig sekvensinformasjon. Dette verktøyet bruker algoritmer til å gruve, samle og kompilere offentlig tilgjengelige data for raskt å justere og sammenligne aminosyresekvenser på tvers av arter. Backend lagrer informasjon fra NCBI-databaser (National Center for Biotechnology Information) og bruker strategisk de frittstående versjonene av Protein Basic Local Alignment Search Tool (BLASTp)54 og Constraint-based Multiple Alignment Tool (COBALT)55.

  1. Under Sammenlign primære aminosyresekvenser klikker du enten Etter art eller Ved tiltredelse. Bruk utvalget Etter art til å skrive inn eller velge fra en liste over arter for å velge proteinmålet av interesse.
  2. Send inn proteintiltredelser (dvs. NCBI-protein-ID) direkte ved å skrive inn tiltredelsen(e) i tekstboksen Ved tiltredelse .
  3. Velg Be om kjøring for å sende inn spørringen. Når du har sendt inn, venter du til et varsel vises øverst til høyre i nettleservinduet som indikerer en vellykket innsending.
  4. Velg kategorien SeqAPASS Run Status øverst på siden for å vise en liste over alle SeqAPASS-kjøringer som utføres under den brukerkontoen, og kontroller prosentfullføringen.
    1. Klikk Oppdater data mens den aktuelle alternativknappen er valgt for å kontrollere statusen for kjøring på nivå 2 og nivå 3.
  5. Velg fanen Vis SeqAPASS-rapporter øverst på siden for å få tilgang til en liste over alle rapporter som er fullført under den kontoen.
  6. I kategorien Vis SeqAPASS-rapporter velger du spørringsproteinet av interesse. Klikk Be om valgt rapport for å åpne siden Proteininformasjon for spørring på nivå 1 og vise resultater, alternativer for datatilpassing, visualiseringer og sammendragsrapporter.
  7. Som standard velger du Vis rapport for å vise data i nettleseren. Du kan også velge Lagre rapport for å laste ned rådata som en .zip fil.
    MERK: Tiden som kreves for en nivå 1-analyse vil variere (gjennomsnittlig 23 minutter for versjon 5.1) avhengig av det globale brukerbehovet på det tidspunktet, antall jobber som er sendt til køen, og mengden proteininformasjon som finnes for en innsendt jobb. Hvis et proteinmål tidligere er fullført, vil data være tilgjengelige i løpet av sekunder etter innsending.

3. Utvikle og kjøre en SeqAPASS-spørring: Nivå 2

MERK: Siden hele proteinsekvensen ikke er direkte involvert i en kjemisk interaksjon, sammenligner en nivå 2-analyse bare aminosyresekvensen til det funksjonelle domenet for å gjøre følsomhetsforutsigelser ved lavere taksonomiske rekker (f.eks. klasse, rekkefølge, familie).

  1. Fra siden Proteininformasjon for spørring på nivå 1 klikker du plusstegnet + ved siden av toppteksten på nivå 2 for å fylle ut spørringsmenyen på nivå 2 .
  2. Identifiser de aktuelle domenene i proteinet av interesse (spørringsprotein).
    1. Hvis et domene ikke er identifisert, klikker du på den integrerte lenken til NCBI Conserved Domains Database (CDD) (tabell 1), som kan hjelpe til med å identifisere det aktuelle domenevalget.
      MERK: Vanligvis velges bare bestemte treffdomener som spørringer på nivå 2.
  3. Klikk Velg domene-boksen for automatisk å fylle ut en liste over funksjonelle domener for spørringsproteinet.
  4. Velg domenetilgangen(e) fra rullegardinlisten, og start nivå 2-spørringen ved å klikke knappen Be om domenekjøring . Når du er sendt inn, venter du til det vises et varsel som indikerer en vellykket innsending.
  5. Klikk Oppdater kjøring på nivå 2 og 3 for å fylle ut data på nivå 2, som vil være tilgjengelige bare sekunder etter innsending.
  6. Under Vis nivå 2-data velger du de(n) fullførte domenetilgangen(e) fra rullegardinlisten og klikker knappen Vis nivå 2-data for å åpne resultatene på en ny side.

4. Tilgang til og forståelse av dataene: SeqAPASS nivå 1 og nivå 2

  1. Bla til bunnen av siden Proteininformasjon for spørring for å vise en rapport over resultatene – en primærrapport leveres med analyse på nivå 1 og 2 som standard. Velg alternativknappen Full rapport for å vise en mer detaljert rapport som inneholder alle sekvenstreff og justeringsberegninger. Klikk på riktig tiltredelse/ID/navn i begge rapportene for å få tilgang til den gjennomsiktige proteinjusterings- og taksonomiinformasjonen i NCBI-databasen.
  2. Bla til høyre i resultattabellen for å vise ECOTOX-kolonnen . Klikk på lenker til ECOTOXicology knowledgebase (ECOTOX) for raskt å samle tilsvarende toksisitetsdata for arter med følsomhetsforutsigelser.
    MERK: ECOTOX er en omfattende, offentlig tilgjengelig kunnskapsbase som gir enkeltkjemiske toksisitetsdata for akvatiske og terrestriske planter og dyreliv. SeqAPASS v6.0 inkluderer en ECOTOX-widget for å koble til relevante ECOTOX-data raskere etter kjemikalier og arter av interesse.
  3. Klikk Last ned tabell for å lagre tabellen som en regnearkfil. Klikk knappen Vis sammendragsrapport for å vise og laste ned en sammendragsrapporttabell som viser data sortert etter taksonomisk gruppe.
    Datasammendragstabeller er tilgjengelige for både primær- og fullstendige rapporter og gir en oversikt over prognoser for et gitt mål.

5. Manipulere datainnstillinger: SeqAPASS nivå 1 og nivå 2

MERK: I både nivå 1- og nivå 2-analyser antas det at jo større proteinlikhet er, desto større er sannsynligheten for at et kjemikalie vil interagere med proteinet på samme måte som spørringsarten/proteinet, noe som gjør dem utsatt for potensielle virkninger av kjemikalier med dette molekylære målet. På grunn av likheten til disse dataene, er trinn for å forstå nivå 1 og 2 data skissert sammen i en enkelt protokoll.

  1. Se undermenyene øverst i Proteininformasjon for spørring for å få tilgang til og manipulere rapportinnstillingene og bruke standardinnstillinger for alle rapportalternativer for de fleste analyser. Hvis det finnes vitenskapelig begrunnelse for å endre standardinnstillingen, følger du disse valgfrie trinnene:
    1. (VALGFRITT) Klikk plusstegnet + ved siden av Følsomhetsavskjæring for å se og justere innstillingene for følsomhetsavskjæring i en ny fane. Velg en ny grenseverdi fra en rullegardinliste, eller angi en brukerdefinert grenseverdi.
    2. (VALGFRITT) Endre tallet i feltet E-verdi (antall forskjellige justeringer som forventes å skje ved en tilfeldighet) hvis noe annet enn standard er ønsket.
      MERK: Ethvert protein med en E-verdi som er større enn tallet i boksen, vil bli eliminert fra den primære rapporten.
    3. (VALGFRITT) Bruk alternativet Sorter etter taksonomisk gruppe til å velge nivået for taksonomisk hierarki som skal vises i kolonnen Filtrert taksonomisk gruppe i resultattabellen.
      MERK: Endring av det taksonomiske hierarkiet vil også endre prediksjonen av følsomhet basert på artene fra hver filtrert gruppe som finnes over grensen.
    4. (VALGFRITT) Endre Common Domain (hvor mange vanlige domener et protein må dele med spørringsproteinet for å bli inkludert i resultatene) hvis noe annet enn standard er ønsket.
      MERK: Siden standardinnstillingen er 1, utelates alle sekvenser som ikke deler minst ett felles domene med spørringsproteinet.
    5. (VALGFRITT) Velg Nei under Arter lest på tvers for å få tilbake følsomhetsforutsigelsene for Y bare hvis Prosentlikhet er større enn eller lik grensen, eller hvis treffet er identifisert som en ortologkandidat.
      MERK: Denne innstillingen er som standard Ja, noe som betyr at en følsomhetsprediksjon av Y vil bli rapportert for alle ortologkandidater, alle arter som er oppført over følsomhetsgrensen, og alle arter under grensen fra samme taksonomiske gruppe med en eller flere arter over grensen.
  2. Klikk på knappen Last ned gjeldende rapportinnstillinger for å laste ned en fil som fanger opp gjeldende innstillinger.
    MERK: Det spesifikke evalueringsnivået (1, 2 eller 3) som er valgt, vil diktere innstillingene som presenteres i rapporten.

