Summary
本プロトコルは、単一エマルジョン製剤ベースの簡単なマイクロ流体技術を介したポリ(乳酸-co-グリコール酸)ベースの高開口多孔質ミクロスフェア(HOPM)の製造について説明しています。これらのミクロスフェアは、組織工学や薬物スクリーニングに応用できる可能性があります。
Abstract
バルク足場や細胞のみの直接注入と比較して、注射可能なモジュラーユニットは、細胞のパッケージングの利便性、細胞保持の改善、および侵襲性の最小化により、機能不全の組織の修復に大きな関心を集めています。さらに、これらのマイクロスケール担体の多孔質コンフォメーションは、培地交換を強化し、栄養素と酸素供給のレベルを改善する可能性があります。本研究は、細胞送達アプリケーションのための簡単なマイクロ流体技術によるポリ(乳酸-co-グリコール酸)ベースの高開放多孔質ミクロスフェア(PLGA-HOPM)の簡便な製造を示しています。得られた単分散PLGA-HOPMは、~400 μmの粒径と~50 μmの開孔を有し、相互接続窓を有していた。簡単に説明すると、7.5%(w / v)ゼラチン水相で包まれた乳化油滴(ジクロロメタン中のPLGA溶液、DCM)を、カスタマイズされたマイクロ流体セットアップの同軸ノズルを介して1%(w / v)連続的に流れるポリ(ビニルアルコール)(PVA)水溶液に導入しました。続いて、ミクロスフェアを溶媒抽出および凍結乾燥手順にかけ、その結果、HOPMが製造されました。特に、さまざまな配合(PLGAとポロジェンの濃度)と処理パラメータ(乳化力、ニードルゲージ、分散相の流量)は、得られるPLGA HOPMの品質と特性に重要な役割を果たします。さらに、これらのアーキテクチャは、拡張された創薬および組織再生アプリケーションのために、成長因子などの他のさまざまな生化学的手がかりをカプセル化する可能性があります。
Introduction
細胞を含んだミクロスフェアは、in situでの細胞保持能力の向上、細胞の効率的な送達、およびその後のin vivoでの細胞増殖能力などの好ましい利点を提供します1。現在までに、組織再生または薬物スクリーニングアプリケーションのための細胞の助長環境をサポートするための成功した足場構造を開発するために、多くの研究が提唱されてきました2。しかし、低酸素環境は、栄養素/酸素の供給不足と代謝廃棄物の蓄積のために、内部で避けられないことがよくあります3。これらの問題を克服するために、様々な生体材料を用いて高多孔性ミクロスフェア(PM)が開発されてきた4,5,6。さらに、動的培養では、足場は過度のせん断応力7に悩まされ、培地の不安定な状態はPMの忠実度を損なう可能性があります。 あるいは、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)を使用して、動的培養用の機械的強度に優れたPMを処理することもできます1。例えば、マウス筋芽細胞(C2C12)を配合したPLGA高開放型PM(HOPM)とヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を配合したポリ(エチレングリコール)中空マイクロロッドを同時注射し、体積筋の喪失を治癒させることで実証し、in situ骨格筋再生の著しい改善を達成しました8。
特に、PMは大きな表面積と高い多孔性を特徴とし、これは細胞接着と低侵襲細胞送達に向けた成長に特に関心があります9。これらの態様を考慮して、PM10、11を製造するために様々な生体適合性材料が採用されてきた。細胞と共培養されたこれらの設計可能なPMは、優れた接着性、かなりの機械的強度、および高度に相互接続された窓を提供し、損傷した組織を修復するための細胞増殖を改善する可能性があります12。これに関して、多孔質球体13、14を作製するための様々な技術も開発されている。一方では、PMはNH4HCO3などのガス形成剤を使用して製造され、相互接続性が不十分なために抑制されました15,16,17。一方、PMは乳化後に直接せん断され、多分散PM18につながった。結局、エマルジョンテンプレートアプローチに基づく液滴マイクロ流体技術は、均一なサイズの粒子をもたらすことが多いため、PMを構築するための効率的な方法である可能性があります19。