6. Visualisering av dataene: SeqAPASS nivå 1 og nivå 2

  1. Klikk plusstegnet + ved siden av Visualisering, og klikk på Visualiser data-knappen for å åpne en egen fane som viser brukerdefinert informasjon og muligheten til å velge en interaktiv graf over resultater.
  2. Klikk Boxplot for å åpne de interaktive boxplot- og plottkontrollene og la boxplot-visualiseringen oppdateres aktivt for å gjenspeile endringer i datatabellen og gi grafikk av publikasjons- og presentasjonskvalitet.
    MERK: Standard boxplot viser artsgrupper på x-aksen og prosentlikhet på y-aksen. Boxplots viser følsomhetsgrensen (stiplet linje), prosentvis likhet på tvers av arter sammenlignet med spørringsarten, og gjennomsnittlige og medianverdier for hver taksonomiske gruppe sammen med 25. og 75. persentil og interkvartilområde. Avhengig av målet med analysen og brukerens behov, kan mange boxplot-funksjoner endres gjennom følgende valgfrie trinn.
    1. (VALGFRITT) Hvis du vil tilpasse de viste taksonomiske gruppene, kan du se boksen Taksonomiske grupper under Kontroller-delen . Fjern grupper ved å rulle over navnene og velge x eller ved å bruke rullegardinmenyen Taksonomiske grupper .
    2. (VALGFRITT) Hvis du vil legge til en forklaring som identifiserer en art av interesse eller bestemte forhåndsdefinerte grupper (f.eks. truede eller truede arter), holder du pekeren over et taksonomisk gruppenavn på x-aksen for å aktivere en popup-boks som viser de tre øverste artene sortert etter høyeste prosentlikhet. Hold markøren over arter i forklaringen for å generere en popup-boks med tilsvarende artsinformasjon. Klikk på boksen for en bestemt taksonomisk gruppe for å generere en nedlastbar sammendragstabell som viser arter og spådommer.
  3. Klikk Last ned Boxplot for å velge en filtype, tilpasse bredde-/høydeoppløsningen og lagre visualiseringen.

7. Utvikle og kjøre en SeqAPASS-analyse: Nivå 3

MERK: En nivå 3-analyse vurderer brukeridentifiserte aminosyrerester i spørringsproteinet og sammenligner raskt bevaringen av disse restene på tvers av arter. Arter der disse restene er bevart, antas å være mer sannsynlig å interagere med et kjemikalie på samme måte som malarten / proteinet. Ettersom nivå 3 fokuserer på individuelle aminosyrer, kan en analyse bare utføres når detaljert kunnskap om aminosyrerestene som er kritiske for kjemisk-protein- eller protein-protein-interaksjonen er tilgjengelig.

  1. Klikk plusstegnet + ved siden av toppteksten på nivå 3 på siden Proteininformasjon for spørring på nivå 1 for å fylle ut spørringsmenyen på nivå 3.
  2. Klikk plusstegnet + ved siden av Referanseutforsker for å åpne referanseutforskerverktøyet, som genererer en forhåndsdefinert boolsk streng for å spørre tilgjengelig litteratur og hjelpe brukere med å identifisere passende litteratur for å støtte identifiseringen av kritiske aminosyrer som skal brukes i nivå 3-evalueringen (tabell 2 og figur 2).
    1. (VALGFRITT) Når spørringsproteinet fylles ut automatisk, bruker du funksjonen Legg til proteinnavn til å legge til flere proteiner.
  3. Klikk på koblingen Generer Google Scholar for å åpne et popup-vindu som inneholder en automatisk generert søkestreng som inneholder relevante søkeord.
  4. Klikk på Søk i Google Scholar for å søke i litteraturdatabasen ved hjelp av søkestrengen.
    1. Du kan også klikke Kopier til utklippstavle og tilpasse søkestrengen ved å legge til eller fjerne termer ved hjelp av funksjonene i Referanseutforsker.

8. Identifiser kritiske aminosyrerester ved hjelp av identifisert litteratur

  1. Velg malsekvensen som brukervalgte arter skal justeres etter, på Spørringsmeny på nivå 3.
    MERK: Denne malsekvensen velges vanligvis basert på litteraturen som de kritiske aminosyrene ble identifisert for, og kan være den samme eller en annen art enn de som ble spurt i nivå 1 og nivå 2.
    1. (VALGFRITT) Bruk Tilleggssammenligninger-boksen til å sammenligne eventuelle tiltredelser/sekvenser som ikke vises i tabellene Primær/Fullstendig rapport .
  2. Skriv inn et brukerdefinert navn for kjøring på nivå 3 i tekstboksen Angi kjørenavn på nivå 3 for å identifisere den fullførte kjøringen på nivå 3. Velg et unikt navn for hver evaluering.
  3. Velg den taksonomiske interessegruppen i feltet Velg taksonomisk gruppe(r). Velg en taksonomisk gruppe for å filtrere tabellen automatisk etter den taksonomiske gruppen.
  4. I resultattabellen klikker du manuelt i avmerkingsboksen ved siden av eventuelle arter som skal justeres etter malsekvensen.
    MERK: For å sikre riktig justering bør én taksonomisk gruppe om gangen sammenlignes med malen. Velg bare tilsvarende kommenterte proteiner for arten av interesse. Når du velger sekvenser for sammenligning, er det viktig å være oppmerksom på visse sekvenser (f.eks. hypotetisk, LAV KVALITET eller delvis). Med mindre det er gjennomsiktig begrunnelse for inkludering, er det best å ekskludere disse sekvensene, da de kan forvrenge spådommer på grunn av ufullstendig eller upassende sekvensinformasjon.
  5. Gjenta trinnene for å justere alle taksonomiske interessegrupper.
  6. Klikk Oppdater kjøring på nivå 2 og 3 når alle artene er justert for å fylle menyen Velg kjørenavn på nivå 3 med de fullførte jobbene på nivå 3, og hente dataene fra en justering på nivå 3 umiddelbart.
  7. Klikk Kombiner nivå 3-data for å kombinere justeringer fra flere taksonomiske grupper.
    1. Hvis du vil vise én enkelt rapport, kan du også velge det brukerdefinerte navnet under Velg spørring som skal vises , og klikke Vis data på nivå 3.
  8. Velg nivå 3-malen som skal brukes som grunnlag for sammenligning av aminosyrerester i menyen Kombiner nivå 3-rapporter , og klikk på Neste.
  9. I nivå 3-jobber velger du fullførte jobber for sammenligning og klikker på Neste. Bruk funksjonen Ordrenivå 3-jobber til å omorganisere de taksonomiske gruppene om ønskelig. Klikk Vis nivå 3-data for å lage en rapportside på nivå 3 med de kombinerte taksonomiske gruppene justert.
  10. Velg tidligere identifiserte aminosyreposisjoner for malarten ved å skrive inn aminosyreposisjonen(e), atskilt med komma, i boksen Angi aminosyrerestposisjoner og deretter velge Kopier til restliste . Velg rester direkte i malsekvensen fra skyttelboksen.
  11. Klikk Oppdater rapport for å oppdatere siden og vise prognosene for følsomhet på nivå 3.
    MERK: Nivå 3 bruker et enkelt sett med regler avledet fra grunnleggende beskrivelser av sidekjedefunksjonelle egenskaper (f.eks. Alifatiske, aromatiske) og molekylære dimensjoner (molekylvektforskjeller >30 g / mol) for å avgjøre om forskjeller i nøkkelposisjoner sannsynligvis vil påvirke proteininteraksjoner13.

9. Visualisere nivå 3 SeqAPASS-data

MERK: Som i tidligere nivåer er primære og fullstendige rapporter tilgjengelige. I tillegg til data som er identiske med dataene på nivå 1 og 2, viser primærrapporten aminosyreposisjoner, forkortelser og en ja/nei-følsomhet (J/N) som malprediksjonen. På samme måte inneholder den fullstendige rapporten informasjon om aminosyresidekjedeklassifisering og molekylvekt.