特に、ミクロスフェアの形態学的属性は、生成されたエマルジョン液滴の品質(すなわち、油中水型W/O、または水中油型O/W)に依存することが多く、これは生体材料の属性に大きく影響し得る20。事前に設計されたマイクロ流体プラットフォームを適用して、マイクロファイバーまたはマイクロスフェアを生成できることは注目に値します。ある例では、Yuらは、毛細管ベースのマイクロ流体プラットフォームに基づく細胞を含んだ微小繊維構造体の生成を実証し、これは天然組織を模倣するための細胞ネットワークを組み立てるために使用できる21。別の例では、Yeらは、マイクロ流体技術を通じてシリカコロイド結晶ビーズのテンプレート複製によってフォトニック結晶マイクロカプセルを作製し、これは複雑な標識および特定の装置を必要とする現在の技術の多くの制限を克服することができた22。
実際、この技術を利用する理由は、性質が簡単であること、高度な機器を必要としないこと、細胞送達や再生医療用途で均一なサイズのPMを合成する際の利便性など、さまざまな利点によるものです。これに関連して、エマルジョンテンプレートの事前に設計されたコンポーネントを使用すると、ポリ(塩化ビニル)(PVC)チューブ、ガラスキャピラリー、および針から組み立てられたマイクロ流体デバイスから、高い気孔率と相互接続性を備えたPMを便利に得ることができます。W/Oエマルション前駆体は、ゼラチン水溶液とPLGAの有機溶液を均質化することによって調製されます。エマルジョンの適用部分を選択的にマイクロ流体プラットフォームに注入することにより、均一な粒子サイズと表面全体から内部までの相互接続された細孔を有するPMが製造される。本プロトコルは、マイクロ流体プラットフォームでのエマルジョンテンプレート化によってPLGA-HOPMを作製することを目的としています。このプロトコルは、PLGA-HOPMの再現性のある生産を可能にし、組織工学および薬物スクリーニングの関連分野に適用できる可能性があると考えられています。
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Protocol
1.溶液の調製
- PVA溶液を80°Cの水浴中で加熱し、続いて4°Cの冷蔵庫に入れることにより、PVA原液を予め調製する。 実験用に室温(RT)まで冷却します。
- ゼラチン水溶液(1 mL、7.5%、w / v)をPLGAの有機相(2 mL、2%、ジクロロメタン、DCM溶液)に加えて、エマルジョン前駆体を調製します(材料の表を参照)。
注:一般に、マイクロ流体技術は、ミクロスフェアを形成するためにさまざまな段階を含みます。連続または収集段階は、水性ポリ(ビニルアルコール)(PVA、600 mL、1%、w/v)を含む。
2. 液滴マイクロ流体デバイスの実装とPLGA-HOPMの作製
注:このアセンブリに必要な消耗品は、 材料表に記載されています。
- 液滴発生器アセンブリをカスタマイズします。
- ガラスキャピラリー(OD、1 mm)、PVCチューブ(ID、1 mm)、および26 Gディスペンシングニードルを使用して、コフローマイクロ流体発生器を構築します。
- ガラスキャピラリーをPVCチューブの端に接続し、上記の構造の接続部に針で穴を開けます。
- PVCチューブのもう一方の端を液滴生成中の連続相に配置します。UV接着剤を使用して、硬化後の接合部の隙間をシールします。
注意: PVCチューブに穴を開けるのに便利なように、針を約45°曲げて曲げ、針先を毛細管に引き伸ばして同軸構造を形成する必要があります。
- 液滴マイクロ流体プラットフォームを準備します。
- 図1に示すように、2つのシリンジポンプを使用します。50 mLシリンジを使用して連続相をロードし、5 mLシリンジを使用してエマルジョンを形成します。
- 連続相と分散相の流速をそれぞれ2 mL/分と0.08 mL/分に設定します。
- 500 mLビーカーを氷浴に入れ、予冷したPVA水溶液で満たします(ステップ1.1)。
注意: ガラスキャピラリーの端は、収集段階に浸す必要があります。プラットフォーム内でエマルジョン液滴が形成された後、収集相の上清をガラス棒で攪拌(1時間、60rpm)することが示唆される。エマルジョン液滴は針先の先端で生成されます。一般に、針のゲージはPMのサイズに影響を与え、小さいゲージはPMの小さいサイズに対応します。また、細孔径は、主にポロゲン濃度と相関しており、適切なゼラチン濃度1で増加し得る。