  1. På rapportsiden på nivå 3 blar du til bunnen for å vise en rapport over resultatene. Klikk på Last ned tabell nederst i rapporten for å lagre tabellen.
  2. Klikk Vis sammendragsrapport på nivå 3 for å vise og laste ned en sammendragsrapporttabell som viser data sortert etter taksonomisk gruppe. Klikk plusstegnet + ved siden av Visualisering på rapportsiden på nivå 3 for å åpne en egen nettleserfane som viser brukerdefinert informasjon og alternativet for å vise resultater i form av et interaktivt varmekart.
  3. Klikk Varmekart på siden Visualiseringsinformasjon for å åpne den interaktive grafikken og kontrollene og la varmekartvisualiseringen oppdateres aktivt for å gjenspeile endringer i datatabellen. Utfør følgende valgfrie trinn for å tilpasse varmekartet.
    1. (VALGFRITT) Velg Rapportalternativer for å bytte mellom en enkel rapport, som viser aminosyreposisjonen, forkortelsen på én bokstav og aminosyrelikhet, eller en fullstendig rapport, som viser detaljert informasjon om hver valgte aminosyre.
    2. (VALGFRITT) Velg Rapportalternativer for å endre hvordan arter vises, enten etter Common Name eller Scientific Name.
      MERK: I Simple Report er aminosyrer kategorisert som Total Match (mørk blå), Partial Match (lyseblå, erstatninger som bare oppfyller ett kriterium), eller Not a Match (gul, erstatninger som ikke oppfyller noen av kriteriene) til malaminosyren. Den fullstendige rapporten viser sammenligninger som enten Total Match (mørk blå) eller Not a Match (gul).
    3. (VALGFRITT) Velg Valgfrie valg for å fremheve nyttig informasjon, for eksempel ortologkandidater, truede arter, truede arter eller vanlige modellorganismer.
    4. (VALGFRITT) Velg Innstillinger for varmekart for å velge flere tilpasningsalternativer, inkludert å legge til eller fjerne kolonner, forklaringer og tekst.
  4. Klikk Last ned Boxplot for å velge en filtype og lagre visualiseringen.

10. Tolkning av SeqAPASS-resultater: Bevislinjer for proteinbevaring

MERK: For enkel tolkning inkluderer dette verktøyet en beslutningssammendragsrapport (DS-rapport) designet for å integrere data på tvers av nivåer. DS-rapporten inneholder resultatene (dvs. datatabeller og/eller visualiseringer) som brukeren har valgt, og gir mulighet for rask evaluering av mottakelighetsforutsigelser på tvers av flere nivåer for flere arter samtidig.

  1. Klikk på Push Level # to DS Report fra resultat- eller datavisualiseringssidene, og vent til dataene blir "pushet" og DS Report-fanen blir aktiv.
    MERK: Hvis resultatene eller eventuelle endringer ikke er overført til DS-rapporten, forblir Push Level # til DS-rapporten aktiv til den er valgt. Hvis en innstilling er endret, vises teksten Klikk for å skyve nye endringer til endringene skyves til rapporten. Visualiseringer kan skyves til DS-rapporten når som helst under evalueringen.
  2. Velg fanen DS-rapport når som helst for å få tilgang til DS-siden.
    MERK: For alle arter som er justert på nivå 1, inneholder tabellen Final Decision Summary Report viktige data og følsomhetsforutsigelser for hver analyse. Hvis en art i DS-tabellen ikke ble inkludert i nivå 3-rapporten, men ble funnet i nivå 1- og/eller nivå 2-jobber, vil cellen i tabellen motta en ikke anvendelig (NA)-betegnelse for nivå 3-følsomhetsprediksjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å demonstrere anvendelsen av SeqAPASS-verktøyet og fremheve nye funksjoner, beskrives to casestudier som representerer tilfeller der proteinbevaring forutsier at det er forskjeller i kjemisk følsomhet på tvers av arter (human transthyretin) og at det ikke er noen forskjeller (μ opioidreseptor [MOR]). Det første av disse eksemplene omhandler proteinsekvens / strukturelle sammenligninger for å forutsi anvendelsesområdet for uønskede utfallsveier (AOP, se tabell 2 for definisjon), mens det andre er fokusert på å utvikle forskningshypoteser som er relevante for følsomhet på tvers av arter for opioider som er tilstede i avløpsvann. De grunnleggende tilnærmingene som er beskrevet i disse casestudiene, kan brukes på ethvert kjemikalie og demonstrere den brede nytten av dette verktøyet for beslutningstaking og forskning.

Skjoldbruskhormoner er avgjørende for normal vekst og utvikling. De syntetiseres i skjoldbruskkjertelen og utskilles i blodet hvor de binder seg til distribusjonsproteiner og sirkuleres gjennom hele kroppen 14,15,16,17,18. Nylige studier har vist at miljøgifter, som polyklorerte bifenyler (PCB), polybromerte difenyletere (PBDE) og per- og polyfluoralkylsubstanser (PFAS), kan binde seg til distribusjonsproteinet transtyretin (TTR) og forstyrre normale skjoldbruskkjertelprosesser 19,20,21,22,23,24,25 . Det er utviklet en AOP som beskriver konkurransebinding til TTR som fører til human nevroutviklingstoksisitet (https://aopwiki.org/aops/152). Selv om det er bevis på at denne AOP også gjelder for gnagere, har anvendeligheten til andre taksonomiske grupper ennå ikke blitt definert. Siden TTR-bindende kjemikalier er tilstede i miljøet, er det viktig å forstå den taksonomiske relevansen av denne AOP, en utfordring som delvis kan løses gjennom SeqAPASS-analyse. Ved hjelp av verktøyets problemformuleringsstrategi kan målet med analysen angis som følger: Med kunnskapen om at TTR-bindende forbindelser fører til uønskede utfall hos mennesker, hvilke taksonomiske grupper vil bli spådd å dele lignende følsomhet?

Det humane transthyretinproteinet er godt karakterisert, og det er flere godt studerte ligander kjent for å binde seg på det humane TTR (hTTR) bindingsstedet, noe som gjør det til et optimalt mål for SeqAPASS-analyse 8,9,13. Ved hjelp av NCBI-tiltredelsen for humant transtyretin, P02766.1, ble det utført en nivå 1-analyse med standardinnstillinger. Resultatene av nivå 1-analysen satte prosentlikhetsgrensen på 49%, med pattedyr (Mammalia), fugler (Aves), reptiler (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), amfibier (Amphibia) og de fleste fiskearter (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) som faller over denne grensen (figur 3). Dermed resulterte alle arter fra disse taksonomiske gruppene i en følsomhetsprediksjon av "Y" (dvs. ja) og er sannsynligvis utsatt for kjemikalier som er kjent for å interagere med hTTR (figur 3 og tilleggsfil 1).

For nivå 2-vurderingen av funksjonelt domene (er) ble NCBI Conserved Domain Database brukt til å identifisere TR_THY (tiltredelse smart00095) som et konservert domene som består av den modne kjeden av TTR-underenhetsproteinet fra rester 27 til 147. Siden proteinsekvensen til TTR rapportert i NCBI inkluderer et 20 aminosyre-pre-segment som ikke er relevant for den nåværende analysen, gir fokus på sammenligningen på den modne kjeden en ekstra, mer spesifikk bevislinje mot bevaring av dette proteinet på tvers av arter. Fra nivå 2-evalueringen ble det rapportert en prosent likhetsgrense på 58%, med pattedyr, fugler, reptiler, amfibier og de fleste fiskearter som igjen falt over denne grensen (figur 4). Følgelig konkluderte SeqAPASS med en følsomhetsprediksjon av "Y" (dvs. ja) for arter fra disse taksonomiske gruppene, noe som indikerer at de sannsynligvis er utsatt for kjemikalier som interagerer med hTTR-proteinet (figur 4 og tilleggsfil 1). Samlet sett tyder resultater fra nivå 1- og nivå 2-analyser på at de fleste virveldyrarter deler bevaring av hTTR og sannsynligvis vil være utsatt for kjemikalier som er kjent for å interagere med dette proteinet.

Figure 3
Figur 3: SeqAPASS nivå 1-analyse av transtyretinbevaring på tvers av taksonomiske grupper med tilgjengelig sekvensinformasjon i forhold til det humane proteinet. Prosentlikhet av proteinaminosyresekvensen vises på Y-aksen; taksonomisk gruppe vises på X-aksen. Åpne sirkler (○) indikerer spørringssekvensen, og lukkede sirkler (●) indikerer arten innenfor den taksonomiske gruppen med høyest prosentlikhet. Innenfor plottet representerer toppen og bunnen av hver boks 75th og 25th persentiler, whiskers strekker seg til 1,5 ganger interkvartilområdet, og gjennomsnittet og medianverdiene er representert av horisontale svarte linjer på boksen. Den stiplede linjen angir grensen for følsomhetsforutsigelser. Forkortelser: TTR = transthyretin; SeqAPASS = sekvensjustering for å forutsi på tvers av artenes følsomhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: SeqAPASS nivå 2-analyse av transthyretinreseptorligandbindende domenebevaring på tvers av taksonomiske grupper med tilgjengelig sekvensinformasjon i forhold til det humane proteinet LBD. Prosentlikhet av ligandbindingsdomenets aminosyresekvens vises på Y-aksen; taksonomisk gruppe vises på X-aksen. Åpne sirkler (○) indikerer spørringssekvensen, og lukkede sirkler (●) indikerer arten innenfor den taksonomiske gruppen med høyest prosentlikhet. Innenfor plottet representerer toppen og bunnen av hver boks 75th og 25th persentiler, whiskers strekker seg til 1,5 ganger interkvartilområdet, og gjennomsnittet og medianverdiene er representert av horisontale svarte linjer på boksen. Den stiplede linjen angir grensen for følsomhetsforutsigelser. Forkortelser: TTR = transthyretin; SeqAPASS = sekvensjustering for å forutsi på tvers av artenes følsomhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Gjennom analysen av molekylær modellering og proteinkrystallografistudier ble aminosyrer identifisert i bindingsområdet til TTR som forventes å interagere med den endogene liganden 3,3′,5,5′-tetraiodo-L-tyronin (T4, PDB 2ROX), samt tre miljøkjemikalier: perfluoroktansulfonat (PFOS, PDB 5JIM), tetrabromobisfenol A (TBBPA, PDB 5HJG) og dietylstilbestrol (DES, PDB 1TZ8)19, 21,22,26. Aminosyrerestene Lys35, Ser137, Leu130, Ala128, Ala129 og Thr139 ble alle identifisert som å spille en nøkkelrolle i protein-ligand-interaksjoner, enten gjennom direkte hydrogenbindingsinteraksjoner eller van der Waals-interaksjoner. Disse seks aminosyrerestene ble evaluert i en nivå 3-analyse på tvers av arter ved bruk av hTTR som malsekvens og ekskludering av ikke-homologe, hypotetiske, delvise og lavkvalitetssekvenser (tilleggsfil 1). Siden det tidligere ble fastslått at TTR bare konserveres på tvers av virveldyrarter, ble virvelløse arter ekskludert fra denne analysen (figur 3 og figur 4). I tillegg er det viktig å merke seg at aminosyreposisjoner rapportert i litteraturen utelukker et 20 aminosyre-pre-segment som er fraværende i det modne hTTR-proteinet, og av denne grunn ble posisjoner innsendt i nivå 3 justert fra de som er rapportert i litteraturen for å sikre nøyaktig justering til den valgte malen protein15 (tilleggsfil 1).

I nivå 3-analysen av TTR ble 294 virveldyrarter valgt for justering (pattedyr, fugler, amfibier, reptiler og fisk). Av de evaluerte artene viste 18 forskjeller i viktige aminosyrer som resulterte i en følsomhetsprediksjon av "N" (dvs. nei). Interessant nok presenterte fem arter av sjøpattedyr en aminosyresubstitusjon i posisjon 2 (128A), mens fire arter av fisk viste substitusjoner i enten posisjon 2 (128A) eller posisjon 6 (139T) (figur 5). Siden disse aminosyrene spiller viktige roller i protein-ligand-interaksjoner i bindingskanalen til TTR, antyder disse dataene at TTR-ligander kan interagere annerledes i disse artene og vil resultere i forskjellig kjemisk følsomhet i forhold til mennesker.

Figure 5
Figur 5: SeqAPASS nivå 3-analyse av bevaring av aminosyrerester som er viktige for TTR-kjemisk binding. (A) Nivå 3-sammendragstabell som viser antall arter med tilgjengelige sekvensdata på tvers av alle taksonomiske grupper, antall arter som forventes å være tilsvarende mottakelige (Y), og antall arter som forventes å ikke være like mottakelige (N). (B) Nivå 3 varmekart som viser utvalgte arter som forventes å ikke være like mottakelige i forhold til det humane transthyretin TTR-proteinet, og demonstrerer fulle, delvise og ikke-matchende aminosyrer. Forkortelser: TTR = transthyretin; SeqAPASS = sekvensjustering for å forutsi på tvers av artenes følsomhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Som svar på tilbakemeldinger fra interessenter og brukere har nye funksjoner blitt designet og innlemmet i SeqAPASS-verktøyet, inkludert muligheten til å koble til empiriske data for forskjellige applikasjoner. Interoperabiliteten mellom dette verktøyet og ECOTOX-kunnskapsbasen (tabell 1) ble oppnådd ved både å legge inn eksterne lenker i nivå- og nivå 2-datatabellene for tiltredelser i ECOTOX, og ved å opprette en ECOTOX-widget i verktøyet for å filtrere direkte til de mest relevante toksisitetsdataene i ECOTOX. Gjennom lenkene og widgeten kan brukere raskt spørre ECOTOX og samle tilsvarende toksisitetsdata for arter med SeqAPASS følsomhetsforutsigelser. For tiden er SeqAPASS-prediksjoner koblet til ECOTOX gjennom en kjemisk stressor og art; Toksisitetsdata er imidlertid ennå ikke knyttet til spesifikke gener/proteiner, noe som vil muliggjøre direkte forbindelser til de spesifikke endepunktene/molekylære målene av interesse for SeqAPASS. Selv om det ikke er ideelt å koble spådommer til toksisitetsdata basert på en kjemisk stressor, da data kanskje ikke er spesifikke for en gitt vei, er det første trinnet å etablere en forbindelse for å bringe resultater sammen. Som den første iterasjonen av en SeqAPASS-ECOTOX-integrasjon, gir den nåværende tilnærmingen brukerne alle tilgjengelige toksisitetsdata for kjemisk stressor (er) og arter på et bredt nivå. Disse dataene, når de kombineres med SeqAPASS-spådommer, kan gi kontekst på brede nivåer (vertebrat vs. virvelløse dyr) og kan vurderes innenfor rammen av AOP-rammeverket.

TTR presenterer et godt eksempel for å undersøke denne sammenhengen, da den eksisterende AOP (AOP 152) gir kontekst for å tolke potensielt relevante ECOTOX-toksisitetsdata. Fra og med ligandene som ble undersøkt i SeqAPASS nivå 3, ble miljøtoksisitetsdata samlet på tvers av arter for fire kjemikalier kjent for å interagere med TTR-ligandbindingsdomenet (dietylstilbestrol [DES], perfluorheksansyre [PFHxA], perfluoroktansulfonat [PFOS] og tetrabromobisfenol A [TBBPA])19,21,23,24 . For hvert kjemikalie ble ECOTOX spurt etter akvatiske og terrestriske data av CAS-nummer (Chemical Abstracts Service) ved hjelp av tilpassede søkeparametere (tilleggsfil 1). Data ble filtrert til artsgrupper av interesse (amfibier, fugler, fisk, virvelløse dyr, pattedyr, reptiler). Innenfor de filtrerte spørringsresultatene ble et gjennomsnitt av studiens minimums- og maksimumskonsentrasjoner av effekt beregnet og implementert som en tilnærming for gjennomsnittet for eventuelle treff som ikke rapporterte en gjennomsnittlig effektkonsentrasjonsverdi (figur 6A og tilleggsfil 1). Innenfor rammen av en enkelt kjemikalie ble Kruskal-Wallis-tester utført for å sammenligne gjennomsnittlige effektkonsentrasjoner av forskjellige taksonomiske grupper, da dataene ikke oppfylte ANOVA-testforutsetningene. Post-hoc parvise sammenligningstester ble deretter utført ved bruk av Dunns test for alle kjemikalier, da de taksonomiske gruppene besto av ulike utvalgsstørrelser. Akvatiske og terrestriske resultater ble analysert separat, da data mellom de to typer eksponeringer ikke er direkte sammenlignbare. Innenfor ECOTOX var akvatiske toksisitetsdata for de utvalgte kjemikaliene tilgjengelige for amfibier, fugler, virvelløse dyr og fiskearter (figur 6A). Terrestriske toksisitetsdata for de utvalgte kjemikaliene var kun tilgjengelig for pattedyr og DES (tilleggsfil 1).