- 乳化および液滴生成を行う。
- 以下の手順に従ってエマルジョンを準備します。
- ゼラチン水溶液をPLGAのDCM溶液に直ちにデカントし(ステップ1.2)、超音波装置を使用して乳化することによってエマルジョンを調製する( 材料の表を参照)。
- 超音波出力を400 Wに調整し、合計処理時間を90秒(間隔2秒、超音波処理1秒)に設定し、プローブの位置を絶えず手動で変更します。
- 得られたエマルジョンを約20分でシリンジ吸引および液滴生成用に安定化させます。
注意: 超音波セルブレーカーのプローブを油水インターフェースに配置します。超音波プローブを容器に接触させないことをお勧めします。
- 液滴生成を実行します。
- 超音波処理後、調製したエマルジョン(ステップ2.3.1)をマイクロ流体プラットフォームの5mLシリンジに迅速にロードします。
- 相分離途中の不安定なW/Oエマルションを不連続相としてマイクロ流体デバイスに導入します。同時に、連続相としてPVAの水溶液を使用してください。
- エマルジョンの適切な部分をマイクロ流体デバイスに注入した後、収集ビーカー(PVA、1%、w / v)の下部にあるエマルジョンを含むミクロスフェアを収集します。
- さらに安定化させるために、サンプルを4°Cで一晩置きます。
- 以下の手順に従って、調製したミクロスフェア(PLGA-HOPM)をすすぎ、凍結乾燥します。
注: 生成された PLGA-HOPM には、内部と表面に任意の細孔が含まれています。- ミクロスフェアを4°Cで保存してからRTに正規化し、ガラス棒(1時間、60 rpm)で攪拌して残留DCMを除去します。
- 500 mLビーカー内の捕集相を注意深く濾過し、回収した微小球を脱イオン水で3回洗浄して、PM表面の残留PVAを洗い流します。
- PLGAミクロスフェアを37°Cの水浴に30分間置き、PLGA骨格に包まれたゼラチンを溶解した。
- 得られたPLGA-HOPMを脱イオン水で2回すすぎ、残留ゼラチンを除去し、-80°Cで24時間凍結乾燥するために予冷します。
- さらなる実験のために、乾燥したPLGA-HOPMを-20°Cで保存してください。
- 以下の手順に従ってエマルジョンを準備します。
3. 走査型電子顕微鏡(SEM)イメージング
- PLGA-HOPMをRTのSEMのサンプルステージ( 材料表を参照)に堆積させ、サンプルステージをマグネトロンスパッタのスパッタセルに入れます。変圧器とマグネトロンを1つずつオンにします。金で1分間スパッタコーティングした後、サンプルをSEMに導入します。
- 加速電圧を5kVに設定してSEM画像を取得します。
- さらに、SEMイメージングの可変フィールドで100 PMを使用してPLGA-HOPMの粒子サイズを定量化します。代表的な結果を測定して、細孔径分布を定量化します。
- Image Jでグラフィックを開き、「直線」を使用してSEM画像のスケールバーを一致させると、ソフトウェアがピクセルと長さを識別できます。
- [分析]をクリックしてスケールを設定し、[既知の距離]をSEM画像のスケールバーに設定し、[グローバル>>]をクリックします。
- ROIマネージャー>>ツールの分析をクリックして、PLGA PMの細孔または粒子サイズを測定し、[追加]をクリックします。要件に基づいてサンプル数を測定します。
- [ 測定 ]をクリックして、さらに計算するためにグラフィックの定量データを取得します。
4. 細胞培養と蛍光イメージング
注:ラット骨髄間葉系幹細胞(BMSC)が本研究に使用されました。細胞は市販の供給源から入手した( 材料表を参照)。
- L-グルタミン(DMEM/F-12)、10%(v/v)ウシ胎児血清、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地で細胞を培養します。細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。
- コンフルエントの90%に達した後、ラットBMSCを1:2の比率で通過させる。
- 以下の手順で細胞接着を行います。
- PLGA-HOPMをエチルアルコール(5 mL、70%、v/v)でインキュベートし、500 x g でRTで10分間遠心分離して滅菌します。
- 滅菌したPLGA-HOPMをリン酸緩衝液で2回洗浄します。
- PBSCをPLGA-HOPMに接着させるために、滅菌遠心チューブ(50 mL)でHOPM(5 mL、1 x 10 5細胞/mL)と細胞懸濁液(5 mL、1 x 105 細胞/mL)をインキュベートします。
- 密閉された50 mL遠沈管を振とう機に入れて、恒温無菌振とう機(37°C、90 rpm)で動的培養を行います( 材料の表を参照)。
注:動的培養は、PMと細胞をプラスチックプレートに直接インキュベートするのではなく、足場へのBMSCの付着率を高めることを目的としています。細胞とPLGA PMを50 mL滅菌遠心チューブに加え、チューブを恒温無菌振とう機(37°C、90 rpm)でインキュベートし、2日ごとに培地を交換します。
- 生死二重染色アッセイを実行します。
- PLGA-HOPMに付着せずにBMSCを溶出するために、細胞を含んだPMを3回すすぎます。
- セルを含んだPMを35mmのガラス底板に置きます。PBSで事前に洗浄したサンプルに、それぞれ1 μLのカルセイン-AMとヨウ化プロピジウム(PI)を含む1 mLの染色バッファー( 材料の表を参照)を追加します。
- 共焦点レーザー走査型顕微鏡でサンプルを評価します( 材料表を参照)。対応する検出器で488nmと552nmの励起光をオンにします。zオーバーレイ分析では、顕微鏡のz軸の動きによってサンプルのさまざまな層をキャプチャするようにz幅を設定します。
注:他の汚れは分析に適切に使用できることに注意してください。
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Representative Results
主要なパラメータ1を最適化した以前の研究に基づいて、PLGAを蒸発性DCM溶媒に溶解しました。一次W / Oエマルジョンは、超音波プローブ処理下でゼラチンと均質化することによって調製された。カスタマイズされたコフロー流体構造は単純化して組み立てられ、シリンジを使用して流れを絶えず導入しました。さらに、PLGAミクロスフェアのPVAおよびゼラチンを除去するために十分なすすぎ手順を実施した(図1A、補足図1A、B)。続いて、PLGA-HOPMの形態学的属性をSEMイメージングによって観察した。PLGA-HOPMは、任意のサイズの細孔(10-100 μm)と相互接続された窓を備えた大きなサイズ(350-500 μm)を示し、酸素/代謝廃棄物の輸送の高効率を促進する可能性があることが観察されました(図1B)。これらの形態学的結果は、報告された結果と一致した1。
概念実証として、BMSCはPLGA-HOPM内で暫定的に培養するために採用されました。PMの内部構造により、細胞が動的培養中に接着し、増殖を確実にすることができると考えられていました8。さらに、BMSCを選択する理論的根拠は、これらの細胞が多極分化および損傷組織を修復することを特徴とし、様々な生理活性物質の生物学的挙動を研究するためにも一般的に使用されていることである23。BMSCを使用して、ミクロスフェアを使用してin vitro微小組織を構築し、CLSMのz分析によって細胞分布と生存状態を視覚化しました(図1C)。1 dで多数の細胞が足場に接着し、緑色の蛍光が維持されていることが観察され、PLGA-HOPMの細胞の広範な接着および遊走能力を表しています。アセトキシメチルエステル(AM)基は疎水性を改善し、生細胞膜の浸透を促進するため、細胞質をカルセインAM染色で間接的にイメージングしました。カルセイン-AMは蛍光を発しませんが、細胞内で内因性エステラーゼによって加水分解され、強い負電荷を有する極性分子カルセインを生成し、強い緑色の蛍光を発することができる24。したがって、細胞質は、カルセインAM染色で間接的に可視化される(図1C、補足図1C)。