Figure 6
Figur 6: Kobling av SeqAPASS-resultater med empiriske data. (A) Gjennomsnittlige effektkonsentrasjoner på tvers av taksonomiske grupper med data tilgjengelig i ECOTOXicology kunnskapsbase for utvalgte kjemikalier kjent for å binde seg til det humane TTR-proteinet. (B) Overlapp i antall arter som inngår i hver SeqAPASS-analyse med de artene som ECOTOX-data var tilgjengelige for. I panel A angir parenteser langs x-aksen antall spørringstreff som dataene ble aggregert for. Stjerner indikerer par med signifikant forskjellige effektkonsentrasjoner mellom artsgrupper innenfor rammen av et enkelt kjemikalie (Dunns test, p < 0,05), der høyere antall stjerner indikerer sterkere signifikansnivåer (*: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001; ****: p < 0,0001). De midterste linjene i hver boks representerer medianen, med bokskanter som viser interkvartilområdet. Whiskers strekker seg opp til 1,5 ganger interkvartilområdet. Uteliggere som faller utenfor dette området vises som individuelle punkter. Forkortelser: TTR = transthyretin; SeqAPASS = sekvensjustering for å forutsi på tvers av arters følsomhet; ECOTOX = ECOTOXicology kunnskapsbase. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Samlet sett tyder disse dataene på at bioaktivitet for kjemikaliene som er vurdert, forekommer hos virveldyr, men forekommer ikke hos virvelløse dyr. Selv om mangelen på biologisk mål- og veiinformasjon i ECOTOX gjør det umulig å koble disse empiriske dataene direkte til TTR, støtter disse resultatene SeqAPASS-spådommene om at virvelløse arter ikke deler følsomhet. Alle virveldyrarter med tilgjengelige data viste følsomhet for både PFOS og TBBPA, selv om de gjennomsnittlige effektkonsentrasjonene var signifikant høyere hos fisk og fugl enn amfibier. Disse dataene antyder potensielle forskjeller i følsomhet mellom taksonomiske grupper som kan tilskrives biologiske baneforskjeller (inkludert TTR). Det er bemerkelsesverdig at andre variabler som metabolisme og utskillelse også kan spille en rolle i forskjeller i følsomhet. For PFHxA og PFOS ble fisk funnet å være signifikant mer følsom enn både virvelløse dyr og fugler, og for DES presenterte amfibier med signifikant høyere gjennomsnittlige effektkonsentrasjoner enn hvirvelløse dyr. Igjen støtter disse dataene vår SeqAPASS-prediksjon om at virvelløse dyr ikke deler følsomhet med virveldyrarter. Av alle arter vurdert ved hjelp av dette verktøyet som det var tilgjengelige TTR-sekvensdata for, hadde bare et lite antall tilsvarende ECOTOX-data for de fire kjemikaliene av interesse (figur 6B, tilleggstabell S1 og tilleggstabell S2). For de artene som mangler apikale data, legger SeqAPASS-spådommer om følsomhet til flere bevislinjer for at beslektede arter kan oppføre seg på samme måte som de med apikale data. Data for alle SeqAPASS- og ECOTOX-analyser er tilgjengelige i tilleggsfil 1.

Ifølge Centers for Disease Control and Prevention (CDC), i 2017, bidro opioider til rundt 47 600 dødsfall ved overdosering i USA, et tall som fortsetter å stige27. Avløpsanlegg i USA er regulert nasjonalt av US Environmental Protection Agency's National Pollutant Discharge Elimination System, som ikke krever testing for opioider eller andre legemidler ved utslipp28. I de senere år har det blitt gjort en innsats for å bruke avløpsvannbasert epidemiologi som et verktøy for å kartlegge samfunnets opioidbruk. Innsats for opioidovervåking har påvist konsentrasjoner så høye som 1,27 μg/L i avløpsvann og 0,7 μg/L i overflatevann29,30. Nyere toksisitetsstudier som vurderer effekten av opioideksponering på fisk har rapportert utviklingen av vanedannende atferd og negative immunologiske effekter (f.eks. høyere infeksjonsrater, nedregulering av immungener)31,32,33. Samlet sett tyder disse studiene på at det er potensial for uønskede miljømessige opioideksponeringer og fremhever viktigheten av å forstå risikoen disse kjemikaliene utgjør for akvatiske arter. Gitt omfanget av arter som kan støte på disse forbindelsene i miljøet, kan identifisering av potensielt mottakelige arter ved hjelp av SeqAPASS være viktig for prioritering av testing eller overvåking.

MOR utgjør det viktigste opioidmålet for behandling av smerte og er ansvarlig for de kraftige smertestillende og vanedannende egenskapene til opiatalkaloider hos mennesker34,35. På grunn av betydningen av denne reseptoren for menneskers helse er MOR-ligander velkjente, og røntgenkrystallografistudier av høy kvalitet er tilgjengelige, noe som gjør dette målet ideelt for SeqAPASS-analyse 8,9,13. Ved hjelp av NCBI-tiltredelsen for human μ opioidreseptor, ACM90349.1, ble en nivå 1-analyse utført ved hjelp av standardinnstillinger. Følsomhetsgrensen ble etablert på 55% for nivå 1, med prosentlikheter for pattedyr (Mammalia), fugler (Aves), reptiler (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), amfibier (Amfibier) og de fleste fiskearter (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) som faller over denne grensen; Derfor resulterte arter fra disse taksonomiske gruppene i en følsomhetsprediksjon av "Y" (dvs. ja), noe som indikerer at de sannsynligvis vil være utsatt for kjemikalier som er kjent for å interagere med menneskelig MOR (figur 7 og tilleggsfil 1). Ved hjelp av NCBI Conserved Domain Database ble 7tmA_Mu_opioid_R identifisert (tiltredelse cd15090) som et funksjonelt domene som består av alle syv helikene av MOR-proteinet fra 133 til 411, inkludert et antatt ligandbindingssted. Sammenlignet med nivå 1 identifiserte nivå 2-resultatene en høyere følsomhetsavskjæring på 88% likhet, med pattedyr, fugler, reptiler, amfibier og de fleste fiskearter funnet over denne avskjæringen og resulterte i en følsomhetsprediksjon av "Y" for ja (figur 8). Samlet sett tyder resultater fra nivå 1- og nivå 2-analyser på at de fleste virveldyrarter deler bevaring av MOR og sannsynligvis vil være utsatt for kjemikalier som er kjent for å interagere med human MOR.