図1:PLGA-HOPMの作製と細胞適合性。 (A)PLGA-HOPMの製造を説明する概略図。(B)SEMイメージングに基づくPMの細孔径(10-100μm)。スケールバー = 100 μm。 (C)PLGA-HOPMと24時間共培養したBMSCの生(カルセイン-AM、緑)および死(ヨウ化プロピジウム、PI、赤)染色。スケールバー = 250 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:細胞を含んだPLGA-HOPMの実際のマイクロ流体プラットフォーム、エマルジョン、および層間イメージングの図。 (A)実際の液滴マイクロ流体プラットフォームのスキーム。(B)超音波処理により乳化されたW/O前駆体。(C)PLGA-HOPMと24時間共培養したBMSCの生染色と死染色の中間層。スケールバー = 250 μm. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、PLGAベースのアーキテクチャ、つまりPLGA-HOPMを製造するための効率的な戦略について説明します。PLGAの溶媒揮発の回避およびエマルジョンの調製中の標的位置への超音波パワーの穏やかな調整を含む、いくつかの重要なステップを慎重に行わなければならないことに留意されたい。さらに、20mLシリンジの液体出口は、乳化前駆体の相分離を解決するためにある程度調整することができる。しかしながら、制限は、ポロゲンの状態が環境温度によって影響を受けるので、エマルジョンの安定性が望ましくない場合があることである。一緒に、液滴マイクロ流体プラットフォームの便利な組み立ては、組織工学および薬物スクリーニングアプリケーションのための細胞を含んだミクロゲルの製造を実質的に容易にすることができる。PLGAは、食品医薬品局(FDA)承認のドラッグデリバリー商品であるため、ミクロスフェアを製造する際のデリバリービヒクルとして頻繁に適用されます25。さらに、脂肪族ポリエステルは、合成手順中のラクチド酸およびグリコール酸の比率に依存する、インビトロまたはインビボのいずれかの加水分解を介して無害な分解属性を提供する26。
PLGA-HOPMを作製するために、水相と有機相を均質化し、超音波プローブを使用してW / Oエマルジョンを形成しました。次に、W/Oエマルションを液滴マイクロ流体デバイスに導入し、針先で水中油中水型(W/O/W)液滴に進化させました(図1A、補足図1A、B)。得られたW/O/W液滴は、捕集相でDCMを抽出・蒸発させることで固化できた。氷浴中で予冷された収集段階では、ゼラチンをソフトゲル状態に保ち、溶媒蒸発中に十分に分布したエマルジョンを直接保持し、さらなる凍結乾燥後にPLGA-HOPMを得ることができます(図1B)。
さらに、エマルジョンテンプレート法には揮発性有機溶剤が含まれており、揮発によって除去される可能性があります。また、PLGA-HOPM中のDCMの残留物は、ガスクロマトグラフィー測定2から計算すると、ほぼ完全に除去することができました。さらに、マイクロ流体技術はPLGAの細胞/生体適合性に影響を与えません。実際、ラットBMSCで培養したPLGA-HOPMは、生細胞の数が豊富で、死細胞はわずかで、形態は伸びていることを示しました。さらに、細胞質は生きた蛍光色素によって画像化することができ、HOPM上での伸張を示しました。
優れた形態学的特性を持つPLGA-HOPMを組み合わせることで、組織再生やさまざまな生物医学的用途のHOPM全体での細胞接着および拡散能力に関する要件を満たすことができます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
SCL、YW、RKK、AZCは、中国国家自然科学財団(NSFC、32071323、81971734、およびU1605225)および福建省大学の科学技術革新研究チームプログラムからの財政的支援を認めています。YSZはこれらのプログラムのいずれによってもサポートされておらず、いかなる種類の支払いも受け取っていませんでした。代わりに,ブリガム・リサーチ・インスティテュートからの支援が認められています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
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