Figure 7
Figur 7: SeqAPASS nivå 1-analyse av μ bevaring av opioidreseptorer på tvers av taksonomiske grupper med tilgjengelig sekvensinformasjon i forhold til det humane proteinet. Prosentlikhet av proteinaminosyresekvensen vises på Y-aksen; taksonomisk gruppe vises på X-aksen. Åpne sirkler (○) indikerer spørringssekvensen, og lukkede sirkler (●) indikerer arten innenfor den taksonomiske gruppen med høyest prosentlikhet. Innenfor plottet representerer toppen og bunnen av hver boks 75- og 25-prosentilene, værhårene strekker seg til 1,5 ganger interkvartilområdet, og middel- og medianverdiene er representert av horisontale svarte linjer på boksen. Den stiplede linjen angir grensen for følsomhetsforutsigelser. Forkortelser: MOR = mu-opioidreseptor; SeqAPASS = sekvensjustering for å forutsi på tvers av artenes følsomhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: SeqAPASS nivå 2-analyse av μ opioidreseptorligandbindende domenebevaring i forhold til domenet i det humane proteinet. Prosentlikhet av den ligandbindende domeneaminosyresekvensen vises på Y-aksen; taksonomisk gruppe vises på X-aksen. Åpne sirkler (○) indikerer spørringssekvensen, og lukkede sirkler (●) indikerer arten innenfor den taksonomiske gruppen med høyest prosentlikhet. Innenfor plottet representerer toppen og bunnen av hver boks 75- og 25-prosentilene, værhårene strekker seg til 1,5 ganger interkvartilområdet, og middel- og medianverdiene er representert av horisontale svarte linjer på boksen. Den stiplede linjen angir grensen for følsomhetsforutsigelser. Forkortelser: MOR = mu-opioidreseptor; SeqAPASS = sekvensjustering for å forutsi på tvers av artenes følsomhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Gjennom analyse av molekylær modellering og proteinkrystallografistudier ble aminosyrer identifisert i bindingsområdet til MOR som antas å interagere med kjente ligander. Selv om det mangfoldige settet av ligander som binder seg godt til opioidreseptorer resulterer i kompleks farmakologi, observeres noen konsistente ligandproteininteraksjoner36,37. Basert på molekylær dokking til forskjellige MOR-krystallstrukturer, interagerer både morfin og fentanyl, MOR-agonister med høy affinitet med D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322 og Y32636,38. Rester D147, Y148, M151 og H297 er også involvert i krystallstrukturer av MOR bundet til morfinagonisten BU72, mens D147, M151, H297 og Y326 også er kritiske for binding til den irreversible morfinantagonisten β-funaltrexamine37. Tatt i betraktning disse bevislinjene, ble ni rester valgt (D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322, Y326) for nivå 3-evaluering ved bruk av menneskelig MOR som malsekvens og unntatt delvise, forutsagte, hypotetiske og lavkvalitetssekvenser. Det er viktig at aminosyreposisjoner rapportert i litteraturen utelukker et 64-aminosyresegment i forhold til NCBI-proteintiltredelsen, og av denne grunn ble posisjoner i nivå 3 valgt for å representere de som justerte seg med malsekvensen for korrekte justeringssekvenser.

I nivå 3-analysen av human MOR ble 284 arter vurdert på tvers av virveldyrarter (pattedyr, fugler, amfibier, reptiler og fisk). På tvers av alle artene som ble evaluert, var de ni aminosyrene enten en total kamp eller en delvis kamp basert på sidekjedeklassifisering og molekylvekt; følgelig resulterte alle artene som ble vurdert i en følsomhetsprediksjon av "Y" for ja (tabell 3 og tilleggsfil 1). Siden disse aminosyrene er viktige i bindingen av både sterke MOR-agonister og sterke antagonister, antyder disse dataene at opioidforbindelser rettet mot humane μ opioidreseptorer kan interagere på samme måte med reseptorer på tvers av vertebrate arter. Selv om det hittil finnes lite empiriske data innenfor ECOTOX-kunnskapsbasen for opioidforbindelser, tyder flere studier på at fisk sannsynligvis er mottakelige31,32,33. Samlet sett peker resultater fra SeqAPASS på potensialet for bredere miljøpåvirkninger av MOR-modulerende kjemikalier på tvers av arter, noe som indikerer at mer forskning og kanskje overvåking kan være verdifullt. Data for alle analyser er tilgjengelig i tilleggsfil 1.

Tabell 3: SeqAPASS nivå 3-analyse av bevaring av aminosyrerester som er viktige for kjemisk binding til den μ opioidreseptoren. Sammendragstabell som viser antall arter med tilgjengelige sekvensdata på tvers av alle taksonomiske grupper, antall arter som antas å være tilsvarende mottakelige (Y), og antall arter som antas å ikke være like følsomme, samt fulle, delvise og ikke-matchende aminosyrer. Forkortelse: SeqAPASS = Sekvensjustering for å forutsi følsomhet på tvers av arter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell S1: Arter med tilgjengelige ECOTOX-data for de fire kjemikaliene av interesse som er kjent for å binde seg til det humane transtyretinproteinet. Data tilgjengelig for hvert kjemikalie er justert med SeqAPASS-spådommer om lignende følsomhet på tvers av nivå 1, 2 og 3. Alle SeqAPASS-spådommer i forhold til den menneskelige transthyretin-sekvensen. Forkortelser: SeqAPASS = sekvensjustering for å forutsi følsomhet på tvers av arter; DES = dietylstilbestrol; PFHxA = perfluorheksansyre; PFOS = perfluoroktansulfonsyre; TBBPA = tetrabromobisfenol A. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell S2: Totalt antall arter med tilgjengelige data på tvers av SeqAPASS og ECOTOX Evalueringer for utvalgte kjemikalier kjent for å binde seg til det humane transthyretinproteinet. SeqAPASS gir midler for å forutsi artenes mottakelighet på tvers av mange arter der empiriske toksisitetsdata ikke er tilgjengelige. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfil 1: SeqAPASS- og ECOTOX-data for alle representative resultater. Filen inneholder ToC etterfulgt av følgende datablad: Tab 1-hTTR SeqAPASS Resultater Nivå 1, Tab 2-hTTR SeqAPASS Resultater Nivå 2, Tab 3-hTTR SeqAPASS Resultater Nivå 3, Tab 4-EcoTox data for DES, Tab 5-EcoTox data for PFOS, Tab 6-EcoTox data for PFHxA, Tab 7-EcoTox data for TBBPA, Tab 8-EcoTox Group Mean Calculations, Tab 9-SeqAPASS EcoTox Data Comparisons, Tab 10-hMOR SeqAPASS Results Level 1, Tab 11-hMOR SeqAPASS Results Level 2 og Tab 12-μ-hMOR SeqAPASS Results Level 3. Forkortelser: SeqAPASS = sekvensjustering for å forutsi følsomhet på tvers av arter; ToC = Innholdsfortegnelse; hTTR = humant transtyretin; ECOTOX = Økotoksikologisk kunnskapsbase; DES = dietylstilbestrol; PFOS = perfluoroktansulfonsyre; PFHxA = perfluorheksansyre; TBBPA = tetrabromobisfenol A; hMOR = human mu-opioidreseptor. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er utbredt anerkjennelse at det ikke er mulig å empirisk teste nok arter til å fange genomisk, fenotypisk, fysiologisk og atferdsmessig mangfold av levende organismer som kan bli utsatt for kjemikalier av toksikologisk interesse. Målet med SeqAPASS er å maksimere bruken av eksisterende og kontinuerlig voksende proteinsekvens og strukturelle data for å hjelpe og informere ekstrapolering av kjemiske toksisitetsdata / kunnskap fra testede organismer til hundrevis eller tusenvis av andre arter gjennom sammenligninger på molekylært nivå. SeqAPASS-verktøyet ble designet for å redusere kompleksiteten i proteinsekvenssammenligninger for forskere, risikovurderinger og regulatorer gjennom en strømlinjeformet og rask analyse som inkluderer transparent genererte og nedlastbare sammendragstabeller, interaktive datavisualiseringer og enkel identifisering av truede og truede arter, samt vanlige modellorganismer. Protokoller er beskrevet her for å kjøre SeqAPASS nivå 1, 2 og 3 for evaluering av primær aminosyresekvenslikhet, funksjonell domenekonservering og kritiske aminosyrer involvert i kjemisk-protein og protein-protein interaksjoner. Bevislinjer samlet fra hvert nivå av SeqAPASS-analyse forutsier kjemisk følsomhet på tvers av arter, og gir konsistente og lett tolkbare data. Til dags dato har dette verktøyet blitt brukt på tvers av et bredt spekter av applikasjoner, inkludert identifisering av kjemikalier som binder seg til visse reseptorer og vurdering av avlesningspotensial for vertebrate økologiske reseptorer med pattedyrsystemer. I tillegg er to casestudier fokusert på skjoldbruskhormondistribusjonsproteinet, TTR og MOR beskrevet her for å demonstrere de nye funksjonene og funksjonaliteten til SeqAPASS v2 til v6.

Som med enhver beregningsmessig tilnærming, er evnen til å generere spådommer om artenes følsomhet i SeqAPASS-verktøyet svært avhengig av inngangen til passende parametere 8,9,13. Det er derfor kritisk at det før en analyse gjennomføres et problemformuleringstrinn for å kartlegge eksisterende data og litteratur for det tiltenkte målet. Å starte en analyse med kunnskap om proteinmålet gjør det mulig for brukeren å identifisere passende proteintiltredelsestall og sekvenser av høy kvalitet. På samme måte sikrer kunnskap om en sensitiv eller målrettet art eller modellorganismer som brukes i analyser eller AOP-utvikling valg av en passende spørringsart som alle andre arter sammenlignes med. Valg av funksjonelle domener for nivå 2 og kritiske aminosyrerester for nivå 3 er også kritiske trinn som krever at brukeren identifiserer passende inndataparametere for å generere spådommer. På grunn av dette behovet for eksisterende kunnskap om en kjemisk proteininteraksjon, integrerer nyere versjonsutgivelser av SeqAPASS-verktøyet brukervennlige ressurser designet for å hjelpe brukerne til relevant informasjon for igangsetting av en spørring (f.eks. lenker til andre verktøy) (tabell 2 og figur 2). I tillegg er popup-informasjonsmeldinger og varsler integrert i verktøyet for å veilede brukeren gjennom analysen og bidra til å informere brukeren om eventuelle feil som må løses.

Kompleksiteten av kjemisk-biologiske interaksjoner presenterer en begrensning av SeqAPASS-verktøyet. Ved ekstrapolering av toksisitetsdata på tvers av arter er bevaring av det molekylære målet en av mange faktorer å vurdere. Adsorpsjon, distribusjon, metabolisme og utskillelse (ADME) av et kjemikalie er avgjørende når man vurderer kjemisk toksisitet, da kjemikalier enten kan aktiveres eller avgiftes ved disse prosessene39,40. Andre faktorer, som ruten for kjemisk eksponering, organismens livsstadium og livshistorie, og diett, kan også spille viktige roller for å bestemme kjemisk følsomhet på tvers av arter, samt41,42. For å løse denne begrensningen er det viktig å forstå hovedspørsmålet SeqAPASS stiller når man forutsier kjemisk følsomhet: er det sannsynlig at et kjemikalies proteinmål er tilstede i en annen art for kjemikaliet å handle på? Dette spørsmålet løses ved å identifisere ortologkandidater og vurdere bevaring av det målet på tvers av arter i forhold til en kjent sensitiv eller målrettet art. Denne informasjonen kan brukes som en bevislinje for ekstrapolering på tvers av arter og integreres i andre bevisstrømmer (f.eks. potensialet for eksponering) for bedre å forstå artenes følsomhet for kjemiske stressorer. Oppdateringer av SeqAPASS har innlemmet integrerte lenker til eksterne verktøy, inkludert US EPA ECOTOX knowledgebase43 og US Fish & Wildlife Service Environmental Conservation Online System (ECOS)44. Tilkobling til disse databasene gir SeqAPASS-brukere enkel tilgang til empiriske kjemiske toksisitetsdata for sammenligning med sekvensbaserte spådommer og et middel til å identifisere arter som kan ha beskyttet status.

SeqAPASS-verktøyet gir en vitenskapelig basert plattform for beregningsmessige prediksjoner av iboende følsomhet som støttes av begreper i evolusjonær biologi og caseeksempler som sammenligner spådommer med tilgjengelige empiriske resultater. I tillegg er SeqAPASS gratis og offentlig tilgjengelig på en godt støttet nettbasert plattform som er allment tilgjengelig (https://seqapass.epa.gov/seqapass/). Ettersom dette verktøyet utnytter sekvensdata og proteininformasjon fra eksisterende databaser, forbedres dets evne til å forutsi kjemisk følsomhet i et bredere mangfold av arter kontinuerlig etter hvert som sekvenseringsteknologien utvikler seg og genomene til nye arter sekvenseres og kommenteres. Selv om dette gir klare fordeler med hensyn til datatilgjengelighet, presenterer det også en begrensning ved at offentlig tilgjengelig sekvensinformasjon kan bli utsatt for inkonsekvent kvalitet, dårlig merknad og ufullstendighet av proteinsekvenser for enkelte arter. Det er imidlertid lovende at omics teknologier og metoder i bioinformatikk utvikler seg raskt, og derfor vil sekvenskurering og kvalitet sannsynligvis fortsette å forbedre seg over tid.

Et hovedmål med SeqAPASS-verktøyet er åpenhet, og gir tilgang i form av lenker til alle datakilder og verktøy som er integrert i backend. Slik åpenhet gir brukeren rask tilgang til de opprinnelige kildene til sekvensen eller taksonomisk informasjon fra NCBI. Anvendelsesdomenet for dette verktøyet er definert av informasjonen som trengs for å gjennomføre en meningsfull analyse. Siden kunnskap om en kjemisk protein- eller protein-protein-interaksjon i en kjent sensitiv eller målrettet art er nøkkelelementer for å starte en spørring, må det erkjennes at søk utført uten denne informasjonen ikke er meningsfulle. I tillegg utgjør kjemikalier som har flere udefinerte biologiske mål eller samhandler med forskjellige mål med ulik grad av styrke, også en utfordring og begrensning av verktøyet i sin nåværende form. Det forventes at med forbedret bioinformatikk, beregningsmodellering og cellebasert, høy gjennomstrømningsscreening og transkriptomikk, vil større kunnskap på tvers av mangfoldet av kjemisk rom om interaksjoner med spesifikke proteiner fortsette å bli belyst. Det forventes at evnen til å anvende SeqAPASS på bredere utfordringer med ekstrapolering av arter, i forhold til å forstå potensialet for negative kjemiske effekter på tvers av artsmangfoldet, vil fortsette å forbedre seg.

Avslutningsvis er SeqAPASS-verktøyet en tilgjengelig plattform som lett bruker molekylær informasjon for å takle den store utfordringen med ekstrapolering på tvers av arter i kjemiske sikkerhetsevalueringer. Selv om eksemplene som er fremhevet her, er fokusert på å generere spådommer om kjemisk følsomhet, kan resultatene også hjelpe til med å forstå den generelle bevaringen av biologiske veier. Ved å samle ulike bevislinjer og legge til rette for tilgang til flere plattformer og databaser, bidrar dette verktøyet til å bygge gjennomsiktige saker for prioritering av kjemisk testing og tildeling av ressurser. Med den fortsatte utviklingen av vitenskapelige og bioinformatiske evner, vil kraften og nytten av verktøyet fortsette å vokse og forbedre seg for å møte behovene til forsknings- og reguleringssamfunn, samtidig som ressursene som kreves for vurderinger på tvers av arter, reduseres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Daniel L. Villeneuve (US EPA, Center for Computational Toxicology and Exposure) og Dr. Jon A. Doering (Department of Environmental Sciences, Louisiana State University) for å gi kommentarer til et tidligere utkast til manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av US Environmental Protection Agency. Synspunktene uttrykt i dette papiret er forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene eller retningslinjene til US Environmental Protection Agency, og heller ikke omtalen av handelsnavn eller kommersielle produkter indikerer godkjenning av den føderale regjeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spreadsheet program N/A N/A Any program that can be used to view and work with csv files (e.g. Microsoft Excel, OpenOffice Calc, Google Docs) can be used to access data export files.
Basic computing setup and internet access N/A N/A SeqAPASS is a free, online tool that can be easily used via an internet connection. No software downloads are required.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krewski, D., et al. Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13 (2-4), 51-138 (2010).
  2. Wang, Z., Walker, G. W., Muir, D. C. G., Nagatani-Yoshida, K. Toward a global understanding of chemical pollution: A first comprehensive analysis of national and regional chemical inventories. Environmental Science & Technology. 54 (5), 2575-2584 (2020).
  3. Brooks, B. W., et al. Toxicology advances for 21st century chemical pollution. One Earth. 2 (4), 312-316 (2020).
  4. Kostal, J., Voutchkova-Kostal, A. Going all in: A strategic investment in in silico toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (4), 880-888 (2020).
  5. Cheng, W., Doering, J. A., LaLone, C., Ng, C. Integrative computational approaches to inform relative bioaccumulation potential of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS) across species. Toxicology Sciences. 180 (2), 212-223 (2021).
  6. Kostich, M. S., Lazorchak, J. M. Risks to aquatic organisms posed by human pharmaceutical use. Science of the Total Environment. 389 (2-3), 329-339 (2008).
  7. Gunnarsson, L., Jauhiainen, A., Kristiansson, E., Nerman, O., Larsson, D. G. Evolutionary conservation of human drug targets in organisms used for environmental risk assessments. Environmental Science & Technology. 42 (15), 5807-5813 (2008).
  8. LaLone, C. A., et al. Evidence for cross species extrapolation of mammalian-based high-throughput screening assay results. Environmental Science & Technology. 52 (23), 13960-13971 (2018).
  9. LaLone, C. A., et al. Editor's highlight: Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS): A web-based tool for addressing the challenges of cross-species extrapolation of chemical toxicity. Toxicology Sciences. 153 (2), 228-245 (2016).
  10. Head, J. A., Hahn, M. E., Kennedy, S. W. Key amino acids in the aryl hydrocarbon receptor predict dioxin sensitivity in avian species. Environmental Science & Technology. 42 (19), 7535-7541 (2008).
  11. Bass, C., et al. Mutation of a nicotinic acetylcholine receptor β subunit is associated with resistance to neonicotinoid insecticides in the aphid Myzus persicae. BMC Neuroscience. 12, 51-51 (2011).
  12. Erdmanis, L., et al. Association of neonicotinoid insensitivity with a conserved residue in the loop d binding region of the tick nicotinic acetylcholine receptor. Biochemistry. 51 (23), 4627-4629 (2012).
  13. Doering, J. A., et al. et al. In silico site-directed mutagenesis informs species-specific predictions of chemical susceptibility derived from the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) tool. Toxicology Sciences. 166 (1), 131-145 (2018).
  14. Noyes, P. D., et al. Evaluating chemicals for thyroid disruption: Opportunities and challenges with in vitro testing and adverse outcome pathway approaches. Environmental Health Perspectives. 127 (9), 95001 (2019).
  15. Park, G. Y., Jamerlan, A., Shim, K. H., An, S. S. A. Diagnostic and treatment approaches involving transthyretin in amyloidogenic diseases. Int J Mol Sci. 20 (12), 2982 (2019).
  16. Rabah, S. A., Gowan, I. L., Pagnin, M., Osman, N., Richardson, S. J. Thyroid hormone distributor proteins during development in vertebrates. Front Endocrinol (Lausane). 10, 506 (2019).
  17. Richardson, S. J. Cell and molecular biology of transthyretin and thyroid hormones. International Review of Cytology. 258, 137-193 (2007).
  18. Yamauchi, K., Ishihara, A. Transthyretin and Endocrine Disruptors. Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure and Biological Functions. Richardson, S. J., Cody, V. , Springer. Berlin Heidelberg, Germany. 159-171 (2009).
  19. Iakovleva, I., et al. Tetrabromobisphenol A is an efficient stabilizer of the transthyretin tetramer. PLoS One. 11 (4), 0153529 (2016).
  20. Ishihara, A., Sawatsubashi, S., Yamauchi, K. Endocrine disrupting chemicals: Interference of thyroid hormone binding to transthyretins and to thyroid hormone receptors. Molecular and Cellular Endocrinology. 199 (1), 105-117 (2003).
  21. Kar, S., Sepúlveda, M. S., Roy, K., Leszczynski, J. Endocrine-disrupting activity of per- and polyfluoroalkyl substances: Exploring combined approaches of ligand and structure based modeling. Chemosphere. 184, 514-523 (2017).
  22. Morais-de-Sa, E., Pereira, P. J., Saraiva, M. J., Damas, A. M. The crystal structure of transthyretin in complex with diethylstilbestrol: A promising template for the design of amyloid inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 279 (51), 53483-53490 (2004).
  23. Morgado, I., Campinho, M. A., Costa, R., Jacinto, R., Power, D. M. Disruption of the thyroid system by diethylstilbestrol and ioxynil in the sea bream (Sparus aurata). Aquatic Toxicology. 92 (4), 271-280 (2009).
  24. Yamauchi, K., Prapunpoj, P., Richardson, S. J. Effect of diethylstilbestrol on thyroid hormone binding to amphibian transthyretins. General and Comparative Endocrinology. 119 (3), 329-339 (2000).
  25. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  26. Ren, X. M., et al. Binding interactions of perfluoroalkyl substances with thyroid hormone transport proteins and potential toxicological implications. Toxicology. 366-367, 32-42 (2016).
  27. Wilson, N., Mbabazi, K., Seth, P., Smith, H., Davis, N. L. Drug and opioid-involved overdose deaths - United States, 2017-2018. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (11), 290-297 (2020).
  28. EPA. National Pollutant Discharge Elimination System (NPDES). United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/npdes/npdes-resources (2018).
  29. Duvallet, C., Hayes, B. D., Erickson, T. B., Chai, P. R., Matus, M. Mapping community opioid exposure through wastewater-based epidemiology as a means to engage pharmacies in harm reduction efforts. Preventing Chronic Disease. 17, 200053 (2020).
  30. Gushgari, A. J., Venkatesan, A. K., Chen, J., Steele, J. C., Halden, R. U. Long-term tracking of opioid consumption in two United States cities using wastewater-based epidemiology approach. Water Research. 161, 171-180 (2019).
  31. Lau, B., Bretaud, S., Huang, Y., Lin, E., Guo, S. Dissociation of food and opiate preference by a genetic mutation in zebrafish. Genes Brain Behave. 5 (7), 497-505 (2006).
  32. Bossé, G. D., Peterson, R. T. Development of an opioid self-administration assay to study drug seeking in zebrafish. Behavioural Brain Research. 335, 158-166 (2017).
  33. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  34. Manglik, A., et al. Crystal structure of the µ-opioid receptor bound to a morphinan antagonist. Nature. 485 (7398), 321-326 (2012).
  35. Comer, S. D., Cahill, C. M. Fentanyl: Receptor pharmacology, abuse potential, and implications for treatment. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 106, 49-57 (2019).
  36. Podlewska, S., Bugno, R., Kudla, L., Bojarski, A. J., Przewlocki, R. Molecular modeling of µ opioid receptor ligands with various functional properties: PZM21, SR-17018, morphine, and fentanyl-simulated interaction patterns confronted with experimental data. Molecules. 25 (20), 4636 (2020).
  37. Huang, W., et al. Structural insights into µ-opioid receptor activation. Nature. 524 (7565), 315-321 (2015).
  38. Lipiński, P. F. J., et al. Fentanyl family at the mu-opioid receptor: Uniform assessment of binding and computational analysis. Molecules. 24 (4), 740 (2019).
  39. Boland, L. A., Angles, J. M. Feline permethrin toxicity: Retrospective study of 42 cases. Journal of Feline Medicine and Surgery. 12 (2), 61-71 (2010).
  40. Stevenson, B. J., Pignatelli, P., Nikou, D., Paine, M. J. Pinpointing P450s associated with pyrethroid metabolism in the dengue vector, Aedes aegypti: developing new tools to combat insecticide resistance. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1595 (2012).
  41. Ankley, G. T., Gray, L. E. Cross-species conservation of endocrine pathways: A critical analysis of tier 1 fish and rat screening assays with 12 model chemicals. Environmental Toxicology and Chemistry. 32 (5), 1084-1087 (2013).
  42. Meteyer, C. U., Rideout, B. A., Gilbert, M., Shivaprasad, H. L., Oaks, J. L. Pathology and proposed pathophysiology of diclofenac poisoning in free-living and experimentally exposed oriental white-backed vultures (Gyps bengalensis). Journal of Wildlife Diseases. 41 (4), 707-716 (2005).
  43. EPA. ECOTOX User Guide: ECOTOXicology Knowledgebase System. EPA, United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://cfpub.epa.gov/ecotox/index.cfm (2021).
  44. ECOS Environmental Conservation Online System. U.S. Fish & Wildlife Service. , Available from: https://ecos.fws.gov/ecp/ (2021).

Tags

Genetikk utgave 192 Ekstrapolering på tvers av arter økotoksikologi prediktiv toksikologi ny tilnærmingsmetodikk opioidreseptor transtyretin
Demonstrasjon av sekvensjusteringen for å forutsi på tvers av arter følsomhetsverktøy for rask vurdering av proteinbevaring
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vliet, S. M. F., Hazemi, M., Blatz,… More

Vliet, S. M. F., Hazemi, M., Blatz, D., Jensen, M., Mayasich, S., Transue, T. R., Simmons, C., Wilkinson, A., LaLone, C. A. Demonstration of the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility Tool for Rapid Assessment of Protein Conservation. J. Vis. Exp. (192), e63970, doi:10.3791/63970 